CN108276475B - 一种鸡骨髓源树突状细胞靶向肽ah及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡骨髓源树突状细胞靶向肽AH及其用途。所述的鸡骨髓源树突状细胞靶向肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用噬菌体随机肽库和全细胞差异筛选技术筛选出鸡骨髓源DC优势结合多肽AH，该肽能较强地结合于鸡源DC，显示了良好的靶向性和特异性，因此该靶向肽可作为基因导向载体等药物的先导分子，为细胞特异性小分子治疗奠定基础，或与疫苗联合使用，提高禽类疫苗免疫效率，促进机体提早产生免疫力。

Description

一种鸡骨髓源树突状细胞靶向肽AH及其用途

技术领域

本发明涉及一种鸡骨髓源树突状细胞靶向肽及其用途，属于生物医药技术领域。

背景技术

免疫学和分子生物学的快速发展，推动了新型疫苗的研制，利用免疫细胞和疫苗抗原的相互作用，来优化机体应答，以加快免疫反应的速度、提高获得性免疫的特异性。近年来，靶向性治疗及预防已成为医药生物技术领域研究热点，现已应用于人肿瘤等方向的治疗，其中靶向树突状细胞的生物免疫疗法可将药物有效地输送至靶标部位，减少用药剂量和给药次数，提高药物的治疗效果，降低不良反应。树突状细胞(dendritic cells，DCs)是目前已知的功能最强的专职抗原呈递细胞，能有效激活初始型T细胞，在天然免疫系统和获得性免疫系统中发挥重要作用。研究者利用噬菌体展示线性12肽库技术，筛选得到了一种人外周血DCs靶向肽，将其与抗原融合表达后，获得了极佳的免疫效果。此外，研究人员利用噬菌体环7肽库技术，筛选出了小鼠骨髓源DC靶向肽，其与抗原偶联的壳聚糖纳米颗粒作为疫苗，免疫效率显著提高。

由于变异株或毒力增强株的出现，现有疫苗产品的效力日益受到影响，新产品的研制重点转变为如何改进疫苗效力，如提高保护性免疫应答的强度、提早产生免疫力或延长免疫期等，靶向性疫苗成为新型疫苗研究重点。家禽免疫相关的研究滞后于哺乳动物，影响其新型药物及生物制品的研制与开发，禽靶向性治疗与预防的领域更是鲜有涉及。虽然现有的哺乳动物DC靶向肽可与多个物种来源的DC发生不同程度的结合，但对禽源DC的结合效果较差。禽类疫苗尚未涉及靶向给药，目前尚未见有关禽源DC靶向肽的报道。

本发明根据树突状细胞是关键的抗原提呈细胞这一特点出发，设计筛选出针对于鸡树突状细胞亲和性良好的线性靶向肽，对家禽的新型DC靶向性疫苗的研制与开发具有重要意义。本发明对鸡骨髓DCs分离培养条件进行摸索，并对其形态、表型、功能进行鉴定，欲获得纯度较高的细胞作为筛选的靶细胞，然后利用噬菌体展示12肽库技术，以鸡骨髓源DC为靶细胞，以骨髓细胞作为负选择细胞，预期筛选得到与鸡DCs结合优良的线性12肽，并通过噬菌体ELISA、流式细胞术、免疫荧光等实验验证其结合效果，以期获得能够靶向鸡源DC的短肽，可作为基因导向载体等药物先导分子，为细胞特异性小分子治疗奠定基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种鸡骨髓源树突状细胞靶向肽及其用途。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种鸡骨髓源树突状细胞靶向肽，命名为AH，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

编码所述的鸡骨髓源树突状细胞靶向肽的核苷酸序列、含有所述的核苷酸序列的表达载体以及含有所述的表达载体的宿主细胞也在本发明的保护范围之内。

进一步的，本发明还提出了所述的鸡骨髓源树突状细胞靶向肽在制备鸡骨髓源树突状细胞靶向药物中的用途。

其中，优选的，所述的药物为疫苗。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1、本发明利用噬菌体随机肽库和全细胞差异筛选技术筛选出鸡骨髓源DC优势结合多肽AH(AHPVIGVLHPYT，SEQ ID NO.1所示)，该肽能较强地结合于鸡源DC，显示了良好的靶向性，为研发禽类靶向疫苗提供了物质基础。

