CN105924501B - 靶向Clec9a的亲和肽WH肽 - Google Patents

Abstract

本发明属于肿瘤预防和治疗技术领域，具体涉及一种靶向mClec9a的亲和肽WH肽、制备及其应用。该肽包括12个氨基酸，其氨基酸序列为：WPRFHSSVFHTH，可通过Fmoc固相合成法制备获得。可在肿瘤预防和治疗中应用。该肽通过噬菌体展示肽库技术淘选获得。对其在生物体内和体外的交叉递呈外源抗原的能力和诱导特异CTL反应情况的研究结果表明，WH肽作为一种靶向载体，能够较好诱导特异性CTL应答，提升IFN‑γ和相关细胞杀伤性分子的表达量，从而增强抗肿瘤效果。结合计算机模拟分子对接技术，对WH肽与Clec9a蛋白间可能的对接区域以及作用位点的研究，也为其他相关研究提供了较好地参考和借鉴意义。

Description

靶向Clec9a的亲和肽WH肽

技术领域

本发明属于肿瘤预防和治疗技术领域，具体涉及一种靶向mClec9a的亲和肽WH肽、制备及其应用。

背景技术

树突状细胞（dendritic cells，DCs）是介导T细胞和B细胞免疫应答的专职抗原递呈细胞。与其他的抗原递呈细胞（antigen-presenting cells，APC）相比，DC具有超强的捕获、加工和递呈抗原的能力，只有DC能活化naïve T细胞（T cells）。DC诱导强有力的特异性的抗肿瘤免疫反应，因此针对DC的免疫治疗是一个非常有效的免疫治疗策略。

在鼠和人类中至少可以分为3类DC：类浆细胞DC（plasmacytoid DC，pDC），血液来源的传统的DC（blood-derived conventional DC，cDC）和组织来源的DC（tissue-derivedcDC）。这3类DC根据DC膜表面的表面分子、功能和来源又可以将这3类分为不同的DC亚群。研究最多的DC亚群是在淋巴器官中发现的blood-derived CD8α+DC、CD4+DC和CD4－CD8α-DC（double negative DC，DN-DC）。不同的DC有不同的功能，如CD8α+DC具有超强MHCⅠ交叉递呈能力，能够递呈细胞相关外源蛋白或自身抗原给CD8+T细胞。在感染模型中DC也能够产生特异性抗病毒性的CTL应答。而CD8α-DC具有很好的将外源抗原递呈给MHC Ⅱ分子和直接引发CD4+T细胞反应。因此这些不同DC亚群分化表面标志物为抗原靶向治疗提供了理论基础，为增强疫苗的效果提供了保障。

现在研究DC疫苗的策略是利用抗体靶向DC表面特异性受体。目前研究最广泛的DC膜受体是C型凝集素受体，如Clec9a（C-type Lectin domain family 9A，Clec9a，又称Dendritic cell Natural killer lectin Group Receptor 1，DNGR1），CD205，Dectin-1和CD206。在鼠中，mClec9a（mouse Clec9a）选择性的表达在CD8α+DC、迁移CD103+DC（migratory CD103+DC）和pDC（plasmacytoid DC），少量表达在一些单核细胞上，而不表达在其他细胞上。在人体内，hClec9a（human Clec9a）选择性表达在与CD8α+DC功能相似的BDCA3+DC（CD141+DC）上，少量表达在B细胞和单核细胞中。所以我们认为DC上的Clec9a是一个非常有潜力的DC疫苗靶点。

Clec9a属于Ⅱ型跨膜糖蛋白，包括胞外区C型凝集素结构域（C-type lectin-likedomain, CTLD），单次跨膜结构域和胞内的一个免疫受体酪氨酸激酶结构域（hemi-immunoreceptor tyrosine-based activation motif，hemi ITAM motif）。mClec9a由264氨基酸组成，hClec9a由241个氨基酸组成，有共同的保守区域CTLD，二者在CTLD相似度为61%。在细胞中mClec9a是以非糖基化的单体的形式存在。

已有研究表明，抗原靶向Clec9a可引发全面的免疫反应，因而通常都是利用Clec9a抗体和抗原进行化学偶联，但由于抗体-抗原复合物的分子量大，因而具有很多的缺点，如抗原渗透性差；此外鼠的anti-hClec9a mAb在人上应用时可能会引起很大的免疫原性。因而迫切需要一种靶向Clec9a的高亲和的多肽载体以替代Clec9a抗体，从而可以降低抗体的免疫原性和改善抗体-抗原复合物的低渗透性的缺陷。

发明内容

本发明目的是提供一种针对Clec9a的靶向亲和肽WH肽，该亲和肽利用噬菌体展示肽库（phage display library）技术筛选获得，在肿瘤预防和治疗中具有较好的应用前景。

本发明所采取的技术方案如下所述。

一种靶向Clec9a的亲和肽WH肽，该肽包括12个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，具体为： WPRFHSSVFHTH，即：Trp-Pro-Arg-Phe-His-Ser-Ser-Val-Phe-His-Thr-His。

基于现有技术，可对该肽进行多种修饰或改造以获得其衍生物，具体改造时，如可采用非天然氨基酸改造，或者采用聚乙二醇、PAS等修饰方法对其进行修饰改造。

所述WH肽衍生物，还包括通过连接子偶联或直接偶联有抗原的衍生物，所述连接子具体可采用（GGGS）_nC、GGSC或GGG等，其中n=1~10；所述抗原具体例如OVA抗原。

所述靶向Clec9a的亲和肽WH肽，可通过Fmoc固相合成法制备获得。

所述靶向Clec9a的亲和肽WH肽在肿瘤预防和治疗中的应用，具体而言，作为一种靶向Clec9a⁺的载体，运载抗原，可增强抗肿瘤免疫反应；所述肿瘤具体例如为B16细胞所致肺癌肿瘤。

