CN106497944B - 一种VP2融合基因、重组狂犬病病毒感染性cDNA克隆及其构建方法 - Google Patents

一种VP2融合基因、重组狂犬病病毒感染性cDNA克隆及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供具体涉及一种VP2融合基因、重组狂犬病病毒感染性cDNA克隆及其构建方法，属于分子生物学领域。VP2融合基因序列如SEQ ID NO:1所示。该感染性cDNA克隆是在携带单拷贝VP2融合基因的重组狂犬病病毒感染性cDNA克隆pHEP‑rVP2''基础上，在其基因组G基因和VP2基因之间再插入一个拷贝的VP2融合基因所得到。重组感染性cDNA克隆pHEP‑rVP2''是在HEP‑Flury株基因组的G基因和L基因之间插入VP2融合基因后得到的。

Description

一种VP2融合基因、重组狂犬病病毒感染性cDNA克隆及其构建 方法
技术领域
本发明属于分子生物领域，具体涉及一种VP2融合基因、重组狂犬病病毒感染性cDNA克隆pHEP-rdVP2及其构建方法。
背景技术
狂犬病病毒（Rabies virus，RV）引起的狂犬病（Rabies），一旦发病致死率几乎高达100%，我国是狂犬病的高发区，发病人数仅次于印度。目前对于狂犬病，主要以有效的疫苗防治为主，人或者动物一旦发病，无特效药可治。犬只成为我国狂犬病的主要带毒宿主和传染源，消灭人狂犬病，就必须减少流浪狗的数量，普及家养犬只的免疫，使其免疫率达到70%以上，先在动物中消灭狂犬病。现有技术中的兽用灭活狂犬疫苗，成本高、免疫后效果仍然不能让人满意。
犬细小病毒性肠炎引起成年犬严重胃肠炎和幼犬心肌炎。CPV（犬细小病毒）灭活疫苗所诱导的血清抗体效价不高。虽然弱毒苗的效果比较理想，但是弱毒株可能发生突变、毒力返强现象。
犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）粒子呈20面体轴对称，大小25nm，其衣壳蛋白由VP1、VP2 和VP3三种结构蛋白构成。VP2由8个反向平行的β片层基序和4个展示在外的多肽loop组成， loop1和loop3上集中了CPV主要的B细胞表位。已有研究证明仅VP2蛋白可自行组装成犬细小病毒样粒子，loop1、loop3和loop4对于病毒样粒子的组装起主要作用，而loop2可容许插入外源性抗原表位，不影响病毒粒子装配，且能将外源表位展示在病毒样粒子表面。
发明内容
本发明的目的是提供一种VP2融合基因。
本发明的再一目的是提供携带所述双拷贝融合基因的重组狂犬病病毒感染性cDNA克隆rHEP-rdVP2。
本发明的另一目的是提供重组狂犬病病毒感染性cDNA克隆rHEP-rdVP2的构建方法，该方法简单、高效、安全。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种VP2融合基因，是将狂犬病毒中和线性抗原表位序列替代犬细小病毒VP2基因部分序列后得到的，所述VP2融合基因的序列如SEQ ID NO：1所示。
含有所述融合基因的质粒、细胞。
本发明还提供携带双拷贝VP2融合基因的重组狂犬病病毒感染性cDNA克
隆pHEP-rdVP2，是在重组狂犬病病毒感染性cDNA克隆pHEP-rVP2''基因组的G基因和VP2融合基因之间再插入一个拷贝VP2融合基因后得到的。
本发明提供重组狂犬病病毒感染性cDNA克隆pHEP-rVP2''，是在含有狂犬
病病毒HEP-Flury株感染性cDNA克隆中的G基因和L基因之间插入VP2融合基因后得到的。
本发明还提供所述重组狂犬病病毒感染性cDNA克隆pHEP-rdVP2的构建方法，包括：利用核酸限制性内切酶BsiW I和PstI，分别对VP2融合基因和pHEP-rVP2''质粒进行酶切，然后将两者的酶切片段连接，在重组感染性cDNA克隆pHEP-rVP2'中插入VP2融合基因，构建携带双拷贝VP2融合基因的重组质粒pHEP-rdVP2
本发明还提供重组感染性cDNA克隆pHEP-rVP2'的构建方法，优选的技术方案中，利用核酸限制性内切酶BsiWI和NheI，分别对VP2融合基因和pHEP-3.0质粒进行酶切，然后将两者的酶切片段连接，获得所述重组质粒pHEP-rVP2'。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供携带两个拷贝融合基因的重组狂犬病病毒感染性cDNA克隆rHEP-rdVP2，由于设计上在G后面第一个VP2融合基因尾部加入了转录终止信号U7序列和下一个VP2融合基因的转录起始信号UUGU序列，该克隆携带的两个拷贝VP2融合基因可以单独表达。此外，以狂犬病毒线性中和抗原表位序列替代VP2基因的loop2部分序列，可以在有效表达犬细小病毒VP2融合蛋白基础上展示线性中和表位，该设计有利于提高VP2融合蛋白的表达量，提高狂犬病毒中和抗体和犬细小病毒中和抗体诱导能力。本发明重组狂犬病病毒rHEP-rdVP2株的构建方法，简单、高效、安全。
附图说明
图1为VP2融合基因构建策略。
图2为pHEP-rVP2'质粒的构建示意图。
图3为pHEP-rVP2'质粒酶切鉴定电泳图，M为DL15000, 1，2：pHEP-rVP2'阳性质粒酶切片段。
