CN106497951B - 一种VP2融合基因、重组狂犬病病毒rHEP-rVP2株、构建方法及其应用 - Google Patents

一种VP2融合基因、重组狂犬病病毒rHEP-rVP2株、构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种VP2融合基因、重组狂犬病病毒rHEP‑rVP2株、构建方法及其应用，属于微生物免疫学领域。VP2融合基因序列如SEQ ID NO:1所示。重组狂犬病病毒rHEP‑rVP2株，是在HEP‑Flury株基因组的G基因和L基因之间插入VP2融合基因后得到的。重组狂犬病病毒rHEP‑rVP2株构建方法，包括在HEP‑Flury株全长cDNA中插入VP2融合基因构建重组质粒，转染宿主细胞，拯救病毒，得到rHEP‑rVP2株。重组狂犬病病毒rHEP‑rVP2株，与亲本株具有相似的病毒滴度，具有较好的免疫原性，免疫后能够产生较高水平针对狂犬病病毒和犬细小病毒抗体，可作为二价疫苗候选毒株。

Description

一种VP2融合基因、重组狂犬病病毒rHEP-rVP2株、构建方法及 其应用
技术领域
本发明属于微生物免疫学领域，具体涉及一种VP2融合基因、重组狂犬病病毒rHEP-rVP2株、构建方法及其应用。
背景技术
狂犬病病毒（Rabies virus，RV）引起的狂犬病（Rabies），一旦发病致死率几乎高达100%，我国是狂犬病的高发区，发病人数仅次于印度。目前对于狂犬病，主要以有效的疫苗防治为主，人或者动物一旦发病，无特效药可治。犬只成为我国狂犬病的主要带毒宿主和传染源，消灭人狂犬病，就必须减少流浪狗的数量，普及家养犬只的免疫，使其免疫率达到70%以上，先在动物中消灭狂犬病。现有技术中的兽用灭活狂犬疫苗，成本高、免疫后效果仍然不能让人满意。
犬细小病毒性肠炎引起成年犬严重胃肠炎和幼犬心肌炎。CPV（犬细小病毒）灭活疫苗所诱导的血清抗体效价不高。虽然弱毒苗的效果比较理想，但是弱毒株可能发生突变、毒力返强现象。
犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）粒子呈20面体轴对称，大小25nm，其衣壳蛋白由VP1、VP2 和VP3三种结构蛋白构成。VP2由8个反向平行的β片层基序和4个展示在外的多肽loop组成， loop1和loop3上集中了CPV主要的B细胞表位。已有研究证明仅VP2蛋白可自行组装成犬细小病毒样粒子，loop1、loop3和loop4对于病毒样粒子的组装起主要作用，而loop2可容许插入外源性抗原表位，不影响病毒粒子装配，且能将外源表位展示在病毒样粒子表面。
发明内容
本发明的目的是提供一种VP2融合基因。
本发明的再一目的是提供携带所述融合基因的重组狂犬病病毒rHEP-rVP2株，该毒株具有较好的免疫原性，免疫后能够产生较高水平针对狂犬病病毒和犬细小病毒的抗体。
本发明的另一目的是提供重组狂犬病病毒rHEP-rVP2株的构建方法，该方法简单、高效、安全。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种VP2融合基因，是将狂犬病毒中和线性抗原表位序列替代犬细小病毒VP2基因部分序列后得到的，所述VP2融合基因的序列如SEQ ID NO：1所示。
含有所述融合基因的质粒、细胞。
本发明还提供携带所述融合基因的重组狂犬病病毒rHEP-rVP2株，是在狂犬病病毒HEP-Flury株基因组的G基因和L基因之间插入所述VP2融合基因后得到的。
本发明还提供所述重组狂犬病病毒rHEP-rVP2株的构建方法，包括如下步骤：在狂犬病病毒HEP-Flury株全长cDNA中插入权利要求1所述VP2融合基因构建重组质粒pHEP-rVP2，转染宿主细胞，拯救病毒，得到重组狂犬病病毒rHEP-rVP2株。
优选的技术方案中，利用核酸限制性内切酶BsiWI和NheI，分别对VP2融合基因和pHEP-3.0质粒进行酶切，然后将两者的酶切片段连接，获得所述重组质粒pHEP-rVP2。
在本发明中，所述宿主细胞为BHK-21 细胞。
本发明还提供含有所述重组狂犬病病毒rHEP-rVP2株的疫苗。
本发明具有以下有益效果：