2、本发明利用噬菌体随机肽库和全细胞差异筛选技术筛选出鸡骨髓源DC优势结合多肽AH(AHPVIGVLHPYT，SEQ ID NO.1所示)具有免疫原性低、相对分子质量小、在血液和非靶组织中清除快、组织穿透力强、与受体亲和力高并可通过受体介导的内吞作用形成吞噬小体而进入细胞内等特点，且易于合成，能通过结构修饰降低其在生物体内的降解率及其副作用。靶向性短肽可与多种药物输送载体联合使用，达到良好的靶向效果，获得的成效是普通疫苗所达不到的。

3、本发明利用噬菌体展示12肽库技术经差减筛选获得一条鸡骨髓源DC靶向肽AH(AHPVIGVLHPYT，SEQ ID NO.1所示)，该靶向肽可作为基因导向载体等药物先导分子，为细胞特异性小分子治疗奠定基础，或与疫苗联合使用，提高禽类疫苗免疫效率，促进机体提早产生免疫力。

附图说明

图1为鸡骨髓源树突状细胞光学显微镜观察结果；

A为细胞培养第六天光镜观察结果；B为细胞经LPS刺激24h后光镜观察结果；

图2为培养7d后鸡骨髓源DC表面分子标志的表达；

图3为混合淋巴细胞反应；

图4为噬菌体与鸡DC亲和力的ELISA检测结果；

图5为肽与DC亲和力的流式检测结果；

图6为荧光显微镜观察荧光肽与DC结合效果；

图7为激光共聚焦观察荧光肽结合位置；

图8为竞争抑制ELISA结果；

图9为细胞因子IFN-γ和IL-10转录水平检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1鸡骨髓源树突状细胞的分离培养与鉴定

1、鸡骨髓源树突状细胞的分离培养

30日龄左右的小鸡处死后于75％乙醇中浸泡10min，无菌条件下取出鸡股骨和胫骨，用注射器吸取含2％双抗PBS(pH 7.2)，冲洗骨髓至髓腔变白；收集洗液，用含2％双抗PBS洗涤2次，每次1000r/min离心5-10min，弃上清液；收集沉淀并用PBS重悬沉淀细胞，然后按1:1比例将骨髓细胞悬液缓缓加入含有Histopaque-1119的离心管中，2500r/min离心30min；收集中间交接面处的白色雾状细胞，PBS重悬，1500r/min离心10min，弃上清液，收集沉淀，并用1mL含10％FBS和1％双抗的RPMI1640完全培养基重悬细胞，进行细胞计数；将得到的骨髓细胞接种于六孔细胞培养板中，每孔加3mL含有鸡rGM-CSF(50ng/mL)和鸡rIL-4(50ng/mL)的RPMI1640完全培养基，细胞的终浓度为2×10⁶/mL，然后置37℃、5％CO₂的培养箱中培养；第3和第5天，半量换液，去除杂细胞和死细胞，同时补足rGM-CSF和rIL-4。鸡骨髓细胞诱导培养6d后，经终质量浓度为200ng/mL的LPS刺激后获得成熟DCs。

2、鸡骨髓源树突状细胞形态观察

在细胞培养期间，应用光学倒置显微镜对培养的DC进行形态变化观察，结果见图1A所示。培养2h后，细胞开始渐渐贴壁，细胞色泽明亮，体积较小，少量分布由几个细胞组成的细胞小集落；24h后，贴壁细胞稍增加，细胞集落数量仍较少；第3d，贴壁细胞数目增加，细胞集落较多，部分细胞仍然呈悬浮状；第5d，细胞集落增大增多，并且集落出现松散贴壁的现象，细胞表面出现多个毛刺；LPS刺激培养24h后，高倍镜下可见与未经刺激的细胞相比细胞表面出现许多树枝状、刺突状突起，且突起粗大较长，见图1B所示。

