CN112142830B

CN112142830B - 一种重组禽腺病毒4型fiber2蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112142830B
Application number: CN202010985212.5A
Authority: CN
Inventors: 荣俊; 胡基雄; 李国攀; 王席; 匡红艳
Original assignee: Jingzhou Changxin Biotechnology Co ltd; Yangtze University
Current assignee: Jingzhou Changxin Biotechnology Co ltd; Yangtze University
Priority date: 2020-09-18
Filing date: 2020-09-18
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2040-09-18
Also published as: CN112142830A

Abstract

本发明公开了一种重组禽腺病毒4型(FAdV‑4)fiber2蛋白及其制备方法和应用，属于基因工程技术领域，其中所述重组蛋白为禽腺病毒4型fiber2蛋白去除了N端274个氨基酸残基后与禽腺病毒4型hexon蛋白第21‑55位氨基酸序列重组得到的蛋白，可用于制备禽腺病毒4型基因工程亚单位疫苗。本发明针对原核表达天然fiber2蛋白溶解性和免疫原性差的缺陷，对fiber2蛋白编码基因进行了系列改造，通过去除fiber2蛋白N端274个氨基酸残基的基因编码序列，并融合hexon蛋白的两个重要抗原表位的基因编码序列，使重组蛋白相比于改造前的fiber2蛋白，溶解性能和免疫原性均显著提高，因此可用于制备成一种品质可控，安全有效，能够预防高致病性FAdV‑4病毒感染的亚单位疫苗，免疫一次即可获得完全保护。

Description

一种重组禽腺病毒4型fiber2蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组禽腺病毒4型fiber2蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

禽腺病毒(FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，根据群特异性抗原的不同分为3个群：Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群，其中I群禽腺病毒有5个属(FAdV-A,B,C,D,E)和12个血清型(FAdV-1,2,3,4,5,6,7,8a,8b,9,10，11)。它们具有共同的群抗原。禽腺病毒血清4型(FAdV-4)是引发心包积液综合征(HHS)的病原。该病是家禽养殖业的主要传染病之一，以心包积液和包涵体肝炎为特征。禽腺病毒感染事件，于1963年首次在美国发生，随后扩散至世界各地。FAdV感染一般引起亚临床症状，而急性感染会引发肌胃糜烂、心包积液及包涵体肝炎、再生障碍性贫血、呼吸道感染等，给养鸡业造成较大损失。2015年以来，FAdV感染鸡群在多国爆发，而发病鸡除3～4周龄的肉鸡外，10～20周龄的蛋鸡也可被FAdV感染。目前高致病性血清4型FAdV在鸡群中流行最广泛，致病性也最强，给养鸡业造成了最为严重的经济损失。

禽腺病毒(FAdV)是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，呈二十面体结构。FAdV的结构蛋白主要有：六邻体(Hexon)、五邻体(Penton)和位于五邻体上的纤维突起(Fiber)三种蛋白。每个五邻体上有2个纤突蛋白，其中，FAdV-A和FAdV-C由2个不同的纤突蛋白基因编码，分别称为fiber-1和fiber-2；FAdV-B,FAdV-D和FAdV-E的2个纤突蛋白只有一个纤突蛋白编码基因。纤突蛋白带有亚群特异性和型特异性抗原表位。

由于高致病性血清4型FAdV对养鸡业造成的巨大危害，许多研究者致力于开发能保护鸡群免于感染FAdV-4的疫苗。其中亚单位疫苗没有全病毒灭活疫苗可能造成感染扩散流行的风险，是所有疫苗中最安全的疫苗种类，同时生产成本较低，是疫苗研究的最佳方向。FAdV-4的六邻体、五邻体和纤突蛋白都可做为亚单位疫苗潜在的抗原蛋白。现有技术如专利CN108918869A公开了fiber2蛋白及其重组蛋白在检测血清4型禽腺病毒抗体方面的应用，然而未经改造的fiber2蛋白用原核细胞表达为不可溶蛋白，很难将其直接制成疫苗，且产品品质不可控，免疫原性相对较差，导致免疫效果差，使用后仍存在感染风险。

发明内容

本发明针对现有技术存在的缺陷，提供了一种重组禽腺病毒4型fiber2蛋白，通过去除fiber2蛋白N端274个氨基酸残基的基因编码序列，并融合hexon蛋白中包含有2个重要抗原表位的基因编码序列融合，从而制成了一种安全有效，能够预防高致病性FAdV-4病毒感染的基因工程亚单位疫苗。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种重组禽腺病毒4型fiber2蛋白，所述重组蛋白为禽腺病毒4型fiber2蛋白去除了N端274个氨基酸残基后与禽腺病毒4型hexon蛋白第21-55位氨基酸序列重组得到的蛋白，其中所述禽腺病毒4型fiber2蛋白对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述禽腺病毒4型hexon蛋白第21-55位氨基酸序列所对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步的，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种编码上述重组禽腺病毒4型fiber2蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种载体，所述载体中包含如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种工程菌，所述工程菌包含上述载体。

