CN108456245A

CN108456245A - 一种Hexon蛋白及其制备方法、单克隆抗体与试剂盒

Info

Publication number: CN108456245A
Application number: CN201711464880.8A
Authority: CN
Inventors: 任广彩; 王瀚; 闫圆圆; 黄妙容; 詹烜子; 陈瑞爱
Original assignee: Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-12-28
Filing date: 2017-12-28
Publication date: 2018-08-28

Abstract

本发明公开一种Hexon蛋白，所述Hexon蛋白是由重组载体转化大肠杆菌诱导获得的，所述重组载体包括经大肠杆菌偏爱密码子优化的hexon基因序列。本发明同时还提供该Hexon蛋白的制备方法、以及由该Hexon蛋白获得的单克隆抗体与试剂盒。本发明提供的Hexon蛋白的表达量高。

Description

一种Hexon蛋白及其制备方法、单克隆抗体与试剂盒

技术领域

本发明涉及一种Hexon蛋白及其制备方法、单克隆抗体与试剂盒。属于技术免疫学领域。

背景技术

腺病毒科根据形态结构、免疫学特性和宿主范围分为哺乳动物腺病毒属、禽腺病毒属、腺胸腺病毒属和唾液酸酶病毒属。禽腺病毒属根据抗原性的不同，分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个亚群。Ⅰ群腺病毒分A、B、 C、D、E五个基因型(种)，12个血清型。

I群血清4型禽腺病毒可引起鸡心包积液肝炎综合征，是侵害鸡的一种急性传染病，主要病变为心包腔有清亮或淡黄色的水样或果冻状液体，肝脏肿大、局部坏死或褪色甚至有出现包涵体，可通过水平传播或垂直传播，发病率和致死率很高。1987年巴基斯坦首次报道了由I群血清4型禽腺病毒引起的心包积液肝炎综合征，2012年在我国出现，至2014年己形成大面积流行，2015-2016年已传播至全国。目前该病在我国鸡群中的发病率较高，且呈逐渐上升趋势。感染宿主的范围也越来越广，白羽肉鸡、三黄鸡、土鸡、种鸡、蛋鸡、种鸭均可感染发病。发病死亡情况因地区、品种而异，给我们畜牧业造成了很大经济损失。因此建立检测I群血清4型禽腺病毒的方法非常重要。

禽腺病毒为无囊膜的裸体病毒，近球形，直径约70～90nm。电镜观察，其形态为正20面体，衣壳由252个中空壳粒构成，其中有12个五邻体(penton)分别位于该病毒12个顶上，240个六邻体 (hexon)分别位于20个三角面和30条棱上。其中Hexon是主要的结构蛋白，含有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇，是中和抗体的靶目标和主要保护性抗原基因。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种表达量更高的Hexon蛋白。

本发明的目的之二在于提供该Hexon蛋白的制备方法。

本发明的目的之三在于提供由该Hexon蛋白免疫小鼠获得的单克隆抗体。

本发明的目的之四在于提供由包含该Hexon蛋白的试剂盒。

实现本发明的目的之一可以通过采取如下技术方案达到：

一种Hexon蛋白，所述Hexon蛋白是由重组载体转化大肠杆菌诱导获得的，所述重组载体包括经大肠杆菌偏爱密码子优化的hexon 基因序列。

进一步地，所述优化的hexon基因序列如SEQ ID No.1所示。

进一步地，所述重组载体的载体为pET-30a(+)载体。

进一步地，所述优化的hexon基因序列通过Ndel/Xhol酶切位点构建至pET-30a(+)载体。

实现本发明的目的之二可以通过采取如下技术方案达到：

一种Hexon蛋白的制备方法，包括：

基因优化步骤：对hexon基因序列进行大肠杆菌偏爱密码子优化，得到优化的hexon基因序列；

制备载体步骤：将基因优化步骤基因优化步骤得到的优化的 hexon基因序列克隆到pET-30a(+)载体上，得到重组载体 pET-30a-hexon；

诱导表达步骤：重组载体pET-30a-hexon转化大肠杆菌，经IPTG 于15℃诱导获得Hexon蛋白。

进一步地，基因优化步骤中，优化的hexon基因序列的序列如 SEQ ID No.1所示。

进一步地，制备载体步骤中，将优化的hexon基因序列克隆到 pET-30a(+)载体中的Ndel/Xhol酶切位点。

进一步地，诱导表达步骤后还包括Hexon蛋白的纯化步骤：将诱导表达步骤诱导获得的菌体用裂解液重悬后进行超声处理，离心收集沉淀，用尿素进行溶解；用0.22μm的滤菌膜进行过滤除菌。