3、流式细胞仪检测鸡骨髓源树突状细胞的纯度及表型

将各组收集到的DC分别装入离心管中，1000r/min离心10min，弃上清液，用PBS(0.01mol/L)重悬细胞，调整细胞浓度至5×10⁵/mL。向用于鉴定DC纯度的细胞(未刺激的DC)中加入PE标记的抗人CD11c或FITC标记的抗鸡MHCⅡ抗体，室温避光孵育20min，PBS洗涤2次，1000r/min离心5min，然后用200μL PBS重悬细胞，应用流式细胞仪进行检测。向用于鉴定DC成熟表型的细胞中加入无荧光标记的鼠抗鸡CD40或鼠抗鸡CD86抗体，室温孵育20min，PBS洗涤2次，1000r/min离心5min，然后再加入PE标记的羊抗鼠IgG，室温避光孵育20min，用PBS洗涤2次，1000r/min离心5min，然后用200μL PBS重悬DC，最后应用流式细胞仪进行检测。

流式细胞术检测诱导培养7d后未成熟细胞表面CD11c和MHCII分子标志，结果见图2所示，鸡骨髓源DC表面CD11c分子的表达量为84.1％，MHCII分子的表达量为74.7％。成熟DC与未成熟DC相比，CD40上调了约17％。成熟DC与未成熟DC相比，CD86上调了约11％。

4、同种异体混合淋巴细胞反应

采用同种异体混合淋巴细胞反应鉴定成熟DC是否具有激活淋巴细胞增殖的功能，具体方法如下：30日龄鸡麻醉剂吸入致死，无菌取其脾脏，研磨后过200目筛网获得单细胞悬液，经淋巴细胞分离液分离得到淋巴细胞，作为反应细胞；加入终质量浓度为50μg/mL的丝裂霉素C处理DC，作为刺激细胞，调整淋巴细胞的浓度为2×10⁶/mL，加入96孔培养板，每孔100μL；以刺激细胞和反应细胞比例分别为1:1、1:10、1:100加入经过不同处理的DC(分为LPS刺激组及未经刺激的DC组)，同时设置单独T细胞孔作为阴性对照和无细胞的空白对照，每孔细胞3个重复，终体积为200μL，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养72h；每孔加入20μLCCK-8溶液，孵育2h，酶标仪读取OD450值。DC对同种异体混合淋巴细胞的刺激指数(stimulation index，SI)计算公式为:SI＝(OD_DC-OD_空白对照)/(OD_阴性孔-OD_空白对照)。结果见图3，经LPS刺激成熟的DC刺激同种异体淋巴细胞增殖能力显著高于未经刺激成熟的DC(*p＜0.05，**p＜0.01)，其刺激能力与DC的浓度成正比。

实施例2.噬菌体展示12肽库差减筛选靶向肽及其亲和DC能力的初步检测

1、噬菌体展示12肽库差减筛选靶向肽

筛选过程分为四轮，具体如下：

第一轮：将2×10¹¹pfu的噬菌体展示12肽库(PhD-12)文库加入到实施例1得到的鸡骨髓源树突状细胞(5×10⁵/mL)中，并在4℃下孵育30min，2000rpm离心3min后将细胞沉淀重新悬浮于含有1％牛血清白蛋白(BSA)和0.05％吐温20的PBS中，重复洗涤3次；加入1mL缓冲液(0.2mol/L甘氨酸-盐酸,pH＝2.2,1mg/mL牛血清白蛋白)，室温下轻混10min后加入50μl Tris-HCl(pH值9.1)进行中和；离心，上清即为膜表面结合噬菌体洗脱液，洗脱液分别与E.coli ER2738培养液(A600nm≈0.5)于锥形瓶中剧烈振摇4.5h,采用聚乙二醇NaCl二次沉淀法制备噬菌体扩增液。