本发明还提供了一种上述重组禽腺病毒4型fiber2蛋白的制备方法，所述方法包括：

步骤1、克隆禽腺病毒4型fiber2蛋白编码基因，并封闭禽腺病毒4型fiber2蛋白编码基因中的NcoⅠ限制性内切酶位点；

步骤2、在禽腺病毒4型fiber2蛋白基因的5′端剪切274个氨基酸残基的核苷酸编码序列，并分别与禽腺病毒4型hexon蛋白第41-55位氨基酸编码序列和第21-40位氨基酸编码序列融合；

步骤3、诱导融合后的基因表达并纯化表达蛋白，即得所述重组禽腺病毒4型fiber2蛋白。

进一步的，步骤1中通过两次重叠PCR的方法封闭禽腺病毒4型fiber2蛋白编码基因中的NcoⅠ限制性内切酶位点，所述重叠PCR中使用的引物如SEQ ID NO.5-12所示。

进一步的，步骤2中先利用如SEQ ID NO.13-14所示的引物进行fiber2蛋白基因的5′端剪切以及与禽腺病毒4型hexon蛋白第41-55位氨基酸编码序列融合，然后利用SEQ IDNO.15-16所示的引物继续与禽腺病毒4型hexon蛋白第21-40位氨基酸编码序列融合。

本发明还提供了上述重组禽腺病毒4型fiber2蛋白在制备禽腺病毒4型基因工程亚单位疫苗中的应用。

本发明还提供了一种禽腺病毒4型基因工程亚单位疫苗，所述疫苗中包含上述重组禽腺病毒4型fiber2蛋白

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过删除掉禽腺病毒4型fiber2蛋白基因5′端274组氨基酸残基的基因编码序列，并在该基因上游分别依次融合了禽腺病毒4型hexon蛋白中包含2个重要抗原表位的第41-55位和第21-40位氨基酸的基因编码序列，原核表达后得到重组蛋白，该重组蛋白相比于改造前的天然fiber2蛋白，溶解性能和免疫原性均显著提高，因此可用于制备成一种品质可控，安全有效，能够预防高致病性FAdV-4病毒感染的亚单位疫苗，利用该疫苗进行一次免疫，即能获得完全保护，不会再有感染风险。

附图说明

图1为本发明实施例1中表达工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a FAdV 4fiber2的SDS-PAGE电泳检测结果图，其中泳道1为E.coli BL21(DE3)/pET28a FAdV 4 fiber2破菌后的全菌液；泳道2为E.coli BL21(DE3)/pET28a FAdV 4fiber2破菌离心后的上清液；泳道3为不含目的片段的空白对照E.coli BL21(DE3)/pET28a破菌离心后的上清液；泳道4为Marker；

图2为本发明实施例2中表达工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a FAdV Nd274fiber2 M3的SDS-PAGE电泳检测结果图，其中泳道1为不含目的片段的空白对照E.coliBL21(DE3)/pET28a，泳道2为Marker，泳道3为离心前FAdV Nd274 fiber2 M3表达蛋白全菌液，泳道4为离心后FAdV Nd274 fiber2 M3表达蛋白上清液；

图3为本发明实施例2中FAdV 4Nd274 fiber2 M3蛋白纯化后的SDS--PAGE电泳图，其中泳道1为不含目的片段的空白对照E.coli BL21(DE3)/pET28a，泳道2为Marker，泳道3为纯化前的FAdV Nd274 fiber2 M3表达蛋白经破菌离心后的上清液，泳道4为纯化后得到的FAdV 4Nd274 fiber2 M3纯化蛋白。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1重组禽腺病毒4型fiber2蛋白的制备

一、FAdV-4fiber2蛋白编码基因克隆和测序

从感染FAdV血清4型的鸡肝组织中提取总DNA，使用Fiber 2PF/Fiber 2PR引物(SEQ ID NO.17-18)，以总DNA为模板，通过PCR扩增fiber2基因，该基因长度为1440bp。

其中用于扩增fiber2基因的引物序列如下：

Fiber 2PF：GAGCTCATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAGAC

Fiber 2PR：AAGCTTTTACGGGAGGGAGGCCGCTGGACAGCT

(Fiber 2PF中的下划线部分为SacⅠ限制性内切酶的酶切位点，Fiber 2PR中的下划线部分为HindⅢ限制性内切酶的酶切位点)