图4 为pHEP-rdVP2质粒PCR鉴定电泳图，M为DL2000, 1，2,3：PCR扩增VP2目的片段。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 VP2融合基因的构建
采用狂犬病病毒（RV） G蛋白第253-275位点之间的线性中和表位（PPDQLVNLHDFRSDEIEHLVVEE）的编码序列替换VP2基因中loop2的第684-686位点之间的序列，构建VP2融合基因，如图1所示。VP2融合基因的序列如SEQ ID NO: 1所示。
1.引物设计
根据 Genbank注册的犬细小病毒VP2基因上、下游序列，设计扩增VP2基因完整序列的正向引物dVP2-P1和反向引物dVP2-P4，正向引物引入BsiWⅠ和Pst I酶切位点，反向引物引入NheⅠ酶切位点，引物序列如下：
dVP2-P1:5-AGTCGTACGATTCTGCAGATGAGTGATGGA-3；
dVP2-P4: 5-CCTGCTAGCTTAATATAATTT-3。
根据VP2基因中loop2的第684-686位点上、下游序列，设计引物23aa-P2和23aa-P3。引物23aa-P2和23aa-P3带有狂犬病病毒（RV）G蛋白第253-275位点之间线性中和表位的编码序列。
23aa-P2：5'-TCTGAGCGAAAGTCGTGCAAATTCACCAACTGACCTGGAGGAGTTCCAGTATGA-3'，
23aa-P3：5'-ACTTTCGCTCAGACGAGATTGAGCATCTCGTTGAGGAAGAGAGTGGCACACCA-3'。
2.VP2融合基因的构建
抽提犬细小病毒（2a亚型毒株）的基因组DNA。
（1）以犬细小病毒基因组DNA为模板，采用引物dVP2-P1和23aa-P2 进行PCR扩增，所得片段命名为P1P2片段。PCR扩增体系如表1：
表1
犬细小病毒基因组DNA 4μL
10×rTaq Buffer 2.5μL
2.5mMdNTP 2μL
VP2-P1（20pmol） 各1μL
23aa-P2（20pmol） 各1μL
rTaq 0.125μL
ddH<sub>2</sub>O 14.375μL
Total 25μL
（2）以犬细小病毒基因组DNA为模板，采用引物23aa-P3和dVP2-P4进行PCR扩增，所得片段命名为P3P4片段。PCR体系如表2：
表2
犬细小病毒基因组DNA模板 4μL
10×rTaq Buffer 2.5μL
2.5mMdNTP 2μL
VP2-P4（20pmol） 各1μL
23aa-P3（20pmol） 各1μL
rTaq 0.125μL
ddH<sub>2</sub>O 14.375μL
Total 25μL
（3）以P1P2片段和P3P4片段为模板，采用引物VP2-P1和VP2-P4进行PCR扩增，得到VP2融合基因。PCR体系如表3：
表3
P1P2片段和P3P4片段 各4μL
10×rTaq Buffer 2.5μL
2.5mMdNTP 2μL
dVP2-P1（20pmol） 各1μL
dVP2-P4（20pmol） 各1μL
rTaq 0.125μL
ddH<sub>2</sub>O 10.375μL
Total 25μL
（4）参照Omega公司的凝胶回收试剂盒（E.Z.N.A. Gel Extraction KitI）使用说明书对PCR产物进行切胶回收、纯化，回收片段与克隆载体pTA2（Takara公司）进行连接。连接反应体系如表4所示：
表4
2×Ligation Buffer 5μL
PCR纯化产物 4μL
pTA2 1μL
Total 10μL
（5）连接产物转化DH5α感受态细胞，抽提重组质粒，酶切鉴定正确。将质粒送测序，结果成功构建VP2融合基因。
实施例2 VP2融合基因克隆至HEP-Flury株全长cDNA
将VP2融合基因插入HEP-Flury株全长cDNA中G基因和L基因之间假基因区域的BsiWI和NheI酶切位点之间，构建重组质粒pHEP- rVP2''，策略见图2所示。具体方法如下：
将PCR扩增的VP2融合基因进行切胶回收、纯化，将纯化的VP2基因和pHEP-3.0质粒（携带HEP-Flury毒株全长cDNA的重组质粒，构建方法见Ito N., Takayama I. M., YamadaK., et al. Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using avaccinia virus-free reverse genetics system [J]. Microbiology and Immunology,2003, 47 (8):613-617.）用Bsi WI和NheI核酸限制性内切酶进行双酶切，酶切体系如表5所示：
表5
VP2融合基因/pHEP-3.0 4µL
10×Tango buffer 2µL
<i>Nhe </i>I 1µL
<i>Bsi </i>WI 1µL
ddH<sub>2</sub>O 13µL
Total 20µL
上述体系混匀后，先37℃孵育3h，用凝胶回收试剂盒进行回收。将回收产物连接，连接体系如表6所示：
表6
VP2融合基因酶切产物 7µL
pHEP-3.0酶切产物 1µL
