CN108107208A - 一种基于纤突蛋白f的检测血清8型禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒 - Google Patents

一种基于纤突蛋白f的检测血清8型禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN108107208A
CN108107208A CN201711372077.1A CN201711372077A CN108107208A CN 108107208 A CN108107208 A CN 108107208A CN 201711372077 A CN201711372077 A CN 201711372077A CN 108107208 A CN108107208 A CN 108107208A
Authority
CN
China
Prior art keywords
serum
antibody
kit
aviadenovirus
type aviadenovirus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711372077.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108107208B (zh
Inventor
叶建强
路浩
邵红霞
秦爱建
王伟康
田晓彦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yangzhou University
Original Assignee
Yangzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yangzhou University filed Critical Yangzhou University
Priority to CN201711372077.1A priority Critical patent/CN108107208B/zh
Publication of CN108107208A publication Critical patent/CN108107208A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108107208B publication Critical patent/CN108107208B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/075—Adenoviridae

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于F蛋白的检测血清8型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，包括包被有血清8型禽腺病毒纤突蛋白基因F的表达蛋白的ELISA酶标板，阳性、阴性对照，HRP标记的兔抗鸡二抗，稀释液、显色液、洗涤液、终止液。本发明的ELISA试剂盒能特异性的检测出FAdV‑8抗体，而与抗流感病毒血清、抗马立克病毒血清、抗新城疫病毒血清、抗鸡传染性贫血病病毒血清、网状内皮细胞增生病病毒、抗血清4型禽腺病毒血清、抗减蛋综合征病毒血清以及SPF鸡血清不反应。因此，该试剂盒具有良好FAdV‑8的特异性，能用于FAdV‑8感染及免疫状况流行病学调查。

Description

一种基于纤突蛋白F的检测血清8型禽腺病毒抗体的间接 ELISA试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种基于纤突蛋白F的检测血清8禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒。
背景技术
禽腺病毒(FowlAdenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，分为5个种(A-E)，12个血清型。虽然在世界各地均有报道，FAdV感染一般引起亚临床状况，而急性感染主要引起包涵体肝炎、心包积液以及肌胃糜烂等。自2013年，国内鸡群由FAdV引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多。到2015年，FAdV感染在国内多个省份鸡群爆发。目前国内FAdV爆发不仅发生在3-4周龄肉鸡，还发生于10-20周龄的蛋鸡，给养鸡业造成了严重经济损失。病毒分离鉴定发现，目前血清8型禽腺病毒(FAdV-8)在鸡群较为流行。然目前尚无针对FAdV-8血清学抗体检测的快速方法及其试剂盒。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种基于F蛋白的检测血清8型禽腺病毒抗体的间接ELISA 试剂盒。
本发明的原理和最核心的关键技术是科学合理的构建了血清8型禽腺病毒F基因的原核表达质粒，之后将该质粒转化入BL21细胞进行原核表达并纯化并进一步将纯化的蛋白作为包被抗原建立试剂盒，检测血清8型禽腺病毒特异性抗体。
实现本发明目的的技术方案是：
本发明所述的一种基于F蛋白的检测血清8型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，包括包被有纤突蛋白基因F表达产物的ELISA酶标板，阳性对照、阴性对照，HRP标记的兔抗鸡二抗，样品(血清)稀释液、底物显色液、洗涤液、终止液。