扩增体系(20μL)为：

PCR结束后通过琼脂糖凝胶电泳回收目的基因片段，然后进行TA克隆，其中TA克隆的体系具体为：

将TA克隆后得到的载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，42℃热激30s。转化菌经过PCR鉴定后提取质粒DNA(命名为pTOPO-T fiber2)并送至上海生物工程有限公司进行测序，测序得到的序列如SEQ ID NO.3所示。

二、FAdV-4fiber 2基因的原核表达工程菌的构建

提取质粒pTOPO-T fiber2的DNA，用SacⅠ/HindⅢ进行双酶切，与同样双酶切线性化的表达质粒载体pET28a采用常规方法进行连接。重组质粒命名为：pET28a FAdV4fiber2。接着将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，构建表达工程菌，该工程菌命名为：E.coli BL21(DE3)/pET28a FAdV 4fiber2。

将表达工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a FAdV 4fiber2进行诱导表达。其中诱导剂为α-乳糖，工作浓度为：0.03mol/L。用超声波破菌离心后，通过SDS-PAGE电泳检测离心前后的破菌液中目的蛋白的表达量和溶解状况。

其中表达工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a FAdV 4fiber2的SDS-PAGE电泳检测结果图如附图1所示，其中泳道1为E.coli BL21(DE3)/pET28a FAdV 4fiber2破菌后的全菌液；泳道2为E.coli BL21(DE3)/pET28a FAdV 4fiber2破菌离心后的上清液；泳道3为E.coli BL21(DE3)/pET28a破菌离心后的上清液(空白对照)；泳道4为Marker(由小到大分别为14，25，30，40，50，70，100，120kDa)。结果显示：表达工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28aFAdV 4fiber2，全菌液中目的蛋白的表达量约为总蛋白的16.27％，分子量约65-68KDa，而离心后的上清液中基本没有目的蛋白，说明所表达的FAdV-4fiber2蛋白为不可溶蛋白，无法用作制备疫苗。

三、FAdV-4fiber 2基因的改造

1、封闭fiber2基因序列中的NcoⅠ限制性内切酶位点

通过测序发现，在FAdV-4fiber 2基因中有3个NcoⅠ限制性内切酶位点，为得到不含表达载体自带融合肽的抗原蛋白，发明人通过重叠PCR的方法封闭原序列中的3个NcoⅠ限制性内切酶位点。具体操作如下：

(1)第一次重叠PCR：将SEQ ID NO.3所示的序列的第335位Thr的编码序列由ACC变为ACG，以封闭第一个NcoⅠ限制性内切酶位点(序列中的第1004bp-1010bp)。具体步骤包括：

①以pTOPO-T fiber2质粒为模板，以FAdV-4Fiber 2A PF和FAdV-4Fiber 2A PR(SEQ ID NO.5-6)为引物，在Easy Taq酶作用下，按照常规PCR操作程序(与上述fiber2基因的PCR扩增相同)扩增30个循环，得到产物片段A。

②以pTOPO-T fiber2质粒为模板，以FAdV-4Fiber 2B PF和FAdV-4Fiber 2B PR(SEQ ID NO.7-8)为引物，在Easy Taq酶作用下，按照常规PCR操作程序(与上述fiber2基因的PCR扩增相同)进行PCR扩增，得到产物片段B。

③取片段A和片段B各1μL的混合物为模板，以FAdV-4Fiber 2A PF和FAdV-4Fiber2B PR为引物，在Easy Taq酶作用下，按照常规PCR扩增35个循环，得到第一次重叠PCR产物。

④将第一次重叠PCR产物进行胶回收后与pTopo-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，菌液PCR鉴定后提取质粒进行测序鉴定，鉴定成功后将提取的质粒DNA进行第二次重叠PCR。

(2)第二次重叠PCR：将SEQ ID NO.3所示的序列的第384位Pro的编码序列由CCC变为CCG，以封闭第2个NcoⅠ限制性内切酶位点(序列中的第1151-1156bp)；将第393位氨基酸残基Pro的编码序列由CCA变为CCG，以封闭第3个NcoⅠ限制性内切酶位点(序列中的第1177-1182bp)。具体操作为：

①以第一次重叠PCR产物构建的质粒DNA为模板，以FAdV-4Fiber 2C PF和FAdV-4Fiber 2C PR(SEQ ID NO.9-10)为引物，在Easy Taq酶作用下，按照常规PCR操作程序扩增30个循环，得到产物片段C。

②以第一次重叠PCR扩增产物构建的质粒DNA为模板，以FAdV-4Fiber 2D PF和FAdV-4Fiber 2D PR(SEQ ID NO.11-12)为引物，在Easy Taq酶作用下，按照常规PCR操作程序扩增30个循环，得到产物片段D。

