CN109021078B - 一个靶向树突状细胞的亲和肽ty肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请属于肿瘤治疗用蛋白相关技术领域，具体涉及一个靶向树突状细胞的亲和肽TY肽及其应用专利申请事宜。所述TY肽为12肽，具体氨基酸序列为：TITHFQFGPTVY。本申请在TY肽基础上，进一步以MSN为基础设计了一种新型的可以靶向DC的纳米运输系统，并负载模式抗原OVA和免疫佐剂CpG，成功制备了纳米载体MSN‑TY/OVA/CpG。实验表明：MSN‑TY/OVA/CpG可以有效地被不成熟的DC摄取，提高了抗原被DC摄取的效率，促进DC的成熟并有效地激活DC，并且有效地促进了抗原的加工和递呈，刺激其分泌细胞因子，进一步引发抗原特异的CTL免疫反应和抗肿瘤免疫反应。

Description

一个靶向树突状细胞的亲和肽TY肽及其应用
技术领域
本申请属于肿瘤治疗用蛋白相关技术领域，具体涉及一个靶向树突状细胞的亲和肽TY肽及其应用专利申请事宜。
背景技术
肿瘤严重威胁着人类健康，全球每年有上千万个新增病例和死亡病例，其中我国约占四分之一。手术治疗、放疗和化疗是目前临床上治疗肿瘤的常规方案。其中肿瘤治疗面临的主要问题是后期肿瘤的转移与高复发率；化疗和放疗的毒副作用较大，并且医治之后的肿瘤很容易产生抗性。因此，发展高效的、特异性强、低毒性的药物是目前肿瘤治疗的当务之急。
肿瘤免疫治疗充分利用了机体自身免疫系统的活化机制，来清除肿瘤细胞，是肿瘤治疗史上的重大突破。目前常用的肿瘤免疫治疗的形式主要有细胞因子疗法、阻断免疫检验点疗法、细胞免疫疗法尤其是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（CAR-T）以及肿瘤疫苗疗法，这些治疗策略在临床上也取得了令人欣喜成果。但也面临着一些问题，例如成本高、在治疗中个体免疫反应差异比较大以及一些负性反应（如细胞因子释放并发症）等。其中肿瘤疫苗以其可以负载肿瘤相关的抗原，激发抗原特异的抗肿瘤免疫反应等独特的优势脱颖而出，成为目前研究的热点。
肿瘤疫苗可以促进抗原特异的CD8+T细胞的增殖，刺激细胞毒性T淋巴细胞的活化进而有效地清除肿瘤细胞。在T细胞介导的免疫反应中，抗原递呈细胞发挥着重要作用。目前DC细胞是已知功能最强、唯一能够活化静息状态T细胞的专职抗原递呈细胞，是启动、维持和调节免疫应答的核心组分，在肿瘤免疫治疗中发挥着关键作用。
DC表面存在很多潜在的靶点，目前已有研究利用化学方法把抗原偶联到抗体上，或者从基因水平使抗原与靶向DC的抗体融合，来提高抗原的运输效率，这为肿瘤疫苗的发展提供了新的策略。抗体介导抗原内吞作用，提高了抗原的运输效率，并激活了T细胞介导的免疫反应。但是也面临一些问题，如抗体在体内可能会引起负性免疫反应，进而影响T细胞的活化；抗原-抗体复合物组织渗透性差，而且鼠源的抗体应用于人，会产生较高的免疫原性。因此，发现DC表面潜在的靶向分子，靶向运输抗原，促进外源性抗原交叉递呈作用，对激发CTL免疫反应是很关键的，也是目前肿瘤疫苗研究的热点。现有技术中，已有基于多肽靶向DC表面特异性受体的肿瘤疫苗被应用于肿瘤免疫治疗，其可以有效地激活体内免疫反应，从而抵抗肿瘤的入侵。然而，初步应用表明，现有肿瘤疫苗存在刺激抗肿瘤免疫反应能力弱的缺陷，其主要原因是抗原运输效率低、体内降解速率快、抗原交叉递呈能力弱、大部分被非专职的抗原递呈细胞识别引起抗原了脱靶效应，进而诱导了CTL的无能，从而削弱了治疗肿瘤的效果，因此筛选新的靶向DC分子并设计新型的肿瘤疫苗，对改进肿瘤疫苗的治疗效果具有重要的意义。
发明内容
本申请目的在于提供一个靶向树突状细胞（DC）的亲和肽TY肽，并针对该亲和肽制备了MSN-TY/OVA/CpG纳米载体，从而为相关疾病的治疗奠定基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一个靶向树突状细胞的亲和肽TY肽，为12肽（包含12个氨基酸），该肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体氨基酸序列为：Thr-lle-Thr-His-Phe-Gln-Phe-Gly-Pro-Thr-Val-Tyr，即T-I-T-H-F-Q-F-G-P-T-V-Y（TITHFQFGPTVY）。
所述靶向树突状细胞的亲和肽TY肽在制备抗肿瘤疫苗中的应用。
所述靶向树突状细胞的亲和肽TY肽的制备方法，为Fmoc固相合成法。
利用所述靶向树突状细胞的亲和肽TY肽所制备纳米载体MSN-TY，通过将TY肽乙酰化后共价偶联到MSN（mesoporous silica nanoparticles，介孔二氧化硅）表面（MSN-TY）制备获得，具体构建过程为：
（1）首先，制备乙酰化的TY肽（或者利用Fmoc固相合成时直接制备乙酰化的TY肽），
（2）然后，将乙酰化的TY肽溶于2 mL的DMF中，加入10倍当量的HoBt混合孵育，再加入10倍当量的DIC，与上述反应物混合均匀后室温孵育10 min，活化TY肽上的羧基；
（3）按MSN（氨基化修饰）：多肽=1:1（质量比）的量取适量MSN于干净的10 mL的圆底烧瓶中，用超声波清洗仪把MSN重新分散于2 mL的DMF中；
（4）把步骤（2）中活化好的TY肽加入到上述步骤（3）中超声分散好的MSN中，室温下磁力搅拌反应24 h；反应产物用水洗涤3次，以除去未结合的多肽，然后分散于PBS缓冲液中（pH=7.2），上述反应均避光进行。
利用所述靶向树突状细胞的亲和肽TY肽所制备纳米载体MSN-TY/OVA/CpG，首先将TY肽乙酰化后共价偶联到MSN（mesoporous silica nanoparticles，介孔二氧化硅）表面（MSN-TY），再通过静电吸附的方法，分别将模式抗原OVA蛋白和TLR9受体激动剂CpG吸附到MSN-TY表面，从而最终制备获得可以特异性靶向DC的纳米疫苗载体MSN-TY/OVA/CpG，其中TY肽可以使该载体特异性地靶向DC，负载的模式抗原OVA蛋白和TLR9受体激动剂CpG可以高效地激活DC；纳米载体形态规则，平均粒径约为150 nm。
所述纳米载体MSN-TY/OVA/CpG在制备抗肿瘤疫苗中的应用。
本申请中，发明人首先利用噬菌体展示肽库技术筛选获得了靶向小鼠脾脏DC的亲和肽TY肽，进一步通过Fmoc固相合成技术合成了生物素标记的DC亲和肽，并利用体外亲和实验，流式检测方法证明了筛选所得TY肽具有较好的亲和性。
基于树突状细胞（dentritic cell，DC）开发的抗肿瘤疫苗是当前免疫治疗研究的热点，通过促进抗原特异的CD8+T细胞的增殖，刺激细胞毒性T淋巴细胞的活化，进而有效地清除肿瘤细胞。DC表面存在许多潜在的靶点，靶向DC运输抗原是一种潜在的制备肿瘤疫苗的方法。但现有肿瘤疫苗的主要问题是抗原脱靶效应（off-target effect）及不能高效地刺激机体产生抗肿瘤免疫应答。因此，选择DC表面特异性受体，设计新型肿瘤疫苗，从多环节活化T细胞，对于肿瘤的免疫治疗具有重要意义。基于这一目的，本申请成功制备了特异性靶向DC的纳米载体MSN-TY/OVA/CpG，该载体粒径均一，脾脏DC摄取效率高，并能刺激DC成熟，并引发抗原交叉递呈作用并显著刺激T细胞增殖。该载体为开发新的抗肿瘤疫苗提供新的思路和技术支持。
