CN104710516B - 抗斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白orf46的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白orf46的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC C2014242的杂交瘤细胞株所分泌的，本发明还公开了所述单克隆抗体的制备方法和用途。本发明的单克隆抗体特异性强、生物结合活性好，与感染斑点叉尾鮰病毒的CCO细胞发生反应，而不与正常的CCO细胞反应，可应用于制备检测斑点叉尾鮰病毒的试剂盒，用于斑点叉尾鮰病毒的检测，检测特异性高，反应灵敏。

Description

抗斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物基因工程领域，具体涉及斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46基因编码的重组蛋白、由其制备的单克隆抗体及应用。
背景技术
斑点叉尾鮰病毒病(channel catfish virusdisese，CCVD)是斑点叉尾鮰鱼苗及幼鱼的主要传染性疾病，能够在短时间内造成40％～90％的鱼苗的死亡，危害严重，该病的病原1971年被确认为斑点叉尾鮰病毒(channel catfish virus，，CCV)。国内外检测这种病毒的方法主要有中和试验、点杂交检测技术、PCR技术、实时定量荧光探针PCR技术、免疫荧光技术等。这些方法虽然准确可靠，但因具有操作繁琐、检测周期长等缺点，不能满足快速确诊病原、及时控制疫情的实际工作需求，因此建立更灵敏快捷的检测技术对该病的防治具有重要的现实意义。近年建立在单克隆抗体基础上的间接免疫荧光(IF)和酶联免疫吸附试验(ELISA)已在鱼类病毒的检测中广泛报道，而目前关于斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46的敏感性、特异性较强的单克隆抗体还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46基因编码的重组蛋白。
本发明的第二个目的是利用上述重组蛋白制备一种抗斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46的单克隆抗体。
本发明的第三个目的是提供所述单克隆抗体在检测斑点叉尾鮰病毒中的应用。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46基因编码的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
编码所述重组蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
所述的重组蛋白作为斑点叉尾鮰病毒囊膜抗原蛋白的应用。
一种单克隆抗体，它是由所述的重组蛋白免疫动物后得到的杂交瘤细胞株3B8所分泌的，所述杂交瘤细胞株3B8保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCC2014242。
所述的单克隆抗体在检测斑点叉尾鮰病毒中的应用。
本发明的优点在于：提供了抗斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46的单克隆抗体和产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明提供的单克隆抗体特异性强、生物结合活性高，与感染斑点叉尾鮰病毒的CCO细胞(斑点叉尾鮰卵巢细胞)发生反应，而不与正常的CCO细胞反应，可应用于制备检测斑点叉尾鮰病毒的试剂盒，用于斑点叉尾鮰病毒的检测，检测时反应灵敏，从而为建立斑点叉尾鮰病毒的快速检测方法奠定了基础，为该病毒的早期诊断、临床快速检测、流行病学调查提供了有效的工具。
附图说明
图1是斑点叉尾鮰病毒免疫印迹法检测的荧光显微照片，图中1为CCO正常细胞，2为感染斑点叉尾鮰病毒的CCO细胞。
图2是斑点叉尾鮰病毒间接免疫荧光检测的荧光显微照片，图中A为感染斑点叉尾鮰病毒的CCO细胞，B为CCO正常细胞。
具体实施方式
实施例1抗原的制备
1.斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46基因片段的PCR扩增