进一步地，所述包被有纤突蛋白基因F表达产物的的ELISA酶标板，是通过将纯化的 F基因原核表达产物包被于96孔ELISA酶标板而制备。
本发明的另一实施方案提供一种血清8型禽腺病毒纤突蛋白基因F的表达蛋白，所述表达蛋白的制备方法包括如下步骤：
(1)利用重组酶ExnaseTM II将pGEX-6p-1线性化载体与血清8型禽腺病毒F基因的PCR产物进行重组克隆，重组克隆经序列验证后，命名为pGEX-6p-1-F，挑取阳性克隆进行质粒制备，并进行PCR鉴定；
(2)将步骤(1)中PCR鉴定的阳性克隆转化到BL21细胞中，并将菌液以1：100体积比接种于加AMP的LB培养基中，250rpm摇3h后，加入IPTG于16℃下进行诱导表达过夜，收集细菌，用PBS重悬后，超声破碎，离心分上清和沉淀；
(3)将步骤(2)中得到的上清经GST亲和层析柱纯化后得到所述血清8型禽腺病毒纤突蛋白基因F的表达蛋白。
本发明的另一实施方案提供上述的血清8型禽腺病毒纤突蛋白基因F的表达蛋白在制备检测血清8型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒中的应用。
本发明的另一实施方案提供一种用于检测血清8型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，所述试剂盒包括包被有权利要求1所述表达蛋白的ELISA酶标板。所述试剂盒还任选包括阳性对照、阴性对照，HRP标记的兔抗鸡二抗，稀释液、显色液、洗涤液、终止液中的一种或几种。
所述阳性对照为抗血清8型禽腺病毒的鸡血清，阴性对照为SPF鸡血清。
所述稀释液或洗涤液均为含0.05％Tween-20的PBST。
所述显色液是指TMB显色液。
所述终止液为2M硫酸。
本发明的另一实施方案提供上述的试剂盒在血清8禽腺病毒抗体检测中的应用。包括如下步骤：将阳性血清1：400稀释后，加入A1、A2孔，将阴性血清1：400稀释后加入A3、A4孔，剩下的孔用于检测待检样品，1:400稀释，37℃反应1h；PBST洗涤3遍后，加入工作浓度的HRP标记的兔抗鸡抗体，37℃反应1h；PBST洗涤3遍后，进行显色10min，之后加入终止液终止显色，读取OD450吸光值，OD450大于0.2的孔判为阳性。所述工作浓度优选1：50000。
本发明所述用于检测血清8型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，可以通过下述步骤得到：
(1)血清8型禽腺病毒分离:取(疑似)禽腺病毒感染的病死鸡的肝脏，研碎后按1:5的比例加入PBS制成悬液；经0.45μm微孔滤器过滤后，经尿囊腔接种8日龄SPF鸡胚，接种后收取尿囊液；尿囊液经鉴定为血清8型禽腺病毒后，－70℃保存；
(2)血清8型禽腺病毒基因组的制备：首先将血清8型禽腺病毒分离毒株病毒经细胞裂解液裂解，随后用酚、氯仿、异戊醇进行病毒基因组抽提，最后用无水乙醇沉淀，溶于30uL灭菌超纯水，即得血清8型禽腺病毒基因组，置-20℃备用；
(3)PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体以及FAdV-8病毒F蛋白基因片段：设计出扩增血清8型禽腺病毒F基因的引物以及pGEX-6p-1线性化载体的引物(表1)；以pGEX-6p-1原核表达载体DNA以及步骤(2)得到的血清 8型禽腺病毒基因组为模板，利用相应引物分别PCR扩增出线性化的pG EX-6p-1载体以及FAdV-8病毒F蛋白基因片段(即血清8型禽腺病毒F 基因的PCR产物)；
(4)pGEX-6p-1-F重组表达载体构建：利用重组酶ExnaseTM II将线性化的pGEX-6p-1 载体以及血清8型禽腺病毒F基因的PCR产物进行体外重组克隆，重组克隆经序列验证后，命名为pGEX-6p-1-F，挑取阳性克隆进行质粒制备，并进行PCR鉴定，鉴定的阳性克隆转化到BL21中进行诱导表达。
(5)原核表达质粒的表达及其产物的免疫反应性鉴定：扩增阳性克隆的BL21，并以1： 100接种于加AMP的LB培养基中，250rpm摇3h以后加入IPTG进行16℃诱导过夜，之后收集细菌，用PBS重悬后，超声破碎(40Hz，超声4s间隔8s进行破碎)，破碎完成后离心分上清和沉淀。SDS-PAGE分析破碎后的上清和沉淀，可见表达产物大部分在上清中(如图3所示)。之后利用Western-blot分析表达产物与阳性血清的反应性(如图4所示)。
(6)制备检测禽腺病毒抗体的抗原:将BL21表达的融合表达产物GST-F上清经GST标签亲和层析柱纯化后得到纤突蛋白基因F的表达蛋白，并通过 SDS-PAGE分析纯化的F蛋白表达产物(如图5所示)。
(7)检测血清8型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒：该试剂盒成分包括包被有纤突蛋白基因F表达产物的ELISA酶标板，阳性阴性对照(阳性对照为抗血清8型禽腺病毒的鸡血清，阴性对照为SPF鸡血清)，HRP标记的兔抗鸡二抗(购买所得)，样品稀释液(含0.05％Tween-20的PBST)，显色液(TMB显色液)、洗涤液(含 0.05％Tween-20的PBST)、终止液(2M硫酸)。
本发明的另一实施方案提供上述的试剂盒在血清8禽腺病毒抗体检测中的应用。
所述试剂盒检测血清8型禽腺病毒抗体的步骤及阳性判定标准如下：将阳性血清1：400 稀释后，加入A1、A2孔，将阴性血清1：400稀释后加入A3、A4孔，剩下的的孔用于检测待检样品(1：400稀释)，37℃反应1h；PBST洗涤3遍后，加入工作浓度(1：50000) 的HRP标记的兔抗鸡抗体，37℃反应1h；PBST洗涤3遍后，进行显色10min，之后加入终止液终止显色。读取OD450吸光值，OD450大于0.2的孔判为阳性。
