CN104911195A - 一种修饰的抗狂犬病病毒HEP-Flury株M蛋白及其单克隆抗体的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白基因MN，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该基质蛋白基因MN表达得到的经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述狂犬病病毒为狂犬病病毒（rabies virus，RV）HEP-Flury株。利用上述修饰的狂犬病病毒HEP-Flury株基质蛋白基因MN构建重组质粒载体，进行表达以及单克隆抗体的制备，该单克隆抗体能特异性识别狂犬病病毒基质蛋白和狂犬病病毒，可以应用于间接ELISA方法、Western-blotting试验和间接免疫荧光试验，用于检测狂犬病病毒，具有良好的敏感性和特异性。

Description

一种修饰的抗狂犬病病毒HEP-Flury株M蛋白及其单克隆抗体的制备和应用

技术领域

本发明属于免疫学和生物技术领域。更具体地，涉及一种修饰的抗狂犬病病毒HEP-Flury株M蛋白及其单克隆抗体的制备和应用。

背景技术

狂犬病病毒(rabies virus，RV)是一种能引起人和动物高度致死性疾病的嗜神经病毒，属弹状病毒科狂犬病毒属，基因组从3'端至5'端依次排列5种结构蛋白，即核蛋白(N)、基质蛋白(M)、磷酸蛋白(P)、糖蛋白(G)和转录酶蛋白(L)。其中基质蛋白为狂犬病病毒最小的结构蛋白，共202个氨基酸，占病毒总蛋白的11％。M蛋白能够连接核衣壳和病毒膜，在1～72位氨基酸残基之间有一个抗原决定簇，该部位与狂犬病病毒的免疫反应有关。另外，由于糖蛋白的羧基端插入其中，因此它可以直接影响糖蛋白在病毒包膜表面的构型，在病毒形态形成中都起着重要作用，并且平衡、调节病毒的转录与复制。因此，M蛋白是检测狂犬病病毒的很好的一个靶点。

M蛋白的表达纯化是抗体制备的前提，合理的基因修饰可以实现蛋白的高效表达。但是对于不同的基因、不同物种来源的同源基因(基因的序列和性质等具有差别)，如何修饰基因，确定修饰位点及修饰数量，致使其与表达菌的偏嗜性匹配，以提高蛋白的表达量；表达过程中怎样进行培养、怎样保证获得蛋白表达需要的溶解氧、怎么样避免污染、加甲醇诱导的量以及时间、对蛋白表达时间的控制即蛋白收获时间、无菌检验的方法、蛋白含量以及活性的测定等均有较大的差异，需要形成一个稳定的、完整的技术方案，才能从根本上解决M蛋白的高效表达和成本问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有狂犬病病毒M蛋白表达技术的不足，提供一种经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白基因MN，利用该修饰的狂犬病病毒HEP-Flury株基质蛋白基因MN构建重组质粒载体，进行表达以及单克隆抗体的制备，该单克隆抗体能特异性识别狂犬病病毒基质蛋白和狂犬病病毒，可以应用于间接ELISA方法、Western-blotting试验和间接免疫荧光试验，用于检测狂犬病病毒，具有良好的敏感性和特异性。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白基因MN，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

一种经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白，由上述经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白基因MN表达得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种表达载体，该载体含有上述经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白基因MN。

由上述表达载体表达达到的狂犬病病毒基质蛋白在制备抗狂犬病病毒M蛋白的单克隆抗体中的应用也应在本发明的保护范围之内。

一种抗狂犬病病毒M蛋白的抗体，采用的免疫原是上述含经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白基因MN的表达载体表达达到的狂犬病病毒基质蛋白。

进一步地，所述狂犬病病毒为狂犬病病毒HEP-Flury株。

更进一步地，所述抗体为单克隆抗体。

一种不以疾病诊断为目的的检测狂犬病病毒的间接ELISA方法，所用抗体是以经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白为抗原制备得到的抗体。

一种不以疾病诊断为目的的检测狂犬病病毒的Western-blotting检测方法，所用抗体是以经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白为抗原制备得到的抗体。

一种不以疾病诊断为目的的检测狂犬病病毒的间接免疫荧光检测方法，所用抗体是以经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白为抗原制备得到的抗体。

本发明构建全长含经修饰优化的狂犬病病毒Hep-flury株M蛋白基因的原核表达质粒pET-MN，在大肠杆菌中表达MN重组蛋白，并以此为基础制备抗M蛋白单克隆抗体，为MN单克隆抗体在间接ELISA方法、Western-blotting试验和间接免疫荧光试验检测狂犬病病毒的应用创造条件

