CN109081870B

CN109081870B - 一种抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体及核酸分子和应用

Info

Publication number: CN109081870B
Application number: CN201811105653.0A
Authority: CN
Inventors: 陈波; 罗紫豪
Original assignee: Chengdu Apak Biotechnology Co ltd
Current assignee: Chengdu Apak Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-09-21
Filing date: 2018-09-21
Publication date: 2021-12-03
Anticipated expiration: 2038-09-21
Also published as: CN109081870A

Abstract

本发明公开了一种抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体及核酸分子和应用，涉及纳米抗体技术领域。本发明公开的抗人促绒毛膜促性腺激素的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该纳米抗体具有与人促绒毛膜促性腺激素β亚单位特异性结合的活性，可以用于检测人促绒毛膜促性腺激素β亚单位，可替代传统单克隆抗体与多克隆抗体；此外该纳米抗体还具有分子量小、亲和力高、结构和性能稳定等特点，可耐受高温，高盐等苛刻条件，提高了抗体的货架期。

Description

一种抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体及核酸分子和应用

技术领域

本发明涉及纳米抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体及核酸分子和应用。

背景技术

人绒毛膜促性腺激素(HCG)是由胎盘绒毛膜的合体滋养层产生的一种糖蛋白，由α和β二个单位通过离子键和疏水键结合在一起。α亚单位是垂体前叶激素所共有,它与FSH、LH、TSH的α亚单位结构相似。β亚单位的结构与LH等的β亚单位不同，在免疫活性上可予区别。血中β亚单位大部分以全分子形式存在，游离态的β亚单位(F-13_HCG)占HCG的I～5％左右。血中游离态的β亚单位是在受孕后6～8天产生，50～80天达到高峰，以后平稳下降，直至孕18周左右稳定于一定浓度。

唐氏综合征又称先天愚型，21-三体综合征，是最常见的染色体疾病和弱智的病因，新生儿中发病率约为1/700左右。根据染色体核型的不同，唐氏综合征分为单纯21三体型、嵌合型和易位型三种类型。唐氏综合征的发生起源于卵子或精子发生的减数分裂过程中染色体的不分离现象，通常是随机发生的，约95％的不分离现象来源于母亲，仅5％左右发生在精子发生期。其结果是21号染色体多了一条，多出的一条染色体因剂量效应破坏了正常基因组遗传物质间的平衡，导致患儿智力低下，颅面部畸形及特殊面容，肌张力低下，多并发先天性心脏病，患者白血病的发病率为普通人群的10-20倍。生活难以自理，患者预后一般较差，50％左右于5岁前死亡。

目前对唐氏综合征缺乏有效的治疗方法。通过孕早、中期检测孕妇血中ΡΑΡΡ-Α，游离β-HCG，AFP等，结合B超检查，可将约90％的唐氏综合征检测出来。对高风险胎儿，通过绒毛活检或羊水穿刺或脐血穿刺等技术作染色体核型分析可以确诊，然后流产处理。

怀有唐氏综合征(DS)胎儿的孕妇，一部分人其血清F-P-HCG水平呈强直性升高，平均MOM值为2.3～2.4Μ0Μ。F-β-HCG在孕早期和孕中期都处于高水平。妊娠中期DS孕妇血清F-β-HCG浓度比正常至少高2倍。F-β-HCG用于DS风险的评估，敏感期可从孕早期到孕中期(7～20周)。

羊驼血清中存在的一种天然缺失轻链的抗体，即重链抗体(heavy-chainantibody，hcAb)。单域重链抗体(single domain antibody，sdAb)是指仅由重链抗体可变区(Variable region)组成的基因工程抗体，又称为VHH抗体(variable domain of heavychain of heavy-chain antibody，VHH antibody)或纳米抗体(Nanobody，Nb)。与传统抗体相比，单域抗体具有分子量小，稳定性高，水溶性好等优点，其次天然缺失轻链，洗脱时不会像传统抗体那样造成轻链脱落造成二次污染，因此可作为新一代的亲和纯化配体用于纯化β-HCG和检测试剂检测β-HCG。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体。