总体而言，本申请在筛选获得特异靶向DC多肽TY肽基础上，进一步以MSN为基础设计了一种新型的可以靶向DC的纳米运输系统，并负载模式抗原OVA和免疫佐剂CpG，成功制备了纳米载体MSN-TY/OVA/CpG。进一步地体内外实验效果评估表明：MSN-TY/OVA/CpG可以有效地被不成熟的DC摄取，提高了抗原被DC摄取的效率，促进DC的成熟并有效地激活DC，并且有效地促进了抗原的加工和递呈，刺激其分泌细胞因子，进一步引发抗原特异的CTL免疫反应和抗肿瘤免疫反应，在B16-OVA荷瘤模型中可有效刺激抗原特异的CD8+T细胞免疫反应，表现出较高的改进效果。
附图说明
图1为流式检测噬菌体单克隆亲和DC情况；
图2、图3、图4分别为生物素化TY肽质谱图、OVA257-264肽质谱图、乙酰化TY肽质谱图；
图5为DC亲和肽与不成熟的BMDC的亲和实验，GA肽做为对照肽；结果显示只有TY肽可以亲和BMDC；
图6为MSN-TY的制备，其中（A）MSN、MSN-TY和MSN-TY/OVA/CpG的红外光谱分析图；（B）MSN和MSN-peptide的热重分析曲线图；
图7为MSN-TY/OVA/CpG载体制备；（A）BCA定量上清中游离的蛋白量，计算不同比例下MSN负载OVA蛋白的包封率；（B）琼脂糖凝胶电泳检测MSN负载CpG的情况；
图8 为纳米载体的表征，（A）不同纳米载体的TEM图片，（B）MSN分散于水中的照片，（C）MSN的SEM照片，（D）MSN、 OVA、 MSN-TY、 MSN-TY/OVA/CpG的Zeta电位；（E）不同纳米载体的粒径分布；
图9 为细胞毒性实验和摄取实验，（A）OVA/CpG、MSN/OVA/CpG、MSN-TY/OVA/CpG纳米载体与BMDC细胞共孵育48 h，利用MTT实验检测其对的细胞毒性；（B）OVAFITC/CpG、MSN/OVAFITC/CpG和MSN-TY/OVAFITC/CpG（各组均以OVAFITC的量计算20 μg/mL）与脾脏细胞37℃孵育4 h后流式检测结果；（C）荧光强度的统计值；（D）BMDC分别与OVAFITC和不同的纳米载体共孵育4 h后，用Hoechst和Lysotracker分别染细胞核（蓝色）和溶酶体（红色），用激光共聚焦显微镜观察BMDC的摄取OVAFITC和纳米载体的情况；
图10为OVA/CpG、MSN/OVA/CpG和MSN-TY/OVA/CpG纳米载体对DC成熟的影响；不同的纳米载体与2×106个/well在6孔板中37℃共孵育24 h（每孔加入的载体量均以OVA 100μg和CpG 80 μg计算）流式检测DC表面共刺激分子 CD86（A, C）和CD40（B, D）的变化；（E,F）ELISA检测分别检测培养基上清中细胞因子TNF-α and IL-12p70的分泌量；
图11为体外纳米载体交叉递呈抗原的能力；OVA/CpG、MSN/OVA/CpG和MSN-TY/OVA/CpG，PBS组为对照组(按照所含OVA的量计算终浓度为50μg/mL)与BMDC（Day6）37℃孵育4 h，无血清的培养基洗两次，而后与分选OT-I小鼠的CD8+T细胞（CFSE标记），按照下列比例BMDC：CD8+T=1：10铺于96孔板中，置于37℃共孵育72 h；（A）流式检测CD8+T细胞的增殖情况；（B）ELISA检测上清中IFN-γ的分泌量；（C，D）qRT-PCR检测Perforin和Grz B在mRAN水平上的相对表达量；
图12 为OVA/CpG和不同的纳米载体引发的抗原特异的CD8+T细胞免疫反应；（A）免疫小鼠的方案；（B）用抗原肽10 μg/mL OVA257-264体外刺激脾脏细胞6 h，胞内因子染色检测CD8+T细胞胞内IFN-γ的表达量，左侧图为不同处理组的流式代表图，右侧为统计图；（C）脾脏细胞用OVA257-264体外刺激5天，ELISA检测上清中IFN-γ的分泌量；（D，E）qRT-PCR检测perforin和GrzB的相对表达量；
图13为 MSN-TY/OVA/CpG对B16-OVA模型的抗肿瘤效果；（A）纳米载体免疫治疗方案（B）给药期间，小鼠的体重变化曲线；（C）小鼠的肿瘤体积变化曲线；（D）最后一次给药后的第五天，处死小鼠，小鼠的肿瘤照片；
图14、图15、图16为MSN-TY/OVA/CpG抗肿瘤作用；（A）肿瘤部位CD3+CD8+T细胞的浸润情况；（B-E）小鼠dLN和脾脏利用OVA257-264体外重新刺激6h，流式分别检测dLN中IFN-γ+CD8+、perforin+CD8+和GrzB+CD8+以及脾脏中IFN-γ+CD8+的比例；（F，G）dLN和脾脏细胞用OVA257-264体外重新刺激5天，ELISA检测上清中IFN-γ的分泌量；（H，I）qRT-PCR检测perforin和GrzB的相对表达量。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例部分实验材料等实验背景情况简要介绍说明如下。
实验动物：雌性C57BL/6J小鼠（SPF级），6~8周龄，购自北京维通利华实验动物技术公司；OT-I小鼠，由上海交通大学杨选明教授惠赠；
主要试剂：
Ph.D-12TM phage display peptide library kits（噬菌体表面展示肽库），NEB公司产品；EasySepTM Mouse CD11c Positive Selection Kit II（分离、分选CD11c细胞用），Stemcell公司产品；DNA酶I、β-丙内酯、Ovalbumin(OVA)，Sigma-Aldrich公司产品；胶原酶IV，Invitrogen公司产品；Biotinylated anti-M13抗体，生工生物工程有限公司；Streptavidin-PE抗体，eBioscience公司产品；CpG ODN1826，金唯智生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒，北京普利莱基因技术有限公司；MSN（氨基化修饰），上海羧菲生物科技公司；Fomc固相合成中所用氨基酸、Biotin-赖氨酸、Rink 树脂、Wang 树脂等，均购自上海吉尔生化有限公司；
其他例如LB培养基、顶层琼脂（0.5 g酵母粉、0.5g NaCl和1g胰蛋白胨，0.1gMgCl2·6H2O，0.7 g琼脂糖，用双蒸水定容至100 mL）、X-gal/IPTG溶液、含有IPTG/X-gal的LB平板、甘氨酸-盐酸洗脱液（Gly-HCl，0.2M，pH=2.2）、Tris-HCl中和液（pH=9.1）、PBS缓冲液、PEG/NaCl溶液（20 g 分子量8000聚乙二醇，14.61 g NaCl，双蒸水定容至100 mL）、EasySepTM Buffer（含1 mM EDTA和2% FBS（v/v）的PBS，pH 7.2）等按现有技术常规制作即可；
主要仪器：
FACS Calibur 流式细胞仪 ，BD公司；多肽合成仪，海南建邦制药公司；RP-HPLC纯化系统，日本岛津公司；透射电镜（Tecnai G2 F20-S-TWIN），FEI公司；扫描电镜（Sigma500），Carl Zeiss公司；红外光谱仪（FT/IR），ThermoScientific公司。
实施例1
本申请所提供的靶向树突状细胞的亲和肽TY肽通过噬菌体展示肽库技术筛选获得，筛选过程包括分选小鼠脾脏DC细胞、细胞水平淘选、噬菌体的扩增、亲和DC噬菌体单克隆DNA序列测定等步骤，本实施例就具体筛选过程简要介绍如下。
（一）分选小鼠脾脏DC细胞