第二～四轮筛选:将第一轮扩增液加入到5×10⁵/mL骨髓细胞中(负选择细胞)4℃下孵育30min，2000rpm离心3min后将上清转移至BMDC，重复第一轮步骤；第三轮将孵育时间缩短为20min，第四轮将孵育时间缩短为10min。各轮筛选洗脱液及扩增液均用LB异丙基-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)5-溴-4-氯-3-吲哚-β-硫代半乳糖苷(Xgal)Tet平皿培养测定噬菌体滴度；第4轮生物淘汰后，随机挑选168个噬斑，用试剂盒提取M13噬菌体单链DNA，进行测序。

经过四轮筛选，共筛选出17株展示不同短肽重复性较高的噬菌体，本发明采用ELISA方法初步筛选与鸡源DC亲和力高的短肽，具体步骤如下：17株噬菌体分别与E.coliER2738培养液(A_600nm≈0.5)于锥形瓶中剧烈振摇4.5h,采用聚乙二醇NaCl二次沉淀法制备噬菌体扩增液，经IPTG-Xgal-Tet平板培养测定各噬菌体滴度后备用；细胞的准备：0.03mg/mL多聚赖氨酸加入96孔板，每孔100μL，室温作用30min后，弃液，PBS洗两次，将培养第6天的DC及新分离的骨髓全细胞分别接种于96孔板内(每孔约10⁵个),37℃作用2h后与各噬菌体克隆扩增液(10¹¹pfu)于4℃孵育30min，以野生型M13噬菌体(M13wt)为对照；PBST洗涤3次后，用含0.1％BSA的PBS孵育10min，加入100μL鼠抗M13单克隆抗体(1:1500),室温下孵育1h；PBST洗涤后加入HRP标记的山羊抗鼠IgG(1:5000),每孔100μL，室温作用1h，每孔加入TMB显色液(A液2.5ml，B液2.5ml，C液2μl)100μL，37℃作用15min，每孔加入2mol/L的H₂SO₄终止液50μL，用酶联免疫分析仪测量各孔490nm处吸光度。结果见图4所示，17株噬菌体均能不同程度地结合DC，其中展示AH肽(AHPVIGVLHPYT，SEQ ID NO.1所示)的噬菌体结合效果最佳，推测其展示的外源肽AH与鸡源DC具有较好的亲和性。

2.多肽的合成

选择ELISA方法鉴定亲和力高的短肽AH(AHPVIGVLHPYT)，人外周血DC靶向肽FY(FYPSYHSTPQRP)及亲和力差的肽AM(AMEKYGQQIATQ)，采用Fmoc法合成，并使用FITC标记短肽，经过HPLC纯化及质谱分析，其纯度>95％(武汉星皓医药有限公司完成)。荧光肽粉末溶解于终浓度为30％的DMSO中，-20℃保存备用。

3.AH肽亲和力的鉴定

3.1流式细胞术检测AH肽亲和鸡源DC能力

将25μg FITC标记的AH肽、FY肽和AM肽，分别加入到培养第6天的DC中(细胞量约10⁶)，4℃作用20min，1800r/min离心10min，细胞沉淀用PBS洗2次，用500μL PBS重悬细胞，使用流式细胞仪检测荧光信号，实验重复三次。检测结果见图5所示，在相同条件下，AH短肽荧光信号强度显著高于AM短肽及人源DC靶向肽FY，证明其能够较好地结合鸡源树突状细胞。

3.2荧光显微镜观察FITC标记肽与鸡骨髓源DC结合效果

将爬片铺于24孔板中，加入0.03mg/ml多聚赖氨酸，每孔200μL，室温作用30min，弃液，PBS洗涤2次后将培养至第6天的DC(细胞数约为10⁵)、50μg FITC标记的AH肽和AM肽分别加入到各孔中，室温作用30min，PBS洗涤3次，使用荧光显微镜观察FITC标记肽与鸡骨髓源DC结合效果。结果见图6所示，AH肽与鸡骨髓源DC结合的荧光强度显著高于AM短肽的荧光强度，表明AH肽较好地结合于DC细胞表面或进入细胞内。