本发明中优化的MN基因的获得是运用RaCC及CAI Calculator软件对狂犬病病毒HEP-Flury株M蛋白基因序列进行分析，发现M基因序列中共含有大肠杆菌稀有密码子20个，其中，仅编码精氨酸(Arg)的稀有密码子agg，aga，cga就有13个，且在第77、78位出现连续成串的情况，CAI(codon adaptation index，密码子适应指数)亦较低，仅0.652，构建完成的pET32-M在优化条件下表达的目的蛋白量仅占菌体总蛋白15～17％。经分析后，综合考虑密码子偏嗜性、mRNA起始区的二级结构稳定性等因素，对其全序列进行同义密码子的替换。于两端分别引入Kpn I和Hind III酶切位点(由Invitrogen公司合成)，继而PCR扩增MN，连接于pMD18-T Simple载体，得到携有优化后序列的质粒pMD-MN，再与pET-32a(+)表达载体的Kpn I和Hind III双酶切反应，回收产物并且连接成功构建pET-MN重组表达载体，重组质粒DNA序列测定结果证实了含有目的基因。将重组表达载体转化DH5α感受态细胞，筛选得到的阳性重组子鉴定正确后提取质粒转化BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达，诱导表达后，离心收集菌体进行SDS-PAGE分析。当基因进行表达后，经过纯化后成功得到表达产物M蛋白，相对分子质量39kDa。

本发明采用用原核表达载体pET-32a表达狂犬病毒Hep-Flury弱毒株M蛋白，纯化后免疫BALB/c雌性小鼠，得到能够稳定分泌特异性McAb的细胞株，制备腹水并进行特异性检测、抗体效价检测及亚型鉴定。结果显示，改造前后的M序列在pET-32a载体中都能够得到大量表达，并经Western-blotting、质谱鉴定分析正确，但改造后的M序列较未改造序列表达量得到明显的提高；该蛋白免疫BALB/c小鼠融合后筛选所得细胞株多次传代仍能够稳定分泌特异性McAb，经鉴定为IgG1(κ)亚型，由其制备的腹水抗体效价在50 000～100 000以上，与犬细小病毒、犬副流感病毒、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒、犬腺病毒II型和犬钩端螺旋体无交叉反应。该McAb特异性显著、与抗原结合能力强，为狂犬病的检测、治疗及对狂犬病病毒M蛋白的进一步深入研究提供了良好的基础。

本发明采用的抗原(M重组蛋白)为可溶性抗原，加之融合时采用了6块96孔细胞培养板进行培养，因此，首选了具有快速、简便、高通量、结果简单明了等优势的ELISA法。摸索适宜的ELISA条件时所得结果显示，选用的包被抗原具有良好的特异性，筛选时所得结果显示，阴性、阳性结果清晰明了，阴性值OD450≤0.03，阳性值OD450≥0.1，差异显著，效率高，因此，该间接ELISA方法对杂交瘤细胞的筛选工作有着重要的作用。

本发明中免疫、包被抗原为融合表达的M蛋白，其中存在大量非RV基质蛋白的部分，如标签蛋白His、trx等载体自身的蛋白，若仅对杂交瘤细胞进行粗略的筛选有可能会得到假阳性，即所得单克隆抗体针对的为载体本身所表达蛋白的抗原位点而不是基质蛋白上的抗原位点。因此，本发明在初步筛选后采用双筛选法对所有疑似阳性结果进行了进一步的检测，包被抗原采用融合蛋白M、pET32a空载体蛋白P、融合表达的其他蛋白G，若样品对P、G蛋白呈阳性反应则判为对基质蛋白阴性。结果显示，初步筛选阳性样品确实存在非特异性情况，如3-A6、3-A11、4-B4、5-D11等对3种包被抗原均呈阳性反应，而最后选择进行亚克隆的样品1-F4、5-B8、6-F2、6-H3则对融合蛋白M呈明显的阳性反应，对另两种包被抗原呈阴性反应，证实该细胞群分泌针对基质蛋白上抗原位点的特异性抗体。

本发明中的基质蛋白作为结构蛋白之一，在组装好的病毒粒子中处于膜的内部，且几乎全部被包裹，绝大多数时候它并不具备类似核蛋白一样的、暴露于病毒粒子表面的抗原表位(Satoshi Ameyama et al.,2003)，因此在筛选过程中若采用纯化的全病毒作为包被抗原则会导致无法得到阳性结果。

本发明中得到的阳性样品需要进行亚克隆，也称为克隆化，基于以下几项理由，该步骤应尽快进行：

(1)使分泌抗体的杂交瘤细胞单克隆化，使其分泌均一的抗体；

(2)在融合早期，杂交细胞非常不稳定，很容易发生染色体丢失和突变，经过克隆化，使杂交细胞逐步稳定；

(3)分泌抗体型和不分泌抗体型同时培养，由于生长竞争，不分泌抗体型可导致分泌抗体型杂交瘤细胞被抑制，通过克隆可及时将分泌抗体型挑选出来。

本发明采用了有限稀释法进行亚克隆，梯度稀释一定量的细胞，使细胞按照3个/孔、2个/孔、1个/孔的浓度分布于96孔细胞培养板中，在经过3次亚克隆后得到了符合单克隆细胞系判断标准的细胞株，经多次传代后检测抗体表明，该细胞株状态良好、增殖能力强、能够稳定分泌特异性抗体。