选择6~8周C57BL/6J小鼠，处死消毒（75%的酒精中浸泡5 min左右）后，按现有技术制备DC细胞，或者具体参考如下操作：
（1）解剖小鼠后，取出脾并将其剪碎，加入胶原酶Ⅰ和DNA Ⅳ酶消化脾脏细胞，37℃摇床震荡消化30 min；
（2）用载玻片研磨脾细胞，并用70目滤网过滤，制成单细胞悬液，加入10 mL PBS7.2， 4℃、2000 rpm离心5 min，弃上清；加入红细胞裂解液5 mL，用移液枪轻轻地吹打均匀，室温裂解8 min，无菌PBS 7.2洗两次；再加入适量的EasySepTM Buffer重悬细胞，调密度为1×108个/mL，将细胞转移到专用的分选管中；
（3）按1 mL的细胞悬液50µL大鼠血清量，室温封闭3 min；取抗体component A和component B各25 µL置于低吸附1.5mL EP管中，混匀后，使两者室温孵育5 min，然后把两者的混合物（50 µL/mL），加入上述封闭好的细胞悬液中，用枪吹打混匀，室温下孵育5 min；
（4）把试剂盒（EasySepTM Mouse CD11c Positive Selection Kit II）中的链霉亲和素磁珠在涡旋仪上剧烈震荡混匀30 s，保证珠子分散均匀；取混匀磁珠按照40 µL/mL量加入到细胞悬液中，吹打均匀后室温条件下孵育3 min；向细胞悬液中加入适量的EasySepTM Buffer，至终体积为2.5 mL，轻轻吹打混匀；
（5）将分选管放置于试剂盒专用的磁铁中，室温静置使其吸附2.5 min；拿起磁铁，将分选管内的液体连续不间断地悬空倾倒入新的离心管中，管壁上吸附的细胞即为通过阳选分选得到的DC细胞，进一步加入PBS 7.2重悬后，计数，备用。
（二）细胞水平淘选流程
参考噬菌体表面展示肽库说明书，进行细胞水平淘选，具体操作过程可参考如下。
取上述分选的DC细胞加入β-丙内酯灭活的M13空噬菌体（没有插入随机12肽的空噬菌体）封闭，而后加入噬菌体原肽库，4℃温和震荡孵育1h。加入PBST（PBS= 5.0)，洗5次，再用PBST（PBS =7.4）洗5次。加入适量的无菌水中，室温裂解细胞，期间不断吹打。采用甘氨酸洗脱缓冲液（pH 2.2）洗脱，离心后将上清转移至新的EP管中，加入中和液中和，将洗脱后的噬菌体利用E.coli ER2738进行扩增和纯化，得到下一轮的肽库。筛选过程中，重复上述操作以开始下一轮的亲和筛选。
本实施例实施过程中，共进行了四轮筛选，得到了特异性亲和DC的噬菌体单克隆。并分别测定洗脱和扩增后的噬菌体滴度，根据公式计算每一轮的回收率情况，回收率=洗脱噬菌体总数/投入噬菌体总数×100%，以回收率情况来评估噬菌体是否得到富集。
经过上述四轮的结合-洗脱-扩增一系列筛选后，统计每一轮的噬菌体回收率情况如下表所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
从上表的回收率结果看出：经过四轮淘选，亲和DC的噬菌体得到的富集，回收率逐渐增加，可以进行噬菌体插入DNA序列的测序，以进一步筛选出结合效果较好的单克隆。
基于第四轮平板上的孤立的蓝色噬菌斑筛选结果（共44个），进一步培养后进行测序分析获得噬菌体中插入的DNA序列，并进而获得特异性亲和DC细胞的多肽序列。
经过测序分析后，共得到8条与DC亲和较好的肽序列（DK、TY、SL、QM、SP、NK、ER、EL），其中TY肽是本申请所请求保护多肽（其他多肽序列因与本申请请求保护多肽序列不同，不再单独说明）。
测序结果表明：TY肽为12肽（包含12个氨基酸），具体氨基酸序列为：Thr-lle-Thr-His-Phe-Gln-Phe-Gly-Pro-Thr-Val-Tyr，即T-I-T-H-F-Q-F-G-P-T-V-Y（TITHFQFGPTVY）。
进一步地，通过噬菌体亲和实验对插入TY肽的TY噬菌体单克隆与DC的亲和力进行了初步鉴定，具体实验过程为：
首先，对筛选的目的噬菌体单克隆进行扩增；其次，用无菌的PBS 7.2调整鼠脾脏细胞的单细胞悬液的细胞密度为1×107个/mL，并分装每管100 µL（1×106个/管）；最后，每管分别加入对应的扩增后的噬菌体（109 pfu），并设置没有插入序列的噬菌体做对照（blank phage），4℃孵育30 min，PBS 7.2洗两次，洗去非特异性结合的噬菌体，加入biotinylated-anti-M13抗体，4℃孵育30 min，PBS 7.2洗两次；加入streptavidin-PE和anti-mCD11c-APC，4℃孵育30 min；PBS 7.2洗两次；流式检测判定结合力情况。
流式检测结果如图1所示。需要说明的是，CD11c+anti-M13-PE+比例高于对照组的为阳性克隆，与小鼠脾脏DC有较高的亲和性。而从图1中可以看出，TY噬菌体单克隆表现出显著的亲和性，高出对照组10.3%，同时DK也表现出一定的亲和性。
需要说明的是，本申请中筛选时采用的是全细胞筛选的方法，筛选与小鼠脾脏DC亲和的多肽，其来源的DC均为不成熟的DC，不成熟DC的抗原摄取能力比较强。筛选过程中，前两轮我们采用分选的小鼠脾脏中的DC与噬菌体孵育，后两轮采用整个脾脏细胞与上一轮扩增的噬菌体孵育。原因是经过两轮的筛选，与DC亲和的噬菌体得到了一定程度的富集，考虑到在整个脾脏细胞中，还含有其他的细胞，让噬菌体竞争性的与DC结合，会得到特异性更强的能够亲和DC的单克隆，从滴度测定和统计的回收率结果可以看出最终噬菌体得到了富集，并且通过噬菌体亲和DC实验初步得出了数个与DC亲和较好的噬菌体单克隆，尤其是TY噬菌体单克隆与DC具有显著地亲和性。
实施例2
在实施例1筛选获得TY肽基础上，发明人以Fmoc固相合成技术合成制备了DC的亲和肽TY肽。需要说明的是，由于验证合成后TY肽与DC的亲和性时，采用的是以带荧光的链霉亲和素与生物素的结合从而间接反应多肽与DC的亲和情况的方法，因而在合成TY肽后，进一步在TY肽的羧基端通过连接子-GGG-连接有一个biotin。而为便于后续纳米载体的制备，同时制备了乙酰化的TY肽、抗原肽OVA257-264。本实施例就相关制备过程简要介绍如下。
（一）添加第一个氨基酸
称取0.37 g Rink 树脂倒入合成仪中，加入DMF使树脂溶胀30 min左右（如果选用Wang 树脂，不要脱保护）；加入配置好的脱保护液（哌啶：DMF=1:4）脱保护2次，以除去氨基酸N端的保护基团，每次10 min；利用真空泵，把脱保护液抽干，按照以下顺序洗涤，DMF洗3遍，每次2 min，DCM洗3遍，每次2 min，DMF洗3遍，每次2 min；根据公式：用量=m树脂×分子量×当量（当量取4），计算所需要的氨基酸、HCTU、DIEA的用量；称取对应的多肽链羧基端的第一个Fmoc-氨基酸和HCTU，在4 mL的EP管中用2 mL的DMF充分溶解，加入到对应的合成仪中，而后再加入300 μL的DIEA，在调速振荡器上震荡反应2.5 h；洗涤完毕后，测定取代值，抽干合成仪中的液体，取少量树脂，烘干，称取1~1.5 mg树脂，加入3 mL脱保护液，震荡反应10min，然后加入比色皿中，调零后，利用紫外分光光度计测定其在290 nm波长处的OD值，按公式计算：取代值=OD290值/（1.65×m树脂），取代值在0.3~0.7之间反应效果最佳，如果小于0.3则说明氨基酸与树脂反应不好，需要重复添加一次上述氨基酸；因为第一个氨基酸一般不会结合树脂全部的活性位点，为避免副产物过多，每个合成仪中加入3 mL的封头液（乙酸酐：吡啶溶液=1：1），摇床上震荡反应2次，每次20 min；反应结束后，抽干合成仪中的封头液，洗涤。