根据斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46基因序列(GenBank登录号：AAA88149.1)，并分析蛋白OFR46的免疫原性、亲疏水性及表面可及性，结果显示在233-590位氨基酸片段的亲水性及抗原指数较高且位于膜外区，故选取233-590位氨基酸的基因序列设计引物，以斑点叉尾鮰病毒的DNA为模板，PCR扩增该序列。其中，扩增的引物序列分别在上、下游引物中加入BamHI、HindⅢ，上游引物加入起始密码子，下游引物加入终止密码子。
上游引物为：5'-AAAGGATCCATGTGTTACGGTCCGTTGGCC-3'，
下游引物为：5'-AAAAAGCTTTCAAGAGAAATCGACGGCGT-3'，
划线部分为酶切位点。
2.斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46基因片段原核表达质粒的构建
斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46基因片段和pGEX-KG载体分别用BamHI、HindⅢ双酶切后，使用胶回收试剂盒回收酶切目的片段和载体，然后在T4DNA连接酶的作用下16℃进行连接，所得到的阳性重组质粒CCV-ORF46-KG送到北京擎科新业生物技术有限公司进行测序确认。
3.重组质粒CCV-ORF46-KG的诱导表达
①将阳性重组质粒CCV-ORF46-KG转化大肠杆菌感受态BL21(DE3)。
②将所得CCV-ORF46-KG的阳性菌液按1:100接种到含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床上180r/min培养。
③培养至OD600值在0.5-0.6之间，加入IPTG使终浓度为1.0mmol/L，37℃摇床上180r/min诱导4h。
④诱导结束后，8,000r/min离心5min，收集菌体，菌体用PBS洗涤一次后，用适量的PBS重悬，加入等量的2×蛋白质电泳上样缓冲液，95℃加热10min，处理后的样品放于-20℃备用。对照组空载体质粒pGEX-KG做同样处理。
⑤采用SDS-PAGE和Western-Blot免疫学检测方法对其表达情况进行鉴定。
4.重组蛋白的纯化
①取大量诱导后的菌液200mL，8,000r/min离心5min，收集所有菌体，用20mL缓冲液重悬后，加入20μL DTT，高压破碎；
②破碎后，样品4℃12,000r/min离心10min，弃掉上清，沉淀用灭菌水洗涤两次，加入19.7mL缓冲液、0.3mL SKL(20％)和20μL DTT，剧烈震荡后，室温静置0.5-2.0h；
③4℃，12,000r/min离心10min，收集上清；
④在上述上清中加入210μL PEG4000(20％)、420μL氧化性谷胱甘肽(50mmol/L)、420μL还原性谷胱甘肽(100mmol/L)，装袋后透析3天；第一天每2h更换透析液一次，第二天每4-5h更换透析液一次，第三天更换两次；
⑤PEG8000浓缩至所需体积，样品于-80℃保存备用。
实施例2单克隆抗体的制备
1.免疫
用纯化的重组蛋白作为抗原免疫4周龄雌性的Balb/c小鼠，每次需用免疫剂量为0.1mg，共免疫四次，采用皮下多点注射，每次间隔14d。
第一次免疫：纯化重组蛋白与等量的完全弗氏佐剂混匀作为抗原。
第二、三、四次免疫：纯化重组蛋白与等量不完全弗氏佐剂混匀作为抗原。
融合前三天的加强免疫：纯化重组蛋白作为抗原，采用腹腔注射。
2.细胞融合
1)SP2/0骨髓瘤细胞的制备
将实验室冻存的SP2/0骨髓瘤细胞复苏，培养至六孔板，然后收集细胞，用0.3mL1640基础培养基重悬，注入BALB/c小鼠背部皮下。待10～14天后小鼠背部形成肿瘤时用颈椎脱臼法处死，75％酒精浸泡5min，消毒皮毛。将小鼠固定于解剖盘中，无菌状态下将肿瘤块剪下，置匀浆器中，加入5mL1640基本培养基充分研磨后，补加1640基本培养基至10mL，静置5min，吸取上层的细胞悬液于另一离心管备用，再补加1640基本培养基至10mL，重复两次。1,000rpm离心10min去上清，以20mL 1640基本培养基重悬细胞。在另一50ml离心管中加入15mL淋巴细胞分离液，将SP2/0细胞悬液轻轻地加在分离液之上，1,000rpm离心10min，用吸管吸取位于界面致密的白色细胞层，用1640基本培养基洗2遍，计数后备用。
2)免疫脾细胞的制备
