CN107586783A - 抗小反刍兽疫病毒n蛋白单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物免疫分析技术领域，具体涉及抗小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体及其应用。公开了一种抗小反刍兽疫N蛋白的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC C2016135的杂交瘤细胞株所分泌的，本发明还公开了所述单克隆抗体的制备方法和用途。本发明的单克隆抗体特异性强、生物结合活性好，与感染小反刍兽疫病毒的Vero细胞发生反应，而不与正常的Vero细胞反应。本发明的单抗可应用于制备检测小反刍兽疫病毒的试剂盒，以及用于小反刍兽疫病毒的检测，检测特异性高，反应灵敏。

Description

抗小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物免疫分析技术领域，具体涉及小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体及其应用。

背景技术

小反刍兽疫病毒病(peste des petits ruminants，PPRV)主要感染山羊、绵羊、羚羊、美国白尾鹿等小反刍动物，山羊发病比较严重。测这种病毒的方法主要有琼脂凝胶免疫扩散试验(该方法简单，但对病毒抗原含量低的温和型小反刍兽疫检测灵敏度不高)、免疫捕获酶联免疫吸附试验(本法可快速鉴别诊断小反刍兽疫病毒和牛瘟病毒)、对流免疫电泳试验、组织培养和病毒分离(可用原代羔羊肾或非洲绿猴肾细胞组织培养分离)。血清学检查方法主要有：病毒中和试验、竞争酶联免疫吸附试验。这些方法虽然准确可靠，但因具有操作繁琐、检测周期长等缺点，不能满足快速确诊病原、及时控制疫情的实际工作需求，因此建立更灵敏快捷的检测技术对该病的防治具有重要的现实意义。近年建立在单克隆抗体基础上的间接免疫荧光(IF)和酶联免疫吸附试验(ELISA)已在该类病毒的检测中广泛报道，而目前关于小反刍兽疫病毒的敏感性、特异性较强的单克隆抗体还未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种小反刍兽疫病毒N基因编码的重组蛋白。

本发明的第二个目的是利用上述重组蛋白制备一种抗小反刍兽疫病毒N蛋白的有阻断活性的单克隆抗体。

本发明的第三个目的是提供所述有阻断活性的单克隆抗体在检测小反刍兽疫病毒中的应用。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种小反刍兽疫病毒N蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第1-1578位碱基所示。其中SEQ ID NO：1中第1-1578位碱基所示序列还包括对应的氨基酸序列，即CDS区(编码区)，该基因共编码525个氨基酸序列。

一种小反刍兽疫病毒N蛋白的重组蛋白，其蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示，包含525个蛋白质序列。

本发明还包括如序列SEQ ID NO：2所示一种小反刍兽疫N蛋白的重组蛋白作为小反刍兽疫病毒核蛋白抗原蛋白的应用。

进一步，申请人制备了一种单克隆抗体，它是由序列表SEQ ID NO：2所述的小反刍兽疫病毒N蛋白的重组蛋白免疫动物后得到的杂交瘤细胞株1A7所分泌的，所述的杂交瘤细胞株1A7保藏在中国典型培养物保藏中心保藏编号为CCTCC NO：C2016135。

申请人构建了一株分泌小反刍兽疫病毒N蛋白的重组蛋白的杂交瘤细胞株1A7，,该杂交瘤细胞株被命名为杂交瘤细胞株1A7，于2016年6月21日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:C2016135。

所述的分泌小反刍兽疫病毒N蛋白的重组蛋白的杂交瘤细胞株1A7分泌具有阻断活性的单克隆抗体能特异性结合小反刍兽疫病毒N蛋白。

本发明还包括所述的单克隆抗体在检测小反刍兽疫病毒中的应用。

本发明的优点在于：提供了抗小反刍兽疫病毒N蛋白的单克隆抗体和产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明提供的单克隆抗体特异性强、生物结合活性高，与感染小反刍兽疫病毒的Vero细胞发生反应，而不与正常的Vero细胞反应，可应用于制备检测反刍兽疫病毒的试剂盒，用于小反刍兽疫病毒的检测，检测时反应灵敏，从而为建立小反刍兽疫病毒的快速检测方法奠定基础，为该病毒的早期诊断、临床快速检测以及流行病学调查提供有效的工具。