（二）后续氨基酸的添加
第一个氨基酸添加成功后，脱保护2次，每次10 min，洗涤；洗涤结束后，用细铁丝挑取肉眼可见的树脂于干净的茚检管中，加入茚检试剂后置于沸水浴反应2 min，观察树脂的颜色，若其为蓝色（但是脯氨酸，丝氨酸和脯氨酸一般为红棕色），则说明脱保护反应成功，反之需要再次进行脱保护；茚检成功后，根据公式计算并称量需要添加的第二个氨基酸和HCTU的量，在4 mL的EP管中加入DMF溶解后，无可见的颗粒，加入到合成仪中，再加入一定量的DIEA，震荡反应1 h；洗涤后茚检，同上述操作来检测氨基酸是否与上一个氨基酸的羧基成功缩合，如果茚检后树脂整体呈现为无色透明并无蓝色斑点，说明缩合反应成功，反之则需再次重复添加该氨基酸。
重复上述操作直至氨基酸添加完成。
需要说明的是，制备乙酰化TY肽时，在上述合成步骤基础上，先进行脱保护，然后摇床上震荡反应2次，10 min/次，洗涤，合成仪中加入3 mL的乙酸酐2次，震荡反应，15 min/次，即可实现多肽乙酰化。
（三）多肽链的切割
在整个多肽链的氨基酸都添加成功（或者乙酰化）后，进行切割。切割之前先进性脱保护，摇床上震荡反应2次，10 min/次；洗涤，最后再用DCM洗3遍，每次2 min；抽干合成仪中的液体，茚检以检测最后一个氨基酸N端的保护基团是否完全脱掉；向每个合成仪中加入预先配好的切割试剂约5 mL，振荡器上振动反应至少3 h；反应结束后，在通风厨中，用真空泵把反应后的液体抽滤到圆底烧瓶中，加入适量的DCM洗涤树脂直到抽滤出来的液体呈现出无色为止，此步的洗涤液也加入到圆底烧瓶中。
设置旋转蒸发仪的温度为65℃，把上述圆底烧瓶置于旋转蒸发仪上蒸发30 min，以去除低沸点的有机试剂（TFA，DCM等），最后，加入1/3圆底烧瓶体积的无水乙醚，旋转蒸发5次，每次约15 min；向圆底烧瓶中加入100 mL冰乙醚，观察到液体变成乳白色，冰上沉淀30min，初步得到粗肽沉淀；弃上清，冰乙醚重悬沉淀，转移到15 mL离心管中，并标记，2000rpm离心2 min弃上清，再重悬沉淀，加入新的冰乙醚，洗涤5次，以去除难挥发的有机试剂；把收集沉淀的离心管开口置于通风厨中挥发过夜，让乙醚挥发干净，称量，标记，置于-20℃中保存备用。
（四）高效液相色谱提纯及质谱检测
对步骤（三）中切割后粗肽进行高效液相色谱提纯，具体色谱参数为：流动相溶液，A液为含有0.1‰三氟乙酸的超纯水，B液为色谱级乙腈；波长设置为228 nm，流速依次按照每分钟1 mL-3 mL-5 mL的顺序逐渐增大，然后最终为5 mL/min，并设置20%-60%乙腈的洗脱梯度；将收集的样品放于冻干机中冻干，收集到EP管中，标记，用封口膜密封后于-20℃冰箱保存。
质谱鉴定时，取少量色谱提纯后精肽（肉眼可见即可），放到1.5 mL EP管中，利用在线的软件计算多肽的分子量，采用质谱分析仪分析测定多肽的分子量，比较仪器测定的分子量与理论预测的分子量是否一致，以鉴定该多肽是否合成成功。
按照上述操作，最终成功合成了biotin标记的DC的亲和肽、抗原肽OVA257-264（需要说明的是，OVA257-264片段是OVA全蛋白中在体内被加工酶解以后可以激活CD8+T细胞的片段序列，体外刺激实验时需要以此片段进行实验，但在小鼠荷瘤后在体内作用时则需采用OVA全蛋白）和乙酰化的TY肽，并利用RP-HPLC纯化系统成功制备了上述多肽，并对收集的对应峰产物进行了质谱分析鉴定，结果如图2、图3、图4所示，质谱图质谱分析结果与多肽的理论分子量相符，说明了多肽的成功合成。
biotin标记的DC的亲和肽TY-biotin、抗原肽OVA257-264和乙酰化的TY肽（TY-Ac）的分子量及质谱检测结果如下表所示：
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需要说明的是，由于本申请中采用的NEB噬菌体展示肽库技术中的M13噬菌体的12肽插入序列的顺序为XXX12-GGGS-pIII protein，即12肽序列C端与Gly相连形成了酰胺键，因此，合成过程中选用了Rink树脂，其合成的多肽链在C端可以形成酰胺键。基于上述基础，合成生物素标记的多肽也是在C端修饰，即增加一端序列GGGKbiotin，而后续乙酰化时，所制备的则是N端乙酰化的TY肽，用于后续纳米载体的合成。
实施例3
筛选所得TY肽在实际使用过程中，受限于生物体吸收及生物降解等原因，因此本申请以纳米材料MSN（介孔二氧化硅纳米粒）作为载体制备了新型的可以靶向DC的纳米疫苗运输系统MSN-TY/OVA/CpG。制备时，首先通过缩合反应将乙酰化的TY肽共价偶联到MSN表面，合成MSN-TY，再通过静电吸附作用负载模式抗原OVA和免疫佐剂CpG （CpG-ODN1826）。
制备MSN-TY（MSN-NH2与COOH-peptide-Ac的连接）的具体过程为：
取适量乙酰化的TY肽溶于2 mL的DMF中，然后加入10倍当量的HoBt混合孵育，再加入10倍当量的DIC，与上述反应物混合均匀后室温孵育10 min，活化TY肽上的羧基；
按MSN-NH2：peptide（质量比）=1:1的量取适量MSN于干净的10 mL的圆底烧瓶中，用超声波清洗仪把MSN-NH2重新分散于2 mL的DMF中，然后把活化好的TY肽加入到上述超声分散好的MSN中，室温下磁力搅拌反应24 h；反应产物用水洗涤3次，以除去未结合的多肽，然后分散于PBS缓冲液中（pH=7.2），上述反应均避光进行。
需要说明的是，制备过程中，为确定OVA、CpG在MSN上的负载情况，分别设置了不同负载比例实验，具体而言：
将OVA溶于PBS 7.2中配置成1 mg/mL的溶液后，按照不同质量比例于圆底烧瓶中加入制备好的MSN-TY纳米粒（MSN：OVA依次为1.25:1、2.5:1、5:1），最后把体积都补加到2mL，4℃置于磁力搅拌器上搅拌过夜；4℃、10000 rpm离心30 min，目的是除去未反应负载的OVA，收集上清，用BCA方法测定上清中的蛋白含量，计算蛋白的包封率；
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；
另一方面，将不同质量比的MSN与CpG（MSN:CpG依次为2、5、10和20），4℃搅拌24h，离心除去未负载的CpG，取上清用Nanodrop 2000测定CpG的负载率，并采用琼脂糖凝胶电泳分析CpG的负载情况。
对所制备 MSN-TY/OVA/CpG进行表征时，采用热重分析（Thermal GravimetricAnalysis，TGA）测定MSN与TY肽的接枝率（分析时，采用N2保护，加热速率为10℃ min-1）；采用红外光谱仪（FT/IR-4000）表征样品表面的有机基团（溴化钾压片，4000~400 cm-1范围内扫描）；采用透射电镜（TEM, JEOL JEM-1200EX，日本）观察纳米粒的形貌；采用粒径电位分析仪（Malvern Zetsizer Nano-ZS90），观察不同的纳米粒子的径分布和Zeta电位。
需要说明的是，在具体制备MSN-TY/OVA/CpG纳米材料前，发明人首先对亲和肽与DC的亲和性进行了实验分析，具体实验过程简要介绍如下。
（一）诱导BMDC（骨髓来源树突状细胞）