取加强免疫后的BALB/c小鼠一只，眼眶放血处死，收集血液并分离血清得到阳性血清，小鼠于75％酒精中浸泡5min；将小鼠移至超净台内放在解剖板上，无菌取出脾脏，放入匀浆器中，加入3mL 1640基础培养基研磨，再补加10mL 1640基础培养基，静置5min；轻轻吸取上层液体于离心管中，匀浆器中再补加10mL 1640基础培养基混匀，静置5min；如此重复洗涤2次，1,000r/min离心10min后，弃去上清，细胞用适量164基础培养基重悬后计数备用。
3)饲养细胞的制备
取未经免疫的BALB/c小鼠一只，眼眶放血处死，收集血液并分离血清得到阴性血清，小鼠于75％酒精中浸泡5min；将小鼠移至超净台内放在解剖板上，无菌取出脾脏，放入匀浆器中，加入3mL 1640基础培养基研磨，再补加10mL 1640基础培养基，静置5min；轻轻吸取上层液体于离心管中，匀浆器中再补加10mL 1640基础培养基混匀，静置5min；如此重复洗涤2次，1,000r/min离心10min后，弃去上清，细胞用适量HAT培养基重悬后备用。
4)细胞融合
将SP2/0骨髓瘤细胞悬液(1×107cells)与免疫脾细胞悬液(1×108cells)在50mL离心管中混匀，补加适量1640基础培养基，1,000r/min离心10min；尽量弃去上清，轻轻弹动离心管底，使细胞沉淀松动；37℃下在1min内缓慢加入预热至37℃的50％PEG 0.8mL，边加边轻轻用吸管尖搅拌；再缓慢加入预热至37℃的1640基础培养基10mL，加入时需缓慢并不断轻轻搅拌；最后再缓慢加入30mL预热至37℃的1640基础培养基；1,000r/min离心10min弃去上清后，37℃放置5-8min；用适量HAT培养基重悬，与饲养细胞混合后，接种于96孔细胞培养板，250μL/孔，一次融合可接种4-8块96孔板；将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
3.阳性杂交瘤细胞的筛选
于融合后第4d吸弃一半培养基，补加新鲜的HAT培养基，第8-10d后吸弃全部培养基，换为HT培养基，待融合细胞形成的集落长至约培养孔1/4大小，细胞上清变黄时，即可进行ELISA检测。筛选出效价相对较高的阳性杂交瘤细胞孔。
4.阳性杂交瘤细胞的亚克隆
将检测为阳性的杂交瘤细胞按有限稀释法进行亚克隆，克隆前先制备饲养细胞。将要克隆的杂交瘤细胞从孔内轻轻吹下，并计数；用HT培养基将细胞稀释至100、50、25、12.5cells/mL；将上述4个浓度的细胞悬液接种至96孔培养板，100μL/孔，使相应孔的细胞数量分别为10、5、2.5、1.25，并补加相应的饲养细胞；培养至第4d时换液，之后定时观察孔内细胞生长情况并记录；待克隆后约7-10d，细胞长至约培养孔1/3-1/2大小时，用间接ELISA方法检测；选单集落且检测呈阳性的孔用相同的方法再继续克隆，检测为阳性的孔可继续扩大培养并冻存；经过3次克隆，直到所有克隆化细胞孔阳性率为100％，获得1株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株，命名为3B8，所述杂交瘤细胞株3B8已于2014年12月22日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCC2014242。
5.单克隆抗体的大量制备
取8-10周龄的BALB/c小鼠，腹腔注射不完全氟氏佐剂0.5mL/只；7-10d后收集扩大培养的杂交瘤细胞株3B8，1,000r/min离心10min，用适量基础1640培养基重悬；腹腔注射杂交瘤细胞105-106cells/只；7-10d后收集腹水；2,000r/min离心10min，取上清备用。
6.单克隆抗体的纯化
按照IgG抗体纯化试剂盒的操作说明，纯化该腹水以获得单克隆抗体。具体操作步骤如下：
①去掉抗体纯化柱底部帽子，将纯化柱放在1.5ml Ep管上，在柱子中加入300ul结合缓冲液(Binding Buffer)，盖上纯化柱盖子，颠倒混匀后，5,000r/min，离心1min；
②弃去下层离心管内液体，重复上述步骤2次；
③在纯化柱内加入100ul待纯化的单克隆抗体腹水，上下颠倒混匀10min，5,000r/min，离心1min，盛接在1.5ml Ep管内的液体为洗脱液，做好标记；
④将纯化柱用Binding Buffer洗3次，5,000r/min离心1min；
⑤在纯化柱中加入300ul洗脱液，上下颠倒混匀，并将柱子放在事先已加入40ul中和液的1.5ml Ep管上，5,000r/min，离心1min，收集于1.5ml Ep管内的液体即为第一次纯化获得的单克隆抗体，并做好标记；
⑥重复上述步骤，分别得到第二次和第三次纯化获得的抗体，做好标记；