本发明的另一目的在于提供一种分离的核酸分子。

本发明的另一目的在于提供一种载体。

本发明的另一目的在于提供一种宿主细胞。

本发明的另一目的在于提供一种制备上述纳米抗体的方法。

本发明的另一目的在于提供一种试剂盒。

本发明的另一目的在于提供上述纳米抗体的应用。

本发明是这样实现的：

本发明的一方面涉及一种抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，本发明的纳米抗体的氨基酸序列并不限于SEQ ID NO.1所示的序列，其还可以是在SEQ ID NO.1所示的序列上经过一个或多个氨基酸残基的替换和/或删除得到的，且具有与SEQ ID NO.1相同生物活性例如与人促绒毛膜促性腺激素β亚单位特异性结合的活性或者是活性加强或者活性减弱的衍生序列。这类衍生序列也属于本发明的保护范围。

本发明的另一方面涉及一种分离的核酸分子，该核酸分子编码上述的抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

对本领域技术人员而言，根据密码子的简并性，容易在上述核苷酸序列的基础进行一个或多个核苷酸的替换，得到相应的衍生序列，以使编码出本发明提供的SEQ ID NO.1所示的纳米抗体。因此，在上述核苷酸序列的基础进行一个或多个核苷酸的替换，得到相应的编码出本发明提供的纳米抗体的衍生的核苷酸序列也属于本发明的保护范围。

本发明的另一方面涉及一种载体，其含有上述的分离的核酸分子。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述载体包括但不限于克隆载体和表达载体。

本发明的另一方面涉及一种宿主细胞，其含有上述的载体。

本发明的另一方面涉及一种偶联物，该偶联物含有上述的抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体以及偶联部。

偶联部的具体类别，均可以根据使用需求进行选择。进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述偶联部包括但不限于放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质、多聚物例如琼脂糖、聚乙二醇等、活性多肽、蛋白、核素，核酸，小分子毒素、受体或配体等。

本发明的另一方面涉及一种制备上述的抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体的方法，其包括：培养上述的宿主细胞。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述方法还包括：从细胞培养物中纯化得到上述抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体。

在本发明公开了抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体的氨基酸序列的前提下，本领域技术人员容易通过基因工程技术、化学合成等方法得到本发明的抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位纳米抗体，其相应的制备方法均属于本发明的保护范围。

本发明的另一方面涉及一种检测检测唐氏综合征的试剂盒，其包括上述的抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体，或者上述的偶联物。

本发明的另一方面涉及上述的抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体在检测唐氏综合征中的应用，该应用以非诊断或治疗为目的。

本发明的再一方面涉及上述的抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体在早孕与唐氏综合征检测中的应用。

本发明的再一方面涉及上述的抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体在制备唐氏综合征检测试剂盒中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体具有与人促绒毛膜促性腺激素β亚单位特异性结合的活性，可以用于检测人促绒毛膜促性腺激素β亚单位，可替代传统单克隆抗体与多克隆抗体；此外该纳米抗体还具有分子量小、亲和力高、结构和性能稳定等特点，，可耐受高温，高盐等苛刻条件，延长了抗体的货架期。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中的洗脱液的电泳结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体的制备

1免疫：

取健康成年羊驼，将人促绒毛膜促性腺激素的β亚单位与佐剂混合，采取背部皮内、皮下多点注射的方式进行免疫，免疫程序如表1所示，第三次加强免疫后第七天，采集羊驼外周血，用于构建噬菌体展示文库。

表1羊驼免疫程序

2羊驼淋巴细胞分离：

在15mL离心管中加入6mL淋巴细胞分离液，再加入等体积的全血样品，800g常温离心20min；

小心吸取中间层悬浮的白细胞至一新的离心管中，加入2倍体积的PBS,800g,常温离心15min；

小心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解红细胞；450g常温离心15min，去上清并计数，按10⁷个淋巴细胞加入2mL Trizol充分裂解，备用。

3总RNA提取：

向上述裂解液中加入1/5体积的氯仿，剧烈震荡20s充分乳化，冰上静止10min；4℃，12000g离心10min，取上清转移至另一新鲜离心管中；

加入等体积的异丙醇，充分混匀后冰上静止10min；4℃12000g离心10min，弃上清，加入75％的乙醇，充分混匀；

4℃，12000g离心10min，去上清；室温干燥5min，加入适量RNase-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。

4cDNA合成：

反转录体系如下：

步骤1：按如下表中体系配制反应液：

混匀后，65℃保温5min，迅速冰浴；

步骤2：按如下表中体系配制cDNA反应液

混匀后，按如下条件反转录：25℃10min；50℃，50min；85℃，5min；离心后每管加入1μL RNase H 37℃，20min。

5抗体基因扩增

巢氏第一轮PCR体系如下：

5×HS buffer	10μL
		Alpvh-LD	1μL
CH<sub>2</sub>-R	1μL
		酶	0.5μL
dNTP	4μL
		cDNA	0.5/1/2/4μL
ddH<sub>2</sub>O	补齐至50μL