本发明携带所述融合基因的重组狂犬病病毒rHEP-rVP2株，该毒株以狂犬病病毒HEP-Flury为亲本株，有效表达犬细小病毒VP2融合蛋白，且该融合蛋白展示狂犬病毒中和线性抗原表位，具有更好的免疫原性，免疫后能够产生较高水平针对狂犬病病毒和犬细小病毒的抗体。重组狂犬病病毒rHEP-rVP2株，与亲本株HEP-Flury具相似的病毒滴度，可以降低犬用疫苗的成本。本发明重组狂犬病病毒rHEP-rVP2株的构建方法，简单、高效、安全。
附图说明
图1为VP2融合基因构建策略。
图2为pHEP-rVP2质粒的构建示意图。
图3为pHEP-rVP2质粒酶切鉴定电泳图，M为DL15000, 1，2：pHEP-rVP2阳性质粒酶切片段。
图4为携带VP2融合基因的重组病毒rHEP-rVP2拯救后免疫荧光鉴定结果
图5为RT-PCR 检测重组病毒rHEP-rVP2的传代稳定性。泳道1为F1代毒，泳道2为F10代毒，有条带且大小相符，泳道3为阴性对照，4孔为阳性对照
图6 为携带VP2融合基因的重组病毒rHEP-rVP2及亲本株HEP-Flury在BSR上的生长曲线。
图7为重组病毒rHEP-rVP2灭活疫苗组KM小鼠体内产生的针对狂犬病病毒抗体水平。
图8为重组病毒rHEP-rVP2灭活疫苗组KM小鼠体内产生的针对犬细小病毒抗体水平，同时设立CPV对照组。此图为血凝抑制实验结果，rHep-rVP2灭活疫苗组KM小鼠血清共三份，一份CPV阳性对照，每孔稀释度两孔重复，此图可以看出rHep-rVP2灭活疫苗组KM小鼠血清抗体效价为、29、29和210。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 VP2融合基因的构建
采用狂犬病病毒（RV） G蛋白第253-275位点之间的线性中和表位（PPDQLVNLHDFRSDEIEHLVVEE，SEQ ID NO:2））的编码序列替换VP2基因中loop2的第684-686位点之间的序列，构建VP2融合基因，如图1所示。VP2融合基因的序列如SEQ ID NO: 1所示。
1.引物设计
根据 Genbank注册的犬细小病毒VP2基因上、下游序列，设计扩增VP2基因完整序列的正向引物VP2-P1和反向引物VP2-P4，正向引物引入BsiWⅠ酶切位点，反向引物引入NheⅠ酶切位点，引物序列如下：
VP2-P1:5-AGTCGTACGATGAGTGATGGA-3；
VP2-P4: 5-CCTGCTAGCTTAATATAATTT-3。
根据VP2基因中loop2的第684-686位点上、下游序列，设计引物23aa-P2和23aa-P3。引物23aa-P2和23aa-P3带有狂犬病病毒（RV）G蛋白第253-275位点之间线性中和表位的编码序列。
23aa-P2：5'-TCTGAGCGAAAGTCGTGCAAATTCACCAACTGACCTGGAGGAGTTCCAGTATGA-3'
23aa-P3：5'-ACTTTCGCTCAGACGAGATTGAGCATCTCGTTGAGGAAGAGAGTGGCACACCA-3'
2.VP2融合基因的构建
抽提犬细小病毒（2a亚型毒株）的基因组DNA。
（1）以犬细小病毒基因组DNA为模板，采用引物VP2-P1和23aa-P2 进行PCR扩增，所得片段命名为P1P2片段。PCR扩增体系如表1：
表1
犬细小病毒基因组DNA 4μL
10×rTaq Buffer 2.5μL
2.5mMdNTP 2μL
VP2-P1（20pmol） 各1μL
23aa-P2（20pmol） 各1μL
rTaq 0.125μL
ddH<sub>2</sub>O 14.375μL
Total 25μL
（2）以犬细小病毒基因组DNA为模板，采用引物23aa-P3和VP2-P4进行PCR扩增，所得片段命名为P3P4片段。PCR体系如表2：
表2
犬细小病毒基因组DNA模板 4μL
10×rTaq Buffer 2.5μL
2.5mMdNTP 2μL
VP2-P4（20pmol） 各1μL
23aa-P3（20pmol） 各1μL
rTaq 0.125μL
ddH<sub>2</sub>O 14.375μL
Total 25μL
（3）以P1P2片段和P3P4片段为模板，采用引物VP2-P1和VP2-P4进行PCR扩增，得到VP2融合基因。PCR体系如表3：
表3
P1P2片段和P3P4片段 各4μL
10×rTaq Buffer 2.5μL
2.5mMdNTP 2μL