本发明的有益效果体现在：
(1)本发明的间接ELISA试剂盒能特异性的检测出FAdV-8抗体，而与抗流感病毒(AIV) 血清、抗马立克病毒(MDV)血清、抗新城疫病毒(NDV)血清、抗鸡传染性贫血病病毒(CIAV) 血清、网状内皮细胞增生病病毒(REV)、抗血清4型禽腺病毒(FAdV-4)血清、抗减蛋综合征病毒(EDS)血清以及SPF鸡血清不反应(如图6所示)，因此，该试剂盒具有良好FAdV-8的特异性，能用于FAdV-8感染及免疫状况流行病学调查；
(2)本发明基于纤突蛋白F的间接ELISA试剂盒，与现有技术中(例如中国发明专利申请号：201710244673.5)中的六邻体蛋白的间接ELISA试剂盒比较，本发明的ELISA试剂盒能特异性检测8型禽腺病毒抗体，而与其它禽腺病毒抗体是没有交叉性的(比如与FAVd-4抗体是没有反应的)，而六邻体蛋白的间接ELISA试剂盒不能区分是8型禽腺病毒抗体还是4型禽腺病毒抗体。
附图说明
图1是本发明PCR扩增得到线性化pGEX-6p-1载体示意图(M：SuperDNAMark泳道1：线性化的pGEX-6p-1载体)。
图2是本发明PCR扩增得到FAdV-8病毒F蛋白基因片段示意图(泳道M：SuperDNAMark；泳道1：FAdV-8病毒F蛋白基因)。
图3是本发明SDS-PAGE分析GST-F的表达示意图(泳道M：蛋白Marker；泳道1：GST上清；泳道2：GST沉淀；泳道3：GST-F表达产物破碎上清；泳道4：GST-F表达产物破碎沉淀)。
图4是本发明Western-blot分析表达产物的反应性示意图(泳道M：蛋白Marker
泳道1：阴性对照GST上清；泳道2：GST-F表达产物破碎上清)。
图5是本发明SDS-PAGE分析纯化的GST-F的表达产物示意图(泳道M：蛋白Marker；泳道1:阴性对照GST上清；泳道2：未纯化GST-F的表达产物破碎上清；泳道3：纯化GST-F的表达产物)。
图6是本发明检测FAdV-8抗体的间接ELISA试剂盒特异性检测示意图。
具体实施方式
为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。
实施例1
本发明所述的间接ELISA试剂盒，可以通过下述步骤得到：
(1)FAdV-8禽腺病毒分离:
取(疑似)禽腺病毒感染的病死鸡的肝脏，研碎后用按1:5的比例加入PBST制成悬液； 5000r/min离心15min，取上清；加入青霉素和链霉素各1000IU/ml，37℃反应30min；经0.45um 微孔滤器过滤后，以0.2ml/胚的剂量，经尿囊腔接种8日龄SPF鸡胚，接种后96-120小时后收取尿囊液；尿囊液经鉴定为FAdV-8禽腺病毒后，－20℃保存。
(2)禽腺病毒基因组的制备：
取FAdV-8分离毒株病毒(血清8型禽腺病毒)上清400uL于1.5mL指形管内，加入400uL细胞裂解液(50mmol/LTris-HCl pH 8.0，20mmol/L EDTApH 8.0， 2％SDS和蛋白酶K)，充分混匀后放置56℃水浴锅作用4h；加入400uLTris平衡酚，充分混匀后10000rpm离心10min，取上清于另一1.5mL指形管；加入400uL 酚：氯仿：异戊醇，充分混匀后10000rpm离心5min，取上清于另一1.5mL指形管；加入800uL无水乙醇，颠倒混匀后放入-20℃孵育30分钟，12000rpm离心 15分钟，弃尽上清；室温自然干燥后向沉淀加入30uL灭菌超纯水和2uL RNA酶，充分溶解后，即得FAdV-8病毒基因组，置-20℃备用。
(3)PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体以及FAdV-8病毒F蛋白基因片段：
设计扩增出含pGEX-6p-1线性化载体与FAdV-8禽腺病毒F蛋白基因片段的引物：具体引物序列见表1，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
表1.PCR扩增线性化pGEX-6p-1及禽腺病毒F基因引物
分别以pGEX-6p-1载体质粒(Invitrogen公司)以及步骤(2)制备的禽腺病毒基因组为模板，表1所述相应引物为引物分别进行PCR扩增出线性化的pGEX-6p-1载体以及FAdV-8病毒F 蛋白基因片段。PCR扩增反应体系为：模板1uL，5×Buffer10uL，10mM dNTP Mix1uL，上游引物为10μmol 2uL，下游引物为10μmol 2uL，高保真酶1uL，加入灭菌超纯水至50uL。 PCR扩增反应循环参数为：95℃预变性4min，随后进行30个循环(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min)，72℃延伸10min。PCR结束后，PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳分析(如图1，图2所示)。
(4)pGEX-6p-1-F重组表达载体构建：
将以上纯化的线性化载体pGEX-6p-1以及FAdV-8病毒F蛋白基因片段PCR产物在商品化重组酶ExnaseTMⅡ的作用下进行重组克隆。重组克隆经序列验证后，命名为 pGEX-6p-1-F。具体重组反应体系如下：纯化的禽腺病毒F基因片段PCR产物50-100ng，纯化的pGEX-6p-1线性化载体50ng，2μL商品化的ExnaseTMⅡ酶，4uL 5倍的缓冲液，其它补加水至20μL。反应物于37℃作用30分钟后，置冰上5min。随后将20μL反应物转化到感受态细胞DH5α，涂LB平板。次日挑取阳性克隆株进行质粒制备，并进行PCR鉴定。鉴定的阳性克隆转化到BL21细胞中进行诱导表达。