现有DC疫苗治疗肿瘤的策略主要有两类：（1）肿瘤抗原刺激的DC疫苗：肿瘤在发展的过程中会形成一系列的特异性的抗原，因此利用肿瘤抗原肽刺激DC既具有特异性、靶向性且不易产生自身免疫反应；（2）基因转染的DC疫苗：与传统的多肽疫苗相比，核酸疫苗在一定程度上可以激发机体全面的免疫反应，可以表达天然构象的抗原，抗原性更强，且可以引发全面的T细胞效应。而本发明中，WH肽能够与肿瘤抗原融合，进而通过病毒载体直接免疫生物体，从而在体内刺激T细胞的增殖以及发挥抗肿瘤免疫活性。因而利用本发明所提供的WH肽可替代现有的anti-Clec9a靶向Clec9a，从而研制新一代的“多肽靶向疫苗”，而所制备的新的多肽疫苗则具有明显的高渗透性、廉价、易于合成和偶联抗原等优点。

总体而言，本申请利用噬菌体展示肽库技术淘选获得了一种对Clec9a具有较好亲和性和特异性的WH肽。进一步地，发明人利用Fmoc固相合成技术制备了该肽，并对其在生物体内和体外的交叉递呈外源抗原的能力和诱导特异CTL反应情况进行了研究。结果表明，WH肽作为一种靶向载体，能够较好诱导特异性CTL应答，提升IFN-γ和相关细胞杀伤性分子的表达量，从而增强抗肿瘤效果。进一步地，本发明中结合计算机模拟分子对接技术，对WH肽与Clec9a蛋白间可能的对接区域以及作用位点进行了研究，也为其他相关研究提供了较好地参考和借鉴意义。

附图说明

图1 为Western blotting检测mClec9a-CTLD表达情况，其中左边泳道为40h上清，右边泳道为64h上清；检测时Anti-FALG 抗体为1:1000稀释，羊抗鼠二抗为1:8000稀释；

图2 为WH肽质谱图；

图3为利用Flt3L诱导Clec9a表达情况；

图4为Clec9a的亲和肽与FL-DC的亲和实验；其中各种生物素化的Clec9a-CTLD的亲和肽与FL-DC在4℃ 孵育 30min，而后洗涤3次，加入SA-PE和anti-CD11c-APC再在冰上孵育30min，洗涤2次后流式检测；GA作为对照肽，Rat IgG1是Clec9a抗体的同型；

图5为Clec9a亲和肽与转染有质粒的HEK-293T细胞的亲和情况， 其中GA作为对照肽，Rat IgG1是Clec9a抗体的同型；（A）为Clec9a抗体和WH肽都不亲和转染pIRES2-EGFP的EGFP⁺HEK293T细胞；（B）为WH肽能够亲和到HEK-293T^Clec9a细胞上；

图6为WH-mClec9a 对接模型；

图7为7个Clec9a的单氨基酸突变体转染后，WH亲和转染不同mClec9a突变体的HEK-293T结果；

图8为WH-Clec9a残基结合模型；其中上图为WH与Clec9a整个蛋白对接模型，下图为细化的WH与Clec9a的D248和W250相互作用，它们之间的距离小于4.5 Å；

图9为WH肽亲和特异性检测结果；

图10为体外实验时WH将OVA_257-264靶向到FL-DC并且将抗原实行MHC class I交叉递呈的实验结果；实验时，将不同浓度的肽（终浓度为10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、 1.25μg/mL）或者生理盐水（NS）与FL-DC在4℃孵育1.5 h，用无血清培养基洗涤3次后备用；将磁珠分选的OT-1小鼠的CD8⁺ T细胞用2μM CFSE 室温避光孵育10min，而后用30%的FBS在冰上终止反应10min，用无血清洗涤3次后备用；将100μL、10⁵ CFSE 标记的 CD8⁺ T cells铺于Round-buttom 96 孔板中，再将荷载或者不荷载肽的10⁴ FL-DC铺于96孔板中培养72h；其中（A）ELISA检测IFN-γ的含量；（B）刺激naïve T细胞增殖；（C）和（D）分别是perforin和Grz BmRNA的倍数变化；荷载FL-DC的肽的浓度为10μg/mL提取的总RNA；

图11为在CpG ODN 1826佐剂存在下抗原靶向到Clec9a刺激CTL priming结果，其中（A）多肽免疫方案，皮下注射多肽（WH-OVA/ OVA257-264/WH/GA-OVA，100μg/只）和30μgCpG ODN佐剂，每隔7天免疫一次，共免疫3次；（B）IFN-γ含量，3次免疫后的第5天用10μg/mLOVA _257-264再刺激脾细胞的上清，用ELISA检测上清中IFN-γ的量；（C）胞内IFN-γ⁺CD8⁺T的频率，利用胞内因子染色的方法检测IFN-γ+CD8+T的频率，左图为流式代表图，右图是每组5只小鼠的IFN-γ⁺CD8⁺T的频率统计图；（D）和（E）分别是perforin和Grz B mRNA的相对变化量；

图10、11中，“**”表示p＜0.01，“***”表示p＜0.001。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步介绍说明，在介绍具体实施例前，对本发明中所涉及部分实验试剂、实验设备、实验材料等情况简要介绍如下。

主要试剂：

100mM 丙酮酸钠、100mM 谷氨酸钠、100×非必需氨基酸、盐酸四环素（Tet）、牛血清白蛋白（BSA）、Hepes，Sigma-Aldrich；

Mouse Flt3L recombinant protein、Protein Transport Inhibitor Cocktail(500×)、Streptavidin-PE、Anti-mouse Clec9a-PE（Clone: 42D2）、Anti-mouse CD11c-APC（Clone: N418）、Rat IgG1 K Isotype control PE（Clone: eBRG1）、Rat IgG1 KIsotype control APC（Clone: eBRG1）、Anti-mouse CD8α-APC（Clone: 53-6.7）、Anti-mouse CD8α-PE（Clone: 53-6.7）、Anti-mouse CD3-PerCP-FlOur 710（Clone: 17A2）、Anti-mouse V alpha 2 TCR-FITC（Clone: B20.1）、Anti-mouse IFN-γ-APC（Clone:XMG1.2）、Anti-mouse IFN-γ（Capture Antibody）、Anti-mouse IFN-γ biotin（Detection Antibody）、mouse IFN-γ protein（Standard Protein）、Avidin-HRP(Enzyme)、1×TMB Solution (Substrate)、5×ELISA/ELISPOT Dilution Buffer、10×Coating Buffer、F(ab')2 Anti-Mouse IgG PE(Polyclone)，ebioscience；

