CN112724199B - 亲和Clec9a的多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫治疗和免疫预防领域，具体涉及一种靶向Clec9a的亲和肽的制备及其应用。该亲和肽选自SEQ ID NO.2所示肽或突变肽或其N端或C端截短肽。本发明独辟蹊径，通过反复筛选、优化得到的肽，能很好地亲和到Clec9a靶蛋白上，并能够显著增强抗原引起的免疫反应。

Description

亲和Clec9a的多肽及其应用

技术领域：

本发明属于免疫治疗和免疫预防领域，具体涉及一种靶向Clec9a的亲和肽，其制备及其应用。

背景技术：

免疫治疗由于能够激活机体的自身免疫，形成免疫记忆和免疫循环成为一种重要的治疗方法。树突状细胞(DCs)作为一类最重要的参与T淋巴细胞应答的抗原递呈细胞，在免疫反应中起着关键作用。DCs是介导T细胞和B细胞免疫应答的专职抗原递呈细胞。与其他的抗原递呈细胞(APC)相比，DCs是已知捕获、加工和递呈抗原能力最强，也是唯一能活化初始T细胞的专职抗原递呈细胞，可以诱导强有力的特异性的免疫反应，因此针对DC的免疫治疗是一种备受瞩目且非常有效的免疫治疗策略。

在人和鼠中至少可以分为3类DC：类浆细胞DC(pDC)，血液来源的传统的DC(cDC)和组织来源的DC(cDC)。这3类DC根据膜表面分子、功能和来源又可以分为不同的DC亚群。不同DC亚群分化表面标志物为抗原靶向治疗提供了理论基础，为增强疫苗的效果提供了保障。根据DC细胞表面标志物的不同可分为：CD1c⁺DCs(BDCA1⁺DCs)，Clec4c⁺DCs(BDCA2⁺DCs)和CD141⁺DCs(BDCA3⁺DCs)。不同亚群的DC具有不同的功能，其中人源的CD141⁺DCs亚群为鼠源的CD8α⁺DC亚群的等价物，相较于其他DC亚群，这类DC的MHC I交叉递呈能力更强，能够递呈细胞相关外源蛋白或自身抗原给CD8⁺T细胞，产生强烈的特异性的CTL反应。

目前研究DC疫苗的策略主要是利用抗体靶向DC表面特异性受体。目前研究最广泛的DC膜受体是C型凝集素受体，如Clec9a(C-type Lectin domain family 9A)，而Clec9a则选择性表达在交叉递呈能力比较强的CD141⁺DC上。

已有研究表明，抗原靶向Clec9a可引发全面的免疫反应，因而通常都是将抗原与Clec9a抗体进行化学偶联以此来增强抗原的免疫反应，但抗体-抗原复合物存在分子量大，组织渗透性差，生产成本高等问题，因而迫切需要一种能替代Clec9a抗体的靶向hClec9a(h缩写在本领域表示人)的高亲和多肽载体，来达到增强抗原的免疫反应和免疫预防的效果。

发明内容：

本发明独辟蹊径，通过反复筛选、优化得到一种亲和Clec9a的肽，该亲和肽能够显著增强抗原的免疫反应，在免疫治疗和预防中具有很好的应用前景。

第一方面，本发明提供一种Clec9a的亲和肽，其选自下述肽或其组合：

SEQ ID NO.2所示多肽，或其第11位氨基酸发生点突变替换为其他氨基酸的突变肽，其N端或C端截短肽，所述截短肽的氨基酸数目为5、6、7、8、9、10或11个。截短肽，在本领域指从多肽母体的N端或C端截去1至多个后得到的一系列更短的肽，如SEQ ID NO.2所示多肽的C端截去1氨基酸得到的截短肽，序列为SEQ ID NO.4。

任选地，所述点突变选自如下突变：

Lys突变为Arg、Trp、Ala、Leu、Asn、Tyr、Ile、Asp、Glu、Cys、Thr、Ser或Val。任选地，所述截短肽为SEQ ID NO.2所示多肽的N端截短肽，其氨基酸数目为5、6、7、8、9、10或11个。

任选地，所述亲和肽的序列选自SEQ ID NOs：1-11(NOs在本领域表示序列号的并列列举，即序列号为1-11之间的任一个整数)。

任选的，所述亲和肽的各氨基酸的构型独立地选自L型或D型，其所有氨基酸可均为L型或D型，如各氨基酸均为L构型。(尽管甘氨酸不分D、L型，本专利为使对各氨基酸构型的描述简洁，亦将甘氨酸任意定义为：D型或L型)