选取6~8周SPF级的C57BL/6J雌性小鼠，处死后消毒（置于75%的酒精中浸泡5 min左右）；解剖小鼠，取其后腿骨，用75%的酒精消毒灭菌，无菌的PBS 7.2冲洗2次；用剪刀在骨头关节处剪断，使其两端相通，取适量的培养基（不含血清）倒入无菌培养皿中，一手用镊子夹住骨头，另一只手用1 mL注射器吸取培养基，使注射器针头插入骨头中间，匀速推动注射器，在流出液体一侧会观察到红色的骨髓，重复上述冲洗过程，直到骨头整体变成白色为止；筛网过滤，收集上述细胞悬液，4℃、2000 rpm离心5 min，裂红，然后用无菌的PBS 7.2洗2次；用5 mL的RPMI 1640培养基（含10%FBS和双抗），重悬细胞，混匀平均分到2个无菌培养皿中，补加培养基至20 mL，加入重组小鼠GM-CSF（20 ng/mL）和IL-4（10 ng/mL）细胞因子，置于细胞培养箱中培养，诱导当天记为第0天；第3天开始半量换液，即用移液管小心抽取一半的培养基，离心后，把细胞重悬后加入对应的皿中，并加入两种细胞因子（若细胞密度太大，应考虑分皿），每天换液一次，第6天即可获得不成熟的BMDC，用于后续实验。
（二）检测亲和肽与DC的亲和性
获取诱导第6天的不成熟的BMDC，调整细胞密度为5×106个/mL，平均分到1.5 mLEP管中，每管100 μL，PBS 7.2洗1次，离心，弃上清；用精密天平称量biotin标记的亲和肽和对照肽，用PBS 7.2稀释到100 μM，然后取100 μL稀释好的多肽加入上述离心管中，4℃与细胞孵育30 min；PBS 7.2洗涤2次，4℃、3000 rpm离心5 min；加入50 μL含有5%大鼠血清的PBS 7.2，放置于4℃封闭10 min，然后加入anti-mCD11c-APC和streptavidin-PE，4℃孵育30 min；直接加入1 mL的PBS 7.2到洗涤1次，200 μL PBS 7.2重悬后流式检测其亲和情况。
虽然DC存在于体内多种组织中，但是其含量较低，种类也比较多，无法满足实验研究的需要。对于人常采用从外周血单核细胞（PMDC）体外诱导产生。对于小鼠而言，最常用的是利用小鼠的骨髓细胞诱导产生，即骨髓来源的DC（BMDC）。为了进一步验证筛选得到的肽与DC的亲和性，利用生物素标记的多肽结合到DC表面，再通过链霉素（streptavidin）与生物素的结合，通过流式间接分析多肽是否亲和到DC上。
图5显示了只有TY肽能够亲和DC，其余的肽都不亲和DC（对照肽GA肽、DK肽）（受限于版面，不加肽的空白对照组结果未示出）。同时对于脾脏来源DC、整个脾脏细胞亲和实验也显示了与此类似结果。基于这一结果，为采用TY肽做为纳米载体的靶向肽奠定了良好基础。
下面就所制备MSN-TY、MSN-TY/OVA/CpG材料的表征情况简要介绍说明如下。
采用红外光谱法表征MSN-TY的结构特征结果如图6（图6A）所示。分析可以看出，MSN与MSN-TY在1630 cm-1处都出现了相同的吸收峰，归属于MSN的介孔中的H2O，TY肽在1630cm-1处也出现了相同的峰，归属于多肽冻干后残存的少量H2O。MSN-TY的红外光谱图与MSN相比，在1580 cm-1和1280 cm-1出现的新的吸收峰，都归属于酰胺键的的吸收峰，分别归属于酰胺键Ⅰ带和酰胺Ⅱ带，表明TY肽成功偶联到MSN的表面。同时，采用热重分析计算MSN-TY的接枝率（图6B）。从图中可以看出加热到100℃前的重量损失来自于MSN空隙中残留的水分，MSN和MSN-TY重量损失分别为3.78%和2.43%，当加热到800℃时，两种材料的总重量损失分别为14.79%和24.43%，从100℃到800℃损失的重量来自于有机功能基团的分解。接枝率可以通过公式(H1-L1)/(100-H1)=(H2-W-L1)/(100-H2)。最终计算得到接枝率结果为12.24%。
制备MSN-TY/OVA/CpG材料过程中，以OVA做为模式抗原，CpG为免疫佐剂，两者通过静电吸附作用负载到MSN或MSN-TY的介孔孔道中。反应结束后，通过离心除去上清中未负载的OVA，BCA蛋白定量试剂盒来分析蛋白的负载情况。
从图7可以看出，随着MSN-TY投入量的增加，其OVA的负载量也逐渐增大，但当MSN：OVA（w/w）为5时为97.6%，而后在随着MSN量的增加，其负载率基本不变。利用同样的方法，离心后把上清用琼脂糖凝胶电泳分析CpG负载情况（图7B）。从结果可以看出，当MSN:CpG（w/w）为20时，基本上就看不到CpG的条带，说明CpG成功吸附到MSN-TY上。
对相关材料的透射电镜（TEM）图（图8A）分析可以看出MSN、MSN-TY、MSN-TY/OVA/CpG的颗粒形状均近似球形，形态规则，分散性好，粒径大小合适，平均粒径120 nm左右。而图8B表明MSN纳米粒分散均匀，无沉淀和聚集现象。MSN的扫描电镜图像如图8C所示，图中MSN颗粒形态规则，大小均一。利用马尔文纳米粒度电位分析仪，测定了不同纳米载体的电位（图8D）。图8E为采用粒径电位分析仪（Nano-S90）测定不同的纳米载体的粒径分布情况。MSN与MSN-TY的平均粒径分别为156.8 nm和155.02 nm比TEM的粒径稍微大些。这由于前者提供的是纳米粒的水溶液状态下的粒径，TEM照片显示的是烘干后的纳米粒的粒径，两种方法测定的结果基本一致，这说明纳米颗粒成功制备，在水中并未出现明显的变形现象。
实施例4
在实施例3基础上，发明人对纳米载体MSN-TY/OVA/CpG的体外活性情况进行了初步分析，相关实验简要介绍如下。
（一）MSN-TY/OVA/CpG的细胞毒性实验
收集诱导第6天的BMDC，含10% FBS的RPMI-1640完全培养基调整细胞悬液密度至5×105 cells/mL，以每孔50000个细胞接种于96孔板，每孔体积100 μL，37℃、5% CO2培养箱中培养2 h；
实验分组（每组5个复孔），具体有：调零孔：无细胞只有PBS组；对照组：PBS+细胞；实验组：OVA组、MSN/OVA/CpG组、MSN-TY/OVA/CpG组，每孔加入用100 μL无血清培养基稀释的药物，按照OVA的浓度来计算，依次为：12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL，置于培养箱中培养48 h。
在结束前4 h，每孔加入20 μL的MTT溶液，继续孵育4 h，终止培养，弃去旧的培养液，每孔加入150 μL的DMSO，室温震荡10 min，使结晶物充分溶解；在490 nm波长处测定各孔吸光度值，记录结果。以吸光度值为纵坐标，药物的不同浓度为横坐标，绘制细胞生长曲线。
纳米载体的体内外毒性，是制约载体在生物领域运用的重要因素。因此，我们采用MTT检测方法对所构建的载体对的细胞毒性作用进行了分析。以BMDC的模型细胞，当不同的纳米载体与BMDC细胞共孵育48 h后，载体中的OVA含量从12.5 µg/mL~100 µg/mL变化时，随着载体浓度的增加，与没有加入载体的对照组相比，OD值无明显的变化（9A所示），结果表明MSN-TY/OVA/CpG纳米载体对细胞的生长无明显影响，没有毒性作用，可以用于后续的体内外实验。
（二）MSN-TY/OVA/CpG的细胞摄取分析
流式检测时，具体参考如下实验方法：首先参考Sigma的FITC-NHS说明书，利用FITC（异硫氰酸荧光素）标记OVA蛋白后，然后参考如下操作进行实验：