③取片段C和片段D各1μL的混合物为模板，以FAdV-4Fiber 2C PF和FAdV-4Fiber2D PR为引物，在Easy Taq酶作用下，按照常规PCR扩增35个循环，得到第二次重叠PCR产物。

④将第二次重叠PCR产物进行胶回收后与pTopo-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，菌液PCR鉴定后提取质粒送至上海生物工程有限公司进行测序鉴定，确认是否成功封闭，并将成功封闭了3个酶切位点的质粒命名为：pTopo-T FAdV 4fiber2 M1。

其中两次重叠PCR所用到的引物序列(SEQ ID NO.5-12)具体如下：

2、FAdV4 Nd 274fiber 2与FAdV4 hexon抗原表位序列融合

在FAdV4 fiber2基因的第275至278位氨基酸残基是一个G3S的连接肽，通过引物设计从fiber2基因5′端275个氨基酸对应的核苷酸序列处开始扩增，以剪切去除5′端274个氨基酸残基，得到FAdV Nd274 fiber 2基因序列，作为抗原蛋白的主要组成部分，并分两次在融合引物的5′端加载FAdV-4hexon蛋白的第41-55位氨基酸编码序列和第21-40位氨基酸编码序列，其中包含了hexon蛋白的两个抗原表位，具体操作如下：

(1)fiber2基因5′端序列剪切和hexon 41-55位氨基酸编码序列融合

以上述的pTopo-T FAdV 4fiber2 M1质粒为模板，用融合1上游引物和融合1下游引物(SEQ ID NO.13-14)进行常规PCR扩增(与上述fiber2基因的PCR扩增相同)，在fiber2基因5′端剪切274个氨基酸残基，同时添加hexon的第41-55位氨基酸编码序列，其中第45-52位氨基酸为hexon蛋白的一个抗原表位序列，并构建质粒得到pTopo-T FAdV Nd274fiber2 M2。其中引物的具体序列为：

融合1上游引物：

ACCATGGGAAGCTACTTTGACTTGAAGAACAAGTTCAGACAGACGGTCGTGGGAGGAGGGAGCGTCTCCACACCC

融合1下游引物：AAGCTTTTACGGGAGGGAGGCCGCTGGACAGCT

(其中融合1上游引物的下划线部分为hexon第41-55位氨基酸编码序列)

(2)与hexon 21-40位氨基酸编码序列融合

通过引物设计，在pTopo-T FAdV Nd274 fiber2 M2质粒的编码序列的5′端插入hexon第21-40位氨基酸编码序列，其中第25-29位氨基酸为hexon蛋白的一个抗原表位序列，具体为：

以上述pTopo-T FAdV Nd274 fiber2 M2质粒为模板，用融合2上游引物和融合2下游引物(SEQ ID NO.15-16)进行常规PCR扩增(与第一步融合步骤相同)，以将hexon的第21-40位氨基酸编码序列，与第一步融合得到的序列相连，并构建质粒得到pTopo-T FAdVNd274 fiber2 M3。其中引物的具体序列为：

融合2上游引物：

ACCATGGCGGGCCCCGGGACGCGCGAATACCTCTCTGAGGACCTCCAACAGTTCATTTCCGCCACCGGAAGCTACTTTGACTTGAAGAAC

融合2下游引物：AAGCTTTTACGGGAGGGAGGCCGCTGGACAGCT

(其中融合2上游引物的下划线部分为hexon第21-40位氨基酸编码序列)

3、表达工程菌的构建

提取pTopo-T FAdV Nd274 fiber2 M3质粒DNA，用NcoⅠ/HindⅢ进行双酶切后回收目的基因片段，然后连接到用NcoⅠ/HindⅢ双酶切线性化的pET 28a质粒上，重组质粒命名为：pET28a FAdV Nd274 fiber2 M3。接着将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，构建表达工程菌，该工程菌命名为：E.coli BL21(DE3)/pET28a FAdV Nd274 fiber2 M3。将该工程菌送交上海生物工程有限公司进行测序，测序得到该基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2 E.coli BL21(DE3)/pET28a FAdV Nd274 fiber2 M3表达蛋白检测分析和纯化

一、表达蛋白检测分析

将表达工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a FAdV Nd274 fiber2 M3进行诱导表达。其中诱导剂为α-乳糖，工作浓度为：0.03mol/L。用超声波破菌离心后，通过SDS-PAGE电泳检测离心前后的破菌液中目的蛋白的表达量和溶解状况。

