CN106046172A

CN106046172A - 传染性法氏囊病病毒重组融合蛋白vp2‑vp1及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN106046172A
Application number: CN201610389727.2A
Authority: CN
Inventors: 韦平; 刘婷; 陈果; 焦鹏涛; 姬中华; 何秀苗; 磨美兰; 韦天超; 黄腾
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2016-06-06
Filing date: 2016-06-06
Publication date: 2016-10-26
Anticipated expiration: 2036-06-06
Also published as: CN106046172B

Abstract

本发明公开了一种传染性法氏囊病病毒重组融合蛋白VP2‑VP1，由VP1和VP2基因串联而成的VP2‑VP1融合基因所编码。试验显示，本发明构建的重组表达载体pVP2‑VP1，能够在重组大肠杆菌中稳定表达重组融合蛋白VP2‑VP1，Western‑blot证实该蛋白具有良好的抗原性。据此，发明人用所表达的重组融合蛋白VP2‑VP1作为抗原，建立了ELISA检测方法和试剂盒，应用该法进行IBDV抗体的间接ELISA检测，将有助于更好的应用于临床IBDV感染后鸡群抗体水平的检测。而试剂盒试用表明其具有敏感、特异、稳定性和重复性良好等优点。

Description

传染性法氏囊病病毒重组融合蛋白VP2-VP1及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于传染性法氏囊病技术领域，尤其涉及一种传染性法氏囊病病毒重组融合蛋白VP2-VP1及其制备方法和应用。

背景技术

传染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一种危害青年鸡的急性、高度接触性的传染病。IBDV主要侵害鸡的淋巴组织，特别是中枢免疫器官法氏囊，病毒在其中的增殖会造成B淋巴细胞的衰竭，从而引起鸡的免疫抑制，特别是雏鸡的早期感染会引发十分严重的，而且是长期的免疫抑制。研究表明，传染性法氏囊病常与其他禽类疾病混合感染，这使得养禽业疫病情况更加复杂和严重。如何及时有效地掌握IBDV的流行情况，并对此制定有效的防控措施显得至关重要。

IBDV属于双RNA病毒科(Birnaviridae)，禽双RNA病毒属(Avibirnavirus)，传染性法氏囊病毒的基因组是分节段的双股RNA病毒，其基因组分为A节段和B节段。A节段全长约3.2kb，包含两个开放阅读框，分别编码前体多聚蛋白pVP2-VP4-VP3(VPX)和VP5蛋白，B节段全长约2.8kb仅含有一个开放阅读框，编码VP1蛋白。研究表明，VP2蛋白是IBDV的主要结构蛋白，含有主要的抗原保护性基因，与病毒毒力相关；VP1蛋白是IBDV的结构蛋白，它的结构改变可使病毒毒力发生变化。国内外学者通过重组蛋白表达IBDV结构蛋白研究了IBDV抗体检测的ELISA方法。目前使用的商品化ELISA试剂盒进行IBDV抗体检测多用IDEXX公司以全病毒为抗原检测IBDV抗体的ELISA方法，国内的商品化ELISA试剂盒也是以全病毒为抗原检测IBDV抗体。国外学者Martíneztorrecuadrada J L等研究了以重组蛋白VPX和VP3作为抗原进行IBDV抗体检测的间接ELISA的方法(Martíneztorrecuadrada J L，2000)，试验表明以重组蛋白VPX作为抗原优于以重组蛋白VP3作为抗原进行IBDV抗体检测；国内学者彭志伟等研究了以重组蛋白VP3作为抗原进行IBDV抗体检测的ELISA方法(彭志伟，2005)。结果显示特异性和敏感性均优于以全病毒作为抗原进行IBDV抗体检测的商品化ELISA试剂盒(美国IDEXX)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种传染性法氏囊病病毒重组融合蛋白VP2-VP1及其制备方法和应用，以便于开展临床IBDV感染后鸡群抗体水平的检测。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

传染性法氏囊病病毒重组融合蛋白VP2-VP1，由VP1和VP2基因串联而成的VP2-VP1融合基因所编码。

VP2-VP1融合基因具有序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列。

上述传染性法氏囊病病毒重组融合蛋白VP2-VP1，具有序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列。

上述传染性法氏囊病病毒重组融合蛋白VP2-VP1的制备方法，通过将VP2、VP1基因主要抗原区域基因片段串联，克隆入原核表达载体pET-32a得到重组表达载体pVP2-VP1，将该重组表达载体pVP2-VP1转入大肠杆菌BL21(DE3)，该重组大肠杆菌经0.5mM IPTG诱导表达，经Ni柱亲和层析纯化获得重组融合蛋白VP2-VP1。