T4 DNA连接酶10×Buffer 1µL
T4 DNA连接酶 1µL
Total 10µL
上述体系混匀后，置于连接仪中，22℃连接24h，连接产物转化XL10-Gold感受态细胞，筛选阳性克隆，抽提重组质粒，用BsiWI/NheI进行酶切鉴定，酶切体系如表7所示：
表7
重组质粒 5µL（约1μg）
10×Tango Buffer 2µL
BsiWI 1µL
NheI 1µL
ddH<sub>2</sub>O 11µL
Total 20µL
将酶切体系混匀，37℃水浴2h。电泳检测酶切产物，以pHEP-3.0质粒做为对照，见图3，结果正确。
经质粒抽提和酶切鉴定正确的质粒送上海英骏生物工程有限公司进行序列测定，将鉴定正确的质粒命名为pHEP- rVP2''。将含有质粒pHEP- rVP2''的克隆参照Qiagen公司质粒中量提取试剂盒说明书进行去内毒素中提pHEP- rVP2''重组质粒，4℃保存待用。
实施例3 利用重组质粒pHEP-rVP2''构建携带双拷贝VP2融合基因的重组病毒感染性cDNA克隆pHEP-rdVP2
1、利用实施例2中构建的重组质粒pHEP-rVP2''构建pHEP-rdVP2，构建方案见图4。
（1）以pHEP-rVP2''质粒为模板，利用上游引物dVP2.F（AGTCGTACGATGAGTGATGGA）和下游引物dVP2.R（序列为：CTGCTAGCAACTGCAGAAAGGTGTTAGTTTTTTTCCTTAATATAATTT）进行PCR扩增。
在上游引物dVP2.F中，加入BsiWI酶切位点。
下游引物在引入Pst I 酶切位点及U7终止信号序列和UUGU起始信号序列。
这对引物以pHEP-Flury(VP2)质粒为模板。
PCR反应条件：94℃ 2min；94℃ 30s，54.5℃ 30s，68℃ 1.5min，运行25个循环；68℃延伸10min。
反应结束后，-20℃保存或直接取5µL PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶(含0.5µg/mLEB)进行电泳检测，大小正确，产物命名为dVP2。
（2）产物的dVP2和pHEP-rVP2''质粒分别用Bsi WI/Pst I进行双酶切，将酶切产物连接，转化XL10-gold感受态细胞，筛选阳性克隆pHEP-rdVP2。
以小量碱裂解法抽提质粒，HEP-rdVP2质粒进行PCR鉴定，见图4。
（3）将酶切正确的质粒送上海英骏生物工程有限公司进行序列测定，正确，质粒命名为pHEP-rdVP2。
将酶切鉴定和测序均正确的克隆参照Qiagen公司质粒中量提取试剂盒说明书进行去内毒素中提重组质粒pHEP-rdVP2)。待拯救用。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种VP2融合基因、重组狂犬病病毒感染性cDNA克隆及其构建方法
<130> 20161031
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1824
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> VP2融合基因
<400> 1
atgagtgatg gagcagttca accagacggt ggtcaacctg ctgtcagaaa tgaaagagca 60
acaggatctg ggaacgggtc tggaggcggg ggtggtggtg gttctggggg tgtggggatt 120
tctacgggta ctttcaataa tcagacggaa tttaaatttt tggaaaacgg atgggtggaa 180
atcacagcaa actcaagcag acttgtacat ttaaatatgc cagaaagtga aaattataga 240
agagtggttg taaataattt ggataaaact gcagttaacg gaaacatggc tttagatgat 300
actcatgcac aaattgtaac accttggtca ttggttgatg caaatgcttg gggagtttgg 360
tttaatccag gagattggca actaattgtt aatactatga gtgagttgca tttagttagt 420
tttgaacaag aaatttttaa tgttgtttta aagactgttt cagaatctgc tactcagcca 480
ccaactaaag tttataataa tgatttaact gcatcattga tggttgcatt agatagtaat 540
aatactatgc catttactcc agcagctatg agatctgaga cattgggttt ttatccatgg 600
aaaccaacca taccaactcc atggagatat tattttcaat gggatagaac attaatacca 660
tctcatactg gaactcctcc aggtcagttg gtgaatttgc acgactttcg ctcagacgag 720
