JPH09154578A - ヒトｓｃｆに対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 ヒト Stem cell factor（ＳＣＦ）に特
異性を有するモノクローナル抗体、及び該抗体を産生す
るハイブリドーマが提供される。 【効果】 該モノクローナル抗体を利用することによ
り、血中のヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物（Ｃ−ＫＩ
Ｔ）と結合していない遊離の可溶型ＳＣＦの選択的アッ
セイが可能となるため、これを血液疾患等の診断薬や治
療薬に利用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトStem cell fa
ctor（ステムセルファクター、以下、ＳＣＦということ
もある）に対して特異性を有するモノクローナル抗体、
それを産生するハイブリドーマ、及びそれを用いる該モ
ノクローナル抗体の製造方法に関する。

【０００２】ＳＣＦは、造血などにおいて重要な役割を
果たしている分子であり、その血中濃度を測定すること
は血液疾患をはじめとする諸疾患における診断において
重要な意義があり、本発明はそれに大きく寄与すること
ができるものである。また、本発明におけるＳＣＦとヒ
トｃ−ｋｉｔ遺伝子産物の結合を阻止することができる
モノクローナル抗体は、診断薬としてだけでなく治療薬
としての用途も有する。

【０００３】

【従来の技術】ヒトＳＣＦは、造血幹細胞の表面に発現
しているｃ−ｋｉｔレセプターのリガンドであって、そ
の前駆体は２７３アミノ酸からなり、Ｎ末端２５アミノ
酸のシグナル配列がとれて最終的には２４８アミノ酸で
構成され、糖鎖を含む分子量約３０ｋＤａ程度の膜結合
型の造血因子である。

【０００４】このように、ＳＣＦは、１９９０年に遺伝
子クローニングされて以来、in vitro、in vivoでのそ
の作用に関する研究が進められてきた。その結果、ＳＣ
Ｆは、構成的な造血における役割をはじめとし、生殖細
胞の成熟期における役割など多くの生理現象に関与して
いることが明らかになってきた。そして、造血において
ＳＣＦはＩＬ−３やＩＬ−６などのサイトカインやｂ−
ＦＧＦなどの成長因子と相乗効果を示し、さまざまな段
階の造血細胞の増殖、分化を促すことがわかった。した
がってＳＣＦは、造血幹細胞の増殖因子としてのみなら
ず、赤血球、血小板、顆粒球、リンパ球の増殖因子とし
て重要なものであり、臨床応用も大いに期待される。

【０００５】ＳＣＦは、骨髄ストローマ細胞や血管内皮
細胞で細胞膜結合型として発現される。そしてその一部
は、プロテアーゼによる分解反応により可溶型として産
生されるものと推測されている。つまり、ＳＣＦには、
膜結合型ＳＣＦと可溶型ＳＣＦ（分泌型ＳＣＦ）とがあ
り、可溶型ＳＣＦは生理活性を有している。実際、健常
人の血清中には平均３．３±１．１ng／mlの可溶型ＳＣ
Ｆが存在するという報告もある。（Langleyら、Blood 8
1, 656, 1993）しかし、このようにして従来法によって
可溶型ＳＣＦとして測定された可溶型ＳＣＦが生体内
で、その活性を示すことができるか否かについては、以
下に述べるような問題点が示されている。換言すれば、
従来法で測定された可溶型ＳＣＦが生理活性を有する真
の可溶型ＳＣＦであるとの保障がないのである。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】既述のように、ＳＣＦ
のレセプターは、造血幹細胞や造血前駆細胞あるいは血
管内皮細胞などの細胞膜表面に発現されるｃ−ｋｉｔ癌
原遺伝子産物（以下、Ｃ−ＫＩＴということもある）で
あることが分かっている。そして、このＣ−ＫＩＴも、
可溶型の分子として血中に放出されており、その濃度は
血中の可溶型ＳＣＦの１０倍以上になると推測されてい
る。したがって、血中での可溶型ＳＣＦの一部は可溶型
のＣ−ＫＩＴと結合し活性を示せない状態にある可能性
がある。

【０００７】しかるに、従来の血中の可溶型ＳＣＦの測
定法においては、可溶型Ｃ−ＫＩＴとの結合の有無を区
別して検出することはできない。その両者、すなわち可
溶型Ｃ−ＫＩＴと結合した可溶型ＳＣＦと結合していな
い可溶型ＳＣＦを区別して真に生体内で有効なＳＣＦの
みを測定できる新たな技術が必要とされている。