VP2-P1（20pmol） 各1μL
VP2-P4（20pmol） 各1μL
rTaq 0.125μL
ddH<sub>2</sub>O 10.375μL
Total 25μL
（4）参照Omega公司的凝胶回收试剂盒（E.Z.N.A. Gel Extraction KitI）使用说明书对PCR产物进行切胶回收、纯化，回收片段与克隆载体pTA2（Takara公司）进行连接。连接反应体系如表4所示：
表4
2×Ligation Buffer 5μL
PCR纯化产物 4μL
pTA2 1μL
Total 10μL
（5）连接产物转化DH5α感受态细胞，抽提重组质粒，酶切鉴定正确。将质粒送测序，结果成功构建VP2融合基因。
实施例2 VP2融合基因克隆至HEP-Flury株全长cDNA
将VP2融合基因插入HEP-Flury株全长cDNA中G基因和L基因之间假基因区域的NheI和Bsi WI酶切位点之间，构建重组质粒pHEP- rVP2，策略见图2所示。具体方法如下：
将PCR扩增的VP2融合基因进行切胶回收、纯化，将纯化的VP2基因和pHEP-3.0质粒（携带HEP-Flury毒株全长cDNA的重组质粒，构建方法见Ito N., Takayama I. M., YamadaK., et al. Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using avaccinia virus-free reverse genetics system [J]. Microbiology and Immunology,2003, 47 (8):613-617.）用NheI和Bsi WI核酸限制性内切酶进行双酶切，酶切体系如表5所示：
表5
VP2融合基因/pHEP-3.0 4µL
10×Tango buffer 2µL
<i>Nhe </i>I 1µL
<i>Bsi </i>WI 1µL
ddH<sub>2</sub>O 13µL
Total 20µL
上述体系混匀后，先37℃孵育3h，用凝胶回收试剂盒进行回收。将回收产物连接，连接体系如表6所示：
表6
VP2融合基因酶切产物 7µL
pHEP-3.0酶切产物 1µL
T4 DNA连接酶10×Buffer 1µL
T4 DNA连接酶 1µL
Total 10µL
上述体系混匀后，置于连接仪中，22℃连接24h，连接产物转化XL10-Gold感受态细胞，筛选阳性克隆，抽提重组质粒，用BsiWI/NheI进行酶切鉴定，酶切体系如表7所示：
表7
重组质粒 5µL（约1μg）
10×Tango Buffer 2µL
BsiWI 1µL
NheI 1µL
ddH<sub>2</sub>O 11µL
Total 20µL
将酶切体系混匀，37℃水浴2h。电泳检测酶切产物，以pHEP-3.0质粒做为对照，见图3，结果正确。
经质粒抽提和酶切鉴定正确的质粒送上海英骏生物工程有限公司进行序列测定，将鉴定正确的质粒命名为pHEP- rVP2。将含有质粒pHEP- rVP2的克隆参照Qiagen公司质粒中量提取试剂盒说明书进行去内毒素中提pHEP- rVP2重组质粒，4℃保存待用。
实施例3 利用重组质粒pHEP-rVP2进行重组病毒rHEP-rVP2 的拯救及筛选
1、转染和病毒筛选方法参照Ito（2003）的方法（Ito N., Takayama I. M.,Yamada K., et al. Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using avaccinia virus-free reverse genetics system [J]. Microbiology and Immunology,2003, 47 (8):613-617.）进行。
转染：
（1）准备BHK-21细胞：在12孔细胞培养板中加入BHK-21细胞，细胞密度为1×105个/孔，采用含10%胎牛血清的培养液在37℃培养12~16h，至细胞50%-60%汇合。转染前，用800μL PBS缓冲液洗涤细胞一次。
（2）取1.25µg 重组质粒pHEP-rVP2，0.625µg pH-N，0.3125µg pH-P，0.125µg pH-L和0.1875µg pH-G混匀在1.5mL离心管中，添加灭菌去离子水至75μL，瞬时离心，使得管顶部的液滴进入溶液中。