实现本发明的目的之三可以通过采取如下技术方案达到：

进一步地，由上述的Hexon蛋白免疫小鼠获得。

实现本发明的目的之四可以通过采取如下技术方案达到：

一种试剂盒，包含上述的Hexon蛋白。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1)本发明提供的hexon基因序列，采用化学合成的方式，与传统组织提取DNA或RNA获得目的基因的方法相比，基因合成无需模板，因而不受基因来源限制，更经济、简便、省时省力。

2)本发明提供的Hexon蛋白的制备方法，采用针对表达菌种进行密码子优化，优化的Hexon基因序列与载体的融合度高，hexon 基因序列的活性高；

3)本发明提供的单克隆抗体和试剂盒，能准确的检测出I群血清4型禽腺病毒，为诊断和预防禽腺病毒感染提供了有利条件。

附图说明

图1为重组载体pET-30a-hexon的载体图谱；

图2为pET-30a-hexon质粒酶切电泳图谱，

泳道1为pET-30a-hexon质粒；

泳道2为pET-30a-hexon质粒MluI酶切；

泳道M为KB Ladder。

图3为Hexon蛋白SDS-PAGE电泳图谱；

泳道M为蛋白marker；

泳道1为BSA(5.00μg)；

泳道2为Hexon蛋白(4.85μg)；

图4为Western Blot鉴定Hexon蛋白；

泳道M为120Ka蛋白marker；

泳道1为hexon蛋白。

图5为BCA蛋白定量方法的标准曲线。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

以下具体实施方式中，如未特殊说明，所获得的病毒、采用的试剂均可通过常规的试验手段或市售的方式获得。

实施例1：

一种Hexon蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1)基因优化：根据本实验室自行采集和分离获得的I群血清4 型禽腺病毒，进行全基因测序，得到hexon基因序列；对hexon基因序列进行大肠杆菌偏爱密码子优化，得到优化的hexon基因序列；优化的hexon基因序列如SEQ ID NO.1所示；

2)制备载体：将基因优化步骤得到的优化的hexon基因序列克隆到pET-30a(+)载体中的Ndel/Xhol酶切位点，得到重组载体 pET-30a-hexon；重组载体pET-30a-hexon的结构如图1所示；

3)诱导表达：将重组载体pET-30a-hexon转化大肠杆菌BL21(DE3) 中，用卡那霉素LB平板筛选，获得阳性菌株，挑取阳性菌落接种卡那霉素LB培养液，震荡培养至少12h，然后经扩大培养。当37℃， 200rpm培养至OD₆₀₀＝1.2时加入0.8mM的IPTG，15℃诱导16h，离心收集菌体，该菌体中含有Hexon蛋白。

实施例2：

一种重组载体pET-30a-hexon的鉴定方法，包括以下步骤：

将实施例1的制备载体步骤得到的重组载体pET-30a-hexon在 37℃恒温箱中用MluI内切酶酶切40min。酶切体系为：pET-30a-hexon 质粒(300ng)，10×M buffer(TAKARA)2μL，MluI限制性内切酶 (TAKARA)1μL，ddH₂O补足至20μL。酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。

本实施例设计上游引物如SEQ ID No.2所示，下游引物如SEQ ID No.3所示；

上游引物：5-atggctgcactaactccaga-3；

下游引物：5-ggtgttggtggtatacagtt-3；

进行目的片段PCR扩增，扩增体系为ddH₂O 8μL，pcrmix (TAKARA)10μL，pET-30a-hexon质粒(100ng/μL)1μL，上游引物(20nM)0.5μL,下游引物(20nM)0.5μL。PCR反应程序为： 95℃预变性5min，1个循环；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸10min，1个循环。PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

