CN105695417A - 一株分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，该杂交瘤细胞株能够产生抗牛支原体的单克隆抗体，并用于检测牛支原体。该杂交瘤细胞株的保藏编号为：CCTCC C2015183，保藏日期为：2015年11月8日。本发明的优点在于：本发明所获得的细胞株能够特异性的分泌针对牛支原体的单克隆抗体，具有较好的灵敏度和较高的特异性。本发明的优点还在于：利用本发明获得的细胞株所产生的抗体能够应用于多种途径，对实际生产有较好的应用价值。

Description

一株分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及一株分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

支原体(Mycoplasma)，又称霉形体，属于柔膜体纲，支原体目，支原体科，其大小介于细菌和病毒之间，是目前已知的能够在无生命培养基中生长繁殖的最小原核微生物，并能够通过0.22μm的细菌滤器。由于支原体缺乏细胞壁，因此具有多形性，且对作用于细胞壁的抗生素有抵抗力。在固体培养基上，支原体菌落呈露滴状、煎蛋样或颗粒状。自1898年法国科学家Nocard等人首次从呼吸道疾病患病牛肺脏组织中分离出该类微生物以来，人、动物、植物及昆虫源性的此类微生物相继被分离鉴定。1967年，该类微生物被国际细菌命名委员会正式命名为支原体并沿用至今。迄今为止，分离鉴定的支原体已达190种以上，其中许多种类可对人、动物、植物及昆虫致病，造成极大危害。

牛支原体(Mycoplasmabovis,Mb)是牛呼吸系统疾病的主要病因之一，其感染可导致牛的肺炎、耳炎、关节炎、精囊炎、乳房炎、生殖道炎症、流产及不孕症等疾病。1961年，美国人Hale等首次在乳房炎患病牛中分离到该病原，1976年，其致病性被证实。此后，牛支原体感染迅速向世界各地传播蔓延，并遍布欧洲、大洋洲、美洲以及亚洲。其中以欧洲最为严重，所造成的损失亦最为惨重。仅在英国，每年约有190万头牛感染发病，且死亡率高达82.％，经济损失约为5400万英镑(Reeve-Johnson,1999)。而美国牛群中牛支原体感染率高达70％，每年的经济损失约为1.08亿美元(RosengartenandCitti，1999)。在我国，黎济申等人于1983年首次从国内乳腺炎病牛的乳汁分离到牛支原体，证实了我国牛群牛支原体感染的存在。2008年，辛九庆等人从传染性坏死性肺炎病死犊牛肺脏中分离出牛支原体，随后证实该病在全国大部分地方普遍流行，且其发病率高达50％-100％，病死率通常为10％-50％。由于目前尚无理想的疫苗进行预防，加之该病原具有多重耐药性，因此，该病给我国养牛业造成了巨大的经济损失。基于此，快速、准确的牛支原体检测方法的建立，必将为该病的有效防控奠定基础。

目前，牛支原体肺炎的诊断以实验室诊断为主。虽然分离和鉴定牛支原体的方法最为确实，但其耗时较长。而用常规的抗体检测方法诊断牛支原体肺炎则灵敏度低，非特异性高。虽然PCR和环介导等温扩增技术灵敏度高，但却极易因核酸的污染而出现假阳性，且PCR技术需要特殊的仪器设备，因此其难以普及。应用单克隆抗体建立的牛支原体检测方法，虽然灵敏度较高，但通常难以对牛支原体和无乳支原体进行有效鉴别。

发明内容

本发明针对目前检测牛支原体存在的问题，提供了一株能产生与牛支原体发生抗原抗体反应的IgG1亚型抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

本申请人通过对牛支原体基因组的分析，发现牛支原体不同菌株的脂蛋白P48基因高度保守，国内外来源的不同菌株其脂蛋白P48基因序列完全一致。而该基因序列与无乳支原体的相关基因序列存在一定的差异，两者的同源性约为80％左右。因此，申请者设计引物对牛支原体脂蛋白P48基因进行了扩增和原核表达，以纯化的表达产物为抗原免疫Balb/c小鼠，在细胞融合的基础上筛选出了可分泌牛支原体特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，并利用所分泌的单克隆抗体，建立了特异强、灵敏高的牛支原体双抗夹心ELISA检测方法。