attgagcatc tcgttgagga agagagtggc acaccaacaa atatatacca tggtacagat 780
ccagatgatg ttcaatttta tactattgaa aattctgtgc cagtacactt actaagaaca 840
ggtgatgaat ttgctacagg aacatttttt tttgattgta aaccatgtag actaacacat 900
acatggcaaa caaatagagc attgggctta ccaccatttc tgaattcttt gcctcaagct 960
gaaggaggta ctaactttgg ttatatagga gttcaacaag ataaaagacg tggtgtaact 1020
caaatgggaa atacaaacta tattactgaa gctactatta tgagaccagc tgaggttggt 1080
tatagtgcac catattattc ttttgaggcg tctacacaag ggccatttaa aacacctatt 1140
gcagcaggac gggggggagc gcaaacagat gaaaatcaag cagcagatgg tgatccaaga 1200
tatgcatttg gtagacaaca tggtcaaaaa actaccacaa caggagaaac acctgagaga 1260
tttacatata tagcacatca agatacagga agatatccag aaggagattg gattcaaaat 1320
attaacttta accttcctgt aacagaagat aatgtattgc taccaacaga tccaattgga 1380
ggtaaaacag gaattaacta tactaatata tttaatacct atggtccttt aactgcatta 1440
aataatgtac caccagttta tccaaatggt caaatttggg ataaagaatt tgatactgac 1500
ttaaaaccaa gacttcatgt aaatgcacca tttgtttgtc aaaataattg tcctggtcaa 1560
ttatttgtaa aagttgcgcc taatttaaca aatgaatatg atcctgatgc atctgctaat 1620
atgtcaagaa ttgtaactta ctcagatttt tggtggaaag gtaaattagt atttaaagct 1680
aaactaagag cctctcatac ttggaatcca attcaacaaa tgagtattaa tgtagataac 1740
caatttaact atgtaccaag taatattgga ggtatgaaaa ttgtatatga aaaatctcaa 1800
ctagcaccta gaaaattata ttaa 1824

Claims (3)

1.携带双拷贝VP2融合基因的重组狂犬病病毒感染性cDNA克隆pHEP-rdVP2，其特征在于，是在重组狂犬病病毒感染性cDNA克隆pHEP-rVP2''基因组的G基因和VP2融合基因之间的Bsi WI和Pst I酶切位点之间再插入所述VP2融合基因后得到的；所述VP2融合基因是将编码狂犬病毒中和线性抗原表位序列的基因序列替代犬细小病毒VP2基因部分序列后得到的，所述VP2融合基因的序列如SEQ ID NO：1所示；所述的重组狂犬病病毒感染性cDNA克隆pHEP-rVP2''是在pHEP-3.0质粒中的含有狂犬病病毒HEP-Flury株感染性cDNA克隆中的G基因和L基因之间的Bsi WI和NheI酶切位点之间插入所述VP2融合基因后得到的。
2.权利要求1所述重组狂犬病病毒感染性cDNA克隆pHEP-rdVP2的构建方法，其特征在于：利用核酸限制性内切酶BsiWI和PstI，分别对VP2融合基因和pHEP-rVP2''质粒进行酶切，然后将两者的酶切片段连接，在重组感染性cDNA克隆pHEP-rVP2''中插入所述VP2融合基因，构建携带双拷贝VP2融合基因的重组质粒pHEP-rdVP2；所述VP2融合基因的序列如SEQID NO：1所示。
3.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于利用核酸限制性内切酶BsiWI和NheI，分别对VP2融合基因和pHEP-3.0质粒进行酶切，然后将两者的酶切片段连接，获得所述重组质粒pHEP-rVP2''。
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Title
含绿色荧光蛋白基因的伪狂犬病毒fa株重组猪细小病毒VP2基因表达载体的构建;罗燕等;《四川农业大学学报》;20051230;第23卷(第2期);232-237页 *
重组猪细小病毒VP2基因的猪伪狂犬病病毒rPRV-VP2株的构建及纯化;付朋飞等;《中国兽医学报》;20160930(第9期);1476-1483页 *

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