Anti-mouse Clec9a antibody，R&D System；

Recombinant Murine GM-CSF、Recombinant Murine IL-4，PEPROTECH；

Fmoc偶联的氨基酸、Fmoc-Lys(biotin)-OH、Rink resin、Wang resin、HoBt（1-羟基-苯并三唑）、DIC，吉尔生化（上海）有限公司；

Pfx50TM DNA polymerase、 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、2-Mercaptoethanol（55mM），Invitrogen；

琼脂糖、IPTG(sopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)、X-gal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside)，北京索莱宝有限公司

酵母粉、胰蛋白胨，OXOID

Ph.D-12TM phage display peptide library kits、XhoI-HF限制性内切酶 、E.coRI-HF限制性内切酶、KpnI限制性内切酶、DNA连接酶和连接缓冲液、10×CutSmart溶液，NEB；

DMEM，Life technology；

胎牛血清（FBS），Biological Industries；

无内毒素质粒中提提取试剂盒，康为世纪；

DNA 表面分子，TakaRa；

anti-FLAG antibody、一抗抗体稀释液，碧云天；

羊抗兔二抗抗体，北京博奥森生物技术有限公司；

HRP-Anti-M13抗体，Sino-Biological company；

RPMI 1640 medium、DMEM medium，Biological Industries；

胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、Total RNA Isolation Kit，郑州贝贝生物有限公司；

常用培养基和溶液：

主要有LB培养基、顶层琼脂、Xgal/IPTG溶液、LB/ IPTG / X-gal平板、Tet母液、LB-Tet平板、0.1M NaHCO₃（pH8.6）包被液、0.2M Gly-HCl（pH2.2）洗脱液、封闭液、Tris-HCl（pH9.1）中和液、TBS缓冲液（50mM Tris-HCl（pH7.5），含有150mM NaCl）、TBST洗涤液、终止液（2M H₂SO₄）、PEG-8000/NaCl沉淀液、2.5M CaCl₂、2×HBS、FCS buffer（即含有2mM EDTA和0.05% NaN₃的PBS溶液(pH7.4)）、PBS7.2溶液、0.25%胰酶、卡纳抗生素储存液（kana 100mg/mL）、ELISA wash buffer（即含有0.05% Tween-20的PBS7.2缓冲液）、ELISA终止液（即1mMH₃PO4溶液）等，均按现有技术制备即可，不再详细描述；

主要仪器：

AKTA prime、Superdex G200，GE 公司；

电泳仪，Bio-Rad；

切向超滤系统及10KDa膜包，赛多利斯公司；

多肽合成仪，海南建邦制药科技有限公司；

UV2450型号分光光度计、RP-HPLC高效液相系统、制备柱，日本岛津；

荧光定量PCR仪、酶标仪、Nanodrop 2000，ThermoScientific；

凝胶成像系统，天能；

FACS Calibur 流式细胞仪，BD；

生物材料：

HEK-293T 细胞、B16细胞、B16F10细胞、S180细胞、H22细胞、CT26细胞、CHO-K1细胞，来源于上海细胞库；

p3×FLAG-mClec9a-CTLD质粒，Caetano Reis e Sousa 教授惠赠；

pIRES2-EGFP质粒，生物风；

E.coli DH5α感受态细胞、E.coli XL-1 blue感受态细胞，实验室自制；

C57BL/6J小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；OT-1小鼠由王盛典教授惠赠（中科院生物物理研究所）；所有实验动物均为SPF动物，6~8周龄，饲养在独立的IVC笼具内；

CpG ODN 1826、相关引物和测序工作均由北京金唯智生物工程有限公司提供和完成。

实施例1

由于噬菌体展示肽库筛选前需要以相应蛋白为基础，因而发明人制备了mClec9a-CTLD蛋白作为筛选前提，相关制备过程简要介绍如下。

第一，以磷酸钙转染法将p3×FLAG-mClec9a-CTLD质粒转染HEK-293T细胞，转染后采用含有0.3%FBS 的DMEM培养基进行培养，培养至适当时间后，过滤，取上清，上清液中即含有所表达的mClec9a-CTLD蛋白；

第二，采用Western Blotting对上清液中所表达的mClec9a-CTLD蛋白进行检测，以确保上清液中含有目的蛋白；分别对转染后培养40h和64h的上清液进行检测，结果如图1所示，从图中可以看出，上清液中均有mClec9a-CTLD蛋白的表达，另外，Western blotting验证结果表明，所表达的mClec9a-CTLD蛋白的分子量为18KDa，与理论分子量相符；

第三，利用Viva- flow200 10KDa的切向超滤系统对上清液进行浓缩，以提高上清液中mClec9a-CTLD蛋白的浓度；

第四，利用anti-FLAG M2 Affinity Gel 亲和含有3×FLAG标签的mClec9a-CTLD蛋白，进一步洗脱、透析后获得初步纯化和富集的mClec9a-CTLD蛋白；

第五，利用Superdex G200预装柱进行分子筛纯化获得纯度较高的mClec9a-CTLD蛋白，以便进一步用于噬菌体肽库筛选工作。

实施例2

以实施例1所制备的mClec9a-CTLD蛋白为基础，利用固相噬菌体展示12肽库筛选靶向到mClec9a-CTLD蛋白具有高亲和力的亲和噬菌体，通过5轮的淘选，噬菌体得到富集，随机挑取第五轮洗脱下来的噬菌体进行测序，得到1条具有重复序列的亲和噬菌体，命名为WH号噬菌体。筛选过程按照NEB标准流程进行淘选，相关过程简要介绍如下。

（一）固相亲和淘选流程

将实施例1所制备mClec9a-CTLD蛋白溶于0.1M NaHCO3(pH8.6)包被液中，包被于96孔板孔中，在密闭的湿盒中4℃孵育过夜；然后将包被液弃尽，加入含5%BSA的0.1MNaHCO3(pH8.6)封闭液，湿盒中4℃孵育3h；TBST buffer洗涤后，加入TBST稀释的噬菌体，缓慢摇动1h，此过程中噬菌体会亲和到靶蛋白mClec9a-CTLD上；亲和过程结束后，采用TBST洗涤，并采用0.2M的Gly-HCl洗脱液（pH2.2）进行洗脱，将含有噬菌体的洗脱液采用中和液中和后，利用E.coli ER2738对噬菌体进行扩增（采用含0.1%Tet的LB液体培养基摇瓶培养）和纯化；对扩增后噬菌体重复上述步骤进行淘洗，以最终获得亲合力最强的噬菌体。