本发明具有以下有益效果：对狂犬病病毒M基因进行了合适的密码子偏嗜性改造，得到优化序列MN，定向克隆至原核表达载体pET-32a，构建重组质粒pETMN，鉴定并转化至表达菌BL21(DE3)后获得了高效表达M蛋白的重组子。

本发明以获得的M重组蛋白为抗原制备单克隆抗体，通过间接ELISA、竞争ELISA法鉴定后发现其与多个犬常见病毒(犬细小病毒、犬副流感病毒、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒、犬腺病毒II型和犬钩端螺旋体)无交叉反应。利用获得的细胞株制备腹水后发现，腹水稀释50 000-100 000倍其OD₄₅₀仍在1.0以上，效果良好。

本发明在成功表达出狂犬病病毒基质蛋白，建立了间接ELISA检测体系筛选杂交瘤细胞的方法，并利用此蛋白免疫制备了鼠源性单克隆抗体。本发明的单克隆抗体能特异性识别狂犬病病毒基质蛋白和狂犬病病毒，可以应用于间接ELISA方法、Western-blotting试验和间接免疫荧光试验，用于检测狂犬病病毒，具有良好的敏感性和特异性。

附图说明

图1为M基因序列与优化后MN序列对比图。

图2为优化前后的M基因的PCR扩增结果，M：Marker DL 2000，1：M基因的PCR产物，2：MN基因的PCR产物，3：阴性对照。

图3为重组质粒的菌液PCR鉴定结果；M：100bp Marker，1：阳性对照，2～5：序列M与pET-32a连接转化产物的菌液PCR结果，6～9：序列MN与pET-32a连接转化产物的菌液PCR结果，10：阴性对照。

图4为重组质粒pET-M、pET-MN的双酶切鉴定结果，M：Marker DL 15000，1：阴性对照，2：pET-M重组质粒双酶切，3：pET-MN重组质粒双酶切。

图5为M基因的PCR产物、优化序列MN及表达载体pET-32a的双酶切；M1：Marker DL 2000，M2：Marker DL 15000，1：M基因的PCR产物双酶切，2：连接与pMD18-T Simple载体的优化序列MN双酶切，3：表达载体pET-32a双酶切，4：阴性对照。

图6为重组质粒表达产物的SDS-PAGE及Western-blotting分析；

图7不同诱导条件下改造前后M蛋白诱导表达产物SDS-PAGE；M：预染蛋白质Marker，1、2：28℃下pET-M、pET-MN诱导4.5h产物，3、4：37℃下pET-M、pET-MN诱导4h产物，5、6：16℃下pET-M、pET-MN诱导14h产物。

图8为表达产物的薄层扫描结果。

图9为目的蛋白纯化产物的SDS-PAGE分析；M：蛋白质预染Marker，1～9：收集的纯化产物。

图10为肽段测序结果与M蛋白氨基酸序列的比较。

图11为肽指纹图谱鉴定。

图12为融合细胞的观察结果。

图13为腹水Western-blotting鉴定结果；M：预染蛋白质Marker，1：pET32a空载体蛋白，2：M蛋白。

图14为间接免疫荧光检测结果(200×)；A：RV-M单抗，B：FITC-RV-N单抗，C：空白对照，D：阴性对照。

图15为抗体亚型的鉴定。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1 优化序列(MN)cDNA的获得

1、M基因的扩增

设计如下一对特异性引物，并分别在上、下游引物中引入Kpn I和Hind III酶切位点(下划线部分)，并加保护性碱基。

上游引物P1:5'-GGGGTACCATGAACTTTCTATGTA-3'；

下游引物P2:5'-CCCAAGCTTTTATTCTAAAAGCAGAG-3'。

2、MN cDNA的设计获得

根据大肠杆菌密码子偏嗜性对狂犬病病毒基质蛋白基因进行全序列核苷酸的同义替换，由Invitrogen公司合成并于两端分别引入Kpn I与Hind III酶切位点，命名为序列MN，具体序列如SEQ ID NO.1所示。M基因序列与优化序列MN核苷酸排布如附图1所示。

3、用引物P1、P2分别对优化前后的基因序列进行PCR扩增，扩增产物于1.0％琼脂糖凝胶中电泳检测，结果如附图2所示，得到一条特异的DNA电泳带，大小600bp左右，与预期结果一致，即扩增出了目的片段。

4、将MN序列连接于pMD18-T Simple载体，得到携有优化后序列MN的质粒pMD-MN，进行冷冻保存。

实施例2 pET-MN重组质粒的构建

1、以质粒pMD-MN为模板，PCR扩增产物即得到MN基因。

2、MN基因的PCR扩增产物经Kpn I与Hind III双酶切，回收后插入pET-32a(+)载体的Kpn I与Hind III双酶切窗口，得到融合有His标签的M融合蛋白基因的重组质粒。用重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，然后将大肠杆菌BL21铺于含氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜，次日挑取质粒转化菌进行扩增后，进行菌液PCR鉴定，阳性重组子继续在37℃培养增菌并抽提质粒DNA进行酶切鉴定，经1.0％的琼脂糖凝胶电泳。