本发明提供一株分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编号为：CCTCCC2015183，保藏日期为：2015年11月8日，细胞分类命名为：杂交瘤细胞株NZYT-ZJC，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学。

本发明还提供由权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。

本发明的第三个目的是提供单克隆抗体的制备方法，是将权利要求1所述的杂交瘤细胞株细胞种植到实验动物腹腔产生腹水而获得的。

作为优选方案，步骤如下：向小鼠腹腔注射0.5mL的液体石蜡，9天后，每只小鼠腹腔注射5×10⁵-10⁶个杂交瘤细胞，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水，4℃，1200r/min离心3min，收集中间层，获得单克隆抗体。

本发明的第四个目的是提供杂交瘤细胞株的应用，将杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体用于检测牛支原体。

作为优选方案，将所述的单克隆抗体配置在检测牛支原体的免疫试剂盒中。

作为优选方案，将所述的单克隆抗体制成用于检测牛支原体的胶体金免疫试纸条。

本发明的第五个目的是提供检测牛支原体的间接法酶联免疫试剂盒，包括一抗，所述一抗为权利要求1所述的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。

作为优选方案，所述试剂盒还包括酶标二抗，所述酶标二抗为羊抗鼠酶标二抗。

本发明的第六个目的是提供检测牛支原体的胶体金免疫试纸条，包括胶体金垫，胶体金垫中含有权利要求1所述的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。

本发明的优点在于：本发明所获得的细胞株能够特异性的分泌针对牛支原体的单克隆抗体，具有较好的灵敏度和较高的特异性，能够对牛支原体和无乳支原体进行有效鉴别。本发明的优点还在于：利用本发明获得的细胞株所产生的抗体能够应用于多种途径，对实际生产有较好的应用价值。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为P48基因的PCR分段扩增；

图2为牛支原体武威株P48基因PCR扩增及重组质粒pET-P48电泳图；其中，A为牛支原体武威株P48基因PCR扩增产物电泳图，M为DL5000DNAMarker；1：牛支原体武威株P48基因；B为重组质粒pET-P48电泳图，其中，M：DL2000DNAMarker；1：pET-P48重组质粒；

图3为P48蛋白原核表达产物的SDS-PAGE电泳鉴定；其中，M：预染的蛋白分子质量标准；1：pET-P48未经IPTG诱导；2：pET-P48经IPTG诱导；3：pET-P48裂解后上清；4：pET-P48裂解后沉淀；5：纯化后的P48蛋白；

图4为本发明的单克隆抗体纯化后的SDS-PAGE鉴定图；1：纯化后的单克隆抗体；M：预染的蛋白分子质量标准；

图5为本发明的单克隆抗体的ELISA检测特异性分析；

图6为本发明的单克隆抗体的特异性分析。其中，A中：M：预染的蛋白分子质量标准；1：牛支原体；2：沙雷氏菌；3：pET-28a；4：绿脓杆菌；5：无乳支原体；6：沙门氏菌；B中：M：预染的蛋白分子质量标准；1：牛支原体；2：巴氏杆菌；3：鸡毒支原体；4：大肠杆菌；5：金黄色葡萄球菌；6：变形杆菌；

图7为两株单克隆抗体亚类的鉴定结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1牛支原体特异性单克隆抗体的制备

1实验材料

1.1质粒、菌株、细胞及实验动物

pET-28a(+)由甘肃农业大学动物医学院预防兽医学实验室保存；牛支原体武威分离株及临洮分离株(分别从甘肃省武威市和临洮县发病牛群分离；牛支原体Hubei-1株、PG45及无乳支原体PG2由华中农业大学惠赠；E.coliDH5α、BL21(DE3)购自北京天根生化科技有限公司；粘质沙雷氏菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌由本实验室保存；SP2/0骨髓瘤细胞由军事兽医研究所扈荣良研究员实验室惠赠；新西兰大白兔6周龄SPF雌性BALB/C小鼠购于兰州兽医研究所实验动物中心。