上述传染性法氏囊病病毒重组融合蛋白VP2-VP1的制备方法，包括以下步骤：

(1)从传染性法氏囊病病毒主要流行株NN1172病毒株提取病毒基因组总RNA，经RT-PCR扩增得到目的基因片段VP2(SEQ.ID.No.7)、VP1(SEQ.ID.No.8)，通过限制性酶切位点经融合PCR扩增得到串联目的基因片段VP2-VP1，通过限制性酶切位点BamH I和Xho I经融合PCR方法将基因片段进行融合并克隆入原核表达载体中，通过酶切和测序鉴定，获得重组表达载体pVP2-VP1；

(2)将重组表达载体pVP2-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌BL21-VP2-VP1；

(3)培养重组大肠杆菌BL21-VP2-VP1至OD₆₀₀为0.6时加入终浓度为0.5mM IPTG诱导表达，经Ni柱亲和层析纯化获得重组融合蛋白VP2-VP1。

步骤(1)中PCR扩增基因片段VP2、VP1所用引物分别为：

VP2F：CGCGGATCCATGACAAACCTGCAAGATCAAACCC(SEQ.ID.No.3)；

VP2R：CCCCGAATTCTGTAATTGTCACTCCACCTGCTTGG(SEQ.ID.No.4)；

VP1F：CCCCGAATTCGAGATCCTTGCCGAACTGAAC(SEQ.ID.No.5)；

VP1R：CCCGCTCGAGCTATTGGCGGCTCTCCTTCTG(SEQ.ID.No.6)。

上述传染性法氏囊病病毒重组融合蛋白VP2-VP1作为抗原在制备检测传染性法氏囊病病毒抗体的ELISA检测试剂盒中的应用。

基于IBDV基因组A节段的VP2蛋白和基因组B节段的VP1蛋白，发明人通过对基因组两个节段的两个蛋白进行融合表达，设计制备了一种传染性法氏囊病病毒重组融合蛋白VP2-VP1，由VP1和VP2基因串联而成的VP2-VP1融合基因所编码。试验显示，本发明构建的重组表达载体pVP2-VP1，能够在重组大肠杆菌中稳定表达重组融合蛋白VP2-VP1，Western-blot证实该蛋白具有良好的抗原性。据此，发明人用所表达的重组融合蛋白VP2-VP1作为抗原，建立了ELISA检测方法和试剂盒，应用该法进行IBDV抗体的间接ELISA检测，将有助于更好的应用于临床IBDV感染后鸡群抗体水平的检测。而试剂盒试用表明其具有敏感、特异、稳定性和重复性良好等优点。

附图说明

图1目的基因的扩增，图中：M为DNA Marker DL 2000；1为VP2基因扩增结果；2为VP1基因扩增结果；3为阴性对照扩增结果。

图2重组质粒的酶切鉴定，图中：M为DNA Marker DL 7000；1为重组质粒pVP2-VP1酶切结果；2为表达载体pET-32a酶切结果。

图3重组融合蛋白VP2-VP1的SDS-PAGE分析及Western-blot鉴定，图中：M为蛋白Marker；1为菌体破碎后的上清；2为菌体破碎后的沉淀；3为Western-blot鉴定重组蛋白。

具体实施方式

实施例1VP2-VP1基因片段的扩增与原核表达质粒

1.1病毒株

传染性法氏囊病病毒(IBDV)毒株(NN1172株)。

1.2引物设计

根据传染性法氏囊病病毒NN1172病毒株基因组设计引物，并由北京华大基因公司合成。PCR所用各引物的序列为：

VP2F：CGCGGATCCATGACAAACCTGCAAGATCAAACCC(SEQ.ID.No.3)；

VP2R：CCCCGAATTCTGTAATTGTCACTCCACCTGCTTGG(SEQ.ID.No.4)；

VP1F：CCCCGAATTCGAGATCCTTGCCGAACTGAAC(SEQ.ID.No.5)；

VP1R：CCCGCTCGAGCTATTGGCGGCTCTCCTTCTG(SEQ.ID.No.6)。

1.3病毒RNA提取

取200μL病毒(NN1172病毒株)与1mL Trizol溶液混匀，震荡30s，静置5min，加入200μL氯仿，震荡30s，随后10000r/min离心30min，取上清400μL于新离心管，加入400μL异丙醇混匀，于-20℃静置30min后10000r/min离心30min弃掉上清，加入1mL 70％乙醇10 000r/min离心10min弃上清液，加入50μL ddH₂O获得病毒的RNA。