其中，pH-N、pH-P、pH-L和pH-G为辅助质粒，用以辅助拯救重组病毒。
（3）在步骤（2）处理后的离心管中，添加7.5μL转染试剂（Superfect TransfectionReagent购自QIAGEN公司），漩涡震荡器上震荡10s。
（4）将步骤（3）处理后的离心管室温静置15min，添加400μL含10%胎牛血清和双抗（青霉素、链霉素）（100IU/mL）的DMEM于离心管中，上下颠倒管几次，混匀。
（5）将步骤（4）处理后的溶解液加入细胞（12孔培养板中的一孔），37℃培养2.5~3h，靠板壁轻轻吸去DMEM，用PBS洗涤细胞一次，重新添加DMEM（含10%胎牛血清和双抗）。在37℃、5%CO2培养箱中培养48h，细胞95%长满后转入34℃培养96h。
病毒筛选：
（1）用锡箔纸包住转染后的细胞板，-70℃反复冻融细胞3次，每次冷冻时间1h，室温溶解。取60μL上清液和60μL新鲜的BHK-21细胞（细胞密度为4×105个/mL）混合于96孔板，其后在37℃培养48h，34℃培养96h。
（2）倾去细胞培养液，每孔加满80%预冷的丙酮，快速倾去丙酮，再次加满丙酮，锡箔纸包住培养板，置-20℃ 1h。弃去丙酮，轻微空干，每孔添加25μL抗狂犬病病毒N蛋白荧光抗体（购自Centocor公司）以及抗CPV荧光抗体（购自Centocor公司），37℃孵育1h，弃去溶解液，用1×PBS洗涤细胞两次，每次5min，再用去离子水快速洗涤细胞一次。
自然干燥，荧光显微镜下观察，可见大量绿色荧光斑点，见图4。证明，病毒拯救成功，命名为rHEP-rVP2株。
实施例4 重组病毒rHEP-rVP2的传代和鉴定
1、将-80℃保存的狂犬病病毒HEP-Flury株与rHEP-rVP2株取出，检测病毒滴度，低于105FFU/mL的病毒使用同单层细胞接种培养法进行传代。在六孔细胞培养皿中加入新鲜消化的BSR细胞约 2×105个/mL，按病毒液体积:培养液总体积=1:10进行接毒。细胞在 37℃、CO2 培养箱中培养约 48h，待细胞长满后再放入34℃、CO2培养箱中培养约96h。在-80℃/室温冻融细胞1次，收获病毒，分装-80℃保存备用。依次传代至第10次，检测病毒滴度、RT-PCR扩增VP2融合基因，同时对扩增片段进行序列测定。
2、狂犬病病毒HEP-Flury株与rHEP-rVP2株的病毒滴度达106FFU/mL。 rHEP-rVP2株RT-PCR产物的电泳图中出现了约1800bp条带，与VP2融合基因大小相符，检测结果正确，如图5所示。RT-PCR产物的序列检测结果正确，没有发现任何突变。上述结果表明，本发明的重组病毒rHEP-rVP2可以稳定传代。
实施例5 重组病毒rHEP-rVP2在BSR细胞上的体外生长研究
1、用细胞营养液调整BSR细胞密度为2×105/mL，将狂犬病毒HEP-Flury株和rHEP-rVP2 株病毒分别按照MOI (multiplicity of infection)为 0.1接种细胞，于5% CO2 、37℃培养箱中培养24h，当细胞完全汇合时转移至34℃培养72h，共培养96h；每隔24h收集100μL上清培养液并进行直接免疫荧光抗体检测（方法参考谭业平等.荧光素酶标记狂犬病病毒的反向遗传学.中国兽医学报,2010,30(7):936-940.），测定不同时间的病毒滴度，绘制成生长曲线。
2、结果显示，重组病毒滴度与亲本株滴度相似，见图6。病毒的一步生长曲线表明rHEP-rVP2与亲本株HEP-Flury相比较生长特性基本一致。
实施例6 重组病毒rHEP-rVP2在KM小鼠体内的免疫原性研究
1、狂犬病病毒的灭活和灭活疫苗的制备：
（1）将rHEP-rVP2株病毒液的滴度稀释为1×107 FFU/mL，按体积比1:4000的比例加入β-丙内脂，4℃放置 24h，再置于37℃水解2h。将灭活后的rHEP-rVP2株病毒液、未灭活的rHEP-rVP2株病毒液分别与BSR细胞共同培养在96孔细胞培养板上，37 ℃、5% CO2培养箱内培养4 d后，进行固定和荧光染色，在荧光显微镜下观察各组有无荧光点及细胞状态。结果灭活病毒无荧光斑点，未灭活病毒均有绿色荧光斑点。