(5)原核表达质粒的表达及其产物的免疫反应性鉴定：
扩增阳性克隆的BL21细胞，并将菌液以1：100体积比接种于加AMP的LB培养基中，250rpm摇3h以后加入IPTG进行16℃诱导过夜，之后收集细菌，用PBST重悬后，超声破碎(40Hz，超声4s间隔8s进行破碎)，破碎完成后离心分上清和沉淀，并用SDS-PAGE分析破碎后的上清和沉淀(如图3所示)，可见表达产物主要表达在上清中，之后利用 Western-blot分析表达产物与阳性血清的反应性(如图4所示)，表明本发明表达的F蛋白能与禽腺病毒8型阳性血清进行良好的免疫反应。
(6)制备检测FAdV-8抗体的抗原：
利用BL21表达的产物上清进行蛋白纯化，经谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析纯化(如图 5所示)，表明纯化效果良好。
(7)检测FAdV-8抗体的间接ELISA试剂盒组装及特性：
该试剂盒成分包括包被有血清8型禽腺病毒纤突蛋白基因F的表达蛋白的ELISA酶标板，阳性阴性对照(阳性对照为抗血清8型禽腺病毒的鸡血清，阴性对照为SPF鸡血清)，HRP标记的兔抗鸡二抗(购买所得)，样品稀释液(含0.05％Tween-20的PBST)，显色液TMB 以及洗涤液(含0.05％Tween-20的PBST)。该试剂盒检测血清8型禽腺病毒抗体的步骤及阳性判定标准如下：将阳性血清1：400稀释后，加入A1、A2孔，将阴性血清1：400稀释后加入A3、A4孔，剩下的孔用于检测待检样品，37℃反应1h；PBST洗涤3遍后，加入1： 50000稀释的HRP标记的兔抗鸡二抗，37℃反应1h；PBST洗涤3遍后，进行显色10min，之后加入终止液(2M硫酸)终止显色。读取OD450吸光值。以OD值大于0.2的孔判为阳性。试剂盒特异性试验发现，该试剂盒仅与抗FAdV-8的阳性血清反应，而抗流感病毒血清 (AIV)、抗马立克病毒血清(MDV)、抗鸡传染性贫血病病毒血清(CIV)、抗血清4型禽腺病毒血清(FAdV-4)以及SPF鸡血清均不反应(如图6所示)。
实施例2
感染样品检测效果
对接种FAdV-8的鸡群的12份血清与接种FAdV-4的鸡群的12份血清进行了检测。如表2所示，来自感染FAdV-8的鸡的12份血清样品均为ELISA阳性，OD值介于0.2291-1.4557之间，均大于0.2。而来自感染FAdV-4的12份血清样品均为ELISA阴性，OD值介于 0.0731-0.1088之间，均小于0.2。以上检测结果再次证明，本发明基于纤突蛋白F的检测血清8型禽腺病毒抗体的ELISA试剂盒具有良好的特异性及应用前景。
表2.ELISA试剂盒对感染FAdV-8的血清检测效果
与现有技术中(例如中国发明专利申请号：201710244673.5)中的六邻体蛋白的间接 ELISA试剂盒比较，本发明的ELISA试剂盒能特异性检测8型禽腺病毒抗体，而与其它禽腺病毒抗体是没有交叉性的(比如与FAVd-4抗体是没有反应的)，而六邻体蛋白的间接ELISA 试剂盒不能区分是8型禽腺病毒抗体还是4型禽腺病毒抗体。

Claims (10)

1.一种血清8型禽腺病毒纤突蛋白基因F的表达蛋白，其特征在于所述表达蛋白的制备方法包括如下步骤：
（1）利用重组酶ExnaseTM II将pGEX-6p-1线性化载体与血清8型禽腺病毒F基因的PCR产物进行重组克隆，重组克隆经序列验证后，命名为pGEX-6p-1-F，挑取阳性克隆进行质粒制备，并进行PCR鉴定；
（2）将步骤（1）中PCR鉴定的阳性克隆转化到BL21细胞中，并将菌液以1：100体积比接种于加AMP的LB培养基中，250rpm摇3h后，加入IPTG于16℃下进行诱导表达过夜，收集细菌，用PBS重悬后，超声破碎，离心分上清和沉淀；
（3）将步骤（2）中得到的上清经GST亲和层析柱纯化后得到所述血清8型禽腺病毒纤突蛋白基因F的表达蛋白。
2.权利要求1所述的血清8型禽腺病毒纤突蛋白基因F的表达蛋白在制备检测血清8型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒中的应用。
3.一种用于检测血清8型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括包被有权利要求1所述表达蛋白的ELISA酶标板。
4.权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还任选包括阳性对照、阴性对照，HRP标记的兔抗鸡二抗，稀释液、显色液、洗涤液、终止液中的一种或几种。
5.权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为抗血清8型禽腺病毒的鸡血清，阴性对照为SPF鸡血清。
6.权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液或洗涤液均为含0.05%Tween-20的PBST。
7.权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述显色液是指TMB显色液。
8.权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述终止液为2M硫酸。
9.权利要求4-8任一项所述的试剂盒在血清8禽腺病毒抗体检测中的应用。