本发明的Clec9a是指哺乳动物树突状细胞上的受体蛋白，如人Clec9a(hClec9a)或小鼠的。Clec9a可为野生型或仍保留其活性的突变型蛋白。优选本发明的亲和肽为hClec9a亲和肽。另需注意的是，本专利的亲和肽，可以游离形式存在，也可以其药学上可接受的盐的形式存在，基于本专利思路的简单变形，均构成对本专利的等同侵权。

第二方面，本发明提供了前述第一方面所述亲和肽与目的抗原偶联构成的抗原偶联物，该目的抗原：可来源于人源、或鼠源、病原病毒或病原菌，可为内源性或外源性抗原，可为肿瘤相关抗原；如，所述目的抗原为OVA抗原、gp100抗原或E7抗原。所述目的抗原可位于所述亲和肽的N端或C端。所述目的抗原与亲和肽，可通过连接子偶联的，连接子可为(GGGS)nC、(GGSC)n或(GGG)n，其中n＝1-10。

第三方面，本发明提供了前述第一方面所述亲和肽的药物形式，如以自身或进一步偶联成的前述抗原偶联物而制备成药物组合物或试剂盒，试剂盒可用于检测待测物对Clec9a蛋白的亲和能力，或用于定性、定位或定量检测生物样品中Clec9a蛋白表达与否、表达位置或表达含量。

第三方面所述的药物组合物可包含药学上可接受的赋形剂，可为疫苗。

第四方面，本发明公开了所述亲和肽或其药用形式，可用于下述至少一种用途：

1)亲和到Clec9a蛋白上，所述Clec9a可为人源或鼠源的野生型或仍保留其活性的突变型蛋白；

2)用于体内外靶向Clec9a，以增强抗原引起的免疫反应，包括与其它药物的联合治疗；

3)用于体内外递送各类抗原；

4)用于抗肿瘤，包括实体瘤，如黑色素瘤等；

5)治疗细菌、病毒或真菌引起的感染；

6)治疗自身免疫性疾病。

本发明的多肽可通过固相合成制得，如采用Fmoc方案制备。

本发明有益效果：

本发明以Clec9a为靶分子，通过液相差相筛选法进行噬菌体展示十二肽库高通量筛选获得了hClec9a亲和肽SG，亲和活性实验得到SG为高活性候选肽，为进一步提高SG肽活性，以SG为母体肽进行序列优化，得到SG的序列优化肽A11K以及A11K同系列多肽A11R。针对该优化肽进一步的体外亲和力实验表明，优化肽A11K、A11R等也能够亲和hClec9a,且亲和力显著提高。为获知A11K肽的最小活动片段，对A11K肽分别从C端和N端进行截短，针对截短肽的亲和活性实验发现A11K的6-11位为其最小活性片段。实验证明A11K肽具有高亲和hClec9a的活性，且针对人源和鼠源Clec9a蛋白均有效。实验证明了该亲和肽能显著增强抗原的免疫反应。所以本发明的肽在免疫治疗方面具有良好的应用前景，为免疫治疗提供了新的选择。

附图说明：

图1为母体肽SG特异性亲和CHO-K1^hClec9a的实验结果图；

图2为SG突变肽A11K特异性亲和CHO-K1^hClec9a的实验结果图；

图3为A11K与hFL-DC(human dendritic cell)的亲和实验；

图4为A11K将抗原肽hgp100_280-288靶向到hFL-DC并且将抗原实行MHC class I交叉递呈的实验结果；

图5为A11K与HEK-293T^mClec9a的亲和实验(m表示鼠源)；

图6为A11K肽将抗原肽OVA_257-264靶向到mFL-DC并且将抗原实行MHC class I交叉递呈的实验结果：(A)ELISA检测上清中IFN-γ的含量。(B)刺激

T细胞增殖。(C)和(D)分别是perforin和Grz B mRNA水平表达量的倍数变化

图7为A11K从C端或N端截短后的截短肽与CHO-K1^hClec9a的实验结果图；

各图中Control为空白对照，对照肽GA肽序列为：GAGAAGGAGGGG，hgp100_280-288表位肽序列为YLEPGPVTA,OVA_257-264表位肽序列为SIINFEKL，同时制备了在羧基端含有-GGGK^biotin的GA肽和本发明亲和肽的衍生物，另外制备了由连接子(3个甘氨酸，-GGG-)连接hgp100_280-288表位肽、OVA_257-264表位肽与本发明亲和肽或GA肽的衍生物，即GA-OVA表示结构为GA-GGG-SIINFEKL，其他类推。

各图中涉及的显著性分析标识，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

具体实施方式：

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是下列实施例仅用于说明本发明，而不应该为限制本发明的范围。