1.2酶及其他主要试剂(盒)

BamHI、XhoI限制性内切酶、T4DNA连接酶、DL2000Marker、预染蛋白质分子量标准等购于宝生物工程(大连)有限公司；PCRMix购于广州东盛生物科技有限公司；支原体培养基基础购于青岛海博生物技术有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物为OXOID产品；1640细胞培养基为Thermo-Hyclone产品；DNA提取试剂盒购于BioTeke公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、TMB底物显色液、DAB显色试剂盒购于天根生化科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒为Thermo产品；His·Tag蛋白纯化试剂盒为MERCK公司产品；TEMED购于上海贝博生物；HRP标记羊抗兔IgG购自北京凯瑞力枫科贸有限公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT、HT(次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷)购自Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯级产品。

1.3培养基配制

1.3.1支原体培养基：称取33g支原体培养基基础，溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min后冷却至室温，无菌操作加入青霉素80万单位和马血清100mL，混匀，分装无菌试管。固体培养基在高压前需加入质量百分比1.0-1.2％的琼脂。

1.3.2LB培养基：称取酵母提取物0.5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，充分溶解于800mL去离子水中，调节pH至7.0，定容至1000mL后高压灭菌并置4℃保存。(LB/K⁺培养基于高压后加入终浓度为100μg/mL的卡那霉素。固体培养基需在高压前加入质量百分比1.0-1.2％的琼脂。

1.3.32×YT培养基：称取胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化钠5g，溶解于800mL去离子水中，充分溶解后调节pH至7.0，定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存。

1.3.4RPMI-1640细胞培养基：含终浓度20％FBS和100U/mL双抗(青霉素及链霉素溶液)的RPMI-1640细胞培养基。

2方法

2.1抗原的制备

2.1.1引物的设计

通过对Genebank中牛支原体P48基因序列进行分析发现：该序列编码区有5个编码色氨酸的密码子TGA，而TGA在大肠杆菌中为终止密码子，因此，需对该位点进行定点突变，需突变位点分别在编码区的258bp、714bp、765bp、1341bp、1383bp位置。因此设计5对引物(如表1所示)，将其中的TGA突变为同义密码子TGG，同时，在扩增全序列的上游引物和下游引物分别引入BamHI和XhoI酶切位点。

表1引物序列

2.1.2牛支原体基因组的粗提及P48基因扩增

将牛支原体武威株按1％比例接种于支原体培养基，5％CO₂、37℃条件下培养40h后取1mL菌液离心弃上清，PBS悬浮沉淀洗涤2次，加入50μLddH₂O煮沸10min后12000r/min离心10min分离上清即为粗提基因组。

以粗提基因组为模板，对支原体P48基因进行分段扩增，其中引物对F1/R2扩增A片段；F2/R3扩增B片段；引物对F3/R4扩增C片段；引物对F4/R5扩增D片段；引物对F5/R1扩增E片段；再以A、B、C、D、E片段为模板，F1/R1引物对扩增获得P48基因全长(如图1所示)。具体扩增条件见表2。

表2PCR扩增条件

2.1.3P48基因原核表达载体的构建

通过OverlapPCR扩增获得牛支原体武威株P48基因序列，其大小为1425bp，与预期大小相一致(图2-A)。其核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo.1。将PCR产物回收和表达，并与质粒pET-28a进行连接：将PCR产物与质粒pET-28a分别用BamHI与XhoI双酶切，酶切体系总体积为40μL(如下所示)，各成分混匀后在37℃水浴酶切2小时后，1％琼脂糖凝胶电泳后对目的片段进行回收，回收产物在16℃条件下过夜连接。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞并将鉴定正确的质粒命名为pET-P48(图2-B)。