附图说明

图1：是通用的商业质粒PET-28a载体图谱。

图2：是本发明包含小反刍兽疫病毒的免疫印迹法检测结果。附图标记说明：其中1为Vero正常细胞，2为感染反刍兽疫病毒的Vero细胞。

图3：是本发明包含小反刍兽疫病毒的间接免疫荧光检测结果。附图标记说明：其中图3中的A图为感染反刍兽疫病毒的Vero细胞，图3中的B图为Vero正常细胞。

图4：是本发明制备的小反刍兽疫病毒杂交瘤细胞遗传性的稳定检测结果。附图标记说明：其中图4中的A图为SP2/0的染色体数量，图4中的B图为本发明的杂交瘤细胞的染色体数量。

具体实施方式

实施例1抗原的制备

1.小反刍兽疫病毒N基因片段的PCR扩增

根据小反刍兽疫病毒N基因序列(登录号GenBank:KM091959.1)，以小反刍兽疫病毒N基因全长设计引物，以小反刍兽疫病毒N蛋白的cDNA为模板，用PCR的方法扩增出这部分序列。其中，扩增的引物序列分别在上、下游引物中加入SalI、NotI。

上游引物(P1)：5'-GCGTCGACTCATGGCGACTCTCCTTAAAAGC-3'，

下游引物(P2)：5'-CGTGCGGCCGCGCCGAGGAGATCCTTGTCGTT-3'，

上述引物中下划线部分为酶切位点。

2.小反刍兽疫病毒N蛋白基因片段原核表达质粒的构建

小反刍兽疫病毒N蛋白基因片段和PET-28a载体【购自湖南科爱医疗器械有限公司(优宝生物)；载体图谱见图1】分别用SalI、NotI双酶切后，使用胶回收试剂盒(购自Magen公司)回收酶切目的片段和载体，然后在T4DNA连接酶的作用下16℃进行连接，所得到的阳性重组质粒PPRV-N-28a送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序确认。

3.重组质粒PPRV-N-28a的诱导表达

(1)将阳性重组质粒PPRV-N-28a转化大肠杆菌感受态BL21(DE3)。

(2)将所得PPRV-N-28a的阳性菌液按体积比1:100接种到含相应抗生素的LB液体培养基(称取胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 5.0g，加入800mL ddH₂O，充分搅拌溶解，然后用ddH₂O定容至1L，按常规方法灭菌后保存)中，在37℃摇床上180r/min培养。

(3)培养至OD₆₀₀值在0.5-0.6，分别加入IPTG(称取50mg IPTG溶于5mL ddH₂O中，使终浓度为10mg/mL，待粉剂全部溶解后0.22μm滤器过滤除菌，适量小份分装，-20℃保存)使终浓度至1.0mmol/L，37℃摇床上180r/min分别诱导4h。

(4)诱导结束后，于8000r/min离心5min，收集菌体，菌体先用ddH₂O洗涤一次后，用适量的ddH₂O重悬，加入等量的2×蛋白质电泳上样缓冲液，于95℃加热10min，处理后的样品放于冰上备用。以空载体质粒PET-28a做同样处理作为对照。

(5)采用常规SDS-PAGE和Western-Blot免疫学检测方法对其进行表达鉴定。

4.重组蛋白的纯化

(1)取大量诱导后的菌液2L，于8,000r/min离心5min，收集所有菌体，用100mLBinding buffer(5×Binding Buffer：Nacl：146.1g，Tris：12.11g，咪唑：3.404g加ddH₂O定容至1L，用0.22μm滤器过滤除菌，保存备用，将5×Binding Buffer稀释四倍即为BindingBuffer)缓冲液重悬后，高压破碎

(2)破碎后，于4℃12,000r/min离心20min，弃掉沉淀，上清用0.45nm滤器过滤。

(3)过滤后的上清收集到250ml蓝盖瓶中，用常规镍柱亲和层析的方法进行上清蛋白的纯化

(4)将纯化好的蛋白样品用2.0ml的EP管收集起来，根据跑胶图的波峰图选择波峰处的样品进行SDS-PAGE鉴定，鉴定蛋白纯度高低

(5)将纯度高的几管样品用超滤浓缩管进行超滤浓缩，在4℃，4500r/min，离心20min，收集浓缩后的样品即为所需蛋白。

实施例2单克隆抗体的制备

1.免疫

免疫用小白鼠为4周龄雌性的Balb/c小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心)，用纯化的重组蛋白作为抗原，每次用的免疫剂量为0.1mg，共免疫四次，采用皮下多点注射，每次间隔14d。