本发明中，利用固相噬菌体展示技术为筛选手段，以mClec9a-CTLD为靶蛋白，通过不断的“结合-洗涤-洗脱-扩增”的实验流程，同时不断增加洗涤强度，缩短噬菌体与靶蛋白的结合时间来获得亲和力更强的噬菌体。筛选过程中，统计投入噬菌体的回收率（结果如下表所示），结果表明，经过5次反复淘选，噬菌体回收率逐渐增加，亲和靶蛋白mClec9a-CTLD的噬菌体得到富集，而且到第五轮时回收率略有下降，说明噬菌体已经富集完毕，可以进行后期的噬菌体克隆插入基因测序分析工作。

以mClec9a-CTLD为靶蛋白的固相淘选回收率结果，表中，回收率=洗脱噬菌体的数目/投入噬菌体的数目；

注：*pfu：phage forming units。

（二）亲和噬菌体克隆DNA序列测定和亲和肽序列分析

对经过5轮淘洗后亲和的噬菌体克隆进行测序，测序时以96gIII为测序引物，由北京金唯智生物科技有限公司进行测序，依据测序结果按照NEB噬菌体展示肽库说明书推导获得插入基因的所编码的氨基酸序列，即获得与mClec9a-CTLD蛋白的具有较高亲合力的亲和肽序列；

推导所获得的WH肽氨基酸序列为：WPRFHSSVFHTH 。

（三）ELISA鉴定噬菌体克隆与蛋白mClec9a-CTLD的亲和性

为确保淘洗过程中所获得的噬菌体克隆的准确性，采用ELISA法对所获得的噬菌体与mClec9a-CTLD蛋白的亲和性重新进行了检测，过程简要描述如下：

首先，将mClec9a-CTLD蛋白进行包被，并与噬菌体进行结合，相关过程参考前述固相亲和淘洗过程；在此过程中，设置包被靶蛋白mClec9a-CTLD并加入插入随机氨基酸序列的M13噬菌体克隆样品作为阴性对照，设置只包被靶蛋白mClec9a-CTLD并且不加入任何噬菌体克隆的TBST buffer作为空白对照；

其次，对亲和结束后样品采用含0.3% Tween-20 的TBST进行洗涤，然后加入HRP-anti-M13抗体，室温振荡1h；

再其次，加入1×TMB显色15min，显色结束后加入2M的 H2SO4终止反应；

最后，测OD450吸光度值，以OD450高于空白对照的2.1倍以上者定义为阳性克隆。结果表明，筛选所得噬菌体与靶蛋白mClec9a-CTLD具有较好的亲和力。

实施例3

本发明主要介绍一下对实施例2筛选所获得的WH多肽采用Fmoc固相合成法的人工制备过程。

Fmoc固相合成法制备WH肽时，首先溶胀树脂，洗涤并脱保护后，将第一个Fmoc-氨基酸和HoBt进行缩合，洗涤后测取代值，然后封头，脱保护并洗涤后，茚检确认脱保护完全，然后缩合第二个氨基酸，重复上述步骤，直至多肽链合成完成；最后将合成完成的多肽链切割并旋转蒸发后，用乙醚沉淀获得粗肽，再进一步通过冰乙醚洗涤和离心沉淀方式对粗肽进一步纯化，最后制得纯度较高的WH多肽产品。详细制备过程描述如下：

（一）缩合第一个氨基酸

1、溶胀树脂：称取0.4g Rink resin倒入合成仪中，用适量的DMF溶胀30min（若树脂为Wang resin，DMF洗涤后直接进入步骤（5）；

2、洗涤：加入DMF洗涤2次，每次洗涤2min；

3、脱保护：加入脱保护液（含20%哌啶的DMF溶液）2次，每次脱保护15min；

4、洗涤：依次加入以下洗涤液洗涤树脂，DMF 2次-MeOH 3次-DCM 3次-DMF 2次，每次洗涤2min；

5、缩合：将第一个Fmoc-氨基酸和HoBt用少量的DMF溶解，加入到合成仪中，10min后加入2.5倍当量的DIC，震荡1.5h；

6、洗涤：洗涤同步骤3；

7、测定取代值：取1~1.5mg烘干后树脂，加入3mL脱保护液，震荡10min，在290nm处读取吸光度值；取代值=样品OD₂₉₀值/（1.65×树脂质量），Rink resin或者Wang resin都是高取代值树脂，取代值都应在0.5以上；

8、封头：用封头液（乙酸酐/吡啶溶液1:1）封掉没有缩合氨基酸的树脂，封头3次，15min/次；

9、洗涤：洗涤过程同步骤4；

（二）添加后续氨基酸

10、脱保护：加入脱保护液，脱保护2次，20min/次；

11、洗涤：洗涤过程同步骤4；

12、茚检：取少许树脂于茚检管中，滴加Kaiser Test溶液，沸水浴中2min，树脂成蓝色（除Pro，His和Ser脱保护后成红棕色）说明脱保护完全，否则需要重复脱保护；

13、缩合氨基酸：按照取代值计算需要添加的氨基酸和HoBt，待完全溶解后加入到合成仪中，加入DIC，震荡2~2.5h；

14、洗涤：洗涤过程同步骤4；

15、茚检：茚检方法同步骤12，茚检后若树脂呈亮黄色，且树脂无蓝色斑点，则说明缩合完全，若出现大量蓝斑，需要重新缩合此氨基酸；

16、重复步骤10~15至整条肽连制备完成；

（三）切割和纯化多肽

17、脱保护：同步骤10；

18、洗涤：洗涤过程同步骤4；

19、茚检：同步骤12；

20、切割：配置切割试剂5mL（82.5% TFA，5% ddH₂O，5%苯酚，5% 苯甲硫醚和2.5%乙二硫醇），混合均匀后，倒入合成仪中，缓慢搅拌切割3h；待反应完成后，抽滤切割反应溶液于三角瓶中，用适量的DCM洗涤树脂3次，与抽滤液混合于圆底烧瓶中；此步骤在通风厨中进行；