如无特别说明，下面所用试剂、生物材料、培养基和溶液均为本领域常用、公众可以得到或市售的物品。

1、噬菌体展示肽库液相筛选得到母体肽SG等，大体筛选过程如下：

a)由于噬菌体展示肽库筛选前需要以相应高表达的稳定细胞系为基础，因而发明人构建了CHO-K1^hClec9a与CHO-K1^Vector高表达稳定细胞系作为筛选前提,利用这两种细胞系采用液相差向筛选法进行噬菌体展示十二肽库的筛选工作；

b)经过多轮的筛选洗脱后，与CHO-K1^hClec9a细胞系有亲和力的噬菌体单克隆逐轮得到富集；

从中挑选阳性克隆进行测序，共得到多个插入十二肽序列，其中多个具有重复克隆，优化肽A11K的母体肽SG为阳性克隆之一，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，各氨基酸为L型。

2、亲和实验

a)培养CHO-K1^hClec9a细胞于含有10％FBS的RMPI 1640培养基中，待细胞长至对数期胰酶消化并收集细胞于1.5mL EP管中，每管细胞量均为3×10⁵，1mL PBS7.2洗两遍后，置于冰上备用。

b)带有生物素化标签的多肽与CHO-K1^hClec9a共孵育：称取一定质量的多肽，PBS7.2溶解至100μM。取100μL100μM的多肽加入到准备好的细胞中涡旋混合冰上共同孵育1h。

c)洗涤加抗体：孵育结束后1mL PBS洗1遍，加入0.3μL的抗体(StreptavidinAPC)涡旋混匀后冰上避光孵育30min。

d)洗抗体：1mL预冷的PBS7.2洗一次，3000rpm离心5min后，加入200μL PBS7.2重悬，转入流式管中流式检测细胞与多肽的结合情况。

多肽与空载体细胞系CHO-K1^Vector的亲和实验同上述步骤。

亲和结果表明：本发明的多肽SG母体肽能够特异性的亲和CHO-K1^hClec9a，即特异性亲和hClec9a蛋白。结果如图1所示。

3、以SG为母体肽，进行后续的优化工作，具体实施方法如下：

a)PEPstrMOD在线预测SG肽的3D结构：打开PEPstrMOD网页，输入所需预测的多肽序列，点击Submit and Go to Next Step。在下方输入邮箱后点击提交，系统预测完成后即可在邮箱下载多肽结构。

b)Z-DOCK分子对接：将上述预测得到的SG肽结构分别与hClec9a(PDB ID:3VPP)进行分子对接，分子对接采用Z-DOCK在线对接，MOE分析对接结果，选择对接模式(综合键能、距离、互作位点进行考虑)，并利用MOE运行50ns分子动力学。

c)MOE单位点突变：选择上述分子动力学后的对接模式，利用MOE运行单位点氨基酸突变，将突变完成后的结果进行亲和力高低排序，选择打分较高的前几名进行后续突变肽的合成，根据Fmoc固相合成法得到的2条突变肽，分别命名为A11R、A11K，各氨基酸为L型，质谱鉴定无误后，按照前面的实验2—亲和实验，检测突变肽亲和能力，结果表明优化肽A11K、A11R能够特异性亲和hClec9a，且亲和效率相较母体肽SG显著提高。结果如图2所示。另外，以肽A11K为例，参照实验2检测对mClec9a的亲和(将细胞系对应替换为过表达鼠源Clec9a的过表达细胞系)，结果表明A11K亦可亲和mClec9a。结果如图5所示。

4、诱导表达hClec9a的hFL-DC，具体实施方法如下：

a)获取健康志愿者的脐带血，密度梯度离心法分选出白膜层CBMC(脐带血单个核细胞)；

b)采用CD34⁺cells磁珠分选试剂盒分选出CD34⁺HSC,在steam cell CD34⁺HSC专用扩增培养基中扩增培养7天，获得足够数量的细胞；

c)扩增细胞在10％FBS的RPMI1640培养基，圆底96孔板中进行分化，细胞密度为6.25×10⁴cells/mL,200μL/well，加入所需细胞因子：Flt3L(100ng/mL)、SCF(20ng/mL)、GM-CSF(2.5ng/mL)、IL-4(2.5ng/mL)，第5天半量换液，并添加新的细胞因子。在第8天收获细胞，流式检测诱导结果，并用于后续实验