【０００８】本発明は、このような当業界のニーズに応
えるためになされたものであって、各方面から検討の結
果、ヒトＳＣＦと特異的に結合し、ヒトＳＣＦとヒトＣ
−ＫＩＴの結合を阻止することのできる特異性の高い抗
体が創製されれば、それを用いて測定系を組むことがで
き、その結果、上記目的が達成されることにはじめて着
目し、この目的に合致した特異性の高い抗体、特にモノ
クローナル抗体の創製がその基礎となるとの観点にた
ち、新規モノクローナル抗体産生システムの確立を本発
明の目的として新たに設定した。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、鋭意研究の結果、
真に活性を持つ血中の可溶型ＳＣＦを測定することので
きる抗ＳＣＦ抗体、特にモノクローナル抗体及びその産
生トータルシステムを完成するに至り、本発明の完成に
至ったものである。以下、本発明について詳述する。

【００１０】目的とするモノクローナル抗体を産生する
ための融合細胞（以下、ハイブリドーマということもあ
る）を創製するため、本発明においては、免疫原として
ヒトＨｅＬａ細胞に着目しただけでなく、更に効率化を
図るためにドナーのｃＤＮＡから目的とする遺伝子のｃ
ＤＮＡを単離し、これをレシピエントに形質導入してな
る形質導入細胞（以下、トランスフェクタントというこ
ともある）を使用することとした。すなわち、本発明者
らは、まず、ＳＣＦを高発現するＨｅＬａ細胞のｃＤＮ
Ａライブラリーから単離したＳＣＦのｃＤＮＡをマウス
繊維芽細胞Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞に形質導入した形質導
入細胞株（トランスフェクタント）を作製した。

【００１１】次に、このトランスフェクタントを免疫原
として例えばマウスに免疫し、その脾細胞、リンパ節細
胞あるいはＢリンパ球を抗体産生細胞として得る。この
抗体産生細胞とマウス、ヒトあるいはラットの骨髄腫細
胞とをいわゆる細胞融合法を用いて融合細胞（ハイブリ
ドーマ）を形成させ、上記トランスフェクタントに特異
的に結合する抗体を産生するクローンを選択することに
よって、モノクローナル抗体を得ることができる。こう
して得られたモノクローナル抗体を、あらかじめ例えば
ビオチン標識したＳＣＦと結合させておきこのビオチン
標識ＳＣＦのＣ−ＫＩＴ陽性細胞株への結合能を、例え
ばＡＶＩＤＩＮ−ＦＩＴＣをさらに反応させることによ
りフローサイトメトリーで検出し、その結合を阻止する
ことのできるモノクローナル抗体を選択的に得ることが
できる。

【００１２】このようにしてＳＣＦとＣ−ＫＩＴの結合
を阻止することのできる抗ＳＣＦ抗体を安定的に産生で
きるハイブリドーマを得た。このようにして得たハイブ
リドーマは、ＳＣＦ２３５と命名し、これを工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託した（ＦＥＲＭ Ｐ−１
５２９５）。

【００１３】これらのクローンをそれぞれ常法にしたが
って培養し、モノクローナル抗体を分離採取する。得ら
れたモノクローナル抗体は、免疫沈降法、ウエスタン−
ブロッティング法等により目的とする抗ＳＣＦ抗体であ
ることが確認された。

【００１４】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、もちろんこれらの実施例のみに限られるものでは
ない。

【００１５】

【実施例１：抗体の作製】

【００１６】（１）免疫原の作製 ＳＣＦを高発現するＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡライブラリ
ーから単離したＳＣＦのｃＤＮＡを動物細胞発現用ベク
ター ｐＢＣＭＧＳ−ｎｅｏに組み込んだ後、これをマ
ウス繊維芽細胞株Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞に形質導入し、
得られたトランスフェクタントを免疫原とした。

【００１７】（２）ハイブリドーマの作製

【００１８】（ａ）免疫 ８週令のＢａｌｂ／ｃマウス（雌）に上記トランスフェ
クタントを２週間間隔で腹腔内投与した。免疫の効果
は、マウスの尾静脈から採取した末梢血の血清と免疫原
との反応性により評価した。効果を確認した後、最終免
疫、細胞融合を行った。

【００１９】（ｂ）細胞融合 最終免疫から４日後、免疫されたマウスの脾細胞とマウ
ス骨髄腫由来細胞株ＳＰ−２を常法に従って細胞融合さ
せた。

【００２０】（ｃ）抗ＳＣＦ抗体産生ハイブリドーマの
スクリーニング 抗ＳＣＦ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング法と
して、トランスフェクタント及びその親株細胞（Ｂａｌ
ｂ／３Ｔ３）を抗原とした間接抗体法を用いた。トラン
スフェクタントに結合し、親株細胞（Ｂａｌｂ／３Ｔ
３）には結合しない抗体を産生するハイブリドーマを選
択し、クローニングした。その結果、クローン（ＳＣＦ
２３５）を得た。（図１）