（2）参照法国赛比克公司ESSAL GEL佐剂说明书推荐的方法进行灭活疫苗的制备：在超净工作台内将ESSAL GEL佐剂和已检测合格的rHEP-rVP2株灭活狂犬病毒液按照佐剂在总重量的比例(w/w)为10%混合。在磁力搅拌器上以300 r/min的速度搅拌10 min，得到rHEP-rVP2株灭活疫苗，然后将配好的疫苗分装于灭菌的玻璃瓶内，加盖密封，置于4 ℃保存备用。
按照上述相同方法，制备亲本株HEP-Flury株灭活疫苗。
2.免疫接种实验
6~8 周龄的清洁级昆明系雌性小鼠分为4组，即HEP-Flury株灭活疫苗组、rHEP-rVP2株灭活疫苗组，犬细小病毒灭活疫苗组和空白对照组，免疫组每组25只，空白对照组10只。免疫组每只小鼠肌注100μL疫苗(注射剂量约为106FFU/只)，空白对照组肌注100μLDMEM。
于免疫后21d尾静脉采血制备血清，采用ELISA试剂盒（购自法国SYNOBIOTICS 公司）分别进行狂犬病病毒抗体检测和犬细小病毒HI抗体检测。
2、结果
如图7，rHEP-rVP2株灭活疫苗组针对狂犬病病毒的平均抗体水平为12.8EU，HEP-Flury株灭活疫苗组针对狂犬病病毒的平均抗体水平为11.5EU，重组病毒能产生相当于亲本株的狂犬病抗体，且均大于0.6 EU/mL，被认为是具有抗狂犬病病毒保护力的。
如图8，rHEP-rVP2株灭活疫苗组针对犬细小病毒的平均HI抗体水平为1:29，与犬细小病毒疫苗对照组HI抗体相当。
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<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种VP2融合基因、重组狂犬病病毒rHEP-rVP2株、构建方法及其应用
<130> 20161031
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1824
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> VP2融合基因
<400> 1
atgagtgatg gagcagttca accagacggt ggtcaacctg ctgtcagaaa tgaaagagca 60
acaggatctg ggaacgggtc tggaggcggg ggtggtggtg gttctggggg tgtggggatt 120
tctacgggta ctttcaataa tcagacggaa tttaaatttt tggaaaacgg atgggtggaa 180
atcacagcaa actcaagcag acttgtacat ttaaatatgc cagaaagtga aaattataga 240
agagtggttg taaataattt ggataaaact gcagttaacg gaaacatggc tttagatgat 300
actcatgcac aaattgtaac accttggtca ttggttgatg caaatgcttg gggagtttgg 360
tttaatccag gagattggca actaattgtt aatactatga gtgagttgca tttagttagt 420
tttgaacaag aaatttttaa tgttgtttta aagactgttt cagaatctgc tactcagcca 480
ccaactaaag tttataataa tgatttaact gcatcattga tggttgcatt agatagtaat 540
aatactatgc catttactcc agcagctatg agatctgaga cattgggttt ttatccatgg 600
aaaccaacca taccaactcc atggagatat tattttcaat gggatagaac attaatacca 660
tctcatactg gaactcctcc aggtcagttg gtgaatttgc acgactttcg ctcagacgag 720
attgagcatc tcgttgagga agagagtggc acaccaacaa atatatacca tggtacagat 780
ccagatgatg ttcaatttta tactattgaa aattctgtgc cagtacactt actaagaaca 840