取C57BL/6J小鼠的脾脏细胞，研磨、裂红后，制成单细胞悬液，铺于96孔板（U型底），调整细胞密度1×107 cells/mL，每孔200 uL；分别与OVAFITC/CPG、MSN/OVAFITC/CPG和MSN-TY/OVAFITC/CpG(含有OVAFITC均为20 ug/ml)，在37℃、5%的CO2培养箱中，共孵育4 h；PBS7.2洗两次，4℃、3000 rpm离心5 min；然后加入anti-mCD11c-APC，4℃孵育30 min后PBS7.2洗一次；用200 μL固定剂（用固定剂稀释液稀释至1×）重悬细胞，室温固定30 min；而后200 μL用破膜剂（用无菌水稀释至1×）洗涤2次，4℃、3000 rpm离心5 min；PBS 7.2重悬细胞，洗涤一次，流式上机检测。
采用激光共聚焦检测MSN-TY/OVA/CpG的细胞摄取时，则参考如下实验方法：
收集诱导第6天不成熟的BMDC，用无血清培养基调整细胞密度为1×106个/mL，每孔2 mL接种于6孔板中；加入OVAFITC/CpG、MSN/OVAFITC/CpG、MSN-TY/OVAFITC/CpG置于37℃、5%CO2培养箱中共孵育4 h（各组OVAFITC终浓度均为20 μg/mL）；收细胞，转移到1.5 mL EP管中，用PBS 7.2洗两次，4℃、4000 rpm离心5 min；用无血清培养基稀释Lysotracker Red DND-99，使其工作液终浓度为50 nM，置于37℃水浴锅预热，每管加入1 mL的上述工作液，置于37℃、5% CO2培养箱与细胞共孵育1 h；PBS 7.2洗两次；加入终浓度为2 μg/mL的Hoechst33342（37℃预热），置于培养箱中细胞共孵育40 min，PBS洗两次；4%多聚甲醛室温固定15min，PBS洗两次，最后10 μL重悬并加入适量的防荧光猝灭剂，滴加到载玻片上，盖上盖玻片，封片，置于共聚焦显微镜下观察。
由于有效的抗原运输、以及抗原能否被DC摄取是肿瘤疫苗治疗激活体内免疫反应重要的一步。借助于将FITC共价偶联到OVA上，通过构建荧光纳米载体，利用流式检测方法对脾脏DC对不同纳米载体OVAFITC/CpG、MSN/OVAFITC/CpG和MSN-TY/OVAFITC/CpG的摄取能力进行了检测分析，结果如图9B、图9C所示。分析可以看出，MSN-TY/OVAFITC/CpG处理组的荧光强度最强，并且显著高于其余实验组，而MSN/OVAFITC/CpG处理组高于游离的OVAFITC/CpG组，这一结果说明，与游离的OVAFITC/CpG相比，无靶向的MSN/OVAFITC/CpG纳米载体也展示出一定的优势，即，纳米粒子介导的运输使得DC摄取OVAFITC能力增强，在此基础上，MSN-TY/OVAFITC/CpG组中TY肽起到了靶向作用，防止被巨噬细胞摄取，能够有效地提高DC对纳米载体的摄取。
对游离的OVAFITC和不同的纳米载体与不成熟的BMDC孵育后的共聚焦显微镜观察情况如图9D所示。彩色图像下，蓝色为细胞核，红色为溶酶体，绿色为纳米载体，可以看出，OVAFITC/CpG处理组仅可以观察到很弱的绿色荧光，而纳米载体组可以观察到较强的绿色荧光，其中MSN-TY/OVAFITC/CpG组荧光最强，说明该纳米载体可以被BMDC高效地摄取，并且可以观察到OVAFITC在溶酶体周围出现了共定位（绿色荧光和红色荧光的叠加出现了黄色荧光），说明纳米载体被BMDC摄取后进入了溶酶体。
综合结果可以认定：MSN-TY/OVA/CpG纳米载体可以高效地运输抗原，被DC识别并摄取加工，这对激活机体的抗原特异的免疫反应是尤为关键的。
（三）MSN-TY/OVA/CpG对DC成熟的影响
首先，对BMDC表面的marker的变化情况进行流式检测，具体操作参考如下：
取诱导第6天的BMDC，铺于6孔板中，每孔2×106个cell，加入不同的纳米载体，OVA/CpG、MSN/OVA/CpG、MSN-TY/OVA/CpG，用PBS 7.2调整载体所负载的OVA的浓度为1 mg/mL，每孔加入对应的载体均含100 μg OVA和30 μg CpG，同时设置不加载体加入对应量的PBS 7.2的空白对照，在37℃、5% CO2培养箱中，培养24 h；收上清，冻存于-80℃，采用ELISA检测细胞因子（TNF-α和IL-12p70）的分泌情况；收集上述细胞，向对应标记好离心管中加入抗体anti-mCD40-FITC和anti-mCD86-FITC，分别加入anti-mCD11c-APC，并设立CD40和CD86的同型对照管和单阳管，置于4℃避光孵育30 min；离心，洗涤后，200 µL重悬，流式检测DC表面共刺激分子CD86、CD40的变化情况。
ELISA检测细胞因子（TNF-α和IL-12p70）的分泌情况时，具体操作参考如下：
将10×包被液用无菌水稀释成1×包被液即为工作液，把capture antibody即Anti-mouse TNF-α或Anti-mouse IL-12p70，按照1:1000稀释到所需浓度，用排枪加入96孔板中，100 µL/well，置于密闭的湿盒中，4℃包被过夜；次日，弃去包被液，并在干净的滤纸上扣干，加入300 µL/well的含0.05 %Tween-20的PBST缓冲液，停留1 min后弃去孔空内的液体，扣干，重复3-5遍；每孔加入200 µL 1×Assay Diluen缓冲液，室温封闭1 h；用PBST（含0.05% Tween-20的PBS 7.2缓冲液）洗涤1次；用1×Assay Diluen缓冲液梯度稀释MouseTNF-α或Mouse IL-12p70标品和待检测培养基上清样品，100 µL/well，盖上封板膜室温孵育2 h；洗涤3~5遍；用1×Assay Diluen稀释检测抗体（Anti-mouse TNF-α-biotin或Anti-mouse IL12p70-biotin，1:1000稀释），100 µL/well，室温孵育1 h；洗涤3~5遍；用1×AssayDiluen把 Avidin-HRP按照1:500的比例稀释到工作液浓度，100 µL/well，室温条件下孵育30 min，注意避光；洗涤5-7遍；加入HRP的底物1×TMB显色液，100 µL/well，37℃避光孵育15 min，（一般显色在10-20 min可达到很好的效果）；用排枪迅速向每个孔中加入50 µL的1mM H3PO4溶液，终止显色反应；检测：15 min内利用酶标仪在450 nm处读取吸光度值（OD值），根据TNF-α和IL-12p70标准品的读数，制作标准曲线，计算出检测样品中TNF-α和IL-12p70的浓度。
DC是专职的抗原递呈细胞可以激活固有免疫和适应性免疫应答。肿瘤抗原被不成熟的DC识别和捕获是介导T细胞免疫应答的第一步。成熟的DC会上调共刺激分子（CD40和CD86），这对于激活T细胞介导的免疫反应是很重要的指标。
对MSN-TY/OVA/CpG是否可以激活DC，促进DC成熟并上调共刺激分子的实验结果如图10所示。分析可以看出，经过MSN-TY/OVA/CpG处理组的CD86的表达明显提高（图10A和图10C），CD80的上调可以促进初次和二次T细胞的免疫应答，CD40是连接固有免疫和适应性免疫重要的共刺激分子。与PBS组相比，MSN-TY/OVA/CpG处理组CD40的表达量提高了58.7%，OVA/CpG处理组提高了13.8%，MSN/OVA/CpG处理组提高了50.4%（图10B和图10D）。成熟的DC会分泌的各种细胞因子，在抗肿瘤免疫反应中也是极为重要的。