【００２１】（ｄ）抗体の精製 ＳＣＦ２３５の培養上清を限外ろ過濃縮した後、結合用
緩衝液（BioRad Protein MAPS buffer）と等量混合し
た。Protein A-Sepharose CL-4B（ファルマシア）を結
合用緩衝液で平衡化し、上記混合液をカラムに流して抗
体を結合させた後、結合用緩衝液でカラムを洗浄した。
0.2M Gly-HCl buffer(ｐＨ３．０）をカラムに流して溶
出を行い抗体画分を得た。

【００２２】

【実施例２：結合実験】biotin標識ＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ Sys
tems）とＳＣＦ２３５抗体を室温で１５分間反応させた
後、Ｃ−ＫＩＴ陽性細胞株（ＨＣＫ／３Ｔ３：ｃ−ｋｉ
ｔ遺伝子をＢａｌｂ／３Ｔ３細胞に形質導入して得られ
たＣ−ＫＩＴトランスフェクタント）と４℃で６０分間
反応させた。その後、アビジン−ＦＩＴＣ（AVIDIN-Flu
orescein isothiocyanate isomer）を加え、さらに、４
℃で３０分間、暗所で反応させた。

【００２３】この細胞を常法に従い、フローサイトメト
リーの検体として供し、biotin標識ＳＣＦのＣ−ＫＩＴ
への結合を測定した。その結果、予めＳＣＦ２３５抗体
と反応させなかったときに比べ、その結合は完全に阻止
された。（図２）すなわち、ＳＣＦ２３５抗体はＳＣＦ
のＣ−ＫＩＴへの結合を阻止することの可能なモノクロ
ーナル抗体であることが確認された。

【００２４】

【実施例３：抗体の性質】ＳＣＦ２３５抗体のサブクラ
スをマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット
（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検定したところ、ＩｇＧ
１であった。

【００２５】また、得られたＳＣＦ２３５抗体５μｇを
還元状態でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後に、ゲルをク
マシー染色したところ、マウスＩｇＧに特有の５０ｋＤ
ａと２５ｋＤａの２本のバンドを検出した。（図３）ゲ
ルとしては、ポリアクリルアミド濃度４〜２０％のグラ
ジエントゲルを用いた。

【００２６】

【発明の効果】本発明によってはじめて、ヒトStem cel
l factorと特異的に結合するモノクローナル抗体が作製
された。このモノクローナル抗体は、ヒトStem cell fa
ctorとヒトｃ−ｋｉｔ遺伝子産物の結合を阻止し得るも
のである。

【００２７】この特性を利用して、該抗体を用いる測定
法を使用することにより、血中のＣ−ＫＩＴと結合して
いない遊離の可溶型ＳＣＦのみを選択的に測定すること
が可能である。

【００２８】例えば、ＳＣＦ抗体を固相化しておけば、
遊離のＳＣＦ（分泌型ＳＣＦ）のみが選択的に該抗体に
結合し、血液中に共存する遊離のＣ−ＫＩＴと結合して
いるＳＣＦは該抗体には結合しない。したがって、固定
化されたＳＣＦ抗体に捕捉されたＳＣＦを、標識した二
次抗体を用いる等の方法にしたがって測定すれば、遊離
のＳＣＦのバイオアッセイが可能となるのである。

【００２９】このようにして、該抗体による測定法を用
いることにより患者自身の血中の遊離した可溶性ＳＣＦ
を測定することができるだけでなく、人為的に投与され
た可溶型ＳＣＦの代謝をモニターすることができる。こ
のことは血液疾患をはじめとする疾患における診断薬や
治療薬の開発にも多大な貢献をすることは明らかであ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】トランスフェクタントをＳＣＦ２３５抗体で染
色した後フローサイトメトリーを用いて解析した図面で
ある。

【図２】Ｃ−ＫＩＴのトランスフェクタントとbiotin標
識ＳＣＦを、ＳＣＦ２３５との反応後に反応させた後、
フローサイトメトリーを用いて解析した図面である。

【図３】ＳＣＦ２３５抗体を還元条件においてＳＤＳ−
ＰＡＧＥに供した後にクマシー染色した図面である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトStem cell factorと特異的に結合す
   るモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 ヒトStem cell factorとヒトｃ−ｋｉｔ
   遺伝子産物の結合を阻止することができることを特徴と
   する請求項１に記載のモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 サブクラスがＩｇＧである請求項１又は
   請求項２に記載のモノクローナル抗体。
4. 【請求項４】 請求項１〜請求項３のいずれか１項に記
   載のモノクローナル抗体を産生することができるハイブ
   リドーマ。
5. 【請求項５】 請求項４に記載のハイブリドーマを使用
   することを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１
   項に記載のモノクローナル抗体の製造方法。