1.2串联VP2-VP1基因的获取

将以上所述RNA进行反转录：在42℃，于4μL缓冲液(250mM Tris-HCl，pH8.3，375mMKCl，15mM MgCl₂)、0.25μL 10μM dATP、0.25μL 10μM dGTP、0.25μL 10μM dCTP、0.25μL 10μM dTTP、2μL 0.1M DTT、40U Ribonuclease Inhibitor(Invitrogen)、200U M-MLV(Invitrogen)中进行60分钟。反应混合物中也含有病毒的RNA和10μM引物(VP2-R、VP1-R)。反转录完成后得到反转录混合物。将2μL反转录混合物加入下列试剂：5μL缓冲液(200μLTris-HCl，pH8.4，500mM KCl)、1.5μL 50μM MgCl₂、10μM引物(VP2-F、VP2-R、VP1-F、VP1-R)、0.25μL 10μM dATP、0.25μL 10μM dGTP、0.25μL 10μM dCTP、0.25μL 10μM dTTP、2U TaqDNA聚合酶和38.1μL ddH₂O，反应在Veriti96 PCR仪器(ABI)中进行：94℃预变性5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸5min。反应完成后，将反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可以看到大小约为700bp的VP2基因片段的条带和大小约为600bp的VP1基因片段的条带(见图1)。

1.3重组质粒的构建

将以上所述扩增得到的传染性法氏囊病毒病毒VP2和VP1基因片段通过胶回收，与原核表达载体质粒pET-32a，分别用限制性内切酶进行消化，通过T4DNA连接酶连接，获得DNA重组质粒。具体方法如下：

将VP2基因片段扩增产物用BamH I和EcoR I进行双酶切。酶切条件为37℃作用3h，酶切体系如下：

将VP1基因片段扩增产物用EcoRI和XhoI进行双酶切。酶切条件为37℃作用3h，酶切体系如下：

将原核表达载体pET-32a用BamH I和XhoI进行双酶切。酶切条件为37℃作用3h，酶切体系如下：

反应完成后，分别对VP2、VP1基因片段酶切产物以及原核表达载体pET-32a酶切产物进行纯化回收。将回收产物用T4连接酶进行连接。连接条件为16℃作用3h，连接体系如下：

将连接产物转化DH5α感受态大肠杆菌，随机挑取10个菌落，于含氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养12h，随后提取质粒，获得DNA重组质粒。

1.4重组质粒的鉴定

(1)双酶切鉴定

使用限制性内切酶BamHI和XhoI将获得的DNA重组质粒进行双酶切。将双酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果判断串联基因VP2-VP1基因片段是否插入载体。结果表明串联基因VP2-VP1基因片段(SEQ.ID.No.9)插入载体中，片段大小约为1300bp(见图2)。

(2)测序鉴定

将获得的DNA重组质粒经双向测序予以验证。测序结果见序列表SEQ.ID.No.10的核苷酸序列，结果表明VP2、VP1基因片段正确插入载体内且测序结果与预期一致。将经过双酶切鉴定和测序鉴定的DNA重组质粒，命名为pVP2-VP1。

实施例2重组表达菌株BL21-VP2-VP1的构建

2.1转化感受态大肠杆菌BL21

将实施例1中经鉴定的重组质粒pVP2-VP1转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组表达菌株BL21-VP2-VP1。

2.2重组蛋白的诱导表达

(1)挑取重组表达菌株BL21-VP2-VP1单菌落接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃200r/min振荡培养16h。

(2)以1∶100比例扩大培养，37℃200r/min振荡培养2h至OD₆₀₀＝0.6，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG进行重组蛋白的诱导表达，继续培养4.5h。

(3)收集培养的菌液，于4℃12000r/min离心10min，收集细菌沉淀。将细菌沉淀用PBS缓冲液(pH7.2)重悬，于-20℃反复冻融3次，超声波裂解细菌，直至细菌悬液变得清澈。

(4)将上述菌液于4℃12 000r/min离心10min，分别收集菌液上清和菌体沉淀。

2.3重组蛋白的SDS-PAGE电泳分析及Western-blot蛋白印迹分析

分别取上述菌液上清和菌体沉淀进行SDS-PAGE进行分析，在样品中加入5×缓冲液(250mM Tris-HCl，pH6.8；10％SDS；0.5％溴酚蓝；50％甘油；5％2-巯基乙醇)，混匀后，于100℃沸水浴10min，随后进行SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE电泳后，进行Western-blot蛋白印迹分析，用蛋白干式转印仪(Invitrogen)把蛋白转移到PVDF膜上，转膜结束后，用TBST配制的5％脱脂奶粉封闭PVDF膜，4℃过夜。将该PVDF膜用PBS洗涤后用1∶00稀释的IBDV抗体阳性血清室温孵育2h，用PBS洗涤后加入1∶5000稀释的兔抗鸡IgG-HRP抗体(EarthOx)室温孵育1h，然后用DAB显色试剂盒(康为世纪)显色，观察结果。