5、验证A11K肽与hFL-DC的亲和实验，具体实施方式如下：

a)诱导获得hFL-DC，具体方法如实施方式4；

b)亲和实验过程同实施方式2(将细胞系替换为hFL-DC)；

结果如图3所示；

6、检测偶联人源抗原gp100_280-288的A11K肽能够引起DC的交叉递呈,具体实施方案如下：

由于Clec9a是一个内吞性的受体，靶向到Clec9a后能够引起Clec9a的内吞效应和交叉递呈作用。为了验证A11K能够增强这一免疫反应，发明人将A11K肽通过连接子(-GGG-)与人源抗原表位gp100_280-288相连，与hFL-DC孵育后，再与来源于HLA-A2⁺健康志愿者的PBMC(外周血单个核细胞)孵育，诱导出抗原特异性的CTL以此来检测A11K肽的交叉递呈作用。相关实验过程简要介绍如下。

a)合成偶联人源gp100_280-288的抗原肽，即A11K-hgp100_280-288，经质谱鉴定正确，可以用于后续实验。

b)诱导hFL-DC：从HLA-A2⁺健康志愿者血液中分出CBMC，具体方式同实施方式5。在第8天收获细胞。

c)荷肽：分别将10μM、3μM、1μM的A11K-hgp100_280-288、GA-hgp100_280-288、hgp100_280-288、PBS与2×10⁵hFL-DC在4℃孵育2h。孵育结束后，1500rpm离心5min，洗涤1次后，计数调成10⁵cells/mL备用。

d)获得HLA-A2⁺志愿者PBMC：第8天从HLA-A2⁺志愿者外周血中分选PBMC，调整细胞密度为2×10⁶cells/mL，铺于24孔板中，1mL/well。

e)将荷肽的DC与获得的PBMC按照1：10的比例共孵育，加入hIL-7(10U/mL),hIL-2(20U/mL)。之后隔天加入hIL-2。在第14天加入新的荷肽的DC，加入hIL-7(10U/mL),hIL-2(20U/mL)，同时加入人源CD3、CD28刺激性抗体(0.2μL)。之后隔天加入hIL-2、hIL-7，第21天收集CTL(细胞毒性淋巴细胞，Cytotoxic T lymphocytes)细胞。

f)将收集的CTL与乳腺癌细胞MCF-7按照10：1的比例共孵育，加入阻断剂1μL/mL，刺激6h，之后收集细胞进行胞内因子染色实验，验证A11K-hgp100_280-288靶向DC引起的交叉递呈作用。结果如图4所示；

综上结果可以看出，A11K肽相对于几个对照组能够高效的递送抗原，显著增强抗原引起的免疫反应，刺激CD8⁺T细胞分泌杀伤性细胞因子。

7、检测偶联鼠源抗原OVA_257-264的A11K肽能够引起DC的交叉递呈,具体实施方案如下：

发明人将A11K肽通过连接子(-GGG-)将与OVA_257-264表位相连，与mFL-DC孵育后，再与来源于OT-1小鼠的CD8⁺T细胞孵育，以此来检测A11K肽引起的交叉递呈作用。相关实验过程简要介绍如下。

(1)mFL-DC荷载peptide-OVA或者对照肽：获取诱导第12天的mFL-DC，用无血清的RPMI1640培养基洗涤2次；分别将10μM、3μM、1μM的A11K-OVA、GA-OVA、OVA_257-264肽和PBS与2×10⁵的mFL-DC在4℃孵育2h，孵育完后，1500rpm离心5min，洗涤2次后，计数调成10⁵cells/mL备用；

(2)分选获得来源于OT-1小鼠的CD8⁺T细胞：脱颈处死OT-1小鼠，取其淋巴结(腹股沟、腋下和面部淋巴结)，参考EasySepTM mouse

CD8⁺T细胞分选试剂盒说明书，分选得到的CD8⁺T细胞；

(3)小分子CFSE标记CD8⁺T细胞：对步骤(2)中分选得到的CD8⁺T细胞进行CFSE标记，并最终调节细胞密度为1×10⁶cells/mL备用；

(4)荷载肽的mFL-DC与CD8⁺T细胞的共孵育：将步骤(3)中CFSE标记(染色)的CD8⁺T细胞铺于96孔板中，按mFL-DC：CD8⁺T细胞＝1:10(数量比)的比例，加入步骤(1)中荷载肽的mFL-DC，二氧化碳培养箱中37℃培养72h；

培养结束后，利用CFSE标记来检测T细胞的增殖，用ELISA对细胞培养的上清液中的IFN-γ的量进行检测，利用qRT-PCR检测perforin和Grz B mRNA的相对表达量。