10.权利要求9所述的应用，其特征在于，所述试剂盒检测血清8型禽腺病毒抗体的步骤及阳性判定标准如下：将阳性血清1：400稀释后，加入A1、A2孔，将阴性血清1：400稀释后加入A3、A4孔，剩下的孔用于检测待检样品，1:400稀释， 37℃反应1h；PBST洗涤3遍后，加入工作浓度的HRP标记的兔抗鸡二抗，37℃反应1h；PBST洗涤3遍后，进行显色10min，之后加入终止液终止显色，读取OD450吸光值，OD450大于0.2的孔判为阳性。
CN201711372077.1A 2017-12-19 2017-12-19 一种基于纤突蛋白f的检测血清8型禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒 Active CN108107208B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711372077.1A CN108107208B (zh) 2017-12-19 2017-12-19 一种基于纤突蛋白f的检测血清8型禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711372077.1A CN108107208B (zh) 2017-12-19 2017-12-19 一种基于纤突蛋白f的检测血清8型禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108107208A true CN108107208A (zh) 2018-06-01
CN108107208B CN108107208B (zh) 2020-03-06

Family

ID=62210129

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711372077.1A Active CN108107208B (zh) 2017-12-19 2017-12-19 一种基于纤突蛋白f的检测血清8型禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108107208B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109824766A (zh) * 2019-02-28 2019-05-31 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种利用Fiber2蛋白检测禽腺病毒4型抗体的间接ELISA检测试剂盒
CN110499296A (zh) * 2019-08-28 2019-11-26 扬州大学 一种耐热的血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗候选株及其构建方法
CN110607285A (zh) * 2019-08-28 2019-12-24 扬州大学 一种耐热的血清4型禽腺病毒基因工程疫苗候选株及其构建方法
CN110850084A (zh) * 2019-12-09 2020-02-28 天津渤海农牧产业联合研究院有限公司 用于血清4型i群禽腺病毒分型鉴定的多肽序列及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106084063A (zh) * 2016-05-26 2016-11-09 吉林大学 一种新型基因工程重组trail融合蛋白及制备方法和用途
CN106443015A (zh) * 2016-09-21 2017-02-22 扬州大学 一种基于hexon蛋白N端保守区的检测禽腺病毒抗体的ELISA试剂盒
CN106771260A (zh) * 2017-03-31 2017-05-31 中国农业大学 检测血清4型禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒及其检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106084063A (zh) * 2016-05-26 2016-11-09 吉林大学 一种新型基因工程重组trail融合蛋白及制备方法和用途
CN106443015A (zh) * 2016-09-21 2017-02-22 扬州大学 一种基于hexon蛋白N端保守区的检测禽腺病毒抗体的ELISA试剂盒
CN106771260A (zh) * 2017-03-31 2017-05-31 中国农业大学 检测血清4型禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒及其检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ASHISH GUPTA ET AL.: "Immunogenicity and protective efficacy of virus-like particles and recombinant fiber proteins in broiler-breeder vaccination against fowl adenovirus (FAdV)-8b", 《VACCINE》 *
HELENA GRGIC ET AL.: "Comparison of fiber gene sequences of inclusion body hepatitis (IBH) and non-IBH strains of serotype 8 and 11 fowl adenoviruses", 《VIRUS GENES》 *