21、旋转蒸发：用旋转蒸发仪去除低沸点的溶液如TFA，DCM等，待溶液成为粘稠状时（若有肽链中含有切割的侧链保护基团时，如pbf基团和Boc基团，需要加入5mL TFA和少量的DCM在冰上冰切30min，而后旋转蒸发），加入1/3烧瓶体积的无水乙醚，旋转蒸发5次；

22、乙醚沉淀：加入100mL冰盐浴的无水乙醚，沉淀粗肽40min；

23、离心和洗涤：将步骤22中混合物2000rpm离心2min，弃上清，收集沉淀，再用新的冰乙醚洗涤5次，以去除难挥发的切割试剂，若不洗涤或洗涤次数太少，粗肽里有难闻的乙二硫醇和苯甲硫醚的气味；

24、自然挥发和标记：在通风橱中过夜挥发干燥，让乙醚挥发干净，称量，标记，即得到所制备的WH多肽产品。

对所制备的WH多肽采用ESI-MS（高效液相色谱-质谱）进行验证，以验证其分子量是否正确。WH多肽理论分子量为1536.73，而从图2中可以看出，其值为768.8（ESI-MS(M+2H)/2 or (M+H)），与预期结果符合较好，表明所制备的WH多肽符合预期，可以用于实际实验或应用研究。

需要说明的是，为便于后续实验研究，同样采用固相合成技术，发明人制备了对照肽GA肽（序列为：GAGAAGGAGGGG）和OVA_257-264表位肽（SIINFEKL），同时制备了在羧基端含有-GGGK^biotin的GA肽和WH肽的衍生物，另外制备了由连接子（3个甘氨酸，-GGG-）连接的含有OVA_257-264表位肽WH肽和GA肽的衍生物WH-OVA（WH-GGG-SIINFEK）和GA-OVA（GA-GGG-SIINFEKL）。

实施例4

以实施例3所制备的WH肽为基础，对其进行了进一步地亲和实验和抗原交叉呈递实验，亲和实验主要是通过对所制备的WH肽与表达Clec9a的DC细胞的亲和程度来检验WH肽的亲和性，抗原交叉呈递实验主要是通过对所制备的WH肽与过表达Clec9a蛋白的细胞系的亲和程度来验证WH肽与Clec9a蛋白间的依赖性，相关实验过程简要介绍如下。

（一）亲和实验

由于足够量的表达Clec9a的DC细胞的获得是相关实验开展前提，因而首先需要诱导DC细胞表达Clec9a蛋白。常规诱导DC的方法有2种，一种是利用GM-CSF/IL-4联合诱导的骨髓来源的DC，称之为GM-DC；另一种是由Flt3L诱导骨髓来源的DC，称之为淋巴系来源的DC（FL-DC）。流式细胞检测表明，只有FL-DC上表达Clec9a，而在GM-DC上不表达，相关实验过程详细介绍如下：

1、FL-DC的诱导（即获得表达Clec9a的DC细胞）

（1）获得骨髓来源的DC：脱颈处死C57BL/6J小鼠，在75%的酒精中浸泡5~10min，用无菌的眼科剪和镊子，解剖小鼠，取其大腿骨和胫骨，去净其附属肌肉，在75%的酒精中浸泡骨头1min，用无菌的PBS冲洗骨头；

在骨头关节处剪断，用1mL注射器吸取无血清的RPMI1640培养基，将针头钻进骨头空腔，推动注射器，冲出骨髓，骨头空腔由红色变成白色，将所有骨髓冲洗干净；

用70μM的滤网过滤，去掉其较大的组织或骨头；

4℃、1500rpm离心5min，弃上清，加入2mL红细胞裂解液，用移液器吹匀，4℃裂解5min；

4℃、1500rpm离心5min，再用10mL的PBS7.2洗涤2次；

加入10mL 含有10%FBS 的RPMI1640培养基，重悬，细胞计数，调成3×106cells/mL铺到无菌的一次性菌用培养皿中，培养；

（2）诱导FL-DC：加Flt3L细胞因子，终浓度为200ng/mL，而后每4天半量换培养液一次（即Day5和Day9），并补加Flt3L细胞因子，培养至10天~12天用于实验；

（3）流式检测FL-DC上Clec9a蛋白的表达情况

获取诱导的FL-DC，用FCS buffer洗涤，并计数（5×10⁵cells/test）；

流式抗体标记：用100μL的FCS buffer重新细胞，用大鼠血清4℃封闭15min后，加入anti-CD11c-APC抗体，而后加入Rat IgG1Κ-PE，4℃孵育30min；

用FCS buffer洗涤2次，流式检测，以确定FL-DC上Clec9a蛋白表达情况。

流式检测结果如图3所示，从图中可以看出，Flt3L成功诱导骨髓来源的FL-DC表达了mClec9a，因此可利用FL-DC替代CD8α+DC来研究多肽靶向性和体外交叉递呈活性研究。

、流式检测WH肽与FL-DC的亲和性

获取诱导的FL-DC，用FCS buffer洗涤，并计数（5×10⁵cells/test）；

用90μL的FCS buffer重悬细胞，加入10μL 1mM生物素化WH肽至终浓度为100μM，4℃孵育30min；

用FCS buffer洗涤2次，洗去非特异性结合；

加入anti-CD11c-APC抗体和streptavidin-PE，4℃孵育30min；

用FCS buffer洗涤2次，流式检测。

检测结果如图4所示，从图中可以看出，只有WH肽能够亲和FL-DC，其余的肽不具有亲和FL-DC的能力（GA作为对照肽，参考实施例3步骤自行制备，序列为GAGAAGGAGGGG）。

、流式检测WH肽与过表达mClec9a蛋白的HEK-293T细胞的亲和性

为了进一步确认WH肽与FL-DC细胞的亲和性依赖于mClec9a蛋白的表达，因而发明人制备了pIRES2-mClec9a重组质粒并将其过表达于HEK-293T细胞中，然后进一步通过流式细胞检测方法检测WH肽与过表达mClec9a蛋白的HEK-293T细胞间的亲和性，相关实验过程介绍如下。