其中表达工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a FAdV Nd274 fiber2 M3的SDS-PAGE电泳检测结果图如附图2所示，其中泳道1为不含目的片段的空白对照E.coli BL21(DE3)/pET28a，泳道2为Marker(由小到大分别为14，25，30，40，50，70，100，120kDa)，泳道3为离心前FAdV Nd274 fiber2 M3表达蛋白全菌液，泳道4为离心后上清液中FAdV Nd274 fiber2M3破菌液。结果显示：对于表达工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a FAdV Nd274 fiber2 M3，全菌液中目的蛋白的表达量约为总蛋白的22.38％，于12000rpm离心15min后，上清液中目的蛋白量约为总可溶蛋白量的23.83％，表明该表达蛋白是可溶性蛋白，将该表达蛋白命名为：FAdV 4Nd274 fiber2 M3，该表达蛋白分子量约为27KDa。

与实施例1中改造前的E.coli BL21(DE3)/pET28a FAdV 4fiber2诱导表达并破菌离心前后的蛋白检测结果相比较，发现改造前的上清液中无目的蛋白fiber2蛋白，fiber2蛋白主要集中在沉淀中，即fiber2蛋白的溶解性能差，不利于直接制备成疫苗，而通过本发明的基因工程改造后得到的FAdV 4Nd274 fiber2 M3蛋白，其溶解性能显著提高。

二、FAdV 4Nd274 fiber2 M3蛋白纯化

1、粗纯化

表达工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a FAdV Nd274 fiber2 M3用α-乳糖诱导表达后，用超声波破菌，然后于12000rpm下离心15min后，取上清液，加入硫酸铵，收集20％-50％硫酸铵饱和度的沉淀。将沉淀用0.02M，pH 7.4的磷酸缓冲液复溶后离心，测得上清液中目的蛋白占总蛋白的35.71％

2、Sephacryl S-300凝胶过滤层析纯化

将上述步骤最终得到的上清液过滤后进行Sephacryl S-300凝胶过滤层析，并用0.02M，pH 7.4的磷酸缓冲液洗脱。收集含目的蛋白的收集管，经过SDS-PAGE电泳后测的目的蛋白纯度为总蛋白的48.7％。

3、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析纯化

将上述凝胶过滤层析的目的蛋白收集液，进行DEAE离子交换柱层析。用0.02M，pH7.4的磷酸缓冲液做A液，0.02M，pH 7.4的磷酸缓冲液+1M NaCl溶液做B液，进行梯度洗脱。收集含目的蛋白的洗脱液，SDS-PAGE电泳，峰面积扫描测得洗脱液中目的蛋白纯度为91.1％。最终纯化获得的纯化蛋白的SDS-PAGE电泳图如附图3所示，其中泳道1为不含目的片段的空白对照E.coli BL21(DE3)/pET28a，泳道2为Marker(由小到大分别为14，25，30，40，50，70，100，120kDa)，泳道3为纯化前的FAdV Nd274 fiber2 M3表达蛋白上清液，泳道4为纯化后得到的FAdV 4Nd274 fiber2 M3纯化蛋白。

实施例3 FAdV-4基因工程亚单位疫苗的制备及免疫攻毒实验

一、疫苗制备

将实施例2中得到的FAdV 4Nd274 fiber2 M3纯化蛋白经过去内毒素处理后，用PBS液稀释至含目的蛋白100微克/毫升。按照蛋白液:疫苗佐剂＝1:3(W/W)的比例，加入疫苗佐剂MONTANIDEIM ISA 71VG，制得成品疫苗用于后续免疫攻毒实验，其中目的蛋白含量为25微克/毫升。

二、实验鸡分组及免疫

选取2周龄SPF鸡，共分为6组，每组8只，每组的处理方式如下:

1、实验1组：0.1mL上述成品疫苗免疫1次(2.5微克蛋白/只)，免疫后28天攻毒；

2、实验2组：0.2mL上述成品疫苗免疫1次(5.0微克蛋白/只)，免疫后28天攻毒；

3、实验3组：0.2mL上述成品疫苗免疫1次，免疫后14天用0.2ml疫苗加强免疫一次(共10.0微克蛋白/只)，首次免疫后28天攻毒；

4、实验4组：0.3ml上述成品疫苗免疫1次(7.5微克蛋白/只)，免疫后28天攻毒；

5、阴性对照：不免疫不攻毒；

6、阳性对照：不免疫攻毒组；

免疫方式：颈部皮下注射。

三、免疫后抗体检测结果

实验鸡免疫后，分别于免疫后1周，2周，3周采取鸡血清，用间接ELISA试剂盒检测血清中抗体含量并计算S/N值，结果如表1所示。

表1免疫前后抗体检测结果

^*本表同行平均值数据中，有不同的字母尾号(a,b)的组之间，在0.05的置信水平上差异显著。

^**S/N值大于2.1的血清样本，判定为抗体阳性；S/N值小于2.1的血清样本，判定为抗体阴性。

由上表1可见，实验鸡免疫前和免疫后1周，各组鸡血清抗体滴度的S/N值无显著性差异，但是在免疫后1周部分实验鸡体内血清抗体已经开始转为阳性；免疫后2周和免疫3周后，实验1-4组的全部免疫鸡的血清抗体全部转为阳性，不同剂量的免疫组之间差异不显著，且免疫组1-4组与未免疫组之间有显著性差异。