第一次免疫：纯化重组蛋白和等量的完全弗氏佐剂(购自sigma公司)混匀作为抗原。

第二、三、四次免疫：纯化重组蛋白和等量不完全弗氏佐剂(购自sigma公司)混匀作为抗原。

融合前三天的加强免疫：纯化重组蛋白作为抗原，采用腹腔注射。

2.细胞融合

(1)SP2/0瘤细胞的制备

将实验室冻存的SP2/0细胞(商购的常规细胞)复苏，培养至六孔板，然后收集细胞，用0.3mL基础1640培养基(购买于武汉飞羿科技有限公司，品牌为HyClone)重悬，注射入BALB/c小鼠背部皮下。待10～14天后小鼠背部形成肿瘤时用颈椎脱臼法处死，75％酒精浸泡5min，消毒皮毛。将小鼠固定于解剖盘中，在无菌状态下将肿瘤块剪下，置匀浆器中，加5mL1640基础培养基充分研磨后，补加1640基础培养基至10mL，静置5min，吸取上层的细胞悬液于另一离心管备用，再补加1640基础培养基至10mL，重复两次。于1000rpm离心10min去上清，以20mL 1640基础培养基重悬细胞。在另一50ml离心管中加入15mL淋巴细胞分离液(购自sigma公司)，将SP2/0细胞悬液轻轻地加在分离液之上，1000rpm离心10min，用吸管吸取位于界面致密的白色细胞层，用1640基础培养基洗2遍，计数后备用。

(2)免疫脾细胞的制备

取加强免疫后的BALB/c小鼠一只，眼眶放血处死，收集血液并分离血清得到阳性血清，小鼠于75％酒精中浸泡5min；将小鼠移至超净台内放在解剖板上，无菌条件下取出脾脏，放入匀浆器中，加入3mL 1640基础培养基研磨，再补加10mL 1640基础培养基，静置5min；轻轻吸取上层液体于离心管中，匀浆器中再补加10mL 1640基础培养基混匀，静置5min；如此重复洗涤2次，于1,000r/min下离心10min后，弃去上清，细胞用适量1640基础培养基重悬后计数备用。

(3)饲养细胞的制备

取未经免疫的BALB/c小鼠一只，眼眶放血处死，收集血液并分离血清得到阴性血清，小鼠于75％酒精中浸泡5min；将小鼠移至超净台内放在解剖板上，无菌取出脾脏，放入匀浆器中，加入3mL 1640基础培养基研磨，再补加10mL 1640基础培养基，静置5min；轻轻吸取上层液体于离心管中，匀浆器中再补加10mL 1640基础培养基混匀，静置5min；如此重复洗涤2次，于1,000r/min离心10min后，弃去上清，细胞用适量HAT培养基(购自sigma公司)重悬后备用。

(4)细胞融合

将SP2/0骨髓瘤细胞悬液(1×10⁷cells)与免疫脾细胞悬液(1×10⁸cells)在50mL离心管中混匀，补加适量1640基础培养基，在1,000r/min下离心10min；尽量弃去上清，轻轻弹动离心管底，使细胞沉淀松动；37℃下在1min内缓慢加入预热至37℃的50％聚乙二醇(PEG)0.8mL，边加边轻轻用吸管尖搅拌；再缓慢加入预热至37℃的1640基础培养基10mL，加入时需缓慢并不断轻轻搅拌；最后再缓慢加入30mL预热至37℃的1640基础培养基；1,000r/min离心10min弃去上清后，37℃放置5-8min；用适量HAT(培养基(1640基础培养基+20％胎牛血清+1％青链霉素+2％HAT培养基)重悬，与饲养细胞混合后，接种于96孔细胞培养板，250μL/孔，一次融合可接种4-8块96孔板；将96孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

(5)阳性杂交瘤细胞的筛选

于融合后第4d吸弃一半培养基，补加新鲜的HAT培养基，第8-10d后吸弃全部培养基，换为HT(购自sigma公司)培养基(1640基础培养基+20％胎牛血清+1％青链霉素+2％HT)，待融合细胞形成的集落长至约培养孔1/4大小，细胞上清变黄时，即可进行ELISA检测。筛选出效价相对较高的阳性杂交瘤细胞孔。