（1）获取cDNA：由于mClec9a主要表达脾脏中的CD8α⁺DC上，因此以脾脏的总RNA为模板，再利用反转录试剂盒反转录成cDNA，用于后续构建mClec9a载体。

（2）构建pIRES2-mClec9a重组质粒：以上述所制备的cDNA为模板，进行PCR扩增获得mClec9a基因序列，PCR扩增时引物序列设计如下：

正向引物：5’-CCCTCGAGATGCATGCGGAAGAAATATATACCTC-3’（其中TCGAG部分为XhoI酶切位点）；

反向引物：5’-CGGAATTCTCAGATGCAGGATCCAAATGC-3’（其中GAATTC部分为E.coRI酶切位点）；

对PCR扩增获得的mClec9a目的条带进行1%琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收目的片段；

对切胶回收目的片段和pIRES2-EGFP质粒分别采用XhoI-HF和E.coRI-HF 进行双酶切，酶切产物分别经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收；

将回收酶切产物采用DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，LB液体培养基进行培养，卡那霉素抗性筛选，并进行双酶切验证，验证正确的质粒再进行测序验证；

（3）转染：将步骤（2）中测序验证正确质粒转染HEK-293T细胞，并进行mClec9a蛋白的表达（同时设置转染pIRES2-EGFP的空质粒作为对照）；

（4）检测：检测步骤参考上述WH肽与FL-DC亲和性检测步骤。

结果如图5所示。从图5中可以看出，WH肽不亲和EGFP+293T^mock （转染pIRES2-EGFP的空质粒）细胞，但是WH肽能够亲和到HEK-293T ^Clec9a（转染pIRES2-mClec9a重组质粒）上，因而可以认为WH肽能够特异性的亲和到表达mClec9a的细胞上。

、WH肽的亲和特异性

基于上述实验可以看出，WH肽能够特异的亲和mClec9a蛋白或表达mClec9a的细胞系，那么对于不表达mClec9a的细胞系能否亲和则需进一步实验验证。

为了验证WH肽与mClec9a蛋白亲和的特异性，发明人检测了WH肽与鼠源细胞系或中国仓鼠细胞的亲和性，细胞系包括肿瘤细胞株（B16，B16-F10，CT26，S180和H22）、巨噬细胞株（RAW264.7）和非鼠源的细胞株（CHO-K1）；相关实验操作参考前述WH肽与FL-DC亲和性检测步骤。

具体结果如图9所示。由于这些细胞株都不表达mClec9a，从图中可以看出，这些细胞株与WH肽只有微弱的亲和性。这一结果说明WH肽与mClec9a蛋白具有很好的特异性。

（二）抗原交叉呈递实验

由于mClec9a是一个内吞性的受体，靶向到mClec9a后能够引起mClec9a的内吞效应和交叉递呈作用。为了验证这一特性，发明人将WH肽通过连接子（-GGG-）将与OVA_257-264表位相连，与FL-DC孵育后，再与来源于OT-1小鼠的CD8⁺T细胞孵育，以此来检测WH肽的交叉递呈作用。相关实验过程简要介绍如下。

（1）FL-DC荷载peptide-OVA或者对照肽：获取诱导第12天的FL-DC，用无血清的RPMI1640培养基洗涤2次；将10µg/mL的WH-OVA、GA-OVA、WH肽和OVA_257-264肽与2×10⁵ 的FL-DC在4℃孵育1.5h，同时设立不荷载肽的FL-DC组；孵育完后，1500rpm离心5min，洗涤2次后，计数调成10⁵cells/mL备用；需要说明的是，相关肽或其衍生物（WH-OVA、GA-OVA、WH肽和OVA_257-264肽）参考实施例3制备步骤制备或按现有技术制备即可；

（2）分选获得来源于OT-1小鼠的CD8+ T细胞：脱颈处死OT-1小鼠，取其脾脏和淋巴结（腹股沟、腋下和面部淋巴结），参考EasySepTM mouse naive CD8⁺T细胞分选试剂盒说明书，分选得到的CD8⁺T细胞；

（3）CFSE标记CD8⁺T细胞：对步骤（2）中分许得到的CD8⁺T细胞进行CFSE标记，并最终调节细胞密度为1×10⁶ cells/mL备用；

（4）荷载肽的FL-DC与CD8⁺T细胞的共孵育：将步骤（3）中CFSE标记（染色）的CD8⁺T细胞铺于96孔板中，按FL-DC：CD8⁺T细胞=1:10（数量比）的比例，加入步骤（1）中荷载肽的FL-DC，二氧化碳培养箱中37℃培养72h；

培养结束后，利用CFSE标记来检测T细胞的增殖，采用ELISA法对细胞培养的上清液中的IFN-γ的量进行检测，利用qRT-PCR检测perforin和Grz B mRNA的相对表达量。

相关实验结果如图10所示。对于相关结果简要解释如下。

由于CFSE是一个小分子化合物，能够穿透细胞膜，在细胞内能够与细胞骨架蛋白相偶联，形成稳定的化合物，发出荧光，并且能够随着细胞的增殖将荧光平均分配到两个子细胞中（CD8⁺ T细胞分裂是平均分裂），故CFSE可以用来标记细胞的增殖。从图10A可以看出，

与对照组GA-OVA组相比，WH-OVA能够强烈刺激naïve T细胞的增殖；作为阳性对照肽OVA_257-264，由于能够直接与MHC class I分子结合，能够直接刺激T细胞的增殖；而阴性不带有抗原的肽或空载的DC则不具有刺激T细胞的增殖能力。这一结果表明，WH肽靶向DC后，能够将抗原加工后刺激T细胞的增殖。

为了验证T细胞的功能，进一步检测了培养液上清中IFN-γ的含量。结果表明，WH-OVA组刺激T细胞分泌IFN-γ的含量达到了4.5ng/mL，非常明显的高于GA-OVA组和阳性OVA_257-264组，这一结果表明，WH-OVA能够强烈的刺激T细胞并且激活了T细胞，并导致其分泌大量的IFN-γ。

对T细胞两个杀伤性分子（即穿孔素perforin和颗粒酶granzyme B）在mRNA水平上的表达水平的检测结果表明，WH-OVA组明显的刺激了perforin和Grz B mRNA的表达，perforin的量高于GA-OVA约3.5倍，而Grz B高于对照组的5倍。