四、攻毒实验及检测

1、FAdV 4肝组织毒的制备：

感染FAdV 4的鸡发病死亡后，取其肝组织用于制备攻毒用组织毒。取1克肝组织，按照质量体积比1:5的比例，1×标准细胞缓冲液PBS作为缓冲液，制作组织匀浆，4000rpm10min取上清用0.22um滤膜过滤备用。

2、攻毒用种毒的准备：

按照FAdV 4肝组织毒的制备方法制备病毒液，提取总DNA作为样本，用常规的realtime PCR方法测定病死鸡肝组织液中的FAdV 2病毒载量，realtime PCR中采用的引物(SEQ ID NO.19-20)为：

FAdV fiber2 RT F3:TCTCCACACCCATCGCTACT

FAdV fiber2 RT R3:CTGACCGTTCCCGCTTGAAT

通过realtime PCR测定得到自制的病毒液中FAdV-4病毒的拷贝数为3.414×10⁷拷贝数/μL。

3、攻毒剂量和方法：利用病毒液对上述实验1-5组以及阳性对照组的实验鸡进行攻毒处理，每只鸡的攻毒剂量为200μL，即FAdV-4病毒的拷贝数为6.8×10⁸；攻毒方法为：口服100μL和滴鼻100μL。

4、攻毒实验记录：(1)分别统计各组在攻毒后7天的死亡情况，计算死亡率；(2)对于已死亡的鸡，即刻剖检；未死亡鸡在攻毒后第7天宰杀后剖检。分别称重肝，脾，法氏囊，计算鸡的肝/体重比×1000、脾/体重比×1000、法氏囊/体重比×1000值，并进行单因素方差分析，检测结果如表2所示。

表2实验鸡死亡率及解剖结果

本表同列平均值数据中，有不同的字母尾号(a,b)的组之间，在0.05的置信水平上差异显著

根据表2的结果可知，其中阴性对照由于未进行攻毒，因此不存在死亡，阳性对照由于未免疫，因此在攻毒后的2-4天内全部死亡，死亡率为100％，实验1组(0.1mL成品疫苗)有2只鸡在攻毒后2-3天死亡，而实验2-4组的免疫鸡无死亡情况，均存活。同时根据解剖结果，其中阴性对照组和实验1-4组与阳性对照之间的肝/体重比×1000值以及脾/体重比×1000值均存在显著性差异，即说明该病毒对于鸡的肝脏和脾脏均有显著影响，并且所有死亡鸡的肝/体重比×1000值都显著升高，均高于42，表明感染鸡的肝脏均存在明显肿大。而7个组的法氏囊/体重比×1000值之间没有显著差异，说明该病毒对法氏囊的损害不明显。

5、攻毒鸡肝组织病毒载量测定与分析：

取各组的肝组织进行绝对荧光定量Realtime PCR检测。将病毒拷贝数/克肝组织值换算成为Log10 viral loads，结果如表3所示。

将阴性对照组的Log10 viral loads平均值+3倍标准差的值，即：6.11做为荧光定量PCR阳性的判断标准，低于6.11为阴性；高于6.11为阳性。

表3攻毒后实验鸡肝的病毒载量测定

根据表3的结果，其中阳性对照由于未进行免疫，因此病毒载量显著高于其他组，荧光定量结果的阳性率与死亡率一致，即病毒载量越高，死亡率越高。

综上所述，根据攻毒保护实验的结果可知，本发明的亚单位疫苗在实验2组、实验3组和实验4组的应用中都能够提供完全的免疫保护，即攻毒时死亡率为0，其中最低完全保护的剂量是实验2组，即使用0.2mL本发明所述的疫苗(5.0微克蛋白/只)的免疫剂量，一次免疫即可使免疫鸡得到完全的保护。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 长江大学

<120> 一种重组禽腺病毒4型fiber2蛋白及其制备方法和应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Gly Pro Gly Thr Arg Glu Tyr Leu Ser Glu Asp Leu Gln Gln