(6)阳性杂交瘤细胞的亚克隆

将检测为阳性的杂交瘤细胞按有限稀释法进行亚克隆，克隆前先制备饲养细胞。将要克隆的杂交瘤细胞从孔内轻轻吹下，并计数；用HT培养基将细胞稀释至100、50、25、12.5cells/mL；将上述4个浓度梯度的细胞悬液接种至96孔培养板(100μL/孔)使相应孔的细胞数量分别为10、5、2.5、1.25，并补加相应的饲养细胞；培养至第4d时将培养孔中的液体换为HT培养基，之后定时观察孔内细胞生长情况并记录；待克隆后约7-10d，细胞长至约培养孔的1/3-1/2大小时，用间接ELISA方法(参考：焦奎、张书圣主编，《酶联免疫分析技术及应用》，北京，化学工业出版社，2004年8月)检测；选单集落且检测呈阳性的孔用相同的方法再继续克隆，检测为阳性的孔可继续扩大培养并冻存；经过3次克隆，直到所有克隆化细胞孔阳性率为100％，获得1株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株，申请人将该杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株1A7，于2016年6月21日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：C2016135。

(7)单克隆抗体的大量制备

取8-10周龄的BALB/c小鼠，腹腔注射不完全氟氏佐剂0.5mL/只；7-10d后收集扩大培养的杂交瘤细胞株1A7，1,000r/min离心10min，用适量1640基础培养基重悬；腹腔注射杂交瘤细胞105-106cells/只；7-10d后收集腹水；2000r/min离心10min，取上清备用。

(8)单克隆抗体的纯化

2.按照IgG抗体纯化试剂盒(购自Thermo公司)的操作说明书操作，纯化该腹水以获得单克隆抗体。具体操作步骤如下：

(1)去掉抗体纯化柱底部帽子，将纯化柱放在1.5ml Ep管上，在柱子中加入300μlBinding Buffer，盖上纯化柱盖子，颠倒混匀后，5000r/min，离心1min；

(2)弃去下层离心管内液体，重复上述步骤2次；

(3)在纯化柱内加入100μl待纯化的单克隆抗体腹水，上下颠倒混匀10min，5000r/min，离心1min，盛接在1.5ml Ep管内的液体为洗脱液，做好标记；

(4)将纯化柱用Binding Buffer洗3次，每次5000r/min，离心1min；

(5)在纯化柱中加入300μl洗脱液，上下颠倒混匀，并将柱子放在事先已加入40μl中和液的1.5ml Ep管上，5000r/min，离心1min，收集于1.5ml Ep管内的液体即为第一次纯化获得的单克隆抗体，并做好标记；

(6)重复上述步骤，分别得到第二次和第三次纯化获得的抗体，做好标记；

(7)将纯化柱用Binding Buffer洗3次，每次5000r/min，离心1min；

(8)再将纯化柱用保存液(该试剂盒自带)洗3次，5000r/min，离心1min；

(9)于纯化柱内加入300μl保存液，混匀后将试剂盒放回4℃保存。

实施例3单克隆抗体的生物活性检测

(1)单克隆抗体的腹水效价测定

具体方法：

用间接ELISA方法检测上述单克隆抗体的腹水效价，用本发明制备的PPRV-N-28a蛋白包被酶标板后，将腹水从体积比1:100倍比稀释至1:3276800做为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG(购买自博士德生物有限公司)为二抗进行间接ELISA检测，并设阴性小鼠血清对照。

结果：本发明所述的单克隆抗体腹水效价为1：204800。

(2)免疫印迹法检测

1)Vero细胞经PPRV感染96小时时细胞出现明显病变，裂解细胞后，加入5×SDS(5×SDS配制方法：1M Tris-HCl 1.25mL，SDS 0.5g，溴酚蓝25mg甘油2.5mL加入去离子水溶解后定容至5mL。使用前每1ml里加入50μl的2-ME(2-巯基乙醇)加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右)蛋白电泳上样缓冲液，同时取正常细胞样品。

2)将1)处理的样品加入电游仪上样孔中，每孔加入样品20μL，其中Marker 7μL，在稳定电压的条件下，起始时用低电压(80V)，待样品跑过浓缩胶后，加大电压至120V，电泳至溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳，取下凝胶。