反应程序：94℃，5min；98℃10s，50℃15s，72℃1min，共30循环；反应结束后，凝胶电泳，割胶回收700bp左右的目的片段。

其中，Alpvh-LD序列(5’-3’)如下：CTTGGTGGTCCTGGCTGC；

CH2-R序列(5’-3’)如下：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC。

巢氏第二轮PCR体系如下：

94℃，5min；98℃10s，57℃15s，72℃45s，共30循环。

其中，AlpVh-F1序列(5’-3’)如下:

CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC；

AlpVHH-R1(5’-3’):

CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCATGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG；

AlpVHH-R2(5’-3’):

CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG。

第二轮反应结束后，凝胶电泳，割胶回收目的片段，进行双酶切。

6文库构建：

6.1载体和目的片段酶切

目的片段双酶切体系(160μL体系)如下：

目的片段	15ug
		SfiI酶	5μL
ddH<sub>2</sub>O	4μL
		cutsmart	10μL
Total	160μL

50℃酶切过夜。

载体双酶切体系(160μL)如下：

pcomb3XSS	50μL(25μg)
		sfiI酶	5μL
ddH<sub>2</sub>O	90μL
		cutsmart	8μL

6.2载体与目的片段的连接

50μL连接体系如下：

16℃连接过夜，加入5μL(1/10量)的3M CH₃COONa(pH 5.2)和125μL(2.5倍量)的冷无水乙醇，-20℃静置30-60min，12000g离心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，室温干燥，溶于15μL去离子水中。

7电转化：

(1)将感受态细胞TG1 100μL置于冰上融化，加入1μL连接产物轻轻混匀，冰上放置30min；

(2)将上述混合液转入0.2cm的电击杯中，调节电击参数：电压为2.5kV，电场强度为2.5kV/cm，电击转化；

(3)立即向电击杯中加入1mL SOC培养基，悬浮细胞，37℃180r/min培养1h进行细胞复苏；

(4)将复苏培养物10倍梯度稀释后均匀涂布于SOB-AG平板，37℃倒置培养过夜。

8抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位纳米抗体亲和淘选：

1)将人促绒毛膜促性腺激素β亚单位用PBS稀释至终浓度为10μg/mL，按100μL/孔加入酶标孔中，4℃包被12h；

2)弃包被液，PBS洗涤3次，每孔加入300μL 3％BSA-PBS封闭液，37℃封闭2h；

3)PBS洗涤6次，加入100μL噬菌体文库，噬菌体数量约为2×10¹¹cfu，37℃孵育2h；

4)吸出未结合的噬菌体，用PBST洗涤5次，PBS洗涤10次；

5)加入100μL Gly-HCl洗脱液，37℃孵育8min，洗脱特异性结合的噬菌体；将该洗脱液转移至一无菌离心管中，迅速用50μL Tris-HCl中和缓冲液中和；

7)取10μL进行梯度稀释，测定滴度，计算淘选回收率，其余洗脱物混合后进行扩增和纯化，用于下一轮亲和淘选。

8)将文库扩增结果进行下一轮淘选，改变淘选条件，每一轮淘选条件如表2。

表2亲和淘选条件

9特异性噬菌体克隆的鉴定：

1)从第三轮淘选洗脱物滴度的平板上(菌落数30～200个)，用灭菌牙签随机挑取48个单克隆接种于1mL 2×YT-GA中，进行扩增。

2)将2μg/mL的人促绒毛膜促性腺激素β亚单位，按100μL/孔加入酶标孔中，4℃包被12h；

3)弃包被液，PBST洗涤3次，每孔加入300μL 3％脱脂牛奶，37℃封闭2h；

4)PBST洗涤3次，加入100μL/孔的培养上清，37℃，孵育1h；

5)PBST洗涤5次，加入辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体(用3％脱脂牛奶，按1:5000稀释)，100μL/孔，37℃作用1h；

6)PBST洗板6次。加入TMB显色液显色，100μL/孔，37℃，5min，加入终止液终止反应，50μL/孔，于450nm下测光密度。OD₄₅₀大于1.0的为阳性克隆。

7)挑取阳性克隆测序，基因序列如SEQ ID NO.2所示，编码的纳米抗体的氨基序列如SEQ ID NO.1所示。

10抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体表达纯化：

(1)将筛选到的SEQ ID NO.2的序列亚克隆至pet-25b(+)载体上，酶切位点为NcoI和Not I。将重组质粒VHH-pET25b⁺转化大肠杆菌Rosetta DE3表达菌株中，挑取单克隆菌株接种于4mL LB-Amp培养基，37℃250rpm培养4～5h；

(2)按照1％(V/V)接种于100mL LB-Amp-0.2％Glu培养基(用500mL摇瓶)，37℃250rpm培养至OD600约0.5；

(3)加入终浓度0.1mM IPTG，30℃220rpm诱导过夜；

(4)(圆底离心管)12000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，-20℃保存备用；

(5)取上述菌，加结合Buffer(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl)重悬；每100mL菌液用30mL结合Buffer；

(6)超声破碎菌体；超声条件为：25～35min、超声5s间隔7s、功率35％；

(7)12000rpm 4℃离心20min，取上清，过0.45μm滤膜以用于纯化。

11抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位纳米抗体的纯化：

(1)纯化过程中使用到的所有试剂均需要提前过0.45μm滤膜，以防柱子发生堵塞；

(2)加8～10个柱体积超纯水清洗Ni柱；

(3)加8～10个柱体积结合Buffer(50mM NaH₂PO₄+500mM NaCl)平衡柱子；

(4)将过膜后的样品加入到Ni柱中，收集流出液；

(5)加8～10个柱体积结合Buffer平和柱子；

(6)依次用含50mM，100mM，250mM和500mM咪唑的结合Buffer洗脱纳米抗体，其中，各咪唑浓度的洗脱体积依次为5mL、4mL、4mL和6mL；收集洗脱液。电泳，结果见图1。

图1中：M:Protein Marker；Lane 1:未诱导，Lane 2:诱导后上清，Lane3:诱导后沉淀，Lane 4-8分别为50mM，100mM，250mM，500mM，500mM咪唑洗脱。泳道2-8在15KD的位置均有条带，代表有纳米抗体被洗脱出。

(7)加5mL 500mM咪唑溶液彻底清洗柱子；

(8)加8～10个柱体积结合Buffer清洗(平衡)Ni柱；

(9)8～10柱体积超纯水清洗Ni柱；

(10)20％乙醇保存柱子。

实施例2

本实施例提供了一种含抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位纳米抗体的偶联物，该偶联物包括实施例1提供的抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位纳米抗体和偶联部，偶联部琼脂糖微球。该偶联物的制备方法如下：

将NHS活化的琼脂糖用0.1M HCl洗涤10次，每次平衡5min。用偶联缓冲液10mMNa₂HPO₄，pH 7.4洗涤10次，加入纯化的抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位纳米抗体4mg/mLNHS活化的琼脂糖微球，室温反应1h，使纳米抗体共价偶联到NHS活化的琼脂糖微球。用偶联的缓冲液洗涤3次，加入1M Tris buffer pH 8.8，封闭未反应的活性基团。用10mMNa₂HPO₄，pH 7.4洗涤3次，既得到人促绒毛膜促性腺激素β亚单位-B结构域的免疫亲和吸附材料即含抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位纳米抗体的偶联物，吸附材料加入20％乙醇，4℃保存。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都阿帕克生物科技有限公司

<120> 一种抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体及核酸分子和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Asp Ser Lys Asp

20 25 30

Leu Leu Gly Trp Ser Arg Gln Val Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala His Ile Ser Ser Gly Gly Thr Thr His Tyr Thr Asp Pro Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr

85 90 95

Ala Ile Val Gly Pro Tyr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cagctgcagc tggttgaatc tggtggtggt ctggttcagg ctggtggttc tctgcgtctg 60

tcttgcgctg cttctggttc taccgactct aaagacctgc tgggttggtc tcgtcaggtt 120

ccgggtaaac agcgtgaact ggttgctcac atctcttctg gtggtaccac ccactacacc 180

gacccggtta aaggtcgttt caccatctct cgtgacaacg ctaaaaacat ggtttacctg 240

cagatgaact ctctgaaacc ggaagacacc gctgtttact actgcaccgc tatcgttggt 300

ccgtacgttt actggggtca gggtacccag gttaccgttt cttct 345

Claims

1.一种抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体。

3.根据权利要求2所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种载体，其特征在于，其含有权利要求2或3所述的分离的核酸分子。

5.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求4所述的载体。

6.一种偶联物，其特征在于，其含有权利要求1所述的抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体以及偶联部。

7.一种制备权利要求1所述的抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求5所述的宿主细胞。

8.一种试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体，或者权利要求6所述的偶联物。