对序列M、MN的转化产物各随机挑选4个单菌落增菌培养后，以菌液为模板，使用设计好的引物P1、P2进行PCR鉴定，结果如附图3所示，阳性菌液片段大小为600bp左右，与预期结果一致。

对PCR检测获得的阳性转化子，继续在37℃培养增菌并抽提质粒。重组质粒经Hind III及Kpn I双酶切，双酶切结果如附图4所示，出现了预期大小的条带，分别为600bp及6000bp左右，可知成功构建出重组表达质粒。重组质粒经测序比对，证实为目的表达载体。

3、经PCR和双酶切鉴定后均为阳性结果的重组质粒pET-MN送往Invitrogen公司进行测序，并利用Blast、DNAstar软件对测序结果与原基因进行分析比较，结果表明：序列MN以正确的方式插入pET32a载体中，所有核苷酸与理论设计相比较没有发生任何突变，其推导的氨基酸与RV M蛋白氨基酸排布一致，无任何突变。至此，得到重组子pET-MN。

4、采用Hind III及Kpn I对M基因的PCR产物、携有优化后序列MN的质粒pMD-MN、表达载体pET-32a进行双酶切，于1.0％琼脂糖凝胶中电泳检测，可见经Kpn I与Hind III双酶切后，成为两个片段，大小分别约为600bp和6000bp，与预期结果相符(如附图5所示)。

实施例3 融合有His标签的M融合蛋白的诱导表达

1、诱导表达：按照《pET系统操作手册》进行样品处理选择阳性菌株大量诱导和纯化融合有His标签M融合蛋白。

2、表达产物的SDS-PAGE电泳

(1)按如下体系配制12％分离胶：双蒸水5.1mL；30％丙烯酰胺贮存液，6.0mL；4×分离胶缓冲液2.5mL；10％过硫酸铵100μL；TEMED 10μL；总体积13.71mL。

(2)按如下体系配制5％浓缩胶：双蒸水4.2mL；30％丙烯酰胺贮存液1mL；4×浓缩胶缓冲液820μL；10％过硫酸铵60μL；TEMED 10μL；总体积6.09mL。

加入适量Tris-甘氨酸电泳缓冲液，上样前用电泳缓冲液冲洗梳子孔，用微量注射器小心加入处理后的样品至样品孔中。接通电源，浓缩胶阶段电压为80V，待溴酚蓝进入分离胶时升电压至120V，直至溴酚蓝前沿迁移至凝胶底部。

(3)电泳完毕后用5倍凝胶体积的考马斯亮蓝R-250染色液对凝胶染色1h，取出凝胶在水中漂洗、脱色交替进行2～3次，观察结果。

重组质粒pET-M、pET-MN转化进表达宿主菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导后SDS-PAGE分析，两个重组子表达产物中均出现特异的目的蛋白带，条带清晰，位置正确，与预期大小(约39KDa)相符。而BL21宿主菌、空载体菌表达产物及未经诱导的重组子表达产物中无这一特异带出现，如图6a，可见经过序列改造优化后的M蛋白(泳道2)的表达量较未优化的(泳道1)显著提高。

3、表达产物的Western-blotting分析

(1)SDS-PAGE结束后，取出凝胶，按下列顺序制备聚丙烯酰胺凝胶-膜“三明治”：海绵垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫。将其转移至电转仪中，200mA恒流转移1.5h。转移后凝胶放入考马斯亮蓝R-250中染色，以检查转移效果。

(2)转移完毕后取下PVDF膜，进行如下操作：封闭；洗膜；加一抗；洗膜；加二抗；洗膜；显色，用吸水纸吸干膜上水分，避光干燥保存(一周内拍照，否则信号将褪色，膜逐渐变黄)。

(3)结果显示，pET-M及pET-MN所得重组蛋白均能够被鼠抗His单克隆抗体(如附图6b所示)及鼠抗RV多克隆抗体(如附图6c所示)特异性识别。

4、诱导表达条件的优化及序列优化前后表达量的比较

(1)根据上述SDS-PAGE结果，设置不同的IPTG浓度、诱导时间、诱导温度、诱导前OD₆₀₀值、培养基抗生素浓度进行诱导表达。优化诱导条件并检测不同表达条件下的表达量，确定最佳诱导条件，并比较序列优化前后M蛋白表达量的变化。

(2)经多次尝试优化诱导条件诱导pET-M及pET-MN，发现诱导前菌液OD₆₀₀值、IPTG浓度、培养基抗生素浓度等对表达量影响较弱，而不同的诱导时间、诱导温度则显著影响M蛋白的表达量。结果发现，pET-M在1mmol/L IPTG，28℃下诱导4.5h时表达量较高，pET-MN在1mmol/L IPTG，16℃下诱导14h时表达量较高，结果如附图7所示。