综上结果可以看出，WH肽能够作为一个运载体将抗原运载到DC，而后由DC加工递呈给特异性的CTL细胞，刺激CTL细胞（细胞毒性淋巴细胞，cytotoxic T lymphocytes）分泌因子和提高T细胞杀伤性分子mRNA的表达。

（三）WH肽与mClec9a相互作用模式分析

发明人对WH肽与mClec9a的相互作用模式进行了进一步分析，相关分析过程及结果简要介绍如下。

二级结构分析：

利用PEP-FOLD Peptide Structure Prediction Server在线软件生成了WH肽的二级结构，从结果可以看出，WH肽是一个α螺旋结构。

空间作用模型分析：

利用In silico的方法，通过加氢、缺失片段修补和质子化等优化手段，生成了mClec9a(UniProtKB: Q8BRU4)的3D空间结构，然后通过ZDOCK将50个WH肽的二级结构与mClec9a进行分子对接，模拟，从而产生了50个WH肽可能与mClec9a的复合物结构（WH-Clec9a complexes）。

对这50个复合物结构进行统计，结果如图6所示。从图中可以看出，大部分WH肽对接到mClec9a的S1区和S2区，S1区：R ¹⁵⁴，E ¹⁵⁶，M ¹⁵⁷，N159 , I¹⁶⁰， S¹⁶¹ ，K¹⁶³，S¹⁶⁴ ，K¹⁶⁷，C²⁴⁷，D²⁴⁸ 和W²⁵⁰；S2 区：E¹⁵³，W¹⁵⁵，K¹⁹¹ ，N¹⁹⁴，S²⁴⁹ 和Y²⁵²。

基于上述分析，可以进一步进行单氨基酸突变以对WH肽与mClec9a蛋白的具体的亲和区域进行分析。为便于分析，选取了WH肽与S1区和S2区相互作用最多的7个氨基酸残基进行丙氨基酸替换（R¹⁵⁴，W¹⁵⁵，M¹⁵⁷，I¹⁶⁰，D²⁴⁸，W²⁵⁰和Y²⁵²），相关实验过程简要介绍如下。

对mClec9a进行单个氨基酸突变时主要利用QuichChange的方法进行，过程为：设计特定引物（引物设计原则为：对突变前后的碱基各取20~30个碱基，前后碱基片段GC含量打分在60~70之间，且相差不超过2°，并且两边都是以G/C碱基结尾），PCR扩增时将mClec9a的单个氨基酸的碱基替换成丙氨酸的密码子（GCX，X为任意碱基），然后再以pIRES2-mClec9a重组质粒为模板，扩增含有突变的载体；利用KpnI酶将pIRES2-mClec9a进行酶切，并转化含有卡纳霉素抗性的平板（转化E.coli XL-1 Blue），最后测序验证其质粒的正确性，验证正确质粒再转染HEK-293T细胞；具体操作可参考前述pIRES2-mClec9a重组质粒转染HEK-293T细胞的相关过程。

对单个氨基酸突变后所表达的mClec9a蛋白与WH肽亲和性进行检测，结果如图7所示。从图7中可以看出，当mClec9a的D²⁴⁸和W²⁵⁰突变成Ala时，大大削弱了WH肽亲和Clec9a⁺HEK-293T细胞的能力，而其他的突变对于WH的亲和性影响不大。

基于上述结果，再通过In silico 方法分析D²⁴⁸和W²⁵⁰与WH肽亲和相互作用的氨基酸，其中W²⁵⁰与WH肽作用的氨基为Arg³， Phe⁴，Ser⁷，Val⁸ 和 Thr¹¹；而D²⁴⁸与WH肽作用的氨基为Arg³ 和 Phe⁴。进而利用计算机模拟了mClec9a与WH肽相互作用的示意图，结果表明，它们原子之间的距离小于4.5Å。相关模拟图如图8所示。这一结果表明，WH肽的第三位的Arg和第四位的Phe在亲和Clec9a中起着非常重要的作用，换言之，mClec9a的D²⁴⁸和W²⁵⁰是WH肽亲和mClec9a的关键残基。

实施例5

基于实施例4的体外亲和性研究和抗原交叉递呈实验结果，可以看出，WH肽具有很好的靶向性，具有靶向运输功能以及携带抗原、诱导抗原的交叉递呈能力，而对其在生物体内的靶向性、免疫活性以及是否能够增强抗原的抗肿瘤活性尚需进一步实验检验。相关实验过程简要介绍如下。

（一）ex vivo CTL priming

为进一步研究WH肽偶联抗原能够在体内也具有刺激CTL priming 的能力，将不同的肽通过皮下免疫小鼠3次（图11A），而后再在体外刺激脾细胞5天后，观察CTL priming的一系列指标的变化情况：上清IFN-γ、胞内IFN-γ以及T细胞杀伤性分子perforin和Grz BmRNA的相对表达量。相关实验过程如下所述。

选取6~8周龄的C57BL/6J小鼠，每组5只；尾基根部皮下多点注射多肽药物和CpGODN 1826，每隔7天给药一次，给药3次，实验分别设以下5组：

NS组： 生理盐水组（NS）+ 30μg/只CpG ODN1826；

WH-OVA组： 100μg/只 WH-OVA+ 30μg/只CpG ODN1826；

WH组： 100μg/只 WH + 30μg/只CpG ODN1826；

OVA257-264组： 100μg/只OVA257-264+30μg/只CpG ODN1826；

GA-OVA组： 100μg/只 GA-OVA+30μg/只CpG ODN1826；

3次免疫后的第五天，处死小鼠，取其脾脏，研磨，裂红，洗涤并计数；

将细胞密度调整为5×10⁶cells/mL，取5mL细胞铺于6孔板中，用10μg/mL的OVA_257-264肽刺激5天；

取其上清保存于-80℃冰箱，ELISA检测IFN-γ的含量（OVA_257-264抗原肽刺激5天后脾细胞的上清）。诱导的细胞一部分用于检测胞内的IFN-γ，另一部分提取总RNA，检测perforin和Grz B的mRNA的相对表达量。

需要说明的是，为确定特异性的IFN-γ⁺CD8⁺T细胞的频率，还利用胞内因子染色的方法检测了IFN-γ的相对含量，以间接的反应特异性CTL的含量，相关实验过程为：