为了进一步验证MSN-TY/OVA/CpG在抗原递呈中的作用，利用ELISA对细胞因子TNF-α（图10E）和IL-12p70（图10F）的分泌量检测结果表明，PBS组作为对照组，MSN-TY/OVA/CpG处理组的TNF-α和IL-12p70的分泌量明显高于其余组，其中OVA/CpG和MSN/OVA/CpG处理组的两种细胞因子的分泌量也有一定程度的提高，并且纳米载体组优于游离的OVA组，说明抗原递呈给DC后在一定程度上确实会促进DC成熟并激活DC，偶联上TY靶向肽后会提高纳米运输系统的抗原的运输效率，这将有益于促进T细胞的增殖和后续免疫反应的激活。
（四）MSN-TY/OVA/CpG靶向DC的抗原交叉递呈
具体实验过程为：
（1）对不成熟的BMDC荷载不同的纳米载体
具体而言：在96孔板中（Round Buttom），平铺不成熟的BMDC，2×105 个/well，分别加入含有50 µg/mL OVA和500 nM CpG的OVA/CpG、MSN/OVA/CpG和MSN-TY/OVA/CpG，每组4个孔，同时设置不荷载肽的BMDC组，37℃、5%的CO2培养箱中孵育4 h；孵育结束后，4℃、2000rpm离心5 min，无血清RPMI1640洗涤2次后，细胞计数，调整密度为1×105个/mL备用。
（2）BMDC与CD8+T细胞共培养
参考前述操作，利用CD8+ T分选试剂盒分选OT-I小鼠的CD8+T细胞，然后利用CFSE标记CD8+T细胞，将细胞制成1×106个/mL悬液，备用。将标记好的CD8 +T细胞铺于圆底的96孔板中，每孔100µL；30 min后，把将荷载纳米载体的BMDC或没有处理的BMDC（对照组）加入到96孔板中，每孔100µL，使其与CD8+T细胞共培养72 h，最终BMDC与CD8+T细胞比例为1:10；共培养结束后，收集上清冻存于-80℃，第二天利用ELISA检测IFN-γ的分泌量；一部分细胞流式检测T细胞的增殖；另一部分细胞（5×102-8个）收集到1.5 mL EP管中，加入500 μL的RNA裂解液，用枪反复吹打细胞，直至全部细胞裂解，-80℃保存。利用qRT-PCR检测perforin和Grz B在mRNA水平上的表达量。
流式检测共培养体系中CD8+T细胞的增殖情况时，检测方法为：
共孵育结束后，收集BMDC与CD8+T细胞于1.5mL EP管中，离心，PBS 7.2洗一遍；
加入用PBS 7.2稀释好的抗体anti-mCD3-PerCP-eflour710和anti-mCD8α-APC，重悬细胞后置于冰上孵育30 min；PBS 7.2洗涤2次，200 µL的PBS 7.2重悬后流式检测T细胞的增殖情况。
RNA提取、cDNA反转录、荧光定量PCR（检测时以β-actin为内参基因）按照现有技术常规操作即可，不再赘述。
为了验证DC摄取抗原被激活以后是否进一步会产生有效的抗原交叉递呈作用，并引起T细胞免疫应答，发明人利用经典的体外模型即荷载抗原OVA的DC细胞与分选的OT-I小鼠CD8+T细胞共孵育，来验证TY肽靶向DC后对OVA抗原的交叉递呈能力的影响。
流式对naïve T细胞的增殖情况检测结果如图11A所示，可以看出，与无靶向肽TY的MSN/OVA/CpG组相比，MSN-TY/OVA/CpG处理组，CFSE标记的T细胞的荧光信号强度逐渐减弱，说明T细胞增殖，有效的抗原运输，进一步提高了抗原刺激T细胞的增殖的能力。游离的OVA抗原，也可以被DC直接摄取，在一定程度上刺激T细胞的增殖。而PBS组中DC没有抗原的刺激，DC不能被激活，因而不能刺激T细胞增殖。
为了进一步研究增殖以后的T细胞的功能，我们检测了DC和T细胞共孵育体系中上清IFN-γ的含量（图11B）。MSN-TY/OVA/CpG组IFN-γ的分泌量明显高于其余三组，与CD8+T细胞增殖的结果是一致的。说明MSN--TY/OVA/CpG不仅可以引起T细胞的增殖还可以激活T细胞的功能，提高IFN-γ的分泌量。
同时，我们利用荧光定量PCR技术检测T细胞表面杀伤性分子perforin和Grz B的表达情况。结果显示，无靶向肽修饰的MSN/OVA/CpG组与OVA/CpG组相比两者的表达量没有显著差异但均高于对照组，而MSN-TY/OVA/CpG处理组，两者的表达量均明显上调（图11C和图11D所示）。
不成熟的DC捕获OVA抗原以后，抗原被加工降解成小的肽段，DC也会被激活，其表面的maker会上调并分泌细胞因子，进一步递呈给T细胞，进而产生抗原特异的T细胞介导或者抗体介导免疫反应。综合上述结果，可以看出：纳米载体可以高效的介导抗原运输，靶向肽TY修饰的纳米载体进一步提高了其吞噬效率。而MSN-TY/OVA/CpG能够激活DC，促进DC的成熟，进一步增强抗原交叉递呈作用，刺激T细胞增殖，激活T细胞的功能，并能促进细胞因子TNF-α和IL-12p70的释放，而且能将外源抗原靶向运输到DC，引起有效的抗原加工递呈作用，并且有效地刺激T细胞增殖和IFN-γ分泌，并提高了T细胞杀伤性分子perforin和Grz B在mRNA水平上的相对表达量。
实施例5
在实施例4实验基础上，发明人进一步对MSN-TY/OVA/CpG体内免疫活性进行了实验分析。相关实验简要介绍如下。
（1）免疫动物模型试验
把6~8周的雌性C57BL/6J小鼠随机分成四组（Control组、OVA/CpG组、MSN/OVA/CpG组、MSN-TY/OVA/CpG组），5只/组；尾基根部皮下多点注射OVA/CpG和不同的纳米载体，每组注射剂量均按照载体所负载的OVA和CpG ODN1826计算，每只小鼠100 μg OVA和30 μg CpGODN 1826，同时设置对照组注射同样剂量的PBS 7.2溶解的CpG ODN 1826；每隔7天免疫一次，共给药三次；在最后一次免疫小鼠后的第五天，处死小鼠（总体流程如图12A所示）。取其脾脏，参考前述操作制成单细胞悬液。
将部分细胞调密度为2×106个/mL后，每孔1 mL，接种于24孔板中，期间要不断地上下晃动离心管，防止细胞沉淀，最后加入为抗原肽OVA257-274（终浓度10 μg/mL），每孔加入1 μL的Protein Transport Inhabitor（1:1000稀释），混合均匀，在37℃、5%的CO2培养箱中培养6 h，胞内因子染色检测CD8α+ T细胞IFN-γ的表达量；
将部分细胞调密度为5×106个/mL后，用移液枪取5 mL细胞接种于6孔板中，实验组与对照组都加入为抗原肽OVA257-274（终浓度10 μg/mL），置于37℃、5%的CO2培养箱中培养5天；收集上清置于-80℃保存，ELISA分析IFN-γ的分泌量。诱导的细胞加入RNA裂解液吹打混匀后，-80℃保存，提总RNA，反转录后利用qRT-PCR检测perforin和Grz B的相对表达情况。
实验结果表明，与其他组相比，MSN-TY/OVA/CpG处理组表现出更强的免疫反应，IFN-γ+ CD8+细胞的比例为1.89%，但是MSN/OVA/CpG组IFN-γ+ CD8+细胞的比例却没有OVA/CpG组高（图12B）。而ELISA检测结果与胞内因子染色的结果是一致的（图12C），可以看出，MSN-TY/OVA/CpG治疗组IFN-γ分泌量明显高于其余治疗组。同时qRT-PCR检测CTL杀伤性表面分子peforin和GrzB在mRAN水平上的相对表达，两者的表达量也较control组明显成倍数增加。这些结果都说明MSN-TY/OVA/CpG可以增强抗原特异的CTL反应。
（2）MSN-TY/OVA/CpG在B16-OVA荷瘤模型上抗肿瘤试验