3)剪去电泳凝胶多余的部分，将其放在用转膜缓冲液湿润的滤纸上。剪取一块与电泳凝胶相同大小的硝酸纤维膜(孔径0.22微米)，用甲醇浸泡1min，放在电泳后的凝胶上，将第二块湿润的滤纸贴在硝酸纤维素膜上。

4)将上述固定好的样品放入装有转膜缓冲液的电泳槽中，凝胶面朝向负极；稳定电流35mA，通电过夜。

5)转移完毕，取出硝酸纤维素膜放入封闭液中封闭1h，37℃。

6)用TBST(pH8.0的TBS的配制：称取1.21g Tris，8.775g NaCl溶于900mL ddH₂O中，调pH值至8.0，用蒸馏水定容至1L，室温下保存。TBST配制：含0.05％Tween-20的TBS。)洗3次，每次5min。

7)将硝酸纤维素膜加入小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体(按体积比1∶500稀释于封闭液)，37℃缓慢摇动1h。

8)用TBST洗3次，每次5min。

9)将硝酸纤维素膜辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(购自博士德生物有限公司)(按体积比1：3000稀释于封闭液)，37℃缓慢摇动1h。

10)用TBST洗3次，每次5min，用化学发光底物(购自advansta公司)显色，并于化学发光成像系统中成像拍照。

结果表明：本发明制备的单克隆抗体与小反刍兽疫病毒N蛋白发生特异性反应，结果如图2所示，本发明制备的单克隆抗体能与病毒杂交显示出条带，而不和细胞发生反应，说明该单克隆抗体是有活性的，可以与真核表达蛋白发生反应。

(3)间接免疫荧光检测

1)将Vero细胞接种至24孔板，待细胞长至80％-90％后，感染小反刍兽疫病毒，同时设置正常细胞作为对照；

2)继续培养24-48h待细胞刚好出现病变时，弃去培养液，用磷酸盐缓冲液即PBS(配制方法：8.0g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄，溶于950mL蒸馏水中，调pH值至7.4，用ddH₂O定容至1L，常规高温高压灭菌，室温下保存)洗涤，5min×3次；

3)加入100％甲醇固定10min，PBS洗涤，5min/次，洗3次；

4)加入封闭液(含1％牛血清白蛋白即BSA的PBS)，室温孵育1h；

5)用PBS洗涤，5min/次，洗3次；

6)加入待检的单抗样品，室温孵育1h；

7)用PBS洗涤，5min/次，洗3次；

8)加入Alexa Fluor 555羊抗鼠IgG(购自博士德生物有限公司)(按体积比1:500稀释)，室温下避光孵育1h；

9)用PBS洗涤，5min/次，洗3次之后，在荧光显微镜下观察并拍照。

结果:如图3所示，小反刍兽疫病毒感染组出现明显的绿色荧光，而正常细胞的对照组则没有荧光出现，说明本发明制备的单克隆抗体能特异性与小反刍兽疫病毒结合，且结合活性较好。

实施例4杂交瘤细胞的遗传性的稳定分析

(1)秋水仙素处理，使细胞停止分裂：取对数生长期的杂交瘤细胞24孔板中的一个孔，加入秋水仙素到培养液内使终浓度为0.4μg/ml。37℃温箱中继续培养2.5-3h。

(2)收集处理的细胞：倾出秋水仙素处理液，细胞消化好后加入1640培养液将细胞吹下。1600r/min离心5min收集细胞。

(3)低渗处理，使细胞肿胀：将细胞沉淀用600μl 37℃预温的0.075mol/L的KCl(配制方法：将0.28g KCl加到50ml ddH₂O中，混匀)低渗溶液悬浮，混匀后置37℃温育30-35min。

(4)固定：加入新配制的固定液(甲醇∶冰乙酸体积比3:1混合)600μl，混匀，1600r/min离心5min，弃上清液。再加入固定液800μl，轻轻混匀，静置20-30min，1600r/min离心5min，弃上清液。再次加入固定液800μl，轻轻混匀，静置20-30min或4℃过夜，1600r/min离心5min，弃上清液。

(5)细胞重悬与浓度检测：每管加入100μl固定液，混匀。吸取50μl细胞悬液于4℃预冷的干净载玻片上，轻吹液滴，使细胞悬液铺展于玻片上，室温下自然干燥。(在显微镜下观察，如果细胞均匀地铺开，细胞不重叠，则用同样细胞浓度制备细胞样品。否则要进一步稀释细胞悬液，以达到满意的铺片效果。)