（1）加入阻断剂：将培养第五天前的7~10h的细胞收集，调整细胞密度为2×10⁶cells/mL，取1mL加入2μL 500×protein transport inhibitor cocktail，混合均匀放置于37℃继续培养7~10h；4℃ 、700g离心5min；

（2）表面分子染色：用100μL的含有2%FBS的 FCS buffer（PBS7.4）重悬，加入anti-CD3-PerCP-eflour710和anti-CD8α-PE，同时设立CD3单阳管和CD8单阳管在4℃孵育30min；用FCS buffer洗涤2次，4℃ 、700g离心5min；

（3）固定和破膜：用200μL、1×Fixation buffer重悬细胞，室温固定30min；用200μL 1×permeablization wash buffer洗涤2次，4℃、700g离心5min；

（4）IFN-γ染色：加入anti-IFN-γ-APC抗体或者同型Rat IgG2a-APC，4℃避光孵育30min；利用1×permeablization wash buffer洗涤2次，4℃、700g离心5min，并用400μLFCS buffer重悬，流式检测。

实验结果如图11所示。从图11B中可以看出，与GA-OVA对照组相比，WH-OVA肽能够明显的刺激细胞分泌大量IFN-γ；通过胞内IFN-γ细胞因子染色，IFN-γ阳性的细胞的频率明显的高于GA-OVA组和OVA_257-264组IFN-γ⁺CD8⁺T频率，这表明靶向肽能够明显在体内刺激T细胞分泌IFN-γ（图11C）；另外CTL杀伤性分子 perforin和Grz B较GA-OVA组明显成倍增加（图11D、E）；这一体内免疫结果表明，WH肽能够增强OVA_257-264抗原刺激的CTL priming的能力。

（二）治疗性B16-OVA模型

基于mClec9a的抗肿瘤疫苗能够将抗原特异靶向到CD8α⁺DC膜上诱导特异性的抗肿瘤免疫反应，WH肽也是同样能够靶向到mClec9a上，那么抗原靶向能否刺激机体特异性的抗肿瘤免疫应答则需进一步验证。因此发明人建立了表达OVA蛋白的B16黑色素瘤肺转移模型，以验证WH-OVA对B16肿瘤的治疗性作用。具体实验过程简要介绍如下。

培养B16-OVA细胞，消化，洗涤，将细胞密度调整为3×10⁶cells/mL；选取6~8周龄的C57BL/6J小鼠，每组5只，尾静脉注射0.3mL B16-OVA细胞，即9×10⁵cells/只，此时定义为第0天；

荷瘤后的第3天，尾基根部皮下多点注射多肽药物和CpG ODN 1826，每隔7天给药一次，给药3次；实验分别设以下5组：

NS组： 生理盐水组（NS）+ 30μg/只CpG ODN1826；

WH-OVA组： 100μg/只 WH-OVA多肽+ 30μg/只CpG ODN1826；

WH组： 100μg/只 WH多肽 + 30μg/只CpG ODN1826；

OVA257-264组： 100μg/只OVA257-264多肽+30μg/只CpG ODN1826；

GA-OVA组： 100μg/只 GA-OVA多肽+30μg/只CpG ODN1826；

给药3次后的第五天，处死小鼠，取出肺，观察各组的肺转移灶的数目；

同时取其脾脏，研磨，裂红，洗涤并计数，将细胞浓度调整为5×10⁶cells/mL，取5mL细胞铺于6孔板中，用10μg/mL的OVA_257-264肽刺激5天；

细胞培养上清保存于-80℃冰箱，ELISA检测IFN-γ的含量（OVA_257-264抗原肽刺激5天后脾细胞的上清）。诱导的细胞一部分用于检测胞内的IFN-γ，另一部分提取总RNA，检测perforin和Grz B的mRNA的相对表达量。

同样，为确定特异性的IFN-γ⁺CD8⁺T细胞的频率，利用胞内因子染色的方法检测了IFN-γ的相对含量，相关操作参考前述内容。

相关实验结果可以看出，WH-OVA靶向肽的治疗组肿瘤转移灶的数目明显的低于GA-OVA组；利用OVA_257-264抗原肽再刺激脾脏5天后，WH-OVA组上清IFN-γ的分泌量明显高于对照组，平均值约15ng/mL，也明显的高于单独OVA_257-264组；与体内多肽免疫实验一致，WH-OVA组明显的增加了perforin和Grz B mRNA的相对表达量。换言之，抗肿瘤实验结果表明利用靶向肽偶联OVA_257-264抗原肽能够引发CTL反应，并且能够明显增强抗原的抗肿瘤活性；即，WH肽可以作为疫苗的运载体。

综上所述，发明人在将OVA_257-264抗原偶联到WH肽后，通过3轮免疫实验，可较好诱导特异性CTL的应答，并且能够刺激T细胞分泌大量的IFN-γ和提高T细胞杀伤性分子perforin和Grz B mRNA的相对表达量。进一步的作为治疗性肿瘤疫苗的实验表明，可大幅降低肺转移灶的数目，可以作为一种像抗体一样的靶向载体，运载抗原，增强抗肿瘤免疫反应。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州大学

<120> 靶向Clec9a的亲和肽WH肽

<130> none

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Trp Pro Arg Phe His Ser Ser Val Phe His Thr His

1 5 10

Claims (4)

1.一种靶向Clec9a的亲和肽WH肽，其特征在于，该肽由12个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：WPRFHSSVFHTH，即：Trp-Pro-Arg-Phe-His-Ser-Ser-Val-Phe-His-Thr-His。

2.权利要求1所述靶向Clec9a的亲和肽WH肽的衍生物，其特征在于，所述WH肽的衍生物为WH肽与OVA抗原偶联后的衍生物，偶联时采用连接子GGG。

3.权利要求1所述靶向Clec9a的亲和肽WH肽的制备方法，其特征在于，通过Fmoc固相合成法制备获得。

4.权利要求2所述靶向Clec9a亲和肽WH肽的衍生物在制备肿瘤治疗药剂中的应用，其特征在于，WH肽作为运载抗原的载体用于制备多肽疫苗，具体用于B16细胞所致肿瘤。