进行相关荷瘤试验时，首先建立B16-OVA黑色素移植瘤模型，具体而言：
收集对数期B16-OVA细胞，0.25%的胰酶消化后吹匀，RPMI-1640培养基调整细胞的密度为1×106个/mL，放置于冰上；选取6~8周的C57BL/6J雌性小鼠，用注射器抽取B16-OVA单细胞悬液，右侧靠下背部皮下注射，每只200 μL，即2×105个/只荷瘤当天记为第0天；
荷瘤第3天，将小鼠随机分成4组（Control组、OVA/CpG组、MSN/OVA/CpG组、MSN-TY/OVA/CpG组），每组5只；尾基根部皮下多点注射OVA/CpG和不同的纳米载体，每组注射剂量均按照载体所负载的OVA和CpG ODN1826计算，每只小鼠100 μg OVA和30 μg CpG ODN 1826，同时设置对照组注射同样剂量的PBS 7.2溶解的CpG ODN 1826，每隔7天免疫一次，共给药三次；从荷瘤后的第七天开始隔天测量小鼠肿瘤的长、宽、高，根据公式：体积=1/2（a×b×c）计算肿瘤体积，并绘制移植瘤的生长曲线（总体流程如图13A所示）。同时测量小鼠的体重，绘制体重变化曲线。
检测肿瘤浸润CD3+CD8+T细胞比率时，参考如下操作：
最后一次给药后的第五天，处死小鼠，然后同组的5个肿瘤组织分别用毛玻璃片研磨破碎（每只小鼠一个离心管，一对玻片），用PBS 7.2冲洗玻片和皿，将单细胞悬液过筛网，得到单细胞悬液；4℃、3000 rpm离心5 min，得细胞沉淀，用1 mL重悬，转移到1.5 mL的EP管中，离心弃上清；用PBS 7.2稀释以下抗体anti-mCD45-FITC、anti-mCD3-eflour710和anti-mCD8α-APC，加入到对应的离心管中，重悬细胞，并设置CD45、CD3和CD8α单阳管上机时调补偿用，4℃孵育30 min；PBS 7.2洗一遍，4℃、3000 rpm离心5 min，200 μL的PBS 7.2重悬，过滤，上机检测。
ex vivo实验检测MSN-TY/OVA/CpG的抗肿瘤效果时，分别取小鼠的引流淋巴结和脾脏，制成单细胞悬液，参考前述操作方法，胞内因子染色分别检测引流淋巴结中分泌IFN-γ、perforin和Grz B的CD8α+T细胞的比例以及脾脏中分泌IFN-γ的CD8α+T细胞的比例；利用ELISA检测脾脏和引流淋巴结的培养基上清中IFN-γ的分泌量；利用qRT-PCR检测perforin和Grz B的mRNA的相对表达量。
从小鼠生长曲线可以看出（图13B所示），给药期间，小鼠体重变化呈逐渐上升趋势，小鼠生长状况良好，说明不同的纳米载体均无毒性，具有良好的生物安全性。而如图13C所示，MSN-TY/OVA/CpG组一直都无明显的肿瘤生长，同时MSN/OVA/CpG和OVA/CpG组也在一定程度上抑制肿瘤的生长，和游离的OVA/CpG组（197.68 mm3）相比，MSN/OVA/CpG组（106.97mm3）表现出较好的抑制肿瘤的效果。由于OVA负载到MSN中延长了抗原在体内的循环时间，可以有效地被抗原递呈细胞（APC）摄取。最后一次给药的第五天，处死小鼠，并拍摄小鼠的肿瘤照片（图13D）。以上结果都说明MSN-TY/OVA/CpG可以有效地抑制肿瘤生长。
对小鼠肿瘤部位CD3+ CD8+T细胞的浸润情况分析表明，如图14A所示，MSN-TY/OVA/CpG处理组CD3+ CD8+T细胞的比例为32%，显著高于其余治疗组，说明MSN-TY/OVA/CpG可以显著地引发抗原特异的CD3+CD8+T细胞向肿瘤浸润。免疫小鼠的一部分引流淋巴结用抗原肽OVA257-264体外刺激6h，流式检测胞内IFN-γ、perforin和GrzB的变化情况。如图14B、图15C、图15D所示，MSN-TY/OVA/CpG处理组组，IFN-γ+CD8+T细胞、perforin+CD8+ T细胞和GrzB+CD8+ T细胞频率明显高于MSN/OVA/CpG和OVA/CpG组，而且MSN-TY/OVA/CpG组也可以刺激脾脏IFN-γ+CD8+ T细胞频率升高（图15E）。荷瘤小鼠的脾脏细胞利抗原肽OVA257-264体外重新刺激5天，MSN-TY/OVA/CpG治疗组明显地促进了脾脏（图16F）和淋巴结（图16G）上清中IFN-γ的分泌量。并且脾脏细胞peforin（图16H）和GrzB（图16I）的相对表达量升高。这与免疫动物模型中的结果是一致的。实验结果表明，MSN-TY/OVA/CpG纳米载体可以有效地在体内靶向运输抗原，并且可以引发脾脏和引流淋巴结部位产生抗原特异的CD8+T细胞免疫反应，增强抗肿瘤效果。
本申请利用MSN负载模式抗原OVA和TLR9的配体CpG，并外表面连接靶向DC的亲和肽TY，制备了MSN-TY/OVA/CpG纳米载体。免疫动物实验和B16-OVA荷瘤小鼠模型实验都证明了MSN-TY/OVA/CpG纳米载体可以将抗原靶向高效率地运输到DC，引发抗原特异性的CTL免疫应答，并且显著地刺激CD8+T细胞IFN-γ的分泌和细胞杀伤性分子perforin和GrzB在mRNA水平上的相对表达量。
在肿瘤治疗模型中，MSN-TY/OVA/CpG纳米载体达到较好的抑制肿瘤生长的效果。提高了dLN中CD8+T细胞胞内IFN-γ、perforin和GrzB的含量，以及脾脏CD8+T细胞IFN-γ在胞内和胞外的释放量，而且相应地也提高了细胞杀伤性分子perforin和GrzB相对表达量。以上结果说明MSN-TY可以作为有效的抗原运输载体，增强了抗肿瘤效果。
序列表
<110> 郑州大学
<120> 一个靶向树突状细胞的亲和肽TY肽及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Thr Ile Thr His Phe Gln Phe Gly Pro Thr Val Tyr
1 5 10

Claims (7)

1.一种靶向树突状细胞的亲和肽TY肽，其特征在于，TY肽为12肽，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示，具体氨基酸序列为：Thr-lle-Thr-His-Phe-Gln-Phe-Gly-Pro-Thr-Val-Tyr，即T-I-T-H-F-Q-F-G-P-T-V-Y，TITHFQFGPTVY。
2.权利要求1所述靶向树突状细胞的亲和肽TY肽在制备抗肿瘤疫苗中的应用。
3.权利要求1所述靶向树突状细胞的亲和肽TY肽的制备方法，其特征在于，采用Fmoc固相合成法制备。
4.利用权利要求1所述靶向树突状细胞的亲和肽TY肽所制备的纳米载体MSN-TY，其特征在于，将TY肽乙酰化后共价偶联到MSN表面，制备时：
首先利用HoBt和DIC活化乙酰化后TY肽上的羧基，然后与氨基化修饰的MSN进行反应制备获得。
5.权利要求4所述纳米载体MSN-TY在制备抗肿瘤疫苗中的应用。
6.利用权利要求1所述靶向树突状细胞的亲和肽TY肽所制备的纳米载体MSN-TY/OVA/CpG，其特征在于，首先将TY肽乙酰化后共价偶联到氨基化修饰的MSN表面获得MSN-TY，再通过静电吸附的方法，分别将模式抗原OVA蛋白和TLR9受体激动剂CpG吸附到MSN-TY表面，从而最终制备获得可以特异性靶向树突状细胞的纳米载体MSN-TY/OVA/CpG。
7.权利要求6所述纳米载体MSN-TY/OVA/CpG在制备抗肿瘤疫苗中的应用。
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