牛登云等: "2015年我国Ⅰ群禽腺病毒分子流行病学调查", 《中国家禽》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109824766A (zh) * 2019-02-28 2019-05-31 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种利用Fiber2蛋白检测禽腺病毒4型抗体的间接ELISA检测试剂盒
CN110499296A (zh) * 2019-08-28 2019-11-26 扬州大学 一种耐热的血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗候选株及其构建方法
CN110607285A (zh) * 2019-08-28 2019-12-24 扬州大学 一种耐热的血清4型禽腺病毒基因工程疫苗候选株及其构建方法
CN110850084A (zh) * 2019-12-09 2020-02-28 天津渤海农牧产业联合研究院有限公司 用于血清4型i群禽腺病毒分型鉴定的多肽序列及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN108107208B (zh) 2020-03-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107607717A (zh) 基于f2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒
CN111239394B (zh) 一种基于混合抗原快速检测新型冠状病毒抗体试剂盒
CN108107208A (zh) 一种基于纤突蛋白f的检测血清8型禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒
CN103539842A (zh) 草鱼呼肠孤病毒ⅱ型s10基因编码的重组蛋白、由其制备的多克隆抗体及应用
CN105973854B (zh) 一种基于f2蛋白的检测4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试剂盒
CN103898203B (zh) 微小隐孢子虫的检测方法及检测试剂盒
CN103487582A (zh) 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体竞争 AlphaLISA检测试剂盒及其方法
CN104181297B (zh) 一种检测羊伪狂犬病毒抗体的elisa试剂盒
CN107056898A (zh) 鲤疱疹病毒3型1301株orf136基因重组表达蛋白、抗体及其应用
CN106442981B (zh) 一种人博卡病毒1型抗体间接elisa诊断试剂盒
Wu et al. Serologic detection of duck enteritis virus using an indirect ELISA based on recombinant UL55 protein
CN106443015A (zh) 一种基于hexon蛋白N端保守区的检测禽腺病毒抗体的ELISA试剂盒
CN113956362A (zh) 一种重组猫细小病毒vp2蛋白抗原及其在抗体诊断和疫苗制备中的应用
CN106866796A (zh) 草鱼呼肠孤病毒ⅱ型s9基因编码的重组蛋白及其应用
CN102680699B (zh) 鉴别i群禽腺病毒感染的elisa检测方法
CN103499693A (zh) 猪瘟病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒及检测方法
CN106018780B (zh) 一种基于f1蛋白的检测4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试剂盒
CN103499689A (zh) 猪圆环病毒2型病毒抗体竞争 AlphaLISA检测试剂盒及检测方法
CN107860921A (zh) 伪狂犬病毒抗体快速定量检测卡及使用方法
CN104569387B (zh) 一种ELISA检测人血清HCMV pp150 IgM抗体试剂盒
CN107356754A (zh) 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2表达及其ELISA试剂盒
CN114778852B (zh) 一种检测prrsv plp2抗体的间接elisa方法
Brakke et al. Wheat streak mosaic virus cylindrical inclusion body protein
Vaniksampanna et al. Enhancement and confirmation of white spot syndrome virus detection using monoclonal antibody specific to VP 26
CN111208302B (zh) 利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫o型抗体的化学发光检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant