JPH06504033A - リポ多糖結合オプソニン及びその使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リボ多糖結合オプソニン及びその使用法發吸９珠術的分野 本発明は新しく発見され、分離された蛋白質、並びに敗血症の防止又は治療の方 法、及びこのような蛋白質を含む組成物に関するものである。より詳細に述べる ならば、本発明はリポ多１１ｉ（ＬＰＳ）及びＣＤ１４単球分化抗原（ｄｉｔｌ ｕｅｎｌｉ出ｏｎ　ａｎｔｉｇｅｎ　）に結合する分子、及びそれに対する抗体 であってＣＤ１４表現細胞によるｔ、ｐｓｕ合体の結合を阻１にする抗体に関す るものである。

発明の背景 敗血症は、最も一般的には感染症又は外傷によって体内に導入され、又は蓄積さ れた毒素によって誘起される病的状態である。敗血症の初期症状は一般的には悪 寒、ひどい発汗、不規則に出たり引いたりする熱、虚脱などであり、その後に持 続的発熱、低血圧がおこり、それにショック、好中球減少症、白血球減少症、播 種性向管内凝固、成人呼吸困難症候群及び多臓器不全が続く。

敗血症誘起性毒素は病原菌、ウィルス、植物及び毒に関係していることが判明し た。十分よく述べられている細菌性毒素のなかにはグラム陰性菌の内毒素又はり 、ｆ！多ｍ（１、ＰＳ）かある。これらの分子はあらゆるグラム陰性菌の外膜の いたるところにある糖脂質である。Ｌ　Ｐ　Ｓ分子の大部分の化学構造は複雑で 種々様々であるか、共通の特徴はＬＰＳの脂ＷＡ領域である［リーチエル（Ｅ、 　Ｔｈ、　Ｒ１ｅｌ＋ｃｈｅｌ）ら著、内毒素ハンドツ・ツク（ｌｌａｎｄｂｏ ｏｋ　ｏｌ　Ｅ＋＋ｄｏｌｏｋｉｎｓ）、１巻、＋１１７−２＋４ベーン、４ｇ 集　ブロクター　（Ｒ，Ａ、　Ｐｒｏｃｌａｒ　）及びリーチエル、エルセヴイ ール、ｒｌ、ステルダム（１９８４）　Ｅ　；生物系における脂ｉｆＡの識別が 、敗血症の病態生理学的変化の、すへてとはいわないまでも多くを開始する。脂 質Ａ構造はあらゆるクイゴのグラム陰性菌に高度に保存されているから、共通の 病態生理学的変化がゲラ１、陰性敗血症を特徴つける。

ｌ　ＰＳは、症状に成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）が含まれる場合Ｃ才特に、 人におけるゲラム陰竹敗血症期間中におこる死の主因であると考えられている［ 「グア７・デ’ｉ７’　ｘンター（〜＋ｎ　［１ｅｔｅｎｌｅ＋）ら、Ｌａｎｃ ｅｔ、１％、６０５ペー：；　（１９８８）　、チーブ→−（ｌｉｅ山「）ら、 ｊ１山ｃ１．　Ｄｌｓ、、１３６巻、＋９−２１１ページ（！９８７）　］　。

例えば、成る特定のサイトカイン。腫瘍壊死因子アルファ／カヘクチン（ＴＮＦ ）が敗血症ショックの主な仲介物質であることが最近報告されたしブトター（Ｂ ｅａｔｌｅ＋　）ら、Ｎ、　ＥＩＩｇ、　Ｊ、　Ｍ！ｄ、　３１６巻、３７９ペ ージ（１９８７）　］、細菌からのＬＰＳ内毒素を実験動物及び人に静脈注射す ると、ＴＮＦの一過性の放出が速やかにおこる［ブトターら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、１３５巻、３９７２　（１９８５）　；マシソン（Ｍｉ＋ｈｉ＠ｏｎ）ら、 Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、１ｎｙｅｓ４．８１巻、１９２５ページ（１９１１１１）　］ 　。ＴＮＦが敗血症ショックの重要な仲介物質であるという証拠は、主として、 動物を抗ＴＮＦ抗体で前処理すると致死率が低下することを明らかにした実験に よる［ブトターら、５ｃｉｅｎｃｅ。

２２９巻　８６９ページ（１９８５）　；７シソンら、１．　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖ ｅｔＬ１１１巻、１９２５、（１９８８）］。これらの報告は、ＬＰＳ又はその 他の因子によって生ずるＴＮＦ分泌の阻害は、死に至ることが多い敗血症の症状 を改善することを示唆する。

この概念は、Ｌ　Ｐ　Ｓに対する宿主（人も含む）の主反応が、単球／マクロフ ァージ系統の細胞によるＬＰＳの識別と、それに続く、サイトカインとして知ら れる一般的群を含む種々様々の細胞生成物の速やかな合成から成るとする主張を 支持する。敗血症に関与し、特に、ＬＰＳに反応すると考えられているその他の 細胞型は、多形核白血球（ＰＭＮ）及び内皮細胞である。これら各細胞型はＬＰ Ｓに反応して強力な炎症性物質を合成し、多形核白血球の場合は細胞毒物質を合 成する。

１、ＰＳを血液中に導入すると、それはリボ多糖結合蛋白質（Ｌ　Ｂ　Ｐ）と呼 ばれる蛋白質に結合する。ＬＢＰは、健康動物及び人の血清中に１００１ｇ／ｍ ｌ以下の濃度て存在する６０ｋｄ糖蛋白質である。急性期にはＬＢＰは肝細胞に よって合成され、血清中濃度３０−５０μｇ／ｍｌに達する。ＬＢＰは急性期ヒ ト及び家兎血清から精製することができる［トビア７．　（Ｔｏｂｉａｓ）ら、 Ｉ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１６４巻、７７７−７９３ベージ（＋９８６）　］ 　。Ｌ　Ｂ　ＰはＬＰＳの脂質Ａ領域を識別し、ラフ（４ｏｕｇｈ　）−及びス ムース□ｍｎｏ＋ｈ）型ＬＰＳの両方と高親和性の化学量１：１の複合体を形成 する［トビアスら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６４巻：　１０８６７−１ ０８７１　（１９８９）　］　、　ＬＢＰは、殺菌性の透過性増加因子（ＢＰＩ ）としで知られるＬＰＳ結合蛋白質と相同のＮ末端配列をもツ［トビアスら、Ｊ 、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６３巻、＋３４７９−１３４８１ベージ（１９ ８８）　］　、　Ｂ　Ｐ　ＩはＰＭＮの特異的顆粒中に保存され［ワイス（Ｗａ ｉｔｓ　）ら、血液（Ｂｌｏｏｄ　）　、６９巻−６５２−６５９（１９８７） 　］　、ＬＰＳに結合し、透過性障壁を破壊することによってグラム陰性菌を殺 す［ワイスら、ｌＩｍ＋ｕｎｏ１．　１３２巻、３１０９−３１１５　（１９８ ４）　］。ＢＰＩとは異なり、ＬＢＰはグラム陰性菌に対して直接細胞毒性では ない［トビアスら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅａ、２６３巻：ｌ３４７９−１３４８ １　（１９８８）　］、そしてその正確な細胞毒性機能ははっきりしない。

その他のバックグラウンドによって、単球／マクロファージ系統の細胞は下記の ような種々様々の免疫機能を行う：微生物の食作用、抗原勧賞の取り込み、及び ヘルパーＴ〜細胞を刺激する形でのその発現。それらは多分、腫瘍に対する免疫 監視（ｓｕｒｖｅｉｌｌａ＋＋ｓｅ）にも関係し、それらは若干の補体成分およ びサイトカインを分泌する。表面膜抗原はこれらの活性の調節に重要な役割を演 する。いくつかの単球／′マクロファージ表面抗原が確認さね、それらの分子量 が測定された。

そのような抗原の−っ、ＣＤ１４、は、単球、マクロファージ及び活性化顆粒球 によって表現される５５−ｋｄ糖蛋白質である。それは、ＭＯ２，ＭＹ４，３Ｃ １０及びＬＥＵＭ３を含む多数のモノクローナル抗体によって識別される。ＣＤ Ｉ４に帰せられる生物学的機能はまだないが、成熟細胞におけるその制限された 表現は、重要なエフェクター機能を示唆する。単球の細胞表面分化抗原ＣＤ１４ を規定する遺伝子のヌクレオチド配列が決定され、それらから、ＣＤ１．４のア ミノ酸残基配列が導き出された［フェレロ（Ｆｍｅ＋ｏ　）ら、核酸研究（Ｎａ ｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｔｅａｃｈ）　１６巻、４１７３ページ（１９１１８ ）　］　。

ヒト血清は痕跡量のリボ多糖結合蛋白１ｉＩ（ＬＢＰ）を含む。そして最近、こ の蛋白質が先ず＋−ｐｓｃ内毒素）と相互作用し、それから食細胞の表面のＣＩ ）　１−４と相ハ′１作用して、敗血症性ショック現象の基礎となる細胞反応を 誘起することが市り明した［ライト　（Ｗ目ｇｈｔ）　ら、　５ｃｉｅｖｃｅ、 ２４９巻：　１４３１−１４３３　（１９９０）　］、しか（２ながらいくつか の観察により、Ｌ　Ｂ　ＰはＬＰＳとＣＤ１４との結合に関与し得る一方、それ は関係する唯一の蛋白質ではないことが示唆された。この結論を支持する王つの 考察が報告されている　（１）精製ＬＢＰをヒト単核細胞に添加すると、血清の 存在下で認められる、生理的量に反応しておこるこれら細胞のＴＮＦ合成能力は 保存されなかった：　（２）ＬＢＰは急性期反応中に十分量存在する急性期反応 体であるが、健康体においてはＬＰＳに対するそれらの反応を説明する程十分に は存在しない；　（３）ＬＰＳとマクロファージとの結合を仲介する溶液の能力 を測定することによって“ＬＰＢ様”活性を測定し、健康体の血清中に非常に高 いレベル＝血清中のＬＢＰ含量によって説明するにははるかに高過ぎるレベル＝ が見いだされた。これらの考察は、ＬＰＳとＣＤ１４とを結合させる特性をもっ た新規分子をヒト血清中に探す動機となった。

係属米国出願第０７／４７３．６０９号において、出願人により°セブチゾと命 名された分子が確認さね、それはオプソニンのような機能をもち、下記の特徴を もつことが判明した： （ａ）このオプソニンはリボ多糖（Ｌ　Ｐ　Ｓ）と結合して、レセプター又は単 球、マクロファージ細胞及び多形核細胞（ＰＭＮｓ）によって識別される複合体 を形成することができる； （ｂ）そのオプソニンは、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって測定して約９０ｋｄの見か け分子量をもつ； （ｅ）そのオプソニンは正常血清中に高濃度で存在し、ＬＰＳに反応した単球に よるＴＮＦの合成を高める； （ｄ）オプソニンとＬＰＳとの複合体はＰＭＮ活性を刺激し、ＰＭＮの内皮への 付着増加を促進し、ＰＭＮ脱顆粒化をおこし、付着分子ＣＲ３の表現を高めて゛ 調節しくｕｐ＋ｅｇａｌａ＋ｅｌ　Ｌ　；（ｅ）そのオプソニンは、先ず最初に ＬＰＳの生合成前駆体、脂質ＩＶａと結合して複合体を形成し、た場合は、レセ プターＣＤ１４に結合することができない。

この分子が侵襲性及びその他の外傷性できごとに対する宿主反応と明らかにかか オ）り合っていることは、その分子が感染症及び外傷に関する診断的並びに治療 的応用に重要な役割をもつことを予想せしめる。その分子のその後の研究は、そ の分子の理解を高め、ひいてはその利用性を広げると考えられるその他の構造的 及び機能的特性を明らかにした。したがって本出願の目的は、その分子の理解及 び利用を高めることである。

発明の概要 本発明により、出願人がここで“セプチン”と命名する分子は、オプソニンとと して機能することが発見された。そのオプソニンは、その主な確定的特性として リボ多糖と結合し５て、単球、マクロファージ細胞及び多形核細胞上のレセプタ ーによって識別される複合体を形成することができ、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によ って測定して約９０ｋｄの見かけ分子量をもつ純粋な形の蛋白質から成る。

このオプソニンはその他にも確定的特性を有する；それらの中には、正常血清中 に高ｌｌＩ関で存在し５、リポ多糖に反応した単球によるＴＮＦ合成を高めると いう特性がある。また、そのオブムーンがリポ多糖と複合体を形成している場合 、それは多形核細胞の活性を刺激し、多形核細胞の内皮への付着を促進し、付着 分子ＣＲ３の表現を高く調節（ｏｐ＋ｅｇｕｌａ＋ｅ）　ｌ、１、Ｆ記多形核細 胞の脱顆粒化をおこす。

このオプソニンのその他の特性として、脂質ＩＶａとして知られるリボ多糖の生 合成前駆体と最初に結合し、て複合体を形成した場合には、レセプターＣＤ１４ に結合するこ吉はできないきいう特性がある。

本発明の分離物が宿主侵襲に対する一連の反応においで果たす完全な役割はまた 明らかでないが、それか成るいくつかの活性の顕在化、及び宿主侵襲に抵抗する 動きと関連する状態に関与していることは明らかである。よって、そのオプソニ ンは、種々の刺激＝侵襲性であろうと特発性であろうと＝を、このような刺激が 促進するらしいこのオプソニンの活性化によって確認し、多分区別する診断的道 具として利用される可能性がある。

このすブソニンはリボ多糖結合蛋白質（ＬＢＰ）、ａ同じような成る特性を有す る。１．　Ｂ　Ｐのようにこのオプソニンは血清に由来し、ＬＰＳ被覆粒子に結 合し、ＣＤ１４依存的方法によるそれらのマクロファージへの付着を仲介する。

しかしながらＬ　Ｂ　Ｐとは異なり、このオプソニンは■、ＢＰとは異なる分子 量をもち、正常血清中に高′？１Ａｒ１ｔで存在し、例えば約４μｇ／ｍｌの桁 に至る範囲で存在する。これは、以前に報告された、健康体において最大濃度１ ００　ｎｇ／ｍｌ以下という公知のオプソニン、１．ＢＩ’、濃度より有意に高 い濃度である。また、このオプソニンはｔ、　Ｂ　Ｐより有意に強力で、Ｉ−Ｐ 　Ｓ被覆赤血球との複合体の、マクロファージ細胞への結合において２０倍もよ り大きい活性を示す。特に、ＬＰＳ被覆赤血球とヒトマクロファージ細胞との結 合力によって測定した、リボ多糖の単球、マクロファージ細胞及び多形核細胞へ の最大結合は、わずか約０．０５μｇ／ｍｌのオプソニン濃度の赤血球の存在及 びそれとの結合によって達せられる。

このオプソニンは、下の実施例１に記載のように、また図１に示すように、Ｎａ Ｃｌ溶出液にあられれる活性のピークによってもＬＢＰとは異なる。特に、この オプソニンはＮａＣｌ勾配をもつビオレックス樹脂で溶出さね、約２００　ｍＭ ＮａＣＩのところに目立ったピークを示した；これに対してＬＢＰでは＞５００ 　ｍＭＮａＣｌにずっと小さいピークがあられれた。これらのデータに関するこ れ以上の議論は実施例１て行われる。

本発明のオプソニンのその後の研究及び特徴づけにより、それはプロテアーゼと プロテアーゼの基質との複合体から成ることが判明した。より詳細に述べるなら ば、その基質はヒト蛋白質Ｃインヒビター（ＰＣＩ）との構造的類似性をいくつ かもつようにみえる。そのオプソニンはＬＰＳと相互作用することによってプロ テアーゼ　カスケードに関与することが今や理論づけられており、したがって複 合体を形成し、ＣＤ１４と相互作用すると考えられている。それはそれとして、 そのオプソニンの把握された成分の正確な分子量及び構造はまだこれから決定さ れるものであり、そのオプソニンはいくつかのプロテアーゼ及びそれらが作用す る蛋白質に由来すると理論づけられる。

発明のオプソニンを、プロテアーゼインヒビターにさらすことによって研究した 、そしてこのオプソニンに対する抗体も産生した。以下に示すデータは、オプソ ニン活性がプロテアーゼインヒビターとの接触によって著しく低下することをあ られしている。この活性をあられすことがわかっている特定のプロテアーゼイン ヒビターを、アンチパイン、ロイペプチン、ベンザミジン、キモスタチン、ペプ スタチンＡ、アプロチニン及びこれらの混合物から成る群から選択する。

本発明はまた、このオプソニンに対して発現する抗体＝このオプソニンを生じさ せるようにみえるプロテアーゼ　カスケードの一成分に対して出現する抗体も含 む＝にも関する。オプソニンに対する典型的抗体が家兎において産生され、ＬＰ Ｓの単球（ＭＯ）への結合を完全に阻止することが確認された。オプソニンに対 するモノクローナル−及びポリクローナル抗体共に考慮され、ここに包含される 。

本発明のオプソニンは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で最初に同定され、特徴づけられ、９０キロダルトン Ｏｄ）蛋白質から成ることがわかった。前記のように、このオプソニンは体液、 特に血清からの分離及び精製によってつくられる。血清又はその他の液を公知の 一連の分離法にかけ、そこでこのオプソニンが回収される。本発明は当然、その オプソニンの別の製造法＝適用可能の公知の遺伝子的復製法を含む＝を考慮して いる。よって本発明はその範囲内のこのような合成的製法を含むものとする。

ｃＤＮＡアミノ酸配列の分離は、以下で詳しく論じるように、組換え遺伝法によ るオプソニンの再生産を容易にする。

本発明はさらに、特発性又は侵襲性刺激物の発見法を含む；これはこれら刺激物 が、本発明のオプソニンによって影響を受ける活性を誘起し得るという事実に基 づいている。特に、侵襲性刺激物は、それらが本発明のオプソニンと結合して、 単球、マクロファージ細胞及び多形核細胞上のレセプターによって識別される複 合体を形成する能力によって確認さね、検出される。この方法で、ＴＨＰＩ細胞 系から誘導されるマクロファージ細胞が、対照として、例えば内毒素、トリパノ ソームなど多数の公知のステイミュレータ−物質て処理さ札又はこれににさらさ れる。一方平行細胞サンプルは、感染性刺激物の推定部位からの抽出材料で処理 さ扛又はこれにさらされる。全サンプルはその後上記の方法によってインキュベ ートされ、その後やはり定められた一連の分離法を受ける。そして対照及び未知 サンプルから誘導された生成分離物の試験結果を比較し、そのオプソニンを含む マクロファージ活性化結合複合体が生成しているかどうか、そして構造的に或い は機能的に同しか又は類似しているかどうかを調べる。

同様なやり方で、そのオプソニンに効果的に拮抗する潜在的薬剤のスクリーニン グのためのアッセイ系が作成される。−例では、被験薬剤を、オプソニン及び成 る量のリポ多糖を含むマクロファージサンプルに加え、オプソニンとＬＰＳ又は マクロファージとの結合活性に与えるその影響を調べる。もう一つの方法では、 オプソニンが活性であることがわかっている細胞内試験系にオプソニンを導入し 、有望な薬剤をも同じ細胞培養物中に導入し、その後培養物を試験し、有望な薬 剤のみを添加した場合、又は公知の量のオプソニンを付加した場合と比較したオ プソニン活性の変化を考察する。

本発明は、本発明のオプソニンの活性及び存在を測定することにより、哺乳動物 の、刺激による、自発性の、又は特発性の病的状態を検出する方法にも関する。

より詳細に述べるならば、オプソニンの活性は、適切に標識化した量のオプソニ ンの使用によって、後に述べるアッセイ法によって直接追跡することができる。

別法として、このオプソニンを用いて結合パートナ−又は抗体を出現せしめ、こ れらを標識化し、血清などのメジウムに導入し、その中のオプソニンの存在を試 験し、それによってそのメジウムを採取した宿主の状態を評価することができる 。

こうして、オプソニン及びこれに対して産生ずる抗体両方とも、例えば同位体添 加、水素化ホウ素ナトリウムによる還元、又は放射性ヨウ素化によって標識化し たオプソニンに対する抗体を用いる、例えばラジオイムノアッセイなどの免疫法 を含む種々の診断的方法と組み合わせて用いることができる。

免疫法では、対照量のオプソニン、その抗体、などがつくられ、酵素、特異的結 合パートナ−及び／又は放射性元素で標識化さね、それから侵襲を受けていると 考えられる哺乳動物の血液サンプルに導入される。標識化物質又はその結合パー トナ−がサンプル内の部位と反応する機会をもった後、生成したマス（ＩＩ＋ａ ｓｓ）を、付着標識の性質によって異なる公知の方法によって試験する。

放射性標識、例えば同位体１’ｃ、　’３１　１．　’　Ｈ，”’　Ｉ、問Ｓな どを用いる場合には、公知の、現在使用できるカウンティング法が利用される。

標識が酵素である場合は、当業者には公知の、現在用いられている比色法、分光 光度法、蛍光分光光度法又はガス測定法によって検出が行われる。

本発明は、オプソニンの存在の程度を定量分析するための試験キットの形で製造 されるアッセイシステムを含む。このシステム又は試験キットは、標識をオプソ ニンに結合させる、ここに述べられる放射性及び／又は酵素的方法の一つによっ てつくられる標識成分と、一つ以上のその他の免疫化学的試薬＝そのうち少なく とも一つは標識化成分、その結合パートナ−１測定すべき成分の一つ、又はそれ らの結合パートナ−のいづれかと結合できる遊離又は固定リガンドである＝とを 含んで成る。

その他の実施態様において、本発明はオプソニン、オプソニンに対する抗体の活 性、又は、同じか、拮抗する活性をもっことが確認された作用物質又はその他の 薬剤に基礎を置く二、三の治療法に関する。第一の治療法は、オプソニンの結合 活性からおこる状態、例えば炎症及び発熱などの発症の予防と関係し、オプソニ ンに対する抗体、オプソニンの産生及び／又は活性を調節できる作用物質、又は オプソニン拮抗物實と１５で作用することができる、オプソニンに対する抗体で はない作用物質を、個々に又は互いに混合して、宿主におけるこれらの状態の発 生を防止するための有効量を投与することから成る。

より訂細に述べるならば、概ねここに引用される治療法は、有効量の抗オプソニ ン抗体又は例えば本発明のその他の面にしたがって作成され使用される薬物スク リーニングアッセイによって開発されたその他の等しく有効な薬剤から成る医薬 組成物の投与によって敗血症、炎症及び／又は発熱を治療する方法を含む。

この治療法の変形実施態様は、先ずオプソニンの存在及び活性を検出し、その後 退した医薬組成物を投与することから成る。

よって、本発明のニドな目的は、哺乳動物における侵襲性刺激に対する宿主反応 と関連せる成る種の特性及び活性をあられす純粋な形のオプソニンを提供するこ とである。

本発明のもう一つの目的は、組換え法を含む、オプソニン製造法を提供すること である。

本発明のその他の目的は、感染症のような、侵襲性、自発性又は特発性病的状態 の存在が疑われる哺乳動物におけるオプソニンの存在を検出する方法を提供する ことである。

本発明のその他の目的は、哺乳動物におりるオプソニンの活性によく似るか、又 はその不都合な副作用を克服するために潜在的に有効な、例えば薬剤、作用物品 などの物質をスクリーニングするだめの方法及び関連アッセイ系を提供すること である。

本発明のその他の目的は、オプソニンの量又は活性をコントロールして、このよ うな存在又は活性の不都合な結末を変える、浦乳動物治療法を提供ン−るこｔｌ 二である。

本発明のまた別の目的は、オブソニ５・の礒又は活性と増進して、ｅＪｉｌｌ性 、ｌ−１発性又は特発性病的状態の不都合な結末を治療又は防ぐ、哺乳動物の治 療法をｔυ供）ることである。

本発明の又別の目的は、オプソニン又はその結合パートナ−１又はその産生をコ ントロールするか、オプソニンの活性に似るか又は拮抗する作用物質又は薬剤か ら成る、又はこれらに基礎を置く治療法に使用する医薬組成物を提供することで ある。

その他の目的及び利点は、下の例証的図を参照して行われる以下の説明を検討す ることによって、熟練せる当業者には明らかである。

図の簡単な説明 図１は、本発明のオプソニンであるセプチンの精製を描いたグラフである。ヒト 血漿をバッチ法でＢｉｏＲｅｘにさらし、それからカラムに注入し、図に示すＮ ａＣｌ勾配で溶出した。フラクションの０Ｄ２ｓｏ及び活性が示される。図に示 すように合一したセプチンに富むフラクションは、主な９０　ｋｄ　バンド及び １０分の１以下の低分子量バンドを有する。その後Ｍｏｎｏ　Ｑ　上で精製する と、挿入部分（ｉｎｓｅｔ　）に示される均質な標本が得られた。

図２は、セブチンーＬＰＳ複合体がＰＭＮ上のＣＲ３表現を増加せしめる様子を 描いたグラフである。ＰＭＮ懸濁液をオプソニン、セプチン、の存在下又は不在 下で、異なる用量のＬＰＳ（Ｒｅ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした 。

そして　ｏ　（Ｌｏ）らがＩ、　１ｍｍａｎｎ１．、１４３巻（１０）　３３２ ５−３３２９　（＋９８９）に記載したように、細胞表面ＯＣＲ，３の表現をＦ ＡＣ３によって測定した。ＦｃＲＩＩＩの表現はこの期間中変化しなかった。

図３は、セブチンーＬＰＳ？Ｊｊ合体がＰＭＮ上のＣＲ３結合活性を増加せしめ る様子を描いたグラフである。ＰＭＮをアッセイプレート中で、セプチンの存在 下及び不在下で種々の量のＬＰＳ（Ｒｅ）と共に３７℃で４５分間インキュベー トシた。

生成した単層を洗い、３０分間Ｃ３二重被覆（ｂｉ−ｃｏａｔｃｄ　）赤血球と 共にインキュベートシた。ライト（ｆｒｉｇｈｔ）らがｊ、　１ｍｍａｎｏ１． 　、１３６　（５）巻、＋７５９−１７６１ページ（＋９８６）に記載したよう に、付着指数を、食細胞１００個につき結合した赤血球数としてあられした。

発明の詳細な説明 本発明により、従来の分子生物学、微生物学、及び組換えＤ　Ｎ　Ａ法が当業者 の技術の範囲内で用いられる。このような方法は文献に十分説明されている。例 えばマーアチス（１１ｓｎｉａｌｉ＋）、フリッチ、：Ｌ（Ｆｌ山ｃｈ）及びサ ムプルツク（Ｓｕ＋　−ｂ＋ｎｏｋ　）の°分子クローニング　実験室マニコア ル（Ｍｏ１ｅｅｕｌａ＋　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：Ａ　Ｌａｂｏ＋ａｂｏｙ　Ｍａｎ ｕａｌ　）　”　（１９８２）　；　”ＤＮＡクローニング・実践的アプローチ （ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｐ「ａｃｌｉｅａｌ＾ｐｐｒｏａｃｈ　） 　”、■及び１１巻［グロブｙ　−（Ｄ、　Ｎ、　Ｇｌｏｕｔ）編、＋９８５］ 　；　”オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃａｌｅｏｌｉｄｅ　５ｙｎ ｔｈｅｓｉｓ）　”しガイド（Ｉｔ　１．　Ｇ＠ｉｊ）編、＋９１１４１　；　 ”核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄ　Ｈｖｂ＋１ｄｉｏ ｊｉｏｎ）″　［ハフ１ズ（［１，Ｄ、　）ｌａｎ＋ｅｓ　）及びヒギンズ（Ｓ 、　１．　）ｌｉｇｇｉｎｓ　）編A １９８５１　；　”転写及び翻訳（Ｔ＋ａｎ＋ｃ＋１Ｐｌｉｏｎ　ｍａｄ　Ｔ＋ ｇｎ山１ｉｏｎ　）　”　［ハムズ及びヒギンズ編、＋９８４］　；　”動物細 胞培ｍｌ（＾ｎ１Ｉｌｌａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　）　”　［フレッシ ュ−−（Ｒ，ｌ、　Ｆ「ｅｒｈｎｅｖ）　Ｉｔ集、＋９８６］　：　”固定細胞 及び酵素（Ｉｍｍｎｂｉｌｉｘｅｄ　Ｃｅ１ｌ　ＡｎｄＥｎｒｙ＋＋＋ｅＩ）” 　［ＩＲｌ、ｔ’＋ｅｓｓ　、（１９８６１］　；パーパル（Ｉｔ、　！’ｃ山 １）、　“分子クローニ゛、・グへの実際的ガイド（ＡＰ＋ｐｃｉｉｃａｌ　Ｇ ｕｉｄｅ　Ｔｏ　Ｍｏ１ｅｅｕｌａ＋　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　−（１９８４）。

モーこて、ここに用いられる場合、下記の用語は以下に示す定義をもつ。

こ１＝に用いられる用語°刺激”及びその複数形は、例えば感染症のような侵襲 的できごと、ｉｌ扛Ｆに創傷書こよって生じる状態に、そして例えば細胞性又は 代謝性障害又はその他の摩因に起因する特発性又は自発性状態に適用するものと する。

本出願及び請求を通じて使用される用語“オブソニプは、ここに、そして請求中 に示される活性プロフィールを有する蛋白質物質を指す。よって、実質」二等価 の、又は変化した活性を示す蛋白質も考慮される。これらの変化は、例えば特定 部（ａの突然変異誘賢によっておきる変化のように３ｌ画的であるかも知れない し、オプソニンの生産体である宿Ｊ！における突然変異によって得られる変化の ように偶発的であるかも知第１ない。また用語“オプソニゾは、その範囲内に、 ここに詳細に記載１−だ蛋白質・１ｆ！げに実質上相同のすべての類似体及び対 立遺伝子変異体も含むものとする。

°ｌノプリコブは、−Ｉ−ｎ−−ｖ　ｉ　ｙｔ＋−におけるＤＮＡ複製の自律的 単位と（７て機能する＝すなわちそれ自身のフントロール下で複製可能である＝ 遺伝子単位（例えばプ弓スミド、染色体、ウィルス）である。

“ベクター゛とは、その他のＤＮＡセグメントがそれに付着して、その付着した セグメントの複製をおこすレプリコン、例えばプラスミド、ファージ又はコスミ ドなどである。

”ＤＮＡ分子”は、一本鎖型か二重鎖らせん型かどちらかの、デオキシリボ核酸 （アデニン、グアニン、チミン又はシトシン）の重合型を指す。この用語は分子 の一次及び二次構造のみに関して用いら枳分子を特定の三次型に限定するもので はない。こうしてこの用語は特に、直鎖ＤＮＡ分子（例えば制限断片）、ウィル ス、プラスミド、及び染色体に見られる二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮ Ａ分子の構造を論する場合、配列はここでは、ＤＮＡの転写されない鎖（すなわ ちｍＲＮＡに相同の配列をもつ鎖）にそって５°から３゛の方向の配列のみを与 えるという通常の協定にしたがって記載される。

ＤＮＡ　”暗月づけ配列（ｃｏｄｉｎｇ　＋ｅｏｏｅｎｃｅ　）　”は、適した 調節配列のコントロール下に置かれるとき、１Ｌμｍ１で転写され、ポリペプチ ドに翻訳される二重鎖ＤＮＡ配列である。暗号づけ配列の境界は、５°　（アミ ノ）末端の開始コドンと、３゛（カルボキシル）末端の翻訳停止コドンによって 決まる。暗号づけ配列は、唄核生物配列、真核生物ｒｎＲＮＡ由来のＣＤＮＡ、 真核生物（例えば哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、及び合成りＮＡ配 列さえも含むことができる、但しこれらに制限されるものではない。ポリアデニ ル化シグナル及び転写停止配列は普通は暗号づけ配列の３゛に位置する。

転写−及び翻訳コン）・ロール配列は、暗号づけ配列を宿主細胞に表現する、例 えばプロモーター、エンハンサ−、ポリアデニル化シグナル、ターミネータ−な どのＤＮＡ調節配列である。

“プロモーター配列”は、ＲＮＡポリメラーゼを細胞に結合させ、下流（３゛方 向）暗号づけ配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明 を明らかにする目的で、プロモーター配列は転写開始部位によってその３゛末端 て境界づけられ、上流（５゛方向）に延びて、バックグラウンド上で検出可能の レベルで転写を開始するのに必要な塩基又は要素の最小数を含む。プロモーター 配列内には、転写開始部位（ヌク１ノアーゼＳ１で地図を作成することによって 好都合に定められる）、並びにＲＮＡポリメラーゼの結合をおこす蛋白質結合ド メイン（コンセンサス配列）が見いだされる。真核生物プロモーターは、必ずと は言えないが、しばしば“ＴＡＴＡ”ボックス及び°ＣＡＴ”ボックスを含む。

原核生物プロモーターは−１０及び−３５コンセンザス配列に加えて、５ｈｉｎ ｅ−Ｄ♂Ｉｇｕ１１＋１配列を含む。ＲＮＡポリメラーゼが暗号づけ配列をｍＲ ＮＡに転写し、そのｍＲＮＡが暗号づけ配列によって規定される蛋白質に翻訳さ れるとき、暗号づけ配列は細胞内の転写−及び翻訳コツトロール配列の“コント ロール下にある。

°シグナル配列”は、暗号づけ配列の前に含まれ得る。この配列は、宿主細胞に 通信し５てポリペプチドを細胞表面に向かわせるか、そのポリペプチドをメジウ ム中に分泌せしめるシブナルペプチド、ポリペプチドのＮ末端、を規定する（ｅ ｎｃｏｄｅ）。そしてこのシグナルペプチドは、その蛋白質が細胞を去る前に宿 主細胞によって切り離される。シグナル配列は、原核生物及び真核細胞に本来あ る種々の蛋白質と関連り、て見いだされる。例えば、アルファ因子、自然の酵母 蛋白質、は酵母から分泌さ才ζそのシグナル配列は異種蛋白質に結合してメジウ ム中に分泌され得る（参照；米国特許第４５４６０８２号、ＥＰｏ　１１６２旧 、公示年月「１１９８３年１月１２１１　；　１９８３年８　Ｊｌ　１２０提出 の米国特許出願第５２２９０９号）、さらに、アルファ因子リーダー及びその類 似物は、種々の酵母、例えばサツカロミセス属及びクルイヴｙ　Ｌ−１ミセス属 （Ｋｌｕｙｖｅ＋ｏｍマｃｅｓ　）などから異種蛋白質を分泌することが判明Ｌ ｌ―（１９Ｈ年１２月２３［１提出（７）ＥＰＯ８１ｔ３１２３０６．９　；　 １９Ｂ７年１２月３０日提出の来国特許出願第１３９６１１２月：！９８９年２ 月１日に公示されたＥＰＯ公布第０３０１６６９号）外生又は胃挿ＤＮＡが細胞 内に導入された場合、細胞はこのようなりＮＡによ−・て“形質転換゛さｔする 。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを形成する染色体ＤＮＡに統合される（共ｆ １゛結合する）かも知れないし７、されないかも知れない。原核生物、酵母、及 び例えば哺乳動物細胞において、形質転換ＤＮＡは例えばプラスミドのようなエ ビソーム要素ヒに保持されるらしい。真核生物細胞に関しては、安定的に形質転 換されｔ−細胞は、形質転換ＤＮＡが染色体に統合され、それが染色体複製によ 、〕Ｃ娘細胞に受け継がれるようになった細胞である。この安定性は、その真核 生物細胞が、形質転換ＤＮＡを含む娘細胞の集団から成る細胞系又はクローンを 確立１−、　ｆｉる能力によってあられされる。　“クローズとは、単一の細胞 又は共通の祖先からａ糸分裂によって誘導される細胞集団である。　“細胞系” とは、ｉｎ　ｖｉｌ＋ｏで幾世代にもわたって安定的に増殖することができる一 次細胞（ａｐ＋ｉｍａ＋マｃｅｌｌ）のクローンである。

二つのＤＮＡ配列は、定められた長さのＤＮＡ配列においてヌクレオチドの少な くとも約７５％（より好適には少なくとも約８０％、最も好適には少なくとも約 ９０又は９５％）がマツチする場合に、“実質上相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ） である”。実質上相同である配列は、配列データバンクで使用できる標準ソフト ウェアを用いてその配列を比較することにより、又はその特殊の系のために定め られた例えば厳しい条件下でのサザン　ハイブリダイゼーション法で確認される 。適切なハイブリダイゼーション条件を定めることは、当業者の技術の範囲内で ある。参照例、マニアチスら、同上、ＤＮＡクローニング、■及び１１巻、同上 ；核酸ハイブリダイビージョン、同」− ＤＮＡ構造の゛非相同（ｈｅｌｅ＋ｏｌｏｇｏｕｓ）　”領域は、比較的大きい ＤＮＡ分子内において確認できる、自然におりるそのように大きいＤＮＡ分子に 関しては見いだされないＩ）　Ｎ　Ａセグメントである。こうして、非相同領域 が哺乳動物遺伝子を規定（ｅｎｃｏｄｅ）するとき、その遺伝子は、ソース微生 物のゲノム中の哺乳動物ゲノムＤＮＡを山ｎｋ　ｌ、ないＤＮＡによって山Ｉｌ ｋされるのが普通である。非相同暗号づけ配列のもう一つの例は、自然には暗号 づけ配列そのものは見いだされない構造である（例えば、ゲノム暗号づけ配列が イントロンか、又は天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列かを含んでい るｃＤＮＡ）。対立遺伝子的変異又は天然に発生ずる突然変異的できごとはここ に定義づけるようなりＮＡの非相同領域を生しない。

′Ａ”を含んで成る組成物（ここで臥”は単一の蛋白質、ＤＮＡ分子、ベクター などである）は、組成物中の蛋白質、ＤＮＡ、ベクター（Ａ及びＢが属する種の カテゴリーによって）の最低７５重量％が“Ａ゛である場合、実質−Ｌ″Ｂ”を 含まない（“Ｂ”は一つ以上の混入蛋白質、ＤＮＡ分子、ベクターなどから成る ）。好適には、　“Ａ”は組成物の最低約９０重量％のＡ＋Ｂ種から成り、最も 好適には最低約９９重量％から成る。はとんど混入物のない組成物が、問題の種 の活性又は特徴をもつ単一の分子飛程のみを含むのも好適である。

゛抗体”とは、特異的エピトープに結合する、抗体及びその断片を含む免疫グロ ブリンである。この用語は特に、ポリクローナル、モノクローナル、及びキメラ 抗体を包含゛４る。この蝦後のものは米国特許第４８１６３９７号及び第４８１ ６５６７号により詳細に記されている。

゛抗体結合部位”とは、特異的に抗原に結合する、Ｈ−及びＬ鎖の変動性及び超 変動性領域から成る、抗体分子の構造部分である。

ここで種々の文法的形で用いられる語句“抗体分子”は、無傷免疫グロブリン分 子及び免疫グロブリン分子の免疫的に活性な部分両方を意味する。

典型的抗体分子は、無傷免疫グロブリン、実質上無傷の免疫グロブリン、そして パラトープを含む免疫グロブリン分子の、当業者にはＦａｂ、Ｆａｂ’　。

Ｆ（ａｂ’）２及びＦ　（Ｖ）として知られる部分を含む部分である；これらの 部分はここに記載の治療法に好適に使用される。

抗体分子のＦａｂ及びＦ　（ａｂ’　）　２部分は、公知の方法によって、実質 上無傷の抗体分子でパパイン及びペプシンそれぞれの蛋白分解反応によってつく られる。参照例；テオフイ０ポラスＱｈｅｏｌｉｌｏｐｏｌｏｕｔ）らの米国特 許第４３４２５６６号（ここに記載の技術の開示は引例によってここに挿入され る）。Ｆ　ａ　ｂ’抗体部分も公知てあり、Ｆ　（ａｂ’　）　２部分から作ら れ、その後メルカプトエタノールの場合のように２個の１１鎖をつなげるジスル フィド結合を還元し、その後生成した蛋白質メルカプタンをヨードアセタミドの ような試薬でアルキル化する。無傷抗体分子を含む抗体はここでは好適である。

種々の文法的形で用いられる語句“モノクローナル抗体”は、特定の抗原と免疫 反応することができる唯一種の抗体結合部位をもつ抗体を指す。こうしてモノク ローナル抗体は普通は、それが免疫反応する抗原に対する単一の結合親和性をあ られす。そこでモノクローナル抗体は、各々が異なる抗原に対して免疫特異的な 、複数の抗体結合部位をもつ抗体分子、例えば型持異的（キメラ）モノクローナ ル抗体、を含むことができる。

語句“実質上同時に（ｓｕｂｓｔａｐｌｉａｌ１７　ｓｉｍｕｌｌａｎｅｏｕｓ ｌマ）　”はここでは、同一結果を生み出すのに十分な時間的範囲を意味するた めに用いられる；例えば抗生物質投与の結果おこる細菌溶解と、ここに記載され る抗オプソニン抗体、ペプチド類似体、又はそれらの準組み合わせ又は組み合わ せによる細菌溶解の結果としての敗血症症状の改善又は予防。

語句“薬物学的に容認される”は、ヒトに投与したときに、生理的に耐えら担普 通はアレルギー反応又は類似の不都合な反応、例えば胃障害、めまいなどをおこ さない分子全体及び組成物を指す。

語句“治療的有効量”は、ここではＴＮＦの血中濃度の臨床的に著しい変イ獣又 は敗血症性ショックのその他の特徴、例えば血圧上昇、発熱又は白血球数増加な どを阻止、好適には最低約３０％減少、より好適には最低５０％減少、最も好適 には最低９０％減少させるのに十分な量を意味するために用いられる。

一義的観点において、本発明は、新しく発見された特殊の因子　−以後オプソニ ンと呼ぶことにする　−の分離並びに同定に関するものである。この因子は血清 又は血漿中に存在することが判明し、例えばリボ多糖（Ｌ　Ｐ　Ｓ）のような侵 襲的刺激物を伴うことを特徴とするスチミュレーター物質、例えば細菌、ウィル ス、ある種の腫瘍、原生動物及びその他の毒素、例えば内毒素、又は特発性状態 などと５単球、マクロファージ細胞及び多形核白血球との結合に関与する。

出願人によるこれまでの研究では、血清蛋白質、ＬＢＰ、がＬＰＳ被覆赤血球に 結合し、ヒトマクロファージ上の抗原ＣＤ１４へのそれらの結合を仲介し、こう して形成されたマクロファージ−ＬＰＳ複合体はそれはそれで、侵襲的刺激物に 対して宿主を仲介し動員するようにみえる成る種の因子、例えばＴＮＦの合成を 活発にすることがわかった。ＬＰＳ及びＣＤ１４に結合し、それによってこの異 化的反応を開始する能力をもった別の血清蛋白質が存在するかどうかを確認する ために、ヒト血清を分画化し、各フラクシヨンについてＬＰＳ被覆赤血球とマク ロファージとの相互作用を仲介する能力を分析した。ここに示されるこの研究の 結果は、ここで１セブチプと名付けられるＬＰＳ結合オプソニンの発見である。

前に述べたように、このオプソニンはその一義的確定的特徴としてリボ多糖に結 合し、単球、マクロファージ細胞及び多形核細胞上のレセプターによって識別さ れる複合体を形成することができる、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定して約 ９０　ｋｄの見かけ分子量をもつ、純粋な形の蛋白質を含んで成る。

より詳細に述べるならば、発明のオプソニンは、現在、プロテアーゼとこのよう なプロテアーゼのための基質との複合体から成ることが確認されている。この確 認は、オプソニンとＬＰＳとの相互作用並びにＣＤ１４に結合し得る複合体の生 成を含むプロプアーゼ　カスケードに関与するとするオプソニンのここに記載の 特徴づけと矛盾しない。このオプソニンは約９３キロダルトン（ｋｄ）の見かｌ ノ分子量をもつようにみえるが、オプソニンを構成すると考えられるそれぞれの 成分へのこの分子量の正確な分布はまだ部分には明らかにされていない。このプ ロテアーゼ　−　それは蛋白質Ｃインヒビター（ＰＣＩ）と構造的に若干似てい るようにみえる　−　のための基質はセルビン科の血漿蛋白質であることが理論 づけられている。しかしながら、蛋白質Ｃインヒビターを用いた実験ではこのよ うな活性の類似性は示されなかった。複合体分子の活性源をその推定的前駆体成 分から解明しようとする試みにおいて、プロテアーゼ（１種類又は複数種類）と 基質との相Ｌｊ作用の研究がさらに続けられる。

発明のオプソニンがプロテアーゼとこのようなプロテアーゼの基質との複合体で あることか確認された結果と（７，て、いくつかの実験は、オプソニンの活性が プロテアーゼインヒヒクーの作用によって阻害されることを明らかに（７た１、 より詳細に述・＼るならば、いくつかのプロテア−ぜ、インヒビターを調べ、ア ンチパイン、ロイペブヲ′ン、ヘンザミジン、キモスタチン、ペプスタチンＡ１ アプロチニン及びこれらの混合物から成る群から、発明のＡブソニンに抵抗する 活性を示組インヒヒターを選択側る。よって、このオ、ｆソニンの作用を阻１１ −する方法及びこのような方法か関係するあらゆる診断的−又は治療的有用性は 、記載のプロテアーゼ（二１−ヒターの投与又は適用（場合により）から成る。

本オーｆ゛へ丁舅よその他の確定的特徴を有する；なかでも、それは正常血清中 に高濃度に存αし、リボ多糖に反応した単球によるＴＮＦ合成を高める。また、 本オブノニシがリボ多糖と複合体を形成するとき、それは多形核細胞活性を刺激 し、寥形核細胞の内皮への付着を促進し、付着分子ＣＲ３の表現を高まるように 調節（−１十Ｍ【２多形核細胞の脱顆粒をおこす。

本オプソニンのその他の特性とＬで、オプソニンが、ますＲ初に、脂質ＩＶａと し゛こ加らオｔているリボ多糖の生白ｂ〜前駆体と結、ＡｉＬＣ複八体をへ成４ る場へ１、−は。

オブ゛／ニノはレセプターＣＤ１４に結合するこ吉はてきない。

本発明は、敗血症の症状の−−−一つ以上、特に、血中ＴＮＦｆｉ度の一過性上 昇点関連した症状、例えば発熱、低血圧、好中球減少、血小板減少、ショック及 び多臓器不全などを治療及び／又は予防する方法に関するものである。このよう な治療を必要とする患者としては、グラム陰性菌感染、ヘビ毒中毒、肝不全など に起因する例えば内毒素血症などの毒血症のリスクのある患者、又はこれにかか っている豐者がある。その他に、ダラム陽性菌、ウィルス又は真菌感染症をもつ 若干の患者は敗血症の症状を呈し、本発明の治療法が効くかも知れない。特に本 発明の利益を受け得る患者は、（ｐ辻１．Ｗ叩町旦１ｏｓリル世（１、川−リ１ すｌ　ｍｅｎｉｎｇ山ｄｅ＋、ブドウ状球菌、又は肺炎双球菌に感染した患者で ある。敗血症のリスクのある患者としては、火傷患者、銃弾による傷を受けた人 々、化学的毒物又は薬物乱用による腎−又は肝不全にかかっている人々がある。

こうして一実施態様において、本発明は、敗血症の一つ以上の症状を改善する方 法であって、このような治療を必要とする患者に治療的有効量の抗オプソニン抗 体を投与する方法を考慮する。活性成分としてここに用いられる作用物質の好適 な治療的有効量は、以下に述べる治療的有効量を含む。血中ＴＮＦ濃度の臨床的 に顕著な増加とは、最低的２５　ｐｇ／ｍｌに至る増加である。血中ＴＮＦ濃度 の測定法は当業者には公知であり、特に好適な方法がここに記載される。

正常な健常者又は実験動物のＴＮＦ濃度は約１０　ｐＩ！／ｍ１以下、すなわち 大部分の敏感なＴＮＦ分析法の検出限界値である、と推定されることに注目しな ければならない［ミチー（Ｍｉｃｈｉｅ）ら、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、１．　Ｍｅｄ 、　３１８巻、！４１１１−１４８６ページ（１９８１１）　：７シソン（Ｍａ ｌｈｉ＋ｏｎ）ら、１．　Ｃｌ１ｎ、ＩｎｖｅｔＬ　８１巻、１９２５ページ（ １９８ｇ）；’７−グ（Ｗｕｇｅ　）ら、Ｌａｎｃｅｔ、　１巻、３５５−３５ ７ベージ（１９８７）　］　。Ｌ　ＰＳにさらした後、ＴＮＦ濃度は１０−２０ 倍上昇して４０１１　ｐｇ／ｍｌのレベルに達することが判明した（上記参照） 。最近、グラム陰性、ＬＰＳ含有髄膜炎菌感染症において、血清ＴＮＦ濃度と致 命的結末との間によい相関性が証明された［ワーブら、ＬａｎｃｅＬ　１巻、３ ５５−３５７ページ（１９８７）　］、さらに、ヒト以下の（＋ｕｂｔ＋ｕｍｍ ｎ）Ｍ貝類を用いる敗血症の動物モデルにおいて、同様なＴＮＦ増加が認めら枳 これらの変化は致死率と直接相関していた［トレイシー（Ｔｒａｃｅｙ）ら、Ｎ ａｔｕｒｅ、　３３０巻、６６２−６６４ページ（１９８７）　］。

以前述べたように、オプソニン又はその結合パートナ−１又はオプソニンに対す る類似性又は拮抗性を示し又はその産生をコントロールするその他のリガンド又 は作用物質は、適した担体と共に、組織感染又はその他の病的破壊をもつ患者に 種々の手段によって投与するための効果的な強度をもつ医薬組成物としてつくら れ、それらを治療する。種々の投与法が用いら札そのなかには、軟膏としての局 所的適用法、又は外科的又はその他の局所的適用法、例えば外科的スポンジ、包 帯、ガーゼパッドなどがある。また、このような組成物は皮下−１静脈−及び腹 腔注射などの非経口的方法によって投与される；からだの創傷領域を洗う洗浄液 への添加、カテーテル化なども含まれる。オプソニンの平均用量には変動があり 、特に、資格のある医師又は獣医の指示及び処方に基づいて定めなければならな い。　また、ポリクローナル及びモノクローナル抗体両方を含む抗体、及びオプ ソニンの産生又は活性を調節する薬剤はいくつかの治療的応用を有し、そのため 、オプソニンの作用に帰せられる感染後の影響、例えば炎症及び発熱などを治療 する目的に使用される。特に、そのオプソニンを用いて、例えば融合マウス膵臓 リンパ球及び骨髄腫細胞を用いるハイブリドーマ法のような公知の方法で、種々 の細胞メジウム中でオプソニンそのものに対するポリクローナル及びモノクロー ナル抗体を産生ずることができる。適した抗体は、このオプソニン並びにそのオ プソニンのわかっている成分部分、すなわちプロテアーゼ及び／又はその基質を 生ぜしめるプロテアーゼカスケードの一成分に対して産生される抗体にも及ぶ。

よってこれらの抗原のいずれかに対する抗体はオプソニンの合成及び／又は活性 を妨害し、それによってその作用を阻止又は遮断する。

ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の一般的作成法は公知である。永久的 抗体産生細胞系は、融合以外の方法、例えば腫瘍原性ＤＮＡによる８９２８球の 直接的形質転換、又はエプスタイン−パール（Ｅｐｓｌｅｉｎ−ＢｉＩｒ）ウィ ルスによるトランスフェクションなどによっても作り出される。参照例；シュラ イニル（ＭＳｃｌ＋＋ｅｉｅ＋）らの−ハイブリドーマ技術（Ｈｙｂ＋ｉｄｏｍ ａ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）　”　（１９８［１）　：ハマーリング（Ｈａｍｍ ｅ＋ｌｉｎｇ）ら、　“モノクローナル抗体及びＴ−細胞ハイブリド−７（Ｍｏ ｎｏｃｌｏｎａｌ　ＡｎｔｉｂｏｄｉｅＳＡｎｄ　Ｔ−ｃｅｌｌ　Ｈｙｂ＋ｉｄ ｏｍａｓ　）　”　（１９８１）　；ケネ・ソト（Ｋｅｎｔｔｌ）ら、　“モノ クローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　）　”　（１ ９８０）　；米国特許第４３４１７６１号；第４３９９１２１号；第４４２７７ ８３号：第４４４４８８７号；第４４５１５７０号；第４４６６９１７号；第４ ４７２５００号；第４４９１６３２号；第４４９３８９０号も参照。

オプソニンペプチドに対して産生ずるモノクローナル抗体のパネルを種々の特性 、すなわちイソタイプ、エピトープ、親和性など、についてスクリーニングする ことができる。特に興味深いものは、オプソニンの活性を中和するモノクローナ ル抗体である。このようなモノクローナル抗体はオプソニン活性アッセイで容易 に確認される。高親和性抗体は、自然の又は組換えオプソニンの免疫アフィニテ ィー精製のためにも有用である。

本発明の治療的方法に用いられる抗オプソニン抗体は、好適にはアフィニティー 精製ポリクローナル抗体である。より好適には、抗体はモノクローナル抗体（ｍ Ａｂ）である。さらに、ここで用いられる抗ＣＤ１４抗体分子がＦａｂ％Ｆａｂ ’　、Ｆ　（ａｂ’　）　２又はＦ　（Ｖ）部分又は全抗体分子の形であること が好適である。

好適モノクローナル抗体は、オプソニンに対して、上記のハイブリドーマによっ て作られたもの（モノクローナル抗体）に類似の免疫反応性を示す。ここに種々 の文法的形で用いられる用語“免疫反応性”とは、与えられた量の抗体と与えら れた量のオプソニン抗原との間の免疫反応を５０％阻止するのに必要な抗原濃度 を指す。すなわち免疫反応性とは、０５のＢ／Ｂ、値に達するために必要な抗原 濃度である。ここでＢ。は競合抗原が存在しない場合に結合する抗体の最大量で あり、Ｂは競合抗原の存在時に結合する抗体量である；ＢｏもＢもバックグラウ ンドを調節しである。ロバード（Ｒｏｂｇｒｄ）　、Ｃｌｉ、　Ｃｈｅｗ、、２ ０巻、＋２５５−１２７０　（＋９７４）参照。

もう一つの特殊の実施態様において、本発明の治療法は、治療的有効量の抗オプ ソニン抗体、好適にはアフィニティー精製ポリクローナル抗体、より好適にはｍ Ａｂを投与することから成る。さらに、ここで用いられる抗オプソニン抗体分子 はＦａｂ、Ｆａｂ’　、Ｆ　（ａｂ’　）ｚ又はＦ　（Ｖ）部分又は全抗体分子 の形であることが好適である。好適には、投与する抗オプソニン抗体の量は、敗 血症の少なくとも１症状を示す患者において血中ＴＮＦ濃度の臨床的に顕著な増 加を引き起こすオプソニンーＬＰＳｌｊｉ合体を最低的３０％、より好適には最 低８０％減らすのに十分な量である。前に述べたように、この方法の利益を受け 得る患者としてはグラム陰性菌感染の結果として内毒素血症にかかっている患者 が含まれる。オプソニンを分離し、抗オプソニン抗体を誘導する方法、及び抗オ プソニン抗体がもつ、オプソニンーＬＰＳ複合体とＣＤ１４との結合を阻止し、 それによってオプソニン誘導性ＴＮＦ分泌を阻止する能力を測定し、最適にする 方法はすべて、当業者には公知である。

ポリクローナル抗ポリペプチド抗体の製法は当業者には公知である。ネスター（ ＮｅｔＩｏ＋）らの米国特許第４４９３７９５号参肌普通は、有用な抗体分子の Ｆａｂ。

及び／又はＦ（ａｂ”）２部分を含むモノクローナル抗体は、引例によってここ に挿入される“抗体＝実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ　Ｌａｈｏ …ｏ＋ｙ　Ｍｕｕｉｌ）”（旧ｌｏｗ　＆　Ｌａｎｅ編集、コールドスプリング 　ハーバ−研究所、ニューヨーク（＋９１１８）　）に記載されているハイブリ ドーマ法を用いてつくられる。つまり、モアフクロ−ナル抗体組成物を生産する ハイブリドーマを作り出すために、骨髄腫又はその他の無際限に永続し得る細胞 系を、ＣＤ１４又はそのオプソニン結合部分、又はオプソニン又はそのＣＤ１． ４結合部分で高度免疫した哺乳動物の膵臓から得たリンパ球と融合する。骨髄腫 細胞系は、リンパ球と同じ種からのものであることか好適である。一般的には、 系統１２９　ＧＩＸ＋のマウスが好適哺乳動物である。本発明に使用する適Ｉ− たマウス骨髄腫としては、ヒボキサンチン−アミノブチ’ｌンー４−ミ９ン感受 性（ＨＡＴ）細胞系　Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ１１．６５３　、及ＩＪＳｐ２ｉ’０− Ａｇ１４がある。これらは、それぞれＣＲＬＩ５８０及びＣＲＩ、１５８１の名 称て、アメリカ培養コＬツクジョン（ロツクヴイル、ＭＤ）から入手できる。

一般的には稗細胞を、ポリＪ−千１ノングリコール（ＰＥＧ）６ｆｌＨを用いて 骨髄腫細胞と融合４−る。融合・入イブリドを、ＨＡ　Ｔに対する感受性によっ て選択する。

本発明の￥施のために有用なモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを、 ＣＤ　１４又は本オーｆ゛、）ニンと免疫反応する能力及び１．、　Ｐ　Ｓ誘導 性ＴＮＦ分泌を阻ｌトする能力によ〕で！；１１認する。

本発明の実施において有用なモノクローナル抗体は、適切な抗原特異性をもつ抗 体量ｐを分泌するハイブリドーマを含む栄養培地から成るモノクローナル　ハイ ブリト−マ培養を開始することによって生産される。培養は、ハイブリトーマか 抗体分子を培地に分泌するのに十分な条件下で、部分な時間続けられる。それか ら抗体含有培地を集める。その後公知の方法で抗体分子をさらに分離する。

これら組成物の生成に有用な培地は当業者には公知であり、市販もされており、 合成培養培地、同系交配マウスなどがある。典型的合成培地は、４．５ｇｍハグ ルコース２０ｍｍグルタミン、及び２０％ウシ胎児血清を補充したダルベツコ最 ｌ」泌須培地（ＤＭＥＭ；ダルベツコら、Ｖｉｔｏｌ、、８巻、３９６ページ（ ＋０５９１）である。

典型的同系交配マウスはＢａ１ｂ／ｃである。

モノクローナル抗オプソニン抗体の製法も当業者には公知である。ニマン（Ｎｉ ｍａｎ　）ら、Ｐ＋ｏｃ、Ｎ［１，＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８０巻、４９４ ９−４９５３　（＋９８３）参照。

典型的には、抗ＣＤ１４モノクローナル抗体をつくるための既述の方法により、 本オプソニン又はペプチド類似体をそれだけで、又は免疫原担体に結合させて、 免疫原として用いる。ハイブリドーマを、オプソニンペプチド類似体及び本オプ ソニンと免疫反応する抗体を作り出す能力についてスクリーニングする。

敗血症症状のリスクのある患者又はその症状を呈する患者は、これらの症状を予 防又は改善する当業者に公知の治療処置の適用によって利益を受け得る。こうし て、本発明は、治療的有効量の抗オプソニン抗１体、オプソニンペプチド類似体 、これらの準組み合わせ又は組み合わせを、敗血症症状を予防又は治療すること がわかっている処置の治療的適用と実質上同時に与えるこ々に関する。例えば、 抗ＴＮＦ抗体及び／又はＴＮＦ拮抗物質の使用などによって敗血症におけるＴＮ Ｆの役割に直接又は間接に王渉することが、敗血症症状を予防又は改善し得る。

活性成分、例えばトレイシーら（Ｎａｌｕｅ、　３３０巻、６６２−６６４ペー ジ、＋９８７）が記載１７たものと一致するＴＮＦに免疫学的特異性をもつモノ クローナル抗体など、として、抗ＴＮＦ抗体を使用することが特に好適である。

同様に、本発明の治療法は、例えばコルチゾル、ヒドロコーチシンなどのステロ イドと実質上同時に治療することをも含む。

敗血症の症状を呈している患者は、普通は抗生物質、典型的にはゲンタマイシン のようなアミノグリコシド又はペニシリンのようなベーターラクチムなどで治療 する。こうして、好適治療法は、治療的有効量の抗オプソニン抗体、ペプチド類 似体又はここに記載されるそれらの準組み合わせを、殺菌量の抗生物質と実質上 同時に投与することを含む。ここに用いる語句“殺菌量”は、治療を受けている 川石において血中殺菌濃度に達するのに十分な量を意味する。一般に人に安全に 投与することができると考えられる抗生物質の殺菌量は当業者には公知であり、 抗生物質により、また治療する細菌性感染症の種類によって変化する（これも当 業者には公知である）。

好適実施例において、抗オプソニン抗体、ペプチド類似体又はここに記載のこれ らの組み合わせの投与は、抗生物質投与の約４８時間以内、好適には約１２−３ ６時間以内、より好適には約２−８時間以内、最も好適には抗生物質投与と実質 上同時に行われる。

本発明の実施において有用な抗生物質としては、“医者の参考書（ｔｈｅ　Ｐｈ ｙｓｉｃｉａｎ＋’　Ｄｅｓｋ　Ｒｅ１ｅ＋ｅｎｃｅ　）　”　（ｈｌｌ　Ｂ、 　Ｂ　編、メディカル　エコノミックス　カンパニー社、オラデル、Ｎ、１．、 １９８９）に記載の処方をもつ抗生物質、抗菌剤及び抗敗血症剤がある。その他 の実施例では、本発明は、治療的有効量のＣＤ１４、好適にはＬ　Ｐ　Ｓ−オプ ソニン複合体に結合するＣＤ１４の可溶性部分をそれだけで、又は治療的有効量 の抗ＴＮＦ抗体、抗オプソニン抗体及び抗生物質と準組み合わせて、又は組み合 わせて投与することに関する。ＣＤ１４を規定する（ｃｏｄｉｎｇ）ｅＩ）ＮＡ 及び推定されるその７’ミノ酸残基配列は当業者には公知である。参照：ゴヤー ト（Ｇのｙｅｓｔ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３９巻、４９７−５００ページ（＋ ９８１１）　；フエレロ（Ｆｅ＋＋ｅ＋ｏ　）ら、ＮｌＩｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ｓ、１６巻、４１７３ページ（＋９８１１）　；バジル（Ｂｉｔｉｌ　）ら、Ｆ 、ａｔ、１．　１ｍｍｎｎｏｌ、１６巻、＋５１１３−１５８９　（１９８６） 。

本発明はさらに、本発明の治療的方法の実施において有用な治療組成物にも関係 する。■−な治療組成物は１、混合物の形で、薬物学的に容認される賦形剤（担 体）皮び、ここて活性成分りして記載されている抗オプソニン抗体、又はそのポ リペプチド類似体の一つ以上を含む。好適実施例において、組成物は、ＬＰＳと 本オプソニンとの結合又はＬＰＳ−オプソニン複合体とＣＤ１．４との結合どち らかを阻ＩＩユするこ３１がてきる抗体又は抗原を含んで成る。考えら第１る抗 原性拮抗物質は脂１ｉＩＶａである。

もう一つの好適実施例において、組成物は、Ｌ　Ｐ　Ｓ−オプソニン複合体とＣ Ｄ１４との結合を阻１トする抗オプ゛ｌニン抗体、好適にはｍΔｂを含む。好適 治療組成物はその他に本発明の抗オプソニン抗体の有効量と、下記の活性成分の 一つ以上を含む：抗生物質、ステロイド、及び抗ＴＮＦ抗体、ＴＮＦ拮抗物質。

典型的処方を下に記す： ゲンタマイシン（硫酸塩）４０ 抗オプソニン抗体　１０ 重硫酸ナトリウムＵＳＰ　３．２ ＥＤＴＡ二ナトリウム　ｔｌｓＰ　０．１注射用水を適宜加えて　１．Ｏｍｌと する抗ＴＮＦ抗体　１０ 抗オプソニン抗体　１０ 重硫酸ナトリウムυＳＰ　３．２ ＥＤＴＡ二ナトリウム　ｌｌ５Ｐ０．１注射用水を適宜加えて　１．Ｏｍｌとす るもう一つの実施例において、本発明は薬物学的に容認される担体中にＣＤ１． ４又はそのオプソニン結合可溶性部分を含む治療組成物を考慮する。好適には組 成物はさらに抗ＴＮＦ抗体、抗オプソニン抗体及び抗生物質の一つ以上を治療的 有効濃度で含む。

活性成分と１．てポリペプチド又は抗体分子を含む治療組成物の製法は当業者は よく理解している。一般的にはこのような組成物は注射薬として液体溶液又は懸 濁液の形でつくられるが、注射前に液体に溶解又は懸濁するために適した固体形 も製造される。製剤は乳濁液でもよい。活性治療成分は、薬物学的に容認され、 活性成分と相客れる賦形剤と混合する場合が多い。適した賦形剤は例えば水、食 塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど及びそれらの組み合わせ である。その」二、所望ならば、組成物は少量の補助物質、例えば活性成分の効 果を高める湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤などを含むことができる。

治療組成物はポリペプチド又は抗体を、中和された薬物学的に容認される塩の形 で含むことができる。薬物学的に容認される塩としては、酸付加塩（ポリペプチ ド又は抗体分子の遊離アミノ基で形成される）、及び例えば塩酸又は燐酸のよう な無機酸、又は酢酸、蓚酸、酒石酸、マンダル酸などのような有機酸で形成され るものがある。遊離カルボキシル基から形成される塩は、例えばナトリウム、１ ）リウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化鉄などの無機塩と、例えばイソ ブ１１ビルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジ ン、ｆロカインなどの有機塩基とかりも誘導される。

治療用ポリペプチド−又は抗体含有組成物は一般的には、例えば単位量の注射に よって静脈内に投与される。本発明の治療組成物に関しで用いられる用語“単位 量”は、人に対する１回投与量として適した物理的に独立した単位を指し、各単 位は必要な希釈剤、すなわち担体又はビヒクルと共に所望の治療効果を与えるよ うに計算されたあらかしめ定められた量の活性物質を含む。

組成物は剤型に合ったやり方で、治療的有効量が投与される。投与すべき量は治 療すべき人、その友の免疫系の、活性成分を利用する能力、及びＣＤ１４又はＬ 　Ｐ　Ｓ−−オプソニン複合体の結合能力の所望の阻止−又は中和程度によって 決まる。投与し２なければならない活性成分の正確な量は、専門家の判断にゆだ ねられ、各人に特異的Ｃある。（７かしながら適切な用量範囲は、１−■体重１ キログラムあたり０１ないし２０、好適には約０５ないし約１０ミリグラム、そ してより好適には１ない１数ミリグラムの範囲であり、投与軽路に依存する。適 切な初期投与及び追加投与の形も種々様々であるか、初期投与後に、注射又はそ の他の投与法によ＝１．１時間以上の間隔−Ｃ反復投与するのが典型的である。

別法として、血中濃度をす／　、１−ルから１０μにの間に維持するのに十分な 連続静脈内注入も考慮される。

ここで用いられる“ｐｇ”はピコグラムを意味し、”ｎ！”はナノグラムを意味 し、■−又は１１ｇ“はマイクログラムを意味し、“ｍｇ“はミリグラムを意味 し、“ｕｌ”又は′μｍ”はマイクロリットルを意味し、ｍ１”はミリリットル を意味（７、”１゛はリットルを意味する。

さらに、オプソニン類似体は、本発明の範囲内で誘導されるオプソニンのヌクレ オチド配列からつくられるものとする。類似体、例えば断片、は例えばオプソニ ンのペプシン消化によってつくられる。その他の類似体、例えばムティン、はオ プソニン暗号づけ配列の標準的な特定部位の突然変異誘発によってつくられる。

“オプソニン活性”を示す類似体は公知のｉｎ　ｖハ１及び／又はｉｎ　ｖＨ＋ ｏア・ソセイによって確認される。

上記のように、オプソニンを規定する（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）　ＤＮＡ配列は、ク ローニングよりもむしろ合成的につくられる。そのＤＮＡ配列は、オプソニンア ミノ酸配列のために適したコドンでデザインされ得る。概して、その配列が表現 のために用いられる場合は意図する宿主のために好適コドンが選択される１、完 全な配列が、標準法によってつくられた重なり合う（オーバーラツプ）オリゴヌ クレオチドから集められ、完全な暗号づけ配列に組み立てられる。参照例；　Ｖ ｄＨｅ　Ｎｍ１ｕｔｅ。

２９２巻、７５６ページ（１９８＋）　；ナノベア（Ｎｘｍｂａｉ＋　）ら、５ ｃｉｅｎｃｅ　、　２２３巻、１２９９　（１９８４）　；ジエイ（ｌａｙ　） ら、１．Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５９巻、６３１１　（ｌＨ４）、。

合成りＮＡ配列は、オプソニン類似体又は゛１１テイゾを表現する遺伝子を好都 合に構成することができる。別法と１．て、ムティンを規定するＤＮＡは、自然 のオプソニン遺伝子又はｅＤＮＡの特定部位の突然変異誘発によってつくるこ古 ができる。そしてムティンは一般的ポリペプチド合成を用いて直接つくることが できる。

概して、特定部位の突然変異誘発を用いて、完全暗号づけ配列から類似体を作り 出すことができる。特定部位の突然変異誘発は、制限された不適当な組み合わせ を除き、突然変異を起こさせるべき一本鎖ファージＤＮＡに相補的なプライマー 合成オリゴヌクレオチドを用いて行われ、所望の突然変異をあられす。つまり、 合成オリゴヌクレオチドを、ファージに相補的な鎖の直接合成のためのプライ′ マーとして用い、生成した二重鎖ＤＮＡを形質転換１．て、ファージ担持宿主細 菌にする。形質転換した細菌の培養物を頂上寒天上で培養１２、ファージをもっ ている単一細胞からプラグを形成せしめる。

理論的には、新しいプラクの５０％が、−側鎖として突然変異型をもつファージ を含み、５０％が元の配列を有する。正しい一対のノ＼イブリダイゼーシコンは 可能とするが、元の一本鎖との不適当な組み合わせではハイブリダイゼーション を十分阻止するという温度で、生成１．たプラクとｋｉｎｏｅｄ合成プライマー とを／％イブリダイズする。そのプローブとハイブリダイズするプラクを取り出 し、培養し、ＤＮＡを回収する。

不自然アミノ酸を蛋白質に部位特異的に挿入する一般的方法は、ルン（Ｃｈ＋ｉ 山ｐｈｅ＋　Ｊ、Ｎｏｒｅｎ）　、アンソニーカヒル（Ｓｐｅｎｃｅｒ　１．　 Ａｎｌｌ＋ｏｎ７−Ｃｘｂｉｌ！　）　、グリフイア、　（Ｍｉｃｈｘｅｌ　Ｃ ，Ｇ＋ｉｌ目ｔｈ）　、シュルツ（Ｐｅｌｖｒ　Ｇ、５ｃｂｕｌｌｘ）、５ｃｉ ｅｎｃｅ。

２４４巻、１８２−１８８　ページ（１９８９４月）に記載されている。この方 法を用いて、不自然アミノ酸との類似体を作り出すことができる。

本発明は、本オプソニンによる影響を受けた活性を明るみに出すことによって、 侵襲性刺激の存在を検出する方法を含む、種々の診断的応用にも関係している。

既述のように、オプソニンを用いて公知の種々の方法によってこのものに対する 抗体を産生ずることができる。そしてこのような抗体はその後置離さね、疑いが もたれる哺乳動物宿主におけるオプソニンの存在の試験などに使用することがで きる。

オプソニンに対する抗体は、公知のハイブリドーマ法を含む標準的方法によって 産生され分離される。便利のためにオプソニンに対する抗体をここではＡｂ。

とし、その他の種に対して生ずる抗体をＡｂ、とする。

哺乳動物におけるオプソニン活性の存在は、このような測定に適用できる普通の 免疫学的方法によって確かめることができる。多数の有用な方法が知られている 。この種の、特に有用な三つの方法は、検出可能の標識をつけたオプソニンか、 検出可能の標識をつけた抗体Ａｂ、か、又は検出可能の標識をつけた抗体Ａｂ２ を利用する。これらの方法は下記の式にまとめられる、ここで星印は、粒子が標 識化されていることを示し、“Ｏｐｓ”はオプソニンをあられす：Ａ、Ｏｐｓ＊ 　＋　Ａｂ、＝　Ｏｐｓ＊Ａｂ。

Ｂ、Ｏｐｓ　＋　Ａｂ＊　＝　０ｐｓＡｂ、＊Ｃ，Ｏｐｓ　＋　Ａｂ＋　＋　Ａ ｂ２＊　＝　０ｐｓＡｂ、　Ａｂ２　＊これらの方法及びその応用はすべて熟練 せる当業者には公知であり、したがって本発明の範囲内で利用される。方法Ａ１ 　“競合的”方法、は米国特許第３６５４０９０号及び第３８５０７５２号に記 載されている。方法Ｃ１“サンドウィッチ”法、は米国特許第ＲＥ３１００６号 及び第４旧６０４３号に記載されている。もう−っの方法は、“二重抗体”、又 は“ＤＡＳＰ“法として公知である。

どの場合にも、炎症性オプソニンは抗体又は結合パートナ−の一つ以上と複合体 を形成し、複合体の１貝が検出可能の標識で標識化されている。複合体が生成し たという事実及び、もし所望ならばその量は、標識の検出のために適用できる公 知の方法によって確認することができる。

上記かられかるように、Ａｂ２の特徴的特性は、それがＡｂ、と反応することで ある。これは、−４乳動物種で生じたＡｂ、が別の種において抗原として用いら れ、抗体Ａｂ２を生成するためである。例えば、ヤギにおいて抗原として家兎抗 体を用いることによってＡｂ２が生成するかも知れない。したがってＡｂ、はヤ ギにおいて生成した抗家兎抗体である。この説明及び請求の目的で、Ａｂ、を− 次又は抗オプソニン抗体と名付け、Ａｂ、を二次又は抗Ａｂ、抗体と名付けるこ とにする。

これらの研究のために最もよく用いられる標識は放射性元素、酵素、紫外線にさ らされたときに蛍光を発する化学物質などである。

多数の蛍光物質が知られており、標識として利用される。これらには、例えば、 フルオレッセイン、ローダミン及びオーラミンがある。特殊な検出物質は、ヤギ においてっくられ、イソチオシアネートによってフルオレッセインと結合した抗 家兎抗体である。

オプソニン又はその結合パートナ−も放射性元素又は酵素で標識化され得る。

放射性標識は、現在使用できるカウンティング法のいずれかによって検出できる 。

好Ｊ同位体＋１”Ｃ，”’　Ｉ、３　Ｈ，＋２９　Ｉ及び′５ｓから選択サレル 。

酵素標識も同様に有用であり、現在用いられる比色法、分光光度法、蛍光分光光 度法又はガス分析法のいずれかによって検出できる。酵素は、架橋分子、例えば カルボジイミド、ジイソシアネート、ゲルタールアルデヒドなどとの反応によっ て、選択された粒子に結合する。これらの方法に用いることができる多くの酵素 は公知であり、利用できる。ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ −グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシ ダーゼ＋ペルオキシダーゼ、及びアルカリホスファターゼが好適である。米国特 許第３６５４０９０号；第３８５０７５２号；第４０１６０４３号が、ソノ他の 標識材料及ヒ方法の開示のための実施例の形で参照される。

本発明によって開発され、利用される特殊のアッセイ系は、レセプターアッセイ として知られる。レセプターアッセイでは、分析すべき材料を適切に標識化し、 その後いくつかの細胞試験ロロニーを成る量の標識化及び未標識化材料と共に培 養し、その後結合試験を行って、標識物質が細胞レセプターに結合する程度を測 定する。この方法で、材料間の親和性の差が確認される。

よって、精製量のオプソニンを放射性標識化し、例えばＬＰＳと結合さ也その後 、例えば最近精製した好中球を用いて結合試験を行う。その後、種々の量の標識 化及び未標識オプ゛ノニンを含む溶液を調製し、細胞ザンプルを培養し、その後 代・キュベートする。生成した細胞単層をそれから洗い、可溶化し、標準誤差が 〈５％になるように十分な時間、ガンマカウンターでカウントする。これらのデ ータをスカチャード分析にかけ、物質の活性に関する考察及び結論を引き出すこ とができる。以上は例であるが、これは、分析する物質の細胞結合能力が［１特 性となる場合の、レセプターアッセイの実施法及び利用法を説明するものである 。

本発明のもう一つの実施Ｌ！？Ｉｌｌにおいて、医学的専門家が使用するために 適した市販の試験キット・が用意され、疑いのある哺乳動物宿主にオプソニンが 存在するかし、ないかを調べることができる。上に述べた試験法により、成る種 類のこのような試験キットは少なくとも標識オプソニン又はその結合パートナ− １例えばそれに特異的な抗体を含み、もちろん、選択される方法、例えば“競合 的”、“サンドウィッチ”、　“ＤＡＳＰ”などによって異なる説明書を含む。

キットは、緩衝剤、安定剤などのあまり重要でない試薬も含むかも知れない。

よ１て、試験キットは、侵襲性刺激に対する哺乳動物宿主の反応を表すためにイ １成され、 （ａ）本オプソニン又はその特異的結合パートナ−を検出可能の標識に直接又は 間接に結合することによって１）られる少なくとも一つの標識化された、免疫化 学的反応性をもった成分のあらか（−１め定められた量と：（ｂ）その（［１１ の試薬と、 （ｃ）ｌ記ギットの使用説明書 とを含んでなる。

より詳細に述べるならば、診断的試験キットは、（ａ）概ね固体相に結合して免 疫吸着剤を形成するか、又はその代わりに、適した標識（ｔｚｇ　）　、又は複 数のこのような最終産物に結合する上記の既知量のオプソニンなど（又はそれら の結合パートナ−）と（ｂ）必要ならばその他の試薬と、 （ｃ）上記試験キットの使用説明書 とを含んでなる。

また別の形では、あらかしめ定められたプロトコール（例えば“競合的”、“サ ンドウィッチ”、　“二重抗体”など）にしたがって操作さね、（ａ）オプソニ ンを検出可能の標識に結合することによって得られた標識成分と、（ｂ）一つ以 上の付加的免疫化学的試薬であって、そのうち少なくとも一つの試薬はリガンド 又は固定リガンドで、そのリガンドは（１）標識成分（ａ）と結合できるリガン ド：（１１）標識成分（ａ）の結合パートナ−と結合できるリガンド：（ｉｉｉ ）測定すべき成分の少なくとも一つと結合できるリガンド；（１ｖ）測定すべき 少なくとも一つの成分の結合パ・−１−ナーと結合できるリガンドから成る群か ら選択されるものである 免疫化学的試薬と、 （Ｃ）オプソニンとその特異的結合パートナ−との免疫化学的反応の−っ以上の 成分の検出及び／又は確認のためのプロトコールを実施するための説明書から成 る試験キットが上記の目的のために作成、使用される。

上記により、オプソニン活性を効果的に調節する可能性のある薬剤をスクリーニ ングするためのアッセイ系が作成される。オプソニンは細胞試験系、例えば１０ ０　ｐｇ／ｍｌ　ＬＰＳをもっ好中球に導入され、見込みのある薬剤も生成した 細胞培養物中に導入される。その後培養物を試験して、見込みのある薬剤のみの 添加による、又は既知オプソニンの添加量の影響によるオプソニン活性の変化を 観察する。

より詳細に述べるならば、試験細胞、例えばオプソニンとＬ　Ｐ　Ｓとの複合体 に対するｌノセブターを有する細胞系ＴＨＰ１、のコロニーを、オプソニン及び ＬＰＳを含む培地に培養することによって薬物アッセイを行うことができる。生 成した培養物に被験薬剤を加え、その後オプソニンと試験細胞上のレセプターと の反応性を測定し、その見込みのある薬剤がオプソニンとＬＰＳ又はレセプター との結合を阻止する活性をもつかどうかを調べることができる。

下記の実施例は本オプソニンの分離及び確認の詳細を示し、その活性について記 載される観察結果は、本オプソニンと、出願人及びこの分野のその他の人々が以 前確認した因子との違いも類似性も明らかにする。当然この後に示される特殊な 材料及び方法は、例に過ぎず、変更可能であり、したがって下記は例証的であっ て、本発明を制限するものではない。

出願人によるこれまでの研究は、血清蛋白質、ＬＢＰ、がＬＰＳ被覆赤血球に結 合し、それらとヒトマクロファージ上のＣＤ１．４との結合を仲介することを示 した。Ｌ　Ｐ　Ｓ及びＣＤ１４に結合する能力をもった別の血清蛋白質が存在す るがどうかを調べるために、ヒト血清を分画化（７、各フラクションについて、 ＬＰＳ被覆被覆赤血球ダマクロファージ相互作用を仲介する能力を分析試験した 。

ヒト血漿及び血漿の分画化勺ンプルを１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＰＢＳで希釈し 、Ｌ　Ｐ　Ｓ被覆赤血球（Ｅ　Ｌ　Ｐ　Ｓ）及び既述のヒトマクロファージと共 に、Ｏ’Ｃで１５分間インキュベートし、それからさらに２０℃で１５分間イン キュベー１−ｔ、た。赤血球とマクロファージとの結合を（１着指数、食細胞１ ００個に結合した赤血球数、として数字であられした。

！３科恢Ｃ！寿凄 新鼾凍結ヒト血漿（グレーターニューヨーク血液センター）２５０ｍｌを２　ｍ ＭＥＤＴＡと一緒にし、圧縮（ｐａｃｋｅｄ）　、平衡化した、ＢｉｏＲｅｘ　 ７Ｇ樹脂１５ｍ１と共に４℃で一晩攪拌した。その樹脂を２回洗い、カラムに充 填した。溶出は、緩衝液Ａ（５０１１１１１１リン酸塩、ｐ１４７．３．４０ｍ ＭＮａＣ＋、２　ｍＭ　ＥＤＴＡ）Ｉｎｍｌで洗い、その後緩衝液Ｂ　（１，Ｑ 　Ｍ　ＮａＣｌを含む緩衝液Ａ１図１参照）を混合（また緩衝液への勾配によっ て溶出を行った。付加的研究は、ヘパリン−セファロースがセプチンに結合する こと、及びセブチンが塩化ナトリウムによって溶出することを示した。この処理 法において、ヘパリン−セファロースを１ｌｉｏｉｌｅｘの代わりに使ってもよ い。

バイオアッセイで活性なフラクションを集め、２［１−トリス　ｐＨ８，５に対 して透析した。合一したサンプルをその後Ｍｏｎｏ　Ｑ　カラムに入れ、Ｏ−Ｉ 　ＭＮａＣｌの緩衝液の勾配で溶出した。活性をもつフラクションを再び集め、 電気泳動によって分析した。

嘘 ヒト血漿（又は血清）を１＝２０に希釈した場合、ＥＬＰＳとマクロファージと の結合を仲介する能力を分析試験すると顕著な活性が示された。Ｅ（赤血球−訳 者）がＬＰＳて被覆されていない限り、血漿はＥとＭＯとの結合に影響を与えな 力じた。そしてＥＬＰＳとＭＯとの血漿仲介性結合はすべて抗ＣＤ１．４ｍＡｂ 。

３Ｃ１０によって阻害された。こうしてこのアッセイは、ＬＰＳ及びＣＤ１４を 結合する分子を検出する。血漿がＥＬＰＳの結合を仲介する能力は、血漿をＢｉ ｏＲｅｘと共にインキュベートした後は完全に失われ、このイオン交換樹脂が血 漿から活性分子を定量的に吸着することを示している（データは示されてぃな（ す。

セプチンの分離 ＮａＣ１勾配でＢｉｏＲｅｘを溶出すると、二つの活性ピークがあられれた；第 一のピークは約２００絹ＮａＣ１に集中し、第二のピークは　＞　５００−　Ｎ ａ１ｌに集中する（図１）。第二のピークは報告されている通りのＬＢＰの溶出 特性を有し、この物質をＭｏｎｏＱでさらに精製すると、Ｉ−Ｐ　Ｂの特性をも った６０ｋｄ蛋白質が得られた。しかしながら、ＬＰＢは血漿の活性の４％以下 を占めるに過ぎなかった。血漿の活性の〉９６％を占める主ピークをさらにＭｏ ｎｏＱカラムで精製した。ＮａＣ１勾配で溶出すると、１９ＱＮａｃｌで１本の 活性ピークが生じた。スベロース（Ｓｕｐｅ＋ｏ＋ｅ’）　ＩＩＩサイジングカ ラムでさらに精製すると単一の分子種が分離した。我々はこの物質をセプチンと 命名した。セブチン希釈物の分析の結果、Ｍｏｎｏ　Ｑから溶出した物質は最初 の活性の１％以下を含むことがわかった。これは活性のかなりの喪失がＭｏｎｏ 　Ｑクロマトグラフィーでおこることを示している。

５ＤＳ−ＰＡＧＥＬＪ：る＋ブチ２ノ分析は、９０．０００　（±３．０００） ダルトンノ単一バンドを明らかにし九セブヂンはＥＬＰＳとマクロファージとの 非常に強い結合を仲介する。ｌＩｋ大結合のために必要なセプチン濃度は＜０． ０５μ！／ｍ１である。

これまでの研究は、匹敵する結合のためには１μｇ／ｍｌのＬＢＰが必要である こきを示シテイタ［ライト（Ｗｅｉｇｈ＋）ら、１．Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１７０ 巻、１２３＋−１２４１（１９８９）。

こうしてセプチンはＬ　Ｂ　Ｐより２０倍も強（ＥＬＰＳとマクロファージとの 相互作用を仲介する。

ＥＬＰＳとマクロファージとのセフチン仲介性結合はすべて、抗ｃＤ１４１１Ｉ Ａ１）、３Ｃ１Ｏ１ｌ：　Ａ　−Ｉ　ＴｕＪｌ止されル；コれｊ、ｔｃＤ１４が セブチンーＬＰＳ？ｊ！合体を識別する責任のあるレセプターであることを示し ている。セブチンにょるＥＬＰＳの前処理は付着をおこすが、マクロファージを セプチンで前処理しても付着はおきない、これはセブヂンがＬＰＳに結合し、Ｃ Ｄ１４がセブチンそのものでなくセプチンーＬＰＳ複合体を識別することを示し ている。

オプソニンであるセブチンがもっていると予想される活性の一つは、ＬＰＳ攻撃 のような侵襲性刺激に反応＋＝−ｒ：ＴＮＦを産生及び合成する単球の能力を促 進し、高めることである。この仮説を下記の実験によって確かめた。

そこで、単核細胞を新鮭ヒト血液がらＦｉｃｏｌｌ勾配で分離し、０．５　ｍｇ ／ｍｌのヒト血清アルプミ入　０．５　ｕ／ｍｌアプロチニン、及び指示量のＲ ｅ内毒素を含むＲＰＭＩ中に２ｘ＋０６細胞／ｍｌで懸濁した。１６時間のイン キュベーション後、上澄液のＴＮＦをサンドウィッチＲ１Δによって測定した。

結果を下記の表１に示す。

０　０．０？　０．２０ Ｑ、ＯＩ　Ｑ、Ｉｏ　０．８４ ０．０５　Ｇ、２０　１．３５ 上から、ＬＰＳによって促進されることが知られているＴＮＦ産生が、ＬＰＳ及 びセプチンの両方の存在によって明らかに高まることがわかる。１μｇ／ｍｌの セブチンのみではＴＮＦ産生は３倍になるが、同量のセプチンを０．０１　ｎｇ ／ｌｌ１ｆのＬＰＳと組み合わせると、同量のＬＰＳだけが存在する場合と比べ て８倍以上増加した。０．０５　ｎｇ／ｍｌ　Ｌ　Ｐ　Ｓと同濃度のセプチンが 存在する場合にも同様な増加がおこり、７倍以上の増加が認められた。

量のＣＤ１４がＰＭＮ上に表現されることを示唆している。ＰＭＮ上のＣＤ１． ４の表現は確認されており、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、ＧＳＣＰ、及びｆＮＬＬＰのような 脱顆粒化刺激によって２倍ないし３倍高く調節されることが示された。ＰＭＮ上 のＣＤ１４はＬＢＰ又はセプチンいずれかが存在する場合のＥ　Ｉ−Ｐ　Ｓの結 合を仲介することができ、表現を誘導する同し拮抗物質でＰＭＮを刺激すると結 合は２−ないし３倍増加する。

セプチンとＬＰＳとの複合体はＰＭＮを劇的に刺激する。重要な付着分子である ＣＲ３（ＣＤＩｌｂ／ＣＤ１８）の表現は、ＰＭＮをｌｎｇ／ｍｌ　ＬＰＳ−セ プチン複合体にさらすと高く調節されるが、セプチン（１μｇ／ｍｌ　）のみで も、５Ｂ／ｍｌと高濃度のＬＰＳでも、高い方への調節をおこさない（図２）。

ＣＲ３はＰＭＮの分泌顆粒内に存在し、したがってこれらのデータは、セプチン ーＬＰＳ複合体とＰＭＮ上のＣＤ１４との相互作用が脱顆粒化をおこすことを示 唆する。しかしセプチンーＬＰＳ複合体によっておきた脱顆粒化は明らかに完全 ではない、なぜならば強い拮抗物質、ＰＭＡ、を用いた平行研究は、ＣＲ３表現 の５倍の増加を示したからである（データは示されていない）。

ＰＭＮを指示濃度のセプチン及びＬＰＳ　（Ｒｅ）と混合し、内皮細胞の単層に 加えた。３７℃で１５分後、その標本を洗い、記載のように付着を測定した［口 （Ｌｏ）ら、１．　Ｅｌｌｌ、　Ｍｅｄ、　、１６９　：　１７７９−１７９３ 　（１９８９）　］　Ｉ結果を下表１１に示す。未刺激細胞の基礎的付着値が下 記のデータから差し引かれた。

表１１ ０．０５　１３５　３３９ Ｑ、　２ｔｌ　１３２　３３０ 動物の内毒素に対する反応における初期のできごとは、ＰＭＮの内皮への付着で ある。この付着能力も、セプチンーＬＰＳ複合体によっては促進されるが、セプ チン又はＬＰＳのみによっては促進されない（表ＩＩ）。ＣＲ３は、刺激された ＰＭＮの未刺激内皮への付着並びにＰＭＮとセプチンーＬＰＳ複合体とのインキ ュベーションを仲介する主要レセプターであるが、Ｃ３ｂ１−被覆赤血球との結 合を仲介するＣＲ３能力によってアッセイした場合のセプチン又はＬＰＳとＰＭ Ｎとのそれを仲介しない（図３）。ＰＭＮのその他の刺激物、例えばＰＭＡ又は ＩＬ−８はＣＲ３の同様な増加をおこす。そしてこれまでの研究は、レセプター 活性の増加が表面上のＣＲ３の数の変化によっても、存在するＣＲ３の結合活性 の変化によってもおきることを示している。その他の予備的研究は、強い付着反 応を起こす濃度のセプチンーＬＰＳ複合体が過酸化水素の放出を刺激しないこと を示している［Ｊ、Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、１０９巻、１３４１ページ（１９８ ０１］　Ｃデータは示されて刺激されたマクロファージの表面からのＣＤ１４の 喪失マクロファージのＬＰＳに対する反応の研究中に、１０％ヒト血清の存在下 でマクロファージにＬＰＳを添加するとマクロファージ細胞表面からＣＤ１４が 劇的に喪失することが発見された。その他の予備的研究は、その喪失は３時間ま でには終わり、たった０、　Ｉ　ｎｇ／ｍｌの量のＬＰＳによっておこることを 示している。この研究結果をもたらした実験を下に記す。

よって、表１１１に記した刺激物をテフロンビーカー中でヒト単球の４日間培養 物（１０％正常血清を含むＲＰＭＩ　１６４０）に加えた。さらに１８時間培養 した後、細胞を洗い、モノクローナル抗体及びフルオレッセインＦ（ａｂ）ｚで 染色し、ＦＡＣ５によって分析した。その結果も下表に示す：データは平均蛍光 強度として表される（直線スケール）。

表Ｉｌ＋ ＬＰＳに反応中のマクロファージからのＣＤ１４の喪失ＣＤ１４　５７０　２６ 　１１３８ ＣＤ１８　１７００　１６３６　１７８８ＨＬ　Ａ　２２９２　２４７２　２３ ９９−（ｃｔｒｌ）　２３　２０　２４ 検討 上記のデータによって示されるように、これらの研究は、ＬＰＳによる細胞反応 のシグナル化がＣＤ１４の喪失と関係していることを示唆する。表面ＣＤ１４の 喪失は、ＬＰＳによるシグナル化を必要とするようにみえる、なぜならば生物学 的に不活性なＬＰＳ類似体は喪失をおこさないからである。その喪失がＴＮＦを 含むオートクリン　ループによっておこることはありそうにない、なぜならばＴ ＮＦαはＣＤ１４の表現において減少でなく増加をおこすからである（表１川。

脂質ＩＶａと命名されたＬＰＳの生合成前駆体はＬＢＰ及びセプチンに強く結合 する（データは示されていない）。ＬＢＰと脂質Ｈａとの複合体もＣＤ１４に普 通に結合するようにみえる、というのは、ＭＯとのｈａｌｌ−ｍｇｘｉｍａｌＬ ＢＰ依存性結合のために必要な脂質ｌＶａ／赤血球の量がＲｅ内毒素の量と同じ だからである。

これに対して、脂質ＩＶａとオプソニン　セプチンとの複合体はＣＤ１４とは結 合せず、本オプソニンがＬＢＰとは異なることを示しており、脂質ＩＶａがセプ チン活性のインヒビターとしてはたらくことを示唆している。

また、脂ｊｉｌＶａはＴＮＦ合成の引金を引かない、そして最近の研究は脂質Ｉ Ｖａの添加がＲｅ内毒素に対して反応したＴＮＦ合成に強く拮抗することを示し ている。脂ｊｊｌＶａは表面ＣＤ１４の喪失をおこさないことが認められた；い くつかの実験ではそれは増加をひきおこした（多分、混入ＬＰＳの効果に拮抗す ることに精製セブチンをアルマゲルと混合し、家兎に注射した（４×）。免疫前 −及び免疫血清から得たＩｇＧを精製し、全ヒト血漿と混ぜた。免疫前１ｇＧは ＥＬＰＳとＭＯとの結合に影響をもたなかったが、抗セブチンはその結合を完全 に阻止１７た（表＋Ｖ）。この実験は、我々が阻止抗体を開発したこと、そして セプチンがｔ、ｐｓとマクロファージとの相互作用に非常に大きい貢献をする血 漿蛋白質であることを示している。

免疫＠　（１５０１１ｇ／ｍ１）４８Ｂ抗セブ千ン（１５０μｇ／ｍｌ）　２４ 抗体を血漿に加え、氷上二で５０分間放置する。それからサンプルを１１００に 希釈し、マクロファージ及びＥ　Ｌ　Ｐ　Ｓと混ぜる。その後赤血球のマクロフ ァージへの付着を測定し、た。

セブｆンをＳＤＳゲルからインモビロン上にプロットし、部分的アミノ酸配列汐 得た。この部分的配列は、官能基関連性蛋白質ＬＢＰ、ＢＰＩ又はＣＥＴＰとの 類似性を示さない。したがってセプチンの新規の性質が確認された。しかしなが ら部分的配列は、セルピン（＋ｅ＋ｉｎｅ　ｐ＋＊１ｅａｉｅ　１ｎｈｉｂｉｔ ｏ＋　）科の血漿蛋白質であるヒト蛋白’Ｈｃ、ｒンヒヒター（ＰＣｌ）の残基 に似ている。配列のこの類似性が、セブチンかｒ）ｃｉと同一物であるという仮 説を考虜するきっかけとな−）た。

１！８！Ｆ’ｃＩ及び二つのモノクローナル抗ＰＣＩ抗体がステンフロウ（Ｔｏ 、　Ｉｏｔ＋ａｐＳｔｅｎｆｌｏｖ　）　（スウェーデン）によって提供された 。精製ＰＣＩは、広い濃度範囲にわたって試験したとき、セプチンの生物学的活 性を全熱もっていなかった。

そしてモノクローナル抗ＰＣＩ抗体はセプチンを中和することも、セプチンのウ ェスターンプロットにおいて反応することもできなかった。こうして、セプチン は構造的には関連があるが、ＰＣＩとは別物であると考えられ、セルピン科の新 しいメンバーであるかも知れない。

結合蛋白質として作用するセルピン科のメンバーとしては先例がある。チロキシ ン結合グロブリン及びコルチコステロイド結合グロブリンは両方共セルピン科に 属するヒト血漿輸送蛋白質である。そこでセルピンがＬＰＳに結合するという仮 説は合理的である。セプチンがセルピン、ｐｃｉ、と似ていることも、敗血症に おける説明できない現象との関連において興味深い。活性化蛋白質Ｃ（ＡＰＣ） 、凝固阻止物質、の注入は、ＴＮＦの合成を阻止することにより、内毒素ショッ クによる死を防ぐ（Ｆ、　Ｔａ７１ｏ＋、私信）。セプチンがＰＣＩに似ている ためにセブチンがＡＰＣインヒビターとしてはたらくことができるのならば、Ａ ＰＣ注入はセプチンを消費し、内毒素に対する反応を防止する。

セルピン（５０ｋＤｘ）の典型的分子量はセプチンのそれ（Ｈｋｈ）とは著しく 異なる。しかしながら、セルピンがその標的プロテアーゼと共有結合複合体を形 成し、これらの複合体がＳＤＳゲル上をセルピンとプロテアーゼとの分子量の合 計として移動することが知られている。セルピン−プロテアーゼ複合体を塩基と 共にインキュベートすることによってアシル中間体を破壊するごとができる。我 々は、セプチンと１Ｍ水酸化アンモニウムとのインキュベーションが分子量のシ フトをおこし、５５　ｋＤａ及び３４　ｋＤａ種を生ずることを認めた。

実施例　７ プロテアーゼインヒビターは血漿中のセブチン活性を阻止するセプチンが明らか にプロテアーゼと基質とから成るという研究結果は、プロプアーゼインヒビター の試験を行うきっかけとなった。プロテアーゼインヒビター混合物の添加は、Ｅ ＬＰＳとＭＯとの相互作用を促進する血漿の能力を著しく低下させた（表■）。

付加的研究は、プロテアーゼインヒビターがセプチンとＥＪ、、ＰＳとの相互作 用を阻止しく表■）、セブチンー■、ＰＳ複合体とＣＤ１４との結合は阻止しな いことを示した。

今日までに見いだされた最も効果的な二つのプロテアーゼインヒビターはアプロ チニンとキモスタチンである。キモスタチンは疎水性残基の後に破壊される（ｃ ｌ…ｅ）キモトリプシン様プロテアーゼを優先的に阻害し、アプロチニンは塩基 性残基の後に破壊されるトリプシン様酵素をもった酵素を優先的に阻害するから 、我々の結果は、ニブロチアーゼのどちらの阻害もセブチン生産を止めるには十 分であることを示唆している。

その後の研究は、無毒性プロテアーゼインヒビターであるアプロチニンもＬＰＳ 及びセプチンによるＰＭＮの刺激を遮断することを示している（表Ｖｌ）。

これらのデータは、蛋白分解的できごと、多分プロテアーゼとセルビンとの相互 作用、がセプチン生成には必要であることを示唆する。

表Ｖ プロテアーゼインヒビターによるセプチン活性の阻害アンチパイン、５μｇ／ｉ ｔ ロイペプチン、５μｇ／ｍｌ　実験　１１２ベンザミジン、２５μｇ／ｍｌ　実 験　２８．５キモスタチン、５μｇ／ｎｌ　実験　３　１５ペプスタチン、５μ ｇ　／ｆｆ１１ キモスタチン　５μｇ／ｍｌ　＋　ペプスタチン　５μｇ／ｍｌ　５．６キモス タチン１００μｇ／ｍｌ　Ｉｌｌアブロヂニン１００μｇ／ｉｆ　９４ プロトコール　Ｉ２ アンチバイン　」−ロイペプチン　＋　ベンザミド　３．０キモスタチン　＋　 ペプスタチンＡ３．３全部で　１０．３ １　プロトコールｌては、血漿を指示濃度のインヒビターで１００倍に希釈し、 ＥＬＰＳ及びマクロファージと混合した。ＥＬＰＳのマクロファージへの付着を ３０分間インキュベーション後に測定し、プロテアーゼインヒビターによって生 じた付着減少を測定した。

２　プロトコールＩＩでは、血漿を指示濃度のインヒビターで１００倍に希釈し 、ＥＬＰＳと混合した。２０分間のインキュベーション後、ＥＬＰＳを洗い、マ クロファージと共にインキュベートした。

上記のように付着を測定した。

青■ アプロチニンはＬＰＳによるＰＭＮの血清依存性刺激を阻止するり婁　アプロチ ニン　付１指数（ＥＣ３ｂｉ）ｔ　ｐ　Ｓ　（１ｎｇ／ｍｌ）　血清（１：ｌ０ ０）アプロチニンの存在下又は不在下てＰＭＮを指示濃度のヒト血清及びＬＰＳ と共に３０分間３７℃でインキュベートした。その後細胞を洗い、ＣＲ３の活性 化を、ＣＲ３被覆羊赤血球の結合（ＥＣ３ｂｉ）の測定によって分析した。

ＭｏｎｏＱカラムからの数フラクションを合一した実験がら、セプチン形成には プロテアーゼとインヒビターとの複合体が必要であるというもう一つの証拠が誘 導された。セプチンビークは使用したセプチン活性の０．２−１％に相当する活 性量を含むが、すべてのピークの合計は負荷活性の５ｆｌ−８０９６を含む。そ こで、蛋白質混合物、多分プロテアーゼと基質、は結合してセプチンを形成する にちがいない。“セプチプビークに存在する活性はあらかじめ形成された少量の プロテアーゼ−セルピン複合体をあられすと我々は考える。

血漿中のその他の蛋白質はプロテアーゼカスケードにおいて、生物学的効果を開 始するように働く。例えば、補体カスケードは非常に少量の免疫補体によって開 始され、凝固カスケードの接触系はアニオン性表面によって開始される。セプチ ンは同様なカスケードの生成物であるようにみえる。公知のプロテアーゼカスケ ードからの蛋白質が“セプチンカスケード”に関与している可能性を排除するた めに、特定の蛋白質の欠失した血漿中のセプチン活性を測定した。補体蛋白質Ｃ ５及び補体蛋白１［Ｃ２及び因子Ｂの欠乏した血１ｆｆｉ（加熱血清）は正常な セプチン濃度を示した。セプチン濃度は血漿の凝固によって影響を受けなかった 。さらに、蛋白質Ｃ、ハーゲマン因子、プレカリクレイン、高分子キニノゲン又 は因子のない血漿は正常なセプチン濃度を示した。こうしてここに記載の酵素反 応は新規のプロテアーカスケードドを示し、このカスケードは本発明の目的であ る。

本発明は、その精神又は本質的特性から逸脱することなくその他の形で実施され 、又はその他の方法で行われ得る。したがって本開示はあらゆる観点て例証的で あり、制限的ではなく、発明の範囲は添付の請求によって示さね、等価の意味及 び範囲に入るあらゆる変更はそこに含まれるものとする。

付着指数（ｏ−ｏ） 平均蛍光チャンネル 付着指数 手続補正書 １、事件の表示 平成３年　特許願事５０５３５０号 ２、発明の名称 リボ多糖結合オプソニン及びその使用法３、補正をする者 平成５年１１月１６日 ６、補正の対象 国際調査報告 ｍｍ　Ａ−＋＋ｍ　Ｎ＠、ＰＣＴ／υｓ　９１１００６９６フロントページの続 き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　３／１２ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４ＢＧＯＩＮ　３３１５３　Ｎ　８３１０− ２ＪＩ

Claims (91)

【特許請求の範囲】
1. １．リポ多糖と結合して単球、マクロファージ細胞及び多形核細胞上のレセプタ ーによって識別される複合体を形成することができ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によ って測定して約９０ｋｄの見かけ分子量をもつ、純粋な形の蛋白質から成るオプ ソニン。
2. ２．上記オプソニンが先ず最初に、脂質ＩＶａとして知られるリポ多糖の生合成 前駆体と結合して複合体を生成する場合は、レセプタ−ＣＤ１４に結合すること ができない請求項１記載のオプソニン。
3. ３．正常血清中に高濃度に存在し、リポ多糖に反応しておこるＴＮＦ合成を高め る請求項１記載のオプソニン。
4. ４．血清から誘導される請求項１記載のオプソニン。
5. ５．上記リポ多糖との複合体中のオプソニンが多形核細胞の活性を刺激し、上記 多形核細胞の内皮への付着増加を促進し、付着分子ＣＲ３の表現を高めて調節し 、上記多形核細胞の脱顆粒化をおこす請求項１、請求項２又は請求項３記載のオ プソニン。
6. ６．約４μｇ／ｍｌの桁までの範囲の量で正常血清中に存在する請求項３記載の オプソニン。
7. ７．ＬＰＳ被覆赤血球とヒトマクロファージ細胞との結合活性によって測定した 場合のリポ多糖と上記単球、マクロファージ細胞及び多形核細胞との最大結合が 、０．０５μｇ／ｍｌ以下の濃度のオプソニンの存在及び赤血球との結合によっ て実現する請求項１記載のオプソニン。
8. ８．上記オプソニンがプロテアーゼカスケードの一部であり、リポ多糖に結合す ることができる請求項１記載のオプソニン。
9. ９．プロテアーゼとこのプロテアーゼの基質との複合体である請求項１記載のオ プソニン。
10. １０．上記基質がヒト蛋白質Ｃインヒビターとの若干の構造的類似性を有する請 求項９記載のオプソニン。
11. １１．上記オプソニンの活性がプロテアーゼインヒビターによって実質的に減少 する請求項１記載のオプソニン。
12. １２．上記プロテアーゼインヒビターがアンチパイン、ロイペプチン、ベンザミ ジン、キモスタチン・ペプスタチンＡ、アプロチニン及びそれらの混合物から成 る群から選択される請求項１１記載のオプソニン。
13. １３．請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、又は請求項１２のいずれ かに記載のオプソニンを生ずるプロテアーゼカスケード。
14. １４．検出可能の標識で標識化した請求項１、請求項２又は請求項３記載のオプ ソニン。
15. １５．標識が酵素、蛍光を発する化学物質及び放射性元素から選択される請求項 １４記載のオプソニン。
16. １６．リポ多糖と結合して、単球、マクロファージ細胞及び多形核細胞上のレセ プターによって識別される複合体を形成することができる、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分 析によって測定して約９０ｋｄの見かけ分子量をもつオプソニンの製法であって 、Ａ．哺乳動物からの血清サンプルを集め、Ｂ．上記血清から上記オプソニンを 分離することから成る製法。
17. １７．オプソニンに対する抗体であって、上記抗体を産生するオプソニンは、リ ポ多糖と結合して、単球、マクロファージ細胞及び多形核細胞上のレセプターに よって識別される複合体を形成することができる、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によっ て測定して約９０ｋｄの見かけ分子量をもつ純粋な形の蛋白質から成るという抗 体。
18. １８．家兎において産生され、免疫血清からの免疫グロブリン（ＩｇＧ）に対し て発現する請求項１７記載の抗体。
19. １９．ポリクローナル抗体から成る請求項１７記載の抗体。
20. ２０．モノクローナル抗体から成る請求項１７記載の抗体。
21. ２１．請求項２０記載のモノクローナル抗体を産生する永続性細胞系。
22. ２２．検出可能の標識によって標識化された請求項１７記載の抗体。
23. ２３．標識が酵素、蛍光を発する化学物質、及び放射性元素から選択される請求 項２２記載の抗体。
24. ２４．リポ多糖と結合して、単球、マクロファージ細胞及び多形核細胞上のレセ プターによって識別される複合体を形成することができ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析 によって測定して約９０ｋｄの見かけ分子量をもつオプソニンの存在を測定する 方法であって、 Ａ．血清又は血漿から上記オプソニンの最低一つのサンプルを調製し；Ｂ．上記 オプソニンサンプルに対する最低一つの対応する抗体又は結合パートナーを作り ； Ｃ．上記オプソニンと、これに対する上記抗体又は結合パートナーとから成る群 から選択される物質に検出可能の標識をつけ；Ｄ．段階Ｃの物質から成る群から 選択される、標識をつけていない物質と、上記オプソニンの存在が疑われる哺乳 動物の生物学的サンプルを適切な基質上に固定し； Ｅ．段階Ｃからの標識物質を上記生物学的サンプルと接触させ、固定化物質と接 触させ； Ｆ．上記固定化物質に結合した段階Ｃからの物質を、上記固定化物質に結合しな い段階Ｃからの物質から分離し； Ｇ．上記結合した物質について上記標識物質の存在を試験することによって上記 オプソニンを測定する測定法。
25. ２５．リポ多糖と結合して、単球、マクロファージ細胞及び多形核細胞上のレセ プターによって識別される複合体を形成することができ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析 によって測定して約９０ｋｄの見かけ分子量をもつオプソニンの結合部位を測定 する方法であって、 Ａ．上記オプソニンの最低１サンプルをつくり；Ｂ．検出可能の標識を上記オプ ソニンサンプルにつけ；Ｃ．標識オプソニンサンプルを、リポ多糖の存在下及び 不在下で上記オプソニンに対する結合部位があるのではないかと思われる哺乳動 物からの生物学的サンプルと接触させ； Ｄ．上記生物学的サンプルについて、結合試験において上記標識オプソニンサン プルの存在を調べる ことによって、上記オプソニンの結合部位を測定する方法。
26. ２６．哺乳動物の或る侵襲性刺激と関連せるオプソニンの存在を測定する方法を 含んで成る請求項２４記載の方法。
27. ２７．上記侵襲性刺激が感染症である請求項２６記載の方法。
28. ２８．上記侵襲性刺激が、細菌感染、ウィルス感染、原生動物感染、腫瘍性哺乳 動物細胞及び毒素から成る群から選択される請求項２６記載の方法。
29. ２９．哺乳動物における侵襲性又は特発性刺激の存在を確認する方法を含む請求 項２４記載の方法。
30. ３０．オプソニンとリポ多糖との複合体のためのレセプターをもつ試験細胞のコ ロニーを、そのオプソニン及びりポ多糖を含む増殖培地に培養し、被験薬剤を加 え、その後上記オプソニンと上記試験細胞コロニーのレセプターとの反応性を測 定することから成り、上記オプソニンは、リポ多糖と結合して単球、マクロファ ージ細胞及び多形核細胞上のレセプターによって識別される複合体を形成するこ とができる、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定して約９０ｋｄの見かけ分子量 をもつ蛋白質物質である、薬剤のオプソニン活性調節能力を試験する方法。
31. ３１．薬剤及びその他の作用物質のオプソニン産生調節能力をスクリーニングす るアッセイ系であって、或る薬剤又は作用物質と共に培養され、その結果上澄液 を与える観察可能の細胞性試験コロニーを含んで成り、上記上澄液はその後上記 オプソニンの存在が試験され、上記オプソニンはリポ多糖と結合して、単球、マ クロファージ細胞及び多形核細胞上のレセプターによって識別される複合体を形 成することができ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定して約９０ｋｄの見かけ 分子量をもつ蛋白質から成るアッセイ系。
32. ３２．血清又は水性メジウム中のオプソニンを証明するための試験キットであっ て、 Ａ．リポ多糖と結合して、単球、マクロファージ細胞及び多形核細胞上のレセプ ターによって識別される複合体を形成することができ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に よって測定して約９０ｋｄの見かけ分子量をもつ蛋白質から成る上記オプソニン 又はそれの特異的結合パートナーと、検出可能の標識との直接的又は間接的付着 によって得られる少なくとも一つのあらかじめ定められた量の免疫化学的反応性 成分と； Ｂ．その他の試薬と； Ｃ．上記キットの使用説明書 とから成る試験キット。
33. ３３．オプソニンのリポ多糖への結合又はそのオプソニンのための細胞レセプタ ーへの結合を阻止し得るオプソニン特異的抗体、上記オプソニンの生産を阻害し 得る作用物質、上記オプソニンに対する拮抗物質として作用することができる、 上記オプソニンに対する抗体でない作用物質から成る群から選択された物質の炎 症抑制量を哺乳動物に投与することから成る哺乳動物の炎症の治療法であって、 上記オプソニンがリポ多糖と結合して、単球、マクロファージ細胞及び多形核細 胞上のレセプターによって識別される複合体を形成することができ、ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ分析によって測定して約９０ｋｄの見かけ分子量をもつ蛋白質から成る上 記治療法。
34. ３４．上記オプソニンに対する抗体がポリクローナル抗体である請求項３３記載 の方法。
35. ３５．上記抗体が家兎において産生され、免疫血清のＩｇＧから誘導される請求 項３３記載の方法。
36. ３６．上記オプソニンに対する抗体でない上記作用物質が少なくとも一つのプロ テアーゼインヒビターから成る請求項３３記載の方法。
37. ３７．上記プロテアーゼインヒビターがアンチパイン、ロイペプチン、ベンザミ ジン、キモスタチン、ペプスタチンＡ、アプロチニン及びそれらの混合物から成 る群から選択される請求項３６記載の方法。
38. ３８．上記抗体が、オプソニンを生ぜしめるプロテアーゼカスケードの−成分に 対して産生される請求項３３記載の方法。
39. ３９．哺乳動物において炎症及び／又は熱の発生を阻止する方法であって、オプ ソニンとリポ多糖との、又はそのオプソニンのための細胞レセプターとの結合を 阻止し得るオプソニン特異的抗体、上記オプソニンの生産を阻害し得る作用物質 、上記オプソニンに対する拮抗物質として作用することができる、上記オプソニ ンに対する抗体でない作用物質及びこれらの混合物から成る群から選択された物 質の、上記炎症及び／又は熱の発生を効果的に阻止する量を投与することから成 り、上記オプソニンはリポ多糖と結合して、単球、マクロファージ細胞及び多形 核細胞上のレセプターによって識別される複合体を形成することができ、ＳＤＳ −ＰＡＧＥ分析によって測定して約９０ｋｄの見かけ分子量をもつ蛋白質から成 る方法。
40. ４０．上記オプソニンに対する抗体がポリクローナル抗体である請求項３９記載 の方法。
41. ４１．上記抗体が家兎において産生され、免疫血清のＩｇＧから誘導される請求 項３９記載の方法。
42. ４２．上記オプソニンに対する抗体でない上記作用物質が少なくとも一つのプロ テアーゼインヒビターから成る請求項３９記載の方法。
43. ４３．上記プロテアーゼインヒビターがアンチパイン、ロイペプチン、ベンザミ ジン、キモスタチン、ペプスタチンＡ、アプロチニン及びこれらの混合物から成 る群から選択される請求項４２記載の方法。
44. ４４．上記抗体がオプソニンを生ぜしめるプロテアーゼカスケードの−成分に対 して産生される請求項３９記載の方法。
45. ４５．哺乳動物における感染性及び非感染性疾患を治療する方法であって、オプ ソニン、上記オプソニンの生産及び／又は活性を増進し得る作用物質、上記オプ ソニンの活性に類似の活性をもつ作用物質及びこれらの混合物から成る群から選 択される物質の疾患抑制量を上記哺乳動物に投与することから成り、上記オプソ ニンはリポ多糖と結合して、単球、マクロファージ細胞及び多形核細胞上のレセ プターによって識別される複合体を形成することができ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析 によって測定して約９０ｋｄの見かけ分子量をもつ蛋白質から成る方法。
46. ４６．患者の敗血症を改善する方法であって、上記患者に治療的有効量の抗オプ ソニン抗体を投与することから成り、上記オプソニンはリポ多糖と結合して、単 球、マクロファージ細胞及び多形核細胞上のレセプターによって識別される複合 体を形成することができ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定して約９０ｋｄの 見かけ分子量をもつ純粋な形の蛋白質から成る方法。
47. ４７．上記オプソニンに対する抗体がポリクローナル抗体である請求項４６記載 の方法。
48. ４８．上記抗体が家兎において産生され、免疫血清のＩｇＧから誘導される請求 項４６記載の方法。
49. ４９．上記抗体がオプソニンを生ぜしめるプロテアーゼカスケードの−成分に対 して産生される請求項４６記載の方法。
50. ５０．上記抗オプソニン抗体が上記オプソニンとリポ多糖との結合を阻害するモ ノクローナル抗体である請求項４６記載の方法。
51. ５１．上記抗オプソニン抗体がリポ多糖と上記オプソニンとの複合体のＣＤ１４ への結合を阻止するモノクローナル抗体である請求項４６記載の方法。
52. ５２．上記治療的有効量が１日、体重１ｋｇあたり０．１ないし２０ミリグラム である請求項５０又は請求項５１記載の方法。
53. ５３．上記方法がさらに上記患者に殺菌量の抗生物質を実質上同時に投与するこ とを含んで成る請求項４６記載の方法。
54. ５４．上記抗生物質がグラム陰性菌に対して有効な抗菌剤である請求項５３記載 の方法。
55. ５５．上記敗血症がグラム陰性菌感染によっておきる請求項４６記載の方法。
56. ５６．上記敗血症がウィルス、グラム陽性菌又は真菌によっておきる請求項４６ 記載の方法。
57. ５７．上記方法がさらに、上記患者にＴＮＦ血中濃度減少量の抗ＴＮＦ抗体を実 質上同時に投与することを含む請求項４６記載の方法。
58. ５８．上記方法がさらに、上記抗オプソニン抗体と実質上同時に、殺菌量の抗生 物質を上記患者に投与することを含む請求項５７記載の方法。
59. ５９．上記患者が下記症状：成人呼吸困難症候群、播種性血管内凝固、賢不全及 び肝不全のうちの一つ以上の症状を示す請求項４６記載の方法。
60. ６０．上記敗血症が化学的又は物理的外傷の結果である請求項４６記載の方法。
61. ６１．内毒素血症患者において単球マクロファージ系の細胞によるリポ多糖誘導 性腫瘍壊死因子分泌を阻止するのに十分な量の抗オプソニン抗体を患者に投与す ることを含んで成る、患者の内毒素血症症状を改善する方法であって、上記オプ ソニンがリポ多糖に結合して単球、マクロファージ細胞及び多形核細胞上のレセ プターによって識別される複合体を形成することができる、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分 析によって測定して約９０ｋｄの見かけ分子量をもつ純粋な形の蛋白質から成る 上記方法。
62. ６２．上記オプソニンに対する抗体がポリクローナル抗体である請求項６１記載 の方法。
63. ６３．上記抗体が家兎において産生され、免疫血清のＩｇＧから誘導される請求 項６１記載の方法。
64. ６４．上記オプソニンに対する抗体ではない上記作用物質が、少なくとも一つの プロテアーゼインヒビターから成る請求項６１記載の方法。
65. ６５．上記プロテアーゼインヒビターが、アンチパイン、ロイペプチン、ベンザ ミジン、キモスタチン、ペプスタチンＡ，アプロチニン及びそれらの混合物から 成る群から選択される請求項６４記載の方法。
66. ６６．上記抗体が、オプソニンを生ずるプロテアーゼカスケードの−成分に対し て産生する請求項６１記載の方法。
67. ６７．上記抗オプソニン抗体が、上記オプソニンとリポ多糖との結合を阻止する モノクローナル抗体である請求項６１記載の方法。
68. ６８．上記抗オプソニン抗体が、リポ多糖と上記オプソニンとの配当体のＣＤ１ ４との結合を阻害するモノクローナル抗体である請求項６１記載の方法。
69. ６９．Ａ．オプソニンに対する抗体、上記オプソニンの産生を阻害し得る作用物 質、上記オプソニンの活性に拮抗することができる上記オプソニンに対する抗体 ではない作用物質、及びそれらの混合物、又はそれらに対する特異的結合パート ナーから成る群から選択される治療的有効量の物質であって、上記オプソニンは リポ多糖に結合して単球、マクロファージ細胞及び多形核細胞上のレセプターに よって識別される複合体を形成することができ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって 測定して約９０ｋｄの見かけ分子量をもつ蛋白質から成る上記物質と；Ｂ．薬物 学的に容認される担体 とから成る 哺乳動物の炎症及び／又は熱の治療のための医薬組成物。
70. ７０．上記オプソニンに対する抗体がポリクローナル抗体である請求項６９記載 の医薬組成物。
71. ７１．上記抗体が家兎において産生され、免疫血清のＩｇＧから誘導される請求 項６９記載の医薬組成物。
72. ７２．上記オプソニンに対する抗体ではない上記作用物質が少なくとも一つのプ ロテアーゼインヒビターから成る請求項６９記載の医薬組成物。
73. ７３．上記プロテアーゼインヒビターがアンチパイン、ロイペプチン、ベンザミ ジン、キモスタチン、ペプスタチンＡ，アプロチニン及びこれらの混合物から成 る群から選択される請求項６９記載の医薬組成物。
74. ７４．上記抗体がオプソニンを生ずるプロテアーゼカスケードの−成分に対して 産生される請求項６９記載の医薬組成物。
75. ７５．薬物学的に容認される賦形剤中に抗オプソニン抗体分子を単位量の形で含 む治療組成物であって、上記抗体分子が上記オプソニンとリポ多糖との結合を阻 止することができる上記治療組成物。
76. ７６．上記オプソニンに対する抗体がポリクローナル抗体である請求項７５記載 の治療組成物。
77. ７７．上記抗体が家兎において産生され、免疫血清のＩｇＧから誘導される請求 項７５記載の治療組成物。
78. ７８．上記オプソニンに対する抗体ではない上記作用物質が少なくとも一つのプ ロテアーゼインヒビターを含んで成る請求項７５記載の治療組成物。
79. ７９．上記プロテアーゼインヒビターがアンチパイン、ロイペプチン、ベンザミ ジン、キモスタチン、ペプスタチンＡ，アプロチニン及びこれらの混合物から成 る群から選択される請求項７８記載の治療組成物。
80. ８０．上記抗体が、オプソニンを生ずるプロテアーゼカスケードの−成分に対し て産生される請求項７５記載の治療組成物。
81. ８１．さらに単位量の抗ＴＮＦ抗体分子を含む請求項７５記載の治療組成物。
82. ８２．さらに殺菌量の抗生物質を含む請求項７５記載の治療組成物。
83. ８３．さらに殺菌量の抗生物質を含む請求項７５記載の治療組成物。
84. ８４．活性成分として、敗血症治療のためにヒトに投与するのに適した濃度で、 上記オプソニンとリポ多糖との結合を阻止し得る抗オプソニン抗体分子と、抗生 物質及び抗ＴＮＦ抗体分子の一つ又は両方とを含んで成る組成物。
85. ８５．上記オプソニンに対する抗体がポリクローナル抗体である請求項８４記載 の組成物。
86. ８６．上記抗体が家兎において産生され、免疫血清のＩｇＧから誘導される請求 項８４記載の組成物。
87. ８７．上記オプソニンに対する抗体ではない上記作用物質が少なくとも一つのプ ロテアーゼインヒビターを含んで成る請求項８４記載の組成物。
88. ８８．上記プロテアーゼインヒビターがアンチパイン、ロイペプチン、ベンザミ ジン、キモスタチン、ペプスタチンＡ，アプロチニン及びこれらの混合物から成 る群から選択される請求項８７記載の組成物。
89. ８９．上記抗体が、オプソニンを生ずるプロテアーゼカスケードの−成分に対し て産生される請求項８４記載の組成物。
90. ９０．Ａ．オプソニン、上記オプソニンの産生又は活性を増進し得る作用物質、 上記オプソニンの活性を真似ることができる作用物質、及びそれらの混合物、又 はそれらの特異的結合パートナーから成る群から選択される治療的有効量の物質 であって、上記オプソニンはリポ多糖に結合して単球、マクロファージ細胞及び 多形核細胞上のレセプターによって識別される複合体を形成することができ、Ｓ ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定して約９０ｋｄの見かけ分子量をもつ純粋な形 の蛋白質から成る上記物質と； Ｂ．薬物学的に容認される担体 とから成る、哺乳動物における感染性及び非感染性疾患の治療のための医薬組成 物。
91. ９１．リポ糖に結合して、単球、マクロファージ細胞及び多形核細胞上のレセプ ターによって識別され、ＮａＣｌ勾配による溶出に基づいて、図１に示されるよ うに約２００ｍＭＮａＣｌにピークをあらわす溶出プロフィールをもつ複合体を 形成することができる純粋な形の蛋白質から成るオプソニン。