SDS-PAGE分析结果显示，菌体沉淀中于大约63kDa处可见明显的目的条带，而菌液上清中目的条带不明显；Western-blot蛋白印记分析显示，于63kDa处可见明显单一的目的条带，表明重组蛋白可以与IBDV抗体发生特异性反应(见图3)。实施例3ELISA试剂盒的设计与应用

3.1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的选择

按方阵滴定法进行，以PBST缓冲液(pH7.4)将抗原蛋白分别稀释至终浓度为4.0μg/mL、2.0μg/mL、1.0μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL和0.125μg/mL，4℃过夜包被酶标板(JET)。用PBST缓冲液(pH7.4)洗涤后加入以PBST缓冲液(pH7.4)以1∶50、1∶100、1∶200、1∶400稀释的IBDV阳性血清和阴性血清，每个稀释度重复3次，取平均值，计算各条件下的P/N值(阳性OD值和阴性OD值)，选择P/N值最大的反应条件作为ELISA最佳反应条件。结果为抗原最佳包被浓度2.0μg/mL，血清最佳稀释度为1∶100(见表1)。

表1抗原包被浓度和血清工作浓度

3.2封闭作用时间的选择

以3.1中确定的最佳抗原浓度即2.0μg/mL包被酶标板(JET)，用PBST缓冲液(pH7.4)洗涤后，加入封闭液(含5％脱脂奶粉的PBST缓冲液稀释，pH7.4)，37℃分别作用1h、2h和3h，检测IBDV阳性血清和阴性血清，每个样品重复3次，取平均值，计算P/N值(阳性OD值和阴性OD值)。选择P/N值最大的2.0h作为封闭最佳作用时间(见表2)。

表2封闭时间

3.3待检血清作用时间的选择

按上述条件包被、封闭酶标板(JET)，检测IBDV阳性血清和阴性血清，37℃分别作用0.5h、1h和1.5h，对其进行ELISA测定，每个样品重复3次，取平均值，计算P/N值(阳性OD值和阴性OD值)。选择P/N值最大的1.5h作为血清最佳作用时间(见表3)。

表3待检血清作用时间

3.4二抗工作浓度的选择

按上述条件包被、封闭、加样、洗涤后分别加入1∶2000、1∶4000、1∶8000和1∶16000稀释的兔抗鸡IgG-HRP酶标二抗抗体(EarthOx)，进行ELISA测定，每个样品重复3次，取平均值，计算P/N值(阳性OD值和阴性OD值)。选择P/N值最大的1∶4000作为最佳工作浓度(见表4)。

表4二抗工作浓度

3.5二抗作用时间的选择

按上述条件包被、封闭、加样、洗涤后，加入1∶4000稀释的兔抗鸡IgG-HRP酶标二抗抗体(EarthOx)，37℃分别作用0.5h、1h和1.5h，进行ELISA测定，每个样品重复3次，取平均值，计算P/N值(阳性OD值和阴性OD值)。选择以P/N值最大的1.0h作为二抗最佳作用时间(见表5)。

表5二抗作用时间

3.6显色时间的选择

按上述选择的最佳条件进行ELISA试验，加入TMB(北京全式金生物技术有限公司)后分别显色5min、10min、15min和20min，进行ELISA测定，每个样品重复3次，取平均值，计算P/N值(阳性OD值和阴性OD值)。选取以P/N值最大的10min作为最佳显色时间(见表6)。

表6底物显色时间

3.7间接ELISA临界值的确定

将经IDEXX公司IBDV抗体检测试剂盒检测IBDV抗体为阴性的SPF鸡血清样品26份，用建立的ELISA方法检测。计算OD₄₅₀平均值为0.124，标准方差为0.026。根据临界值的计算公式＝阴性样品OD₄₅₀平均值+3×标准方差，计算出阴阳临界值为0.202。即血清样品的OD₄₅₀≥0.202，可判定为阳性；OD₄₅₀＜0.202，可判定为阴性。

3.8 ELISA重复性试验

使用3批蛋白包被酶标板，选用6份IBDV抗体阳性血清和2份IBDV进行批内和批间重复性试验，计算变异系数，以验证本发明ELISA方法的重复性，结果表明批内变异系数＜7％，批间变异系数＜15％，证明该法具有良好的重复性。