(3)经薄层扫描分析发现，优化序列MN所构建的重组质粒pET-MN与未优化的重组质粒pET-M相比，表达量有明显的提高。薄层扫描结果显示(如附图8所示)，pET-M在28℃、37℃、16℃下目的蛋白分别占菌体蛋白总量的17.34％(图8a)、14.22％(图8c)、15.48％(图8e)；而pET-MN在28℃、37℃、16℃下目的蛋白分别占菌体蛋白总量的25.31％(图8b)、19.17％(图8d)、32.19％(图8f)，序列改造后表达量显著提高。

实施例4 目的蛋白的纯化

1、采用上述最佳诱导条件进行大量表达蛋白并超声破碎，弃去上清，15mLBinding Buffer(含6M尿素)重悬菌体，冰浴2h后，4℃ 12 000r/min离心20min，收集上清，即为溶解的包涵体。His Trap FF crude(1mL)纯化之前用0.45μm或0.22μm滤膜过滤上清。

用蒸馏水注满泵的管道或注射器，将柱连接到层析系统的管道，用注射器(使用提供的接头)注入蒸馏水；将在柱出口的速变弹簧夹移去。用10倍柱体积的灭菌双蒸水洗去柱内的乙醇；用10倍柱体积的结合缓冲液平衡柱，流速为1mL/min；用注射器将溶解的包涵体上到柱上；用10倍柱体积的含6M尿素的结合缓冲液冲洗；用8～10倍柱体积的洗脱缓冲液分步洗脱，收集洗脱液；用10倍柱体积结合缓冲液淋洗；用10柱体积灭菌双蒸水淋洗；用20％的乙醇注满柱床，于4～30℃保存。

2、纯化蛋白浓度的测定：重组质粒pET-MN在优化条件下诱导表达后，目的蛋白经HisTrap FF crude柱层析纯化，浓度依次降低，如附图9所示。根据公式：蛋白质浓度(mg/mL)＝(1.55×A₂₈₀-0.76×A₂₆₀)×稀释倍数，经测定纯化后的重组蛋白含量为4.1mg/mL。

3、表达后纯化产物的质谱分析：将纯化后的表达产物用MS/MS质谱分析法进行质谱鉴定，经肽指纹图谱鉴定(图11)及部分强信号肽段测序(图10)，纯化后的蛋白即为狂犬病病毒M蛋白。

实施例5

1、免疫原的制备及动物免疫：取纯化的M蛋白作为抗原，用0.01mol/L pH7.4的PBS适当稀释后，与弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化，按200μg/只的抗原量经背部皮下注射6～8周龄的雌性BALB/c小鼠4只；然后分别在第15d和第29d，用弗氏不完全佐剂与等体积的抗原混合乳化分别进行二免及三免，选抗体效价最高的小鼠腹腔注射未添加佐剂的M蛋白，抗原量为150μg/只，3～4d后取其脾脏进行融合。将免疫的4只小鼠分别命名为M1～M4，三免后取血清，用间接ELISA法测定抗体水平。M蛋白以32μg/mL浓度包被，样品孔设置重复。

表1 三免后抗体水平检测结果

2、间接ELISA方法条件摸索

取三免后的小鼠血清进行间接ELISA，分别进行包被抗原量、封闭液的选择及封闭时间、二抗稀释度、显色及终止时间等的优化。取15只空白SPF小鼠血清以M蛋白为包被抗原测定阴性值，并按统计学方法标定阳性判断标准。

表2 间接ELISA操作程序

抗原吸附：用包被液将抗原按1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、12μg/mL、16μg/mL、24μg/mL、32μg/mL浓度稀释，加入酶标板中，100μL/孔，置于4℃过夜；先后经过洗涤、封闭、洗涤、加入一抗、洗涤、加入二抗、洗涤、显色、终止等操作后，尽快使用酶标仪读数。

读数及结果判定：采用酶标仪测定，检测波长为450nm，校正波长为630nm，以空白对照调零，读取各孔的光密度值。阴性对照孔OD450值记为N，样品读取结果记为S，若即判定结果为阳性。

取三免后的小鼠血清做间接ELISA，进行包被抗原量、封闭液选择及封闭时间、显色及终止时间等优化。实验后发现，不同封闭液及封闭时间、显色及终止时间等对结果无明显影响，但包被抗原量对样品检测结果有影响，结果见表3。

表3 不同抗原包被量结果比较

根据以上结果可见(样品孔设置一重复)，在其他条件相同的情况下，抗原浓度低于4μg/mL时，随着浓度的提高OD450值也在提高，但当抗原浓度大于4～8μg/mL时，OD450值基本恒定，因此，在后期的ELISA法检测中，采用4μg/mL浓度、100μL/孔进行抗原包被。

15只未接种任何抗原的SPF BALB/c小鼠断尾采血，取血清进行间接ELISA测定阴性值，并根据结果制定阳性判断标准，样品孔设置一重复。

表4 阴性小鼠血清测定结果

根据表4的结果，计算15份阴性血清的平均值及标准差，结果见表5。

表5 阴性血清平均值

根据表5结果及统计学中相关方法得知，在样品稀释度为1：100时，阴性、阳性临界值为即OD450nm≥0.12时可判定为阳性；在样品稀释度为1：5000时，阴性、阳性临界值为即OD450nm≥0.032时可判定为阳性。