实施例3：

一种Hexon蛋白的纯化方法，包括以下步骤：

将实施例1的诱导表达步骤诱导获得的菌体用裂解液重悬后进行超声处理，离心收集沉淀，用尿素进行溶解；用0.22μm的滤菌膜进行过滤除菌，得到纯化的Hexon蛋白。利用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白分子量和纯度鉴定，结果如图3和图4所示。经分析，Hexon蛋白纯度大约为90％，分子量为45kDa左右，与根据SEQ ID No.4的氨基酸序列预期的蛋白分子量45296.9Da相符。用BCA蛋白定量方法进行定量检测Hexon蛋白浓度，BCA蛋白定量方法的标准曲线如图5所示，Hexon蛋白在OD₅₆₀处的吸光值为0.311，经计算 Hexon蛋白浓度为1.1mg/mL。

实施例4：

一种基于Hexon蛋白的单克隆抗体的制备方法，分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株的获得方法包括以下步骤：

1)动物免疫

将实施例3)得到的纯化的Hexon蛋白与等量佐剂(一免为弗氏完全佐剂，二免为弗氏不完全佐剂)混匀后，按100g/只抗原量腹腔注射免疫BALB/c小鼠,初次免疫后每隔14天进行第二次免疫；同样间隔14天进行第3次免疫，细胞融合前3-5天加强免疫一次。

2)细胞融合

无菌取免疫BALB/c小鼠脾脏，制备免疫脾细胞,与对数生长期的 SP2/0细胞融合,将HAT选择培养液加入到细胞融合物,悬浮细胞,分配到已有饲养细胞的96孔细胞培养板,置于37℃、5％CO₂的温箱中培养。

3)杂交瘤细胞的筛选

用实施例3所获得的纯化Hexon蛋白抗原包被96孔板，采用方阵滴定法来确定间接ELISA检测方法的抗原包被最适稀释度和血清稀释度。用间接ELISA方法检测融合细胞培养上清液，同时设立空白对照及SP2/0上清对照。

4)杂交瘤细胞的克隆化

选择2-3次检测为阳性的杂交瘤细胞孔，用有限稀释法连续克隆，将克隆化的杂交瘤细胞扩大培养，得到杂交瘤细胞株，液氮冻存。

性能检测与效果评价

1.稳定性评价

将实施例4获得的杂交瘤细胞株进行连续传代培养、液氮冻存与复苏实验，用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清液中的抗体效价。如表1所示，所获得的10株杂交瘤细胞株能稳定分泌抗I群血清4型禽腺病毒Hexon蛋白的单克隆抗体。

将杂交瘤细胞株在不完全1640培养液中培养7d，待杂交瘤细胞全部死亡，按照ThermoScientific公司单克隆抗体亚类鉴定试剂盒说明书的操作对杂交瘤细胞分泌上清液进行亚类鉴定，鉴定结果如表 1所示。

经实施例4我们获得了10株分泌抗I群血清4型禽腺病毒Hexon 蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，即基于Hexon蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

表1细胞上清间接ELISA鉴定结果

注：包被抗原A为Hexon蛋白，包被抗原B为his-tag蛋白。

由上表可知，以上10株杂交瘤细胞株获得了IgG2a,K，IgG2b,K 两种抗体亚型的单克隆抗体。

2.单克隆抗体特异性鉴定

分别用I群血清4型禽腺病毒、新城疫病毒、马立克病毒、传染性支气管炎病毒、、禽流感病毒等包被96孔检测板,用间接ELISA方法鉴定所制备单克隆抗体的反应特异性。结果如表2所示。

表2单克隆抗体特异性鉴定

样品	P/N值	结果判定
			I群血清4型禽腺病毒	2.57	反应
新城疫病毒	0.75	不反应
			马立克病毒	1.02	不反应
传染性支气管炎病毒	1.36	不反应
			禽流感病毒	1.26	不反应