(6)染色：用10％Giemsa染液染(姬姆萨染色液原液配制：姬姆萨染料0.6g(0.15g)加于50mL(12.5ml)甘油中，置55℃～60℃水浴1.5h～2h后，加甲醇50mL(12.5ml)，静置24h以上，用0.45μm滤器过滤即成姬姆萨染色液原液，装于棕色瓶内保存备用。10％Giemsa染液配制：取原液1份加入9份0.01mol/L pH7.2的PBS中混匀。)10-15min。流水冲洗，自然干燥。

(7)观察与计数：将载玻片置显微镜油镜下观察计数。

结果显示，本发明制备的杂交瘤细胞1A7的染色体数量大约为100条左右，而正常小鼠脾细胞的染色体条数约为40，本发明的杂交瘤细胞1A7约为SP2/0细胞和正常脾细胞染色体数量之和(见图4)。说明本发明筛选的杂交瘤细胞株是单个小鼠免疫脾细胞和单个小鼠骨髓瘤细胞融合所产生的，其染色体数是正确的，遗传性稳定。

实施例5单克隆抗体的阻断活性检测

1.阻断ELISA检测

(1)用本发明的PPRV-N-28a蛋白包被酶标板，4℃包被过夜；

(2)弃掉包被液，用PBST(8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，0.2gKH₂PO₄，0.5mL Tween-20，加ddH₂O定容至1L)洗3次，200μl/孔，3min/次；

(3)每孔加入100μl封闭液，37℃封闭1h，然后弃掉封闭液，用PBST洗3次，200μl/孔，3min/次；

(4)在酶标板的一孔加入羊阴性血清100μl，另外两孔中分别加入羊PPRV高免血清(购买于天行健生物制品公司)按体积比1:5稀释和PPRV-N所制兔多抗(购自武汉爱博泰克生物科技有限公司)按1:200稀释100μl/孔，37℃封闭3h，然后弃掉液体，用PBST洗3次，200μl/孔，3min/次；

(5)每孔加入PPRV-N单克隆抗体1A7株细胞上清100μl，37℃封闭1h，然后弃掉液体，用PBST洗3次，200μl/孔，3min/次；

(6)每孔加入HRP羊抗小鼠二抗(购自博士德生物有限公司)(按体积比1:5000稀释)100μl，37℃封闭1h，然后弃掉液体，用PBST洗3次，200μl/孔，3min/次；

(5)每孔加入50μl底物A(购自武汉科前动物生物制品有限责任公司)，底物B(购自武汉科前动物生物制品有限责任公司)，37℃避光孵育10min，加入底物C(购自武汉科前动物生物制品有限责任公司)终止反应，检测OD₆₃₀值。结果见表1。

表1本发明所制备的单克隆抗体1A7的阻断活性测试

结果显示：在加有羊阳性血清与兔多抗的孔与加有阴性血清的孔相比OD₆₃₀值明显降低且阻断率(PI)＝100-OD_阳性/OD_阴性×100，阻断率分别为76.9％，68.5％(结果见表1)。这表明本发明制备的单克隆抗体1A7具有阻断活性。

Claims (7)

1.一种小反刍兽疫病毒N蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1中第1-1578位碱基所示。

2.一种小反刍兽疫病毒N蛋白的重组蛋白，其蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。

3.权利要求2所述的一种小反刍兽疫病毒N蛋白的重组蛋白作为小反刍兽疫病毒核蛋白抗原蛋白的应用。

4.一种单克隆抗体，它是由权利要求2所述的小反刍兽疫病毒N蛋白的重组蛋白免疫动物后得到的杂交瘤细胞株1A7所分泌的，所述的杂交瘤细胞株1A7保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2016135。

5.一株分泌小反刍兽疫病毒N蛋白的重组蛋白的杂交瘤细胞株1A7，其特征在于，该杂交瘤细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2016135。

6.权利要求5所述的分泌小反刍兽疫病毒N蛋白的重组蛋白的杂交瘤细胞株1A7，其特征在于，该杂交瘤细胞株1A7分泌具有阻断活性的单克隆抗体能特异性结合小反刍兽疫病毒N蛋白。

7.权利要求4所述的单克隆抗体在检测小反刍兽疫病毒中的应用。