3、细胞融合：

(1)加强免疫：第四或第五次免疫后4～5d再次取小鼠血清测定抗体水平。

表6 融合前小鼠抗体水平检

根据表6结果取各血清稀释度下抗体水平均较高者在融合前3d以200μg/只剂量腹腔注射未添加佐剂抗原，进一步刺激机体产生大量抗体。

(2)SP2/0骨髓瘤细胞的准备：融合前7～10d用DMEM完全培养基复苏SP2/0骨髓瘤细胞，在37℃、5％ CO2条件下培养1～2代。

(3)制备脾细胞：取加强免疫后3～4d的BALB/c小鼠脾脏放于含DMEM平皿中，洗涤并剥除结缔组织；转移至另一含DMEM平皿中，用镊子或西林瓶底部轻柔挤压脾脏，充分释放脾细胞。

(4)融合：将取好的脾脏细胞加入准备好的装有SP2/0细胞的离心管中进行融合静置的融合管经离心后，弃上清后加入5mL HAT培养基，轻轻吹吸混匀，然后加入培养基至60～70mL培养基；分装96孔板(6块)，每孔100μL，37℃培养，放于温箱内部，3d内勿动；第4d用HAT培养基全换液；第10d(杂交瘤细胞上清变黄或淡黄色即可)用间接ELISA法检测阳性孔。细胞融合后第4d，取出96孔板置倒置显微镜下观察细胞，并用HAT培养基全换液。第5～10d每天观察细胞生长情况，并于第10d取细胞上清检测。

由图12箭头所示，可见第4d时已有融合细胞生长并分裂生殖，同时周围存在大量死亡的细胞(A)；第7d时融合细胞已初具规模，活力较好的融合细胞已长成由15～30个细胞组成的细胞团，同时周围的死亡细胞继续裂解(B)。

图13中以所得腹水为一抗进行Western-blotting分析，腹水与pET-32a空载体蛋白无反应；与M蛋白反应，在约40KDa处出现一特异性条带，与预期相符。由图13箭头所示，第7d时融合细胞已初具规模，活力较好的融合细胞已长成由15～30个细胞组成的细胞团，同时周围的死亡细胞继续裂解。

4、阳性杂交瘤细胞的筛选

(1)初次检测：以M蛋白为包被抗原采用间接ELISA法在优化条件下对融合细胞上清进行检测。每块酶标板F12、G12、H12孔分别为阳性、阴性及空白对照。

表7 融合细胞上清初步检测结果

根据表7所示，参考本次阴性、阳性、空白对照的结果及融合细胞生长状态，当样品OD450≥0.1时判定为初步阳性，OD450≥0.07时为弱阳性。

(2)假阳性的筛除：采用双筛选法，以纯化的pET-32a空载体表达产物及用该载体表达的其他融合蛋白为抗原对检出的阳性进行假阳性的筛除，去除针对载体上非目的蛋白抗原位点的单克隆抗体。将呈阳性及弱阳性结果的样品孔再次进行间接ELISA。除M蛋白外，另以纯化的pET-32a空载体蛋白(P)及以pET-32a为载体表达的其他融合蛋白(G)为包被抗原，筛除假阳性。

表8 假阳性筛除

根据表8所示，筛除与P、G蛋白反应呈阳性结果的样品，最后按照与M蛋白反应呈阳性且OD450较高、与P、G蛋白反应呈阴性且OD450低的标准，选取1-F4、5-B8、6-F2、6-H3等4个样品进行亚克隆。

(3)阳性杂交瘤细胞的克隆化：将选定的样品1-F4、5-B8、6-F2、6-H3按步骤2.5.3亚克隆，检测后根据ELISA结果及细胞数量进行筛选并再次亚克隆。如此往复2～3次，直至得到稳定分泌单克隆抗体的细胞株。表9所示为最后一次克隆化ELISA检测结果，3个方阵分别为编号A4、B4、C4的细胞株亚克隆结果，每个方阵中的F12、G12、H12分别为阴性、阳性及空白对照。

表9 第3次克隆化后ELISA结果

据表9所示，加注阴影结果为孔中仅有1个细胞克隆的样品。以上结果中，所有阳性结果孔中均有1～4个细胞克隆，所有有细胞生长的孔均为阳性(即阳性率100％)，且此次亚克隆源细胞株为上次亚克隆结果强阳性，同时孔中仅有1个细胞克隆的样品，因此，以上加注阴影结果对应的样品即可判定为单克隆细胞株。以纯化的pET-32a空载体蛋白(P)及M蛋白为包被抗原，对以上44个单克隆细胞株上清进行间接ELISA检测以筛除克隆化过程中产生的假阳性。