3.9 ELISA敏感性和特异性试验

将IBDV抗体阳性血清和阴性血清连续倍比稀释，进行ELISA检测，计算P/N值，直到1∶40 960稀释仍为阳性，证明该方法具有很高的敏感性；用该ELISA方法对禽类易感的禽流感病毒(H5亚型)、禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒的标准阳性血清(中国兽医药品监察所)进行检测，结果均为阴性，证明该方法具有良好的特异性。

3.10临床血清样品的检测

应用本研究建立的ELISA试剂盒对463份临床血清样品进行检测，以3.7中确定的判定标准为依据对检测结果进行判定，阳性率为83.6％(387/463)。

3.11 ELISA试剂盒组装

ELISA试剂盒包含酶标板(JET)、重组VP2-VP1蛋白、阴性对照血清、阳性对照血清、兔抗鸡IgG-HRP酶标二抗抗体(EarthOx)、TMB显色液(北京全式金生物技术有限公司)、终止液、封闭液、洗涤液。

综上，本发明首次将IBDV VP2蛋白和VP1蛋白的串联融合表达作为抗原进行IBDV抗体的检测。选用的VP2蛋白是IBDV主要的宿主保护性抗原，与病毒的毒力相关，而VP1蛋白也能影响病毒的毒力，以串联VP2-VP1蛋白作为诊断抗原，能够简便、快速、准确的检测IBDV抗体。本发明构建了表达重组融合蛋白VP2-VP1的重组表达载体，并将其表达的重组融合蛋白VP2-VP1用于建立IBDV抗体ELISA检测方法，初步应用结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性；该试剂盒检测与对禽类易感的禽流感病毒(H5亚型)、禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒的阳性血清均为阴性，特异性良好；将IBDV抗体阳性血清和阴性血清连续倍比稀释，计算P/N值，直到1∶40 960仍为阳性，证明该方法具有很高的敏感性；经检查批内变异系数小于7％，批间变异系数小于15％，证明本方法具有很好的重复性。这将为进一步研究IBDV感染后抗体产生规律、临床感染情况的监测奠定基础。

Claims

1.一种传染性法氏囊病病毒重组融合蛋白VP2-VP1，其特征在于：由VP1和VP2基因串联而成的VP2-VP1融合基因所编码。

2.根据权利要求1所述的传染性法氏囊病病毒重组融合蛋白VP2-VP1，其特征在于：所述VP2-VP1融合基因具有序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列。

3.根据权利要求2所述的传染性法氏囊病病毒重组融合蛋白VP2-VP1，其特征在于具有序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列。

4.权利要求1所述的传染性法氏囊病病毒重组融合蛋白VP2-VP1的制备方法，其特征在于通过将VP2、VP1基因主要抗原区域基因片段串联，克隆入原核表达载体pET-32a得到重组表达载体pVP2-VP1，将该重组表达载体pVP2-VP1转入大肠杆菌BL21(DE3)，该重组大肠杆菌经0.5mM IPTG诱导表达，经Ni柱亲和层析纯化获得重组融合蛋白VP2-VP1。

5.根据权利要求4所述传染性法氏囊病病毒重组融合蛋白VP2-VP1的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)从传染性法氏囊病病毒主要流行株NN1172病毒株提取病毒基因组总RNA，经RT-PCR扩增得到目的基因片段VP2、VP1，通过融合PCR扩增得到串联目的基因片段VP2-VP1，通过限制性酶切位点经融合PCR方法将所述基因片段进行融合并克隆入原核表达载体中，通过酶切和测序鉴定，获得重组表达载体pVP2-VP1；

(2)将重组表达载体pVP2-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌BL21-VP2-VP1：

(3)培养重组大肠杆菌BL21-VP2-VP1至OD₆₀₀为0.6时加入终浓度为0.5mM IPTG诱导表达，经Ni柱亲和层析纯化获得所述重组融合蛋白VP2-VP1。

6.根据权利要求5所述传染性法氏囊病病毒重组融合蛋白VP2-VP1的制备方法，其特征在于步骤(1)中PCR扩增基因片段VP2、VP1所用引物分别为：

VP2F：CGCGGATCCATGACAAACCTGCAAGATCAAACCC；

VP2R：CCCCGAATTCTGTAATTGTCACTCCACCTGCTTGG；

VP1F：CCCCGAATTCGAGATCCTTGCCGAACTGAAC；

VP1R：CCCGCTCGAGCTATTGGCGGCTCTCCTTCTG。

7.权利要求1所述传染性法氏囊病病毒重组融合蛋白VP2-VP1作为抗原在制备检测传染性法氏囊病病毒抗体的ELISA检测试剂盒中的应用。