3.诱生腹水

选取6-8周龄雌性小鼠，腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，一周后腹腔注射杂交瘤细胞2A10E9，待小鼠腹部明显增大、触摸有紧张感时抽取腹水，离心取上清液，并进行纯化。利用间接ELISA测定抗体效价，结果如表3所示。

表3杂交瘤细胞2A10E9的抗体效价

注：包被抗原A为Hexon蛋白，包被抗原B为his-tag蛋白。

由表3可知，杂交瘤细胞2A10E9的抗体效价可达到1:5×10⁵。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 肇庆大华农生物药品有限公司

<120> 一种Hexon蛋白及其制备方法、单克隆抗体与试剂盒

<130> 肇庆大华农生物药品有限公司

<141> 2017-12-28

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1200

<212> DNA

<213> 优化后hexon序列()

<400> 1

atggctgcac taactccaga tttaacaact gctacaccca ggctacaata ttttcacatt 60

gcgggcccgg gcacccgtga gtatctgagc gaggatctgc agcaattcat cagcgcgacc 120

ggtagctatt tcgacctgaa gaacaaattt cgtcagaccg tggttgcgcc gacccgtaac 180

gttaccaccg aaaaggcgca gcgtctgcaa atccgttttt acccgattca aaccgacgat 240

accagcaccg gttatcgtgt gcgttacaac attaacgttg gtgacggctg ggtgctggat 300

atgggcagca cctatttcga catcaagggt attctggatc gtggcccgag ctttaaaccg 360

tattgcggta ccgcgtacaa cccgctggcg ccgaaagaga gcatgttcaa caactggagc 420

gaaaccgcgc cgggtcagaa cgttagcgcg agcggccaac tgagcaacgt gtacaccaac 480

accagcacca gcaaggatac caccgcggcg caggttacca aaatcagcgg cgtgtttccg 540

aacccgaacc aaggtccggg tcgtaacccg ctgcgtcgtg ttcaaaacgc gaacaccggt 600

gtgctgggcc gttttgcgaa gagccaatac aactatgcgt acggtgcgta cgttaaaccg 660

gtggcggcgg atggcagcca gagcctgacc caaaccccgt attggattat ggacaacacc 720

ggtaccaact acctgggcgc ggttgcggtg gaggactata ccaacagcct gagctatccg 780

gataccattg tggtgccgcc gccggaagac tatgacgact acaacattgg taccacccgt 840

gcgctgcgtc cgaactatat cggcttccgt gataacttta ttaacctgct gtaccacgac 900

agcggtgttt gcagcggcac cctgaacagc gagcgtagcg gtatgaacgt ggttgtggag 960

ctgccggatc gtaacaccga actgagctat cagtacatgc tggcggacat gatgagccgt 1020

caccactatt ttgcgctgtg gaaccaggcg gttgaccaat acgatccgga agtgcgtgtg 1080

ttcagcaacg acggttatga ggaaggcgcg ccgagctacg cgtttaaccc ggaagcggtg 1140

ggcgcgggcg agggttacgg tccggatctg agccaaatca aactgtatac caacaacacc 1200

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atggctgcac taactccaga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ggtgttggtg gtatacagtt 20

<210> 4

<211> 406

<212> PRT

<213> Hexon蛋白氨基酸序列()

<400> 4

Met Ala Ala Leu Thr Pro Asp Leu Thr Thr Ala Thr Pro Arg Leu Gln

1 5 10 15

Tyr Phe His Ile Ala Gly Pro Gly Thr Arg Glu Tyr Leu Ser Glu Asp

20 25 30

Leu Gln Gln Phe Ile Ser Ala Thr Gly Ser Tyr Phe Asp Leu Lys Asn

35 40 45

Lys Phe Arg Gln Thr Val Val Ala Pro Thr Arg Asn Val Thr Thr Glu

50 55 60

Lys Ala Gln Arg Leu Gln Ile Arg Phe Tyr Pro Ile Gln Thr Asp Asp

65 70 75 80

Thr Ser Thr Gly Tyr Arg Val Arg Tyr Asn Ile Asn Val Gly Asp Gly

85 90 95

Trp Val Leu Asp Met Gly Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Lys Gly Ile Leu