表10 克隆化后假阳性筛除

根据表10所示，44个样品均为特异性针对融合蛋白中基质蛋白部分而产生的抗体。

(4)阳性杂交瘤细胞的克隆化

对筛选所获得的阳性杂交瘤细胞孔以有限稀释法进行克隆化，以获取能稳定分泌抗体的细胞株。亚克隆9d后，观察培养板中细胞的生长情况，并标记细胞集落数目，当细胞孔上清变淡黄或黄色时即可用间接ELISA法进行检测，取读数较高、孔内细胞克隆数在1-2个的细胞再次进行亚克隆，直至得到稳定分泌单抗的单细胞克隆。

(5)扩大培养：进行亚克隆的同时，多余的杂交瘤细胞转至24孔细胞培养板中进行扩大培养，即细胞原始孔。

(6)阳性杂交瘤细胞冻存：亚克隆之前检测阳性孔的细胞除亚克隆之外的全部剩余细胞进行扩大培养后，移入液氮罐中保存。

(7)细胞复苏：复苏时从液氮罐中取出冻存管后迅速放入37℃水浴锅中，轻轻摇动使其在1min内融化，然后1000r/min离心5min，移至超净工作台，悬浮于预热的HT完全培养液中，置于37℃，5％ CO2培养箱中进行培养。

(8)腹水制备及抗体效价的测定：筛选出的细胞株经培养稳定后，取生长状态良好、抗体分泌能力强者采用体内诱生法制备腹水。

按表4的间接ELISA方法，测定所得腹水的抗体效价，按OD450值在1.0以上为有效浓度。通过小鼠体内诱生法制备腹水并测定其抗体效价。结果见表11，检测样品作一重复，C为细胞上清原液，阳性对照为1：10 000稀释的血清。

表11 抗体效价测定

如表11所示，所得腹水经50 000倍稀释后OD450仍保持在1.0左右，经1000 000倍稀释后仍为阳性，证实该腹水抗体水平较高。

5、单抗生物学特性鉴定

(1)特异性与交叉性ELISA、竞争ELISA法检测，为检测所得单克隆抗体的特异性，取犬用六联苗为抗原进行交叉检测。以犬用六联苗为抗原包被，按表4所示进行间接ELISA法检测，同时采用竞争ELISA法检测。

酶标仪测定，检测波长为450nm，校正波长为630nm，以空白对照调零，读取各孔的光密度值。将腹水按1：10 000倍稀释，细胞上清按1：1 000倍稀释，结果见表12、13。

表12 间接ELISA法检测抗体特异性

表12所示方阵中，每行第1列至第8列分别包被按1：1、1：100、1：1 000、1：3 000、1：5 000、1：10 000、1：50 000、1：100 000比例稀释的六联苗，A、B、C行分别采用抗犬细小病毒(CPV)血清(1：1 000倍稀释)、腹水、细胞上清为一抗。结果显示，抗CPV血清与包被的各稀释度六联苗均呈阳性反应，且OD450按稀释度的加大出现明显的梯度；腹水及细胞上清则呈阴性反应，且各稀释度下OD450稳定。

表13 竞争ELISA法检测抗体特异性

表13中，A、B行以1：1 000倍稀释六联苗为包被抗原，一抗为1：200倍稀释的抗CPV血清，但A行1～10列所用一抗预先与1：1、1：100、1：300、1：500、1：1 000、1：3 000、1：5 000、1：10 000、1：30 000、1：50 000稀释六联苗37℃作用1h；C、D行以M蛋白(4μg/mL)为包被抗原，一抗为1：10 000倍稀释的腹水，但D行1～10列所用一抗预先与1：1、1：100、1：300、1：500、1：1 000、1：3 000、1：5 000、1：10 000、1：30 000、1：50 000稀释六联苗37℃作用1h。结果显示，抗CPV血清在与高浓度六联苗竞争结合后，所含抗体被大量中和，抗体效价与未竞争结合样品比较出现明显下降；而与任何浓度的六联苗竞争结合的腹水抗体效价与未竞争结合样品相比较无波动。以上结果显示，所得腹水具有良好的特异性，与其他犬常见病毒无交叉反应。

(2)Western-blotting检测单抗：对所得腹水进行Western-blotting分析，分别采用M蛋白及pET-32a空载体蛋白为基础抗原。

如图13所示，腹水与pET-32a空载体蛋白无反应；与M蛋白反应，在约40KDa处出现一特异性条带，与预期相符。

(3)间接免疫荧光检测单抗

采用间接免疫荧光法，以适当比例稀释的腹水为一抗，FITC-羊抗小鼠IgG为二抗，对狂犬病病毒感染的细胞进行荧光染色。结果：阳性孔(腹水)有立体感强的黄绿色荧光，阴性血清没有看到荧光，骨髓瘤SP2/0上清无荧光，BHK细胞对照无荧光。

图14中采用间接免疫荧光法对腹水进行检测。图14-A显示，以制备的RV基质蛋白单克隆抗体为一抗，FITC标记羊抗鼠IgG为二抗，激发后镜下可见清晰明亮的荧光灶，细胞形态清晰；以FITC标记的RV核蛋白单抗为抗体、按直接免疫荧光法进行染色所得图14-B为阳性对照。