相关实验结果如图6所示。对于相关结果简要解释如下。

从图6A可以看出，

与对照组Control、GA-OVA组相比，A11K-OVA能够强烈刺激

T细胞的增殖；作为阳性对照肽OVA_257-264，由于能够直接与MHC class I分子结合，能够直接刺激T细胞的增殖；而空载的DC则不具有刺激T细胞的增殖能力。这一结果表明，A11K肽靶向mDC后，能够将抗原加工后刺激T细胞的增殖。

为了验证T细胞的功能，进一步检测了培养液上清中IFN-γ的含量。结果表明，A11K-OVA组刺激T细胞分泌IFN-γ的含量明显高于Control组、GA-OVA组和OVA_257-264组，这一结果表明，A11K-OVA能够强烈的刺激T细胞并且激活了T细胞，并导致其分泌大量的IFN-γ。对T细胞另外两个杀伤性分子(即穿孔素perforin和颗粒酶granzyme B)在mRNA水平上的表达水平的检测结果表明，A11K-OVA明显的刺激了perforin和Grz B mRNA的表达。

综上结果可以看出，A11K肽不仅能够递送人源抗原，增强免疫反应，同时也可以递送鼠源抗原，增强鼠源抗原引起的免疫反应。

8、将肽A11K进行截短，亲和实验研究其截短肽亲和效率，具体实施方法与上述实施方式3所述相同。

从C端截掉1个氨基酸命名为C1，从N端截掉一个氨基酸命名为N1,以此规律分别命名为C1、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7。

进行亲和实验(实验过程同实施方式2)发现与A11K肽相比，截短肽N5和A11K肽的亲和能力相当。详细结果如图7所示。

亲和肽序列如下表1所示：

序列表

<110> 郑州大学

<120> 亲和Clec9a的多肽及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Ser Ser Ala His Lys Leu Lys Leu Pro Ala Gly

1 5 10

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ser Ser Ser Ala His Lys Leu Lys Leu Pro Lys Gly

1 5 10

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ser Ser Ser Ala His Lys Leu Lys Leu Pro Arg Gly

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ser Ser Ser Ala His Lys Leu Lys Leu Pro Lys

1 5 10

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ser Ser Ala His Lys Leu Lys Leu Pro Lys Gly

1 5 10

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ser Ala His Lys Leu Lys Leu Pro Lys Gly

1 5 10

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ala His Lys Leu Lys Leu Pro Lys Gly

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

His Lys Leu Lys Leu Pro Lys Gly

1 5

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Lys Leu Lys Leu Pro Lys Gly

1 5

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Leu Lys Leu Pro Lys Gly

1 5

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Lys Leu Pro Lys Gly

1 5

Claims (14)

1.一种Clec9a蛋白的亲和肽，所述亲和肽的序列选自SEQ ID NOs：1-3、5-9。

2.如权利要求1所述的亲和肽，其特征是，所述亲和肽的各氨基酸的构型独立地选自L型或D型。

3.如权利要求1所述的亲和肽，其特征是，所述亲和肽所有氨基酸均为L型或D型。

4.如权利要求1所述的亲和肽，其特征是，所述亲和肽的各氨基酸均为L构型。

5.抗原偶联物，由权利要求1-4任一项所述亲和肽与目的抗原偶联构成。

6.如权利要求5所述的抗原偶联物，其特征是，该目的抗原来源于人源、或鼠源、病原病毒或病原菌。

7.如权利要求5所述的抗原偶联物，其特征是，该目的抗原为内源性或外源性抗原。

8.如权利要求5所述的抗原偶联物，其特征是，该目的抗原为肿瘤相关抗原。

9.如权利要求5所述的抗原偶联物，其特征是，所述目的抗原为OVA抗原、gp100抗原或E7抗原。

10.如权利要求5所述的抗原偶联物，其特征在于，所述目的抗原位于所述亲和肽的N端或C端。

11.如权利要求5-10任一项所述的抗原偶联物，其特征在于，所述目的抗原与亲和肽是通过连接子偶联的。

12.如权利要求11所述的抗原偶联物，其特征是，所述连接子为（GGGS）_nC、（GGSC）_n或（GGG）_n，其中n=1~10。

13.药物组合物，含权利要求1-4任一项所述亲和肽或权利要求5-10任一项所述的抗原偶联物。

14.权利要求1-4任一项所述亲和肽、权利要求5-10任一项所述的抗原偶联物或权利要求13所述药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于下述至少一种用途：

1）亲和到Clec9a蛋白上，所述Clec9a为人源或鼠源的野生型蛋白；

2）用于体内外靶向Clec9a，以增强抗原引起的免疫反应；

3）用于体内外递送抗原；

4)用于抗肿瘤，肿瘤为黑色素瘤。

Images