100 105 110

Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Cys Gly Thr Ala Tyr Asn Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Lys Glu Ser Met Phe Asn Asn Trp Ser Glu Thr Ala Pro

130 135 140

Gly Gln Asn Val Ser Ala Ser Gly Gln Leu Ser Asn Val Tyr Thr Asn

145 150 155 160

Thr Ser Thr Ser Lys Asp Thr Thr Ala Ala Gln Val Thr Lys Ile Ser

165 170 175

Gly Val Phe Pro Asn Pro Asn Gln Gly Pro Gly Arg Asn Pro Leu Arg

180 185 190

Arg Val Gln Asn Ala Asn Thr Gly Val Leu Gly Arg Phe Ala Lys Ser

195 200 205

Gln Tyr Asn Tyr Ala Tyr Gly Ala Tyr Val Lys Pro Val Ala Ala Asp

210 215 220

Gly Ser Gln Ser Leu Thr Gln Thr Pro Tyr Trp Ile Met Asp Asn Thr

225 230 235 240

Gly Thr Asn Tyr Leu Gly Ala Val Ala Val Glu Asp Tyr Thr Asn Ser

245 250 255

Leu Ser Tyr Pro Asp Thr Ile Val Val Pro Pro Pro Glu Asp Tyr Asp

260 265 270

Asp Tyr Asn Ile Gly Thr Thr Arg Ala Leu Arg Pro Asn Tyr Ile Gly

275 280 285

Phe Arg Asp Asn Phe Ile Asn Leu Leu Tyr His Asp Ser Gly Val Cys

290 295 300

Ser Gly Thr Leu Asn Ser Glu Arg Ser Gly Met Asn Val Val Val Glu

305 310 315 320

Leu Pro Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Tyr Met Leu Ala Asp

325 330 335

Met Met Ser Arg His His Tyr Phe Ala Leu Trp Asn Gln Ala Val Asp

340 345 350

Gln Tyr Asp Pro Glu Val Arg Val Phe Ser Asn Asp Gly Tyr Glu Glu

355 360 365

Gly Ala Pro Ser Tyr Ala Phe Asn Pro Glu Ala Val Gly Ala Gly Glu

370 375 380

Gly Tyr Gly Pro Asp Leu Ser Gln Ile Lys Leu Tyr Thr Asn Asn Thr

385 390 395 400

His His His His His His

405

Claims

1.一种Hexon蛋白，其特征在于，所述Hexon蛋白是由重组载体转化大肠杆菌诱导获得的，所述重组载体包括经大肠杆菌偏爱密码子优化的hexon基因序列。

2.如权利要求1所述的Hexon蛋白，其特征在于，所述优化的hexon基因序列如SEQ IDNo.1所示。

3.如权利要求1所述的Hexon蛋白，其特征在于，所述重组载体的载体为pET-30a(+)载体。

4.如权利要求1所述的Hexon蛋白，其特征在于，所述优化的hexon基因序列通过Ndel/Xhol酶切位点构建至pET-30a(+)载体。

5.一种Hexon蛋白的制备方法，其特征在于，包括：

制备载体步骤：将基因优化步骤得到的优化的hexon基因序列克隆到pET-30a(+)载体上，得到重组载体pET-30a-hexon；

诱导表达步骤：重组载体pET-30a-hexon转化大肠杆菌，经IPTG于15℃诱导获得Hexon蛋白。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，基因优化步骤中，优化的hexon基因序列的序列如SEQ ID No.1所示。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，制备载体步骤中，将优化的hexon基因序列克隆到pET-30a(+)载体中的Ndel/Xhol酶切位点。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，诱导表达步骤后还包括Hexon蛋白的纯化步骤：将诱导表达步骤诱导获得的菌体用裂解液重悬后进行超声处理，离心收集沉淀，用尿素进行溶解；用0.22μm的滤菌膜进行过滤除菌。

9.一种单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1-4任一项所述的Hexon蛋白免疫小鼠获得。

10.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-8任一项所述的Hexon蛋白。