(4)抗体亚型的鉴定按试剂盒说明书对抗体亚型进行鉴定。结果如图15所示，抗体亚型为IgG1(κ)型。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  华南农业大学

 <120>  一种修饰的抗狂犬病病毒HEP-Flury株M蛋白及其单克隆抗体的制备和应用

 <130> 

 <160>  2    

 <170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  609

<212>  DNA

<213>  修饰后基质蛋白基因MN的核苷酸序列

 <400>  1

atgaacttcc tgtgtaaaat tgtgaaaaac tgtcgtgatg aagataccca gaaaccgtct     60

 ccggcgtcag ccccgccgga tggcgatgat ctgtggctgc cgccgccgga atatgtgccg    120

 ctgaaagaac tcaccagcaa aaaaaacatg cgtaacttct gtatcaacgg tgaagtgaaa    180 

gtgtgcagcc cgaacggtta ctcattccgt atcctgcgcc atattctgcg ttcattcgat    240 

gaaatctact ctggcaatca tcgtatgatt ggtctggtca aagtggtggt gggtctggcc    300 

ctgtcaggtg cgccggcgcc ggaaggcatg aactgggtgt acaaactgcg tcgtaccctg    360 

attttccagt gggccgattc tcgtggcccg ctggaaggtg aagaactgga acattctcag    420 

gaaatcacct gggatgatga taccgaattc gtgggtctgc agatgcgtgt gagcgcgcgt    480 

cagtgtcata ttcagggccg tatctggtgt atcgatatga actctcgtgc gtgtcagctg    540 

tggtctgata tgtctctgca gacccagcgt tctgaagaag ataaagattc ttctctgctg    600 

ctggaataa                                                            609 

 

<210>  2

<211>  202

<212>  PRT

<213>  修饰后基质蛋白基因MN编码的蛋白氨基酸序列 

<400>  2 

Met Asn Phe Leu Cys Lys Ile Val Lys Asn Cys Arg Asp Glu Asp Thr

1               5                   10                  15       

Gln Lys Pro Ser Pro Ala Ser Ala Pro Pro Asp Gly Asp Asp Leu Trp

            20                  25                  30           

Leu Pro Pro Pro Glu Tyr Val Pro Leu Lys Glu Leu Thr Ser Lys Lys

        35                  40                  45               

Asn Met Arg Asn Phe Cys Ile Asn Gly Glu Val Lys Val Cys Ser Pro

    50                  55                  60                   

Asn Gly Tyr Ser Phe Arg Ile Leu Arg His Ile Leu Arg Ser Phe Asp

65                  70                  75                  80   

Glu Ile Tyr Ser Gly Asn His Arg Met Ile Gly Leu Val Lys Val Val

                85                  90                  95       

Val Gly Leu Ala Leu Ser Gly Ala Pro Ala Pro Glu Gly Met Asn Trp

            100                 105                 110          

Val Tyr Lys Leu Arg Arg Thr Leu Ile Phe Gln Trp Ala Asp Ser Arg

        115                 120                 125              

Gly Pro Leu Glu Gly Glu Glu Leu Glu His Ser Gln Glu Ile Thr Trp

    130                 135                 140                  

Asp Asp Asp Thr Glu Phe Val Gly Leu Gln Met Arg Val Ser Ala Arg

145                 150                 155                 160  

Gln Cys His Ile Gln Gly Arg Ile Trp Cys Ile Asp Met Asn Ser Arg

                165                 170                 175      

Ala Cys Gln Leu Trp Ser Asp Met Ser Leu Gln Thr Gln Arg Ser Glu

            180                 185                 190          

Glu Asp Lys Asp Ser Ser Leu Leu Leu Glu

        195                 200        

 

Claims (10)

1.一种经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白基因MN，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白，其特征在于，由权利要求1所述经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白基因MN表达得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种表达载体，其特征在于，该载体含有权利要求1所述经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白基因MN。

4.由权利要求3所述表达载体表达达到的狂犬病病毒基质蛋白在制备抗狂犬病病毒M蛋白的单克隆抗体中的应用。

5.一种抗狂犬病病毒M蛋白的抗体，其特征在于，采用的免疫原是以权利要求3所述表达载体表达达到的狂犬病病毒基质蛋白。

6.根据权利要求5所述抗体，其特征在于，所述狂犬病病毒为狂犬病病毒HEP-Flury株。

7.根据权利要求5所述抗体，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。

8.一种不以疾病诊断为目的的检测狂犬病病毒的间接ELISA方法，其特征在于，所用抗体为权利要求5所述抗体。

9.一种不以疾病诊断为目的的检测狂犬病病毒的Western-blotting检测方法，其特征在于，所用抗体为权利要求5所述抗体。

10.一种不以疾病诊断为目的的检测狂犬病病毒的间接免疫荧光检测方法，其特征在于，所用抗体为权利要求5所述抗体。