ggtgatgaat ttgctacagg aacatttttt tttgattgta aaccatgtag actaacacat 900
acatggcaaa caaatagagc attgggctta ccaccatttc tgaattcttt gcctcaagct 960
gaaggaggta ctaactttgg ttatatagga gttcaacaag ataaaagacg tggtgtaact 1020
caaatgggaa atacaaacta tattactgaa gctactatta tgagaccagc tgaggttggt 1080
tatagtgcac catattattc ttttgaggcg tctacacaag ggccatttaa aacacctatt 1140
gcagcaggac gggggggagc gcaaacagat gaaaatcaag cagcagatgg tgatccaaga 1200
tatgcatttg gtagacaaca tggtcaaaaa actaccacaa caggagaaac acctgagaga 1260
tttacatata tagcacatca agatacagga agatatccag aaggagattg gattcaaaat 1320
attaacttta accttcctgt aacagaagat aatgtattgc taccaacaga tccaattgga 1380
ggtaaaacag gaattaacta tactaatata tttaatacct atggtccttt aactgcatta 1440
aataatgtac caccagttta tccaaatggt caaatttggg ataaagaatt tgatactgac 1500
ttaaaaccaa gacttcatgt aaatgcacca tttgtttgtc aaaataattg tcctggtcaa 1560
ttatttgtaa aagttgcgcc taatttaaca aatgaatatg atcctgatgc atctgctaat 1620
atgtcaagaa ttgtaactta ctcagatttt tggtggaaag gtaaattagt atttaaagct 1680
aaactaagag cctctcatac ttggaatcca attcaacaaa tgagtattaa tgtagataac 1740
caatttaact atgtaccaag taatattgga ggtatgaaaa ttgtatatga aaaatctcaa 1800
ctagcaccta gaaaattata ttaa 1824
<210> 2
<211> 23
<212> PRT
<213> 狂犬病病毒
<400> 2
Pro Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile
1 5 10 15
Glu His Leu Val Val Glu Glu
20

Claims (5)

1.一种VP2融合基因，其特征在于是将狂犬病毒中和线性抗原表位序列替代犬细小病毒VP2基因部分序列后得到的，所述VP2融合基因的序列如SEQ ID NO：1所示。
2.含有权利要求1所述融合基因的质粒或细胞。
3.携带权利要求1所述融合基因的重组狂犬病病毒rHEP-rVP2株，其特征在于，是在狂犬病病毒HEP-Flury株基因组的G基因和L基因之间插入权利要求1所述VP2融合基因后得到的；所述重组狂犬病病毒rHEP-rVP2株采用如下方法制备：在狂犬病病毒HEP-Flury株全长cDNA中G基因和L基因之间假基因区域的NheI和Bsi WI酶切位点之间插入权利要求1所述VP2融合基因构建重组质粒pHEP-rVP2，转染宿主细胞，拯救病毒，得到重组狂犬病病毒rHEP-rVP2株；利用核酸限制性内切酶BsiWI和NheI，分别对VP2融合基因和pHEP-3.0质粒进行酶切，然后将两者的酶切片段连接，获得所述重组质粒pHEP-rVP2。
4.根据权利要求3所述重组狂犬病病毒rHEP-rVP2株，其特征在于所述宿主细胞为BHK-21 细胞。
5.含有权利要求3所述重组狂犬病病毒rHEP-rVP2株的疫苗。
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