1 5 10 15

Phe Ile Ser Ala Thr Gly Ser Tyr Phe Asp Leu Lys Asn Lys Phe Arg

20 25 30

Gln Thr Val Val Gly Gly Gly Ser Val Ser Thr Pro Ile Ala Thr Phe

35 40 45

Val Ser Gly Ser Pro Ser Leu Asn Thr Tyr Asn Ala Thr Thr Val Asn

50 55 60

Ser Ser Ala Asn Ala Phe Ser Cys Ala Tyr Tyr Leu Gln Gln Trp Asn

65 70 75 80

Ile Gln Gly Leu Leu Val Thr Ser Pro Tyr Leu Lys Leu Asp Ser Ala

85 90 95

Thr Met Gly Asn Arg Pro Gly Asp Leu Asn Ser Ala Asn Ala Lys Trp

100 105 110

Phe Thr Phe Trp Val Ser Ala Tyr Leu Gln Gln Cys Asn Pro Ser Gly

115 120 125

Ile Gln Ala Gly Thr Val Ser Pro Ser Thr Ala Thr Leu Thr Asp Phe

130 135 140

Glu Pro Met Ala Asn Arg Ser Val Thr Ser Pro Trp Thr Tyr Ser Ala

145 150 155 160

Asn Gly Tyr Tyr Glu Pro Ser Ile Gly Glu Phe Gln Val Phe Ser Pro

165 170 175

Val Val Thr Gly Ala Trp Asn Pro Gly Asn Ile Gly Ile Arg Val Leu

180 185 190

Pro Val Pro Val Ser Ala Ser Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Leu Cys Tyr

195 200 205

Ser Leu Gln Cys Thr Asn Ala Ser Ile Phe Asn Pro Asn Asn Ser Gly

210 215 220

Thr Met Ile Val Gly Pro Val Leu Tyr Ser Cys Pro Ala Ala Ser Leu

225 230 235 240

Pro

<210> 2

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcgggcc ccgggacgcg cgaatacctc tctgaggacc tccaacagtt catttccgcc 60

accggaagct actttgactt gaaaaacaag ttcagacaga cggtcgtggg aggggggagc 120

gtctccacac ccatcgctac ttttgtctcg ggaagtccca gcctcaacac ctacaatgcc 180

acgaccgtca attccagcgc gaacgccttc tcttgcgcct actaccttca acagtggaac 240

atacaggggc tccttgttac ctccccctac ttgaaattgg acagcgccac catggggaat 300

cgccctgggg acctcaactc cgccaatgcc aaatggttca ccttttgggt gtccgcctat 360

ctccagcaat gcaacccctc cgggattcaa gcgggaacgg tcagcccctc caccgccacc 420

ctcacggact ttgaacccat ggccaatagg agcgtgacca gcccatggac gtactcggcc 480

aatggatact atgaaccatc catcggggaa ttccaagtgt tcagcccggt ggtaacaggt 540

gcctggaacc cgggaaacat agggatccgc gtcctccccg tgccggtttc ggcctccgga 600

gagcgataca cccttctatg ctatagtctg cagtgcacga acgcgagcat ttttaatcca 660

aacaacagcg gaaccatgat cgtgggaccc gtgctctaca gctgtccagc ggcctccctc 720

ccgtaa 726

<210> 3

<211> 1440

<212> DNA

<213> 禽腺病毒4型(Fowl adenovirus serotype-4)