⑦将纯化柱用Binding Buffer洗3次，每次5,000r/min，离心1min；
⑧再将纯化柱用保存液洗3次，5,000r/min，离心1min；
⑨于纯化柱内加入300ul保存液，混匀后将试剂盒放回4℃保存。
实施例3单克隆抗体的生物活性检测
1.单克隆抗体的腹水效价测定
方法：用间接ELISA方法检测上述单克隆抗体的腹水效价，用CCV-ORF46-KG蛋白包被酶标板后，将腹水从1:800倍比稀释至1:1638400做为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗进行间接ELISA检测，并设阴性小鼠血清对照。
结果：本发明所述的单克隆抗体腹水效价为1：409600。
2.免疫印迹法检测
①CCO细胞经CCV感染24小时后细胞出现明显病变，裂解细胞并加入5×SDS蛋白电泳上样缓冲液，同时取正常细胞样品做为阴性对照。
②将①处理的样品加入电游仪上样孔中，每孔加入样品20uL，其中Marker 7uL，在稳定电压的条件下，起始时用低电压(80V)，将待样品跑过浓缩胶后，加大电压至120V，当电泳至溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳，取下凝胶。
③剪去电泳凝胶多余的部分，将其放在用转膜缓冲液湿润的滤纸上。剪取一块与电泳凝胶相同大小的硝酸纤维膜(孔径0.22微米)，用甲醇浸泡1min，放在电泳后的凝胶上，将第二块湿润的滤纸贴在硝酸纤维素膜上。
④将上述固定好的样品放入装有转膜缓冲液的电泳槽中，凝胶面朝向负极；稳定电流359mA，通电1h。
⑤转移完毕，取出硝酸纤维素膜放入封闭液中封闭1h，37℃。
⑥用TBST洗3次，每次5min。
⑦将斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46的单克隆抗体用封闭液稀释500倍，37℃孵育上述硝酸纤维素膜，缓慢摇动1h。
⑧用TBST洗3次，每次5min。
⑨将硝酸纤维素膜放入1：1000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG中，37℃缓慢摇动1h。
⑩用TBST洗3次，每次5min，用化学发光底物显色，并于化学发光成像系统中成像拍照。
结果：本发明的单克隆抗体与斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46发生特异性反应，如图1所示，该单克隆抗体能与斑点叉尾鮰病毒感染组杂交显示出条带，而不和正常细胞对照组发生反应，说明该单克隆抗体是有活性的，可以与斑点叉尾鮰病毒发生反应。
3.间接免疫荧光检测
①将CCO细胞接种至24孔板，待细胞长至80％-90％后，感染斑点叉尾鮰病毒，同时设置正常细胞对照；
②继续培养24-48h待细胞刚好出现病变时，弃去培养液，用PBS洗涤，5min×3次；
③加入100％甲醇固定10min，PBS洗涤，5min×3次；
④加入封闭液，室温孵育1h；
⑤PBS洗涤，5min×3次；
⑥加入待检的单抗样品3B8，室温孵育1h；
⑦PBS洗涤，5min×3次；
⑧加入Alexa Fluor 555羊抗鼠IgG(1:300稀释)，室温孵育1h；
⑨PBS洗涤，5min×3次后，然后至荧光显微镜下观察并拍照。
结果:如图2所示，斑点叉尾鮰病毒感染组出现明显的红色荧光，而正常细胞的对照组则没有荧光出现，说明制备的单克隆抗体能特异性与斑点叉尾鮰病毒结合，且结合活性较好。
综上，本发明制备的单克隆抗体可用于斑点叉尾鮰病毒的检测，且检测特异性高，反应灵敏。

Claims (1)

1.抗斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46的单克隆抗体在检测斑点叉尾鮰病毒中的应用，所述抗斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46的单克隆抗体，它是由斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46基因编码的重组蛋白免疫动物后得到的杂交瘤细胞株3B8所分泌的，所述杂交瘤细胞株3B8保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC C2014242，
所述斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
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