3.3激光共聚焦观察荧光肽结合位置

细胞处理方法及荧光肽作用时间等步骤同上(3.2)。PBS漂洗3次后，加入DIL染料(1:1000稀释)，4℃孵育30min，PBS漂洗3次，通过激光共聚焦显微镜观察荧光肽结合DC的位置。结果见图7所示，AH短肽能较好地结合于DC的细胞表面，相同条件下，AM短肽结合细胞的荧光强度较弱，结合效果不佳。

3.4竞争抑制实验

通过竞争抑制ELISA方法验证AH短肽与DC的结合是否呈剂量依赖性，具体方法如下：0.03mg/ml多聚赖氨酸加入96孔板，每孔100μl，室温作用30min后，弃液，PBS洗2次，将培养至第6天的鸡骨髓源DC及新分离的鸡骨髓全细胞分别接种于96孔板内(每孔10⁵)，37℃作用2h；然后分别与不同浓度梯度(0μg，25μg，50μg，75μg，100μg，125μg，150μg，用PBS补至100μl)的AH肽4℃作用30min，PBST洗涤3次，加入AH噬菌体(10¹¹pfu)于4℃孵育30min；PBST洗涤3次后，用含0.1％BSA的PBS孵育10min，加入100μL鼠抗M13单克隆抗体(1:1500),室温孵育1h；PBST洗涤后加入HRP标记的山羊抗鼠IgG(1:5000),每孔100μL，室温作用1h，每孔加入100μL的TMB显色液(A液2.5ml，B液2.5ml，C液2μl)，37℃孵育15min，然后每孔加入50μL终止液2mol/L H₂SO₄，酶联免疫分析仪测量各孔490nm处吸光度。重复3次，并设置细胞阴性对照。结果见图8所示，AH肽抑制噬菌体克隆与DC的结合，随AH肽浓度的增加，噬菌体克隆与DC结合的OD490值逐渐下降。

3.5AH短肽对细胞转录IFN-γ和IL-10水平的影响

DC在外界刺激下，细胞因子的分泌可能会受到影响。因此，采用荧光定量PCR方法检测靶向肽AH与DC作用后其两个关键细胞因子(IFN-γ和IL-10)的转录水平，具体方法如下：将25μg合成的靶向肽AH与约5×10⁶个未成熟的DC在4℃作用30min后，收集细胞，未刺激的细胞用于对照细胞，按RNA提取试剂盒说明书提取RNA，反转录成cDNA。SYBR Green real-time RT-PCR：将2×SYBR Green PCR MasterMix、模板cDNA分别与引物β-1/β-2，IFN-1/IFN-2和IL10-1/IL10-2混合(引物序列见表1所示)，混匀后分装到各个PCR管中，每个样本3个重复。实时PCR扩增程序为:95℃60s，95℃15s，60℃30s,共40个循环。β-actin为内参基因，相对荧光定量(Relative quantity)计算如下:^△△Ct＝(Ct_目的基因-Ct_内参基因)_实验组-(Ct_目的基因-Ct_内参基因)_对照组。检测结果见图9所示，靶向肽AH与DC作用后，细胞因子IFN-γ和IL-10转录水平变化差异不显著，表明DC的功能未受到影响。

表1引物序列

综上，本发明利用噬菌体展示12肽库技术进行了四轮差减筛选，并通过ELISA、流式细胞术、荧光显微镜观察及激光共聚焦显微镜观察等方法验证，获得了一条对鸡骨髓源DC具有较强的亲和力的靶向肽AH(AHPVIGVLHPYT)。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种鸡骨髓源树突状细胞靶向肽AH及其用途

<130> KLPI171051

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> AH

<400> 1

Ala His Pro Val Ile Gly Val Leu His Pro Tyr Thr

1 5 10

Claims (6)

1.一种鸡骨髓源树突状细胞靶向肽，命名为AH，其特征在于，所述的鸡骨髓源树突状细胞靶向肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的鸡骨髓源树突状细胞靶向肽的多核苷酸。

3.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求3所述的表达载体。

5.权利要求1所述的鸡骨髓源树突状细胞靶向肽在制备鸡骨髓源树突状细胞靶向药物中的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的药物为疫苗。