<400> 3

atgctccggg cccctaaaag aagacattcc gaaaacggga agcccgagac cgaagcggga 60

ccttccccgg ctccaatcaa gcgcgccaaa cgcatggtga gagcatccca gcttgacctg 120

gtttatcctt tcgattacgt ggccgacccc gtcggagggc tcaacccgcc ttttttggga 180

ggctcaggac ccctagtgga ccagggcgga cagcttacgc tcaacgtcac cgatcccatc 240

atcatcaaga acagatcggt ggacttggcc cacgacccca gtctcgatgt caacgcccaa 300

ggtcaactgg cggtggccgt tgaccccgaa ggggccctgg acatcacccc cgatggactg 360

gacgtcaagg tcgacggagt gaccgtaatg gtcaacgatg actgggaact ggccgtaaaa 420

gtcgacccgt ccggcggatt ggattccacc gcgggtggac tgggggtcag cgtggacgac 480

accttgctcg tggatcaggg agaactgggc gtacacctca accaacaagg acccatcact 540

gccgatagca gtggtatcga cctcgagatc aatcctaaca tgttcacggt caacacctcg 600

accggaagcg gagtgctgga actcaaccta aaagcgcagg gaggcatcca agccgacagt 660

tcgggagtgg gcgtttccgt ggatgaaagc ctacagattg tcaacaacac tctggaagtg 720

aaaccggatc ccagcggacc gcttacggtc tccgccaatg gcctagggct gaagtacgac 780

actaataccc tagcggtgac cgcgggcgct ttaaccgtgg tcggaggggg gagcgtctcc 840

acacccatcg ctacttttgt ctcgggaagt cccagcctca acacctacaa tgccacgacc 900

gtcaattcca gcgcgaacgc cttctcttgc gcctactacc ttcaacagtg gaacatacag 960

gggctccttg ttacctcccc ctacttgaaa ttggacagcg ccaccatggg gaatcgccct 1020

ggggacctca actccgccaa tgccaaatgg ttcacctttt gggtgtccgc ctatctccag 1080

caatgcaacc cctccgggat tcaagcggga acggtcagcc cctccaccgc caccctcacg 1140

gactttgaac ccatggccaa taggagcgtg accagcccat ggacgtactc ggccaatgga 1200

tactatgaac catccatcgg ggaattccaa gtgttcagcc cggtggtaac aggtgcctgg 1260

aacccgggaa acatagggat ccgcgtcctc cccgtgccgg tttcggcctc cggagagcga 1320

tacacccttc tatgctatag tctgcagtgc acgaacgcga gcatttttaa tccaaacaac 1380

agcggaacca tgatcgtggg acccgtgctc tacagctgtc cagcggcctc cctcccgtaa 1440

<210> 4

<211> 105

<212> DNA

<213> 禽腺病毒4型(Fowl adenovirus serotype-4)

<400> 4

gcgggccccg ggacgcgcga atacctctct gaggacctcc aacagttcat ttccgccacc 60

ggaagctact ttgacttgaa gaacaagttc agacagacgg tcgtg 105

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagctcatgc tccgggcccc taaaagaaga c 31

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtccccaggg cgattcccca tcgtggcgct gtccaatttc aagtaggg 48

<210> 7

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tacttgaaat tggacagcgc cacgatgggg aatcgccctg gggacctc 48

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aagcttttac gggagggagg ccgctggaca gct 33

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gagctcatgc tccgggcccc taaaagaaga c 31

<210> 10

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggccgagtac gtccacgggc tggtcacgct cctattggcc atcggttcaa agtccgtgag 60

ggtggc 66

<210> 11

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctcacggact ttgaaccgat ggccaatagg agcgtgacca gcccgtggac gtactcggcc 60

aatgga 66

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aagcttttac gggagggagg ccgctggaca gct 33

<210> 13

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

accatgggaa gctactttga cttgaagaac aagttcagac agacggtcgt gggaggaggg 60

agcgtctcca caccc 75

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aagcttttac gggagggagg ccgctggaca gct 33

<210> 15

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

accatggcgg gccccgggac gcgcgaatac ctctctgagg acctccaaca gttcatttcc 60

gccaccggaa gctactttga cttgaagaac 90

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aagcttttac gggagggagg ccgctggaca gct 33

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gagctcatgc tccgggcccc taaaagaaga c 31

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aagcttttac gggagggagg ccgctggaca gct 33

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tctccacacc catcgctact 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ctgaccgttc ccgcttgaat 20

Claims

1.一种重组禽腺病毒4型fiber2蛋白，其特征在于，所述重组蛋白为禽腺病毒4型fiber2蛋白去除了N端274个氨基酸残基后与禽腺病毒4型hexon蛋白第21-55位氨基酸序列重组得到的蛋白，其中所述禽腺病毒4型fiber2蛋白对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述禽腺病毒4型hexon蛋白第21-55位氨基酸序列所对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述的重组禽腺病毒4型fiber2蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求2所述的核苷酸序列。

4.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌包含如权利要求3所示的载体。

5.一种如权利要求1所述的重组禽腺病毒4型fiber2蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1中通过两次重叠PCR的方法封闭禽腺病毒4型fiber2蛋白编码基因中的NcoⅠ限制性内切酶位点，所述重叠PCR中使用的引物如SEQ ID NO.5-12所示。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2中先利用如SEQ ID NO.13-14所示的引物进行fiber2蛋白基因的5′端剪切以及与禽腺病毒4型hexon蛋白第41-55位氨基酸编码序列融合，然后利用SEQ ID NO.15-16所示的引物继续与禽腺病毒4型hexon蛋白第21-40位氨基酸编码序列融合。

8.权利要求1所述的重组禽腺病毒4型fiber2蛋白在制备禽腺病毒4型基因工程亚单位疫苗中的应用。

9.一种禽腺病毒4型基因工程亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗中包含权利要求1所述的重组禽腺病毒4型fiber2蛋白。