2.1.4P48蛋白的原核表达及纯化

将pET-P48重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单菌落接入适量LB液体培养基中，37℃摇床220r/min过夜培养后按1％转接种2×YT培养基。当菌液的OD₆₀₀值达0.6时加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，25℃、180r/min诱导10h，菌体离心、洗涤、重悬并超声裂解后离心分离上清和沉淀，并经SDS-PAGE检测，表达产物rMbP48分子量约51ku(图3)，其氨基酸序列参见序列表中SEQIDNo.2。进而纯化表达产物rMbP48，定量后用于直接免疫或分装备用。

2.2单抗的制备

2.2.1BALB/C小鼠的免疫

纯化rMbP48稀释后，将抗原与等量弗氏完全佐剂充分乳化，经皮下及足跖部等多点注射免疫6-8周龄雌性BALB/C小鼠(200μg/只)，首免两周后进行第二次免疫，抗原剂量减半(100μg/只)并用弗氏不完全佐剂，间隔两周后进行第三次免疫，剂量与方法同二次免疫。三次免疫后7天，断尾采血分离血清，并应用间接ELISA法检测小鼠抗体效价。选取效价最高的BALB/C小鼠作为制备单克隆抗体的融合用小鼠，在进行融合的前三天应用首次免疫的剂量对小鼠腹腔注射加强免疫。

2.2.2骨髓瘤细胞的复苏

从液氮罐中取出冻存的SP2/0细胞，迅速放入37℃水浴锅中快速摇动使之完全融化；随之1000r/min离心5min，吸弃上清，用1640细胞培养基(含20％FBS)将细胞沉淀悬浮后移入加有适量细胞培养液的细胞瓶中，置入5％CO₂37℃的培养箱中培养；3-5d后传代进行扩大培养。融合前夜更换细胞培养液，第二天进行融合。

2.3细胞融合

2.3.1饲养细胞的制备

取一只未免疫的6周龄的健康BALB/C小鼠，眼眶放血并分离血清，即为阴性血清对照；处死小鼠后将其浸泡于75％酒精中10min。将小鼠仰面固定后用灭菌手术剪剪开腹部皮肤，将皮肤向两侧剥离使腹腔暴露，用10mL注射器吸取8mL无菌1640细胞培养液，用镊子小心夹起腹膜，将1640细胞培养液注入腹腔；轻揉腹部使培养液与巨噬细胞充分混匀，用注射器回抽培养液并移入50ml离心管，重复上述操作一次，即为收集的腹腔巨噬细胞；1000r/min离心10min后弃上清，用1640基础液洗涤细胞两次后，用含10％FBS的细胞培养液重悬细胞，将细胞数量调整为1×10⁵个/mL，并铺于96孔细胞培养板中，每孔100μL。边缘孔需多加一些培养液以防止蒸发，铺制好培养板放入37℃、5％CO₂及饱和湿度的培养箱内培养。

2.3.2免疫小鼠脾细胞的制备

取加强免疫后的BALB/C小鼠一只，眼球放血处死后浸泡于装有75％酒精的烧杯中10min，收集到的血液分离血清即为阳性血清。将小鼠仰面固定，用灭菌手术剪沿腹中线剪开腹部皮肤，用镊子纵向拉开皮肤，暴露腹膜，换一套剪刀和镊子，剪开腹膜，使脾脏暴露，并换用新的镊子和剪刀，用镊子提起脾脏，剪刀剪去周围脂肪和其他结缔组织，放入无菌平皿中，用无血清1640基础培养基清洗3遍。1mL注射器针头穿刺脾脏后，用20mL注射器吸取15mL细胞培养基，从脾脏一端注入，同时用镊子轻轻挤压脾脏，将脾细胞冲出，从脾脏另一端重复上述操作，充分洗出脾细胞。将冲洗出的脾细胞悬浮起来并转移至50mL离心管中，1000r/min离心10min，弃去上清，用无血清1640细胞培养基洗涤两次后重悬计数。

2.3.3SP2/0骨髓瘤细胞的准备

弃去SP2/0细胞瓶中的细胞培养液，用无血清1640细胞培养基将细胞吹洗下来，转移入50mL培养基中，并用无血清1640细胞培养基洗涤两次后细胞计数。

2.3.4细胞融合

将SP2/0细胞与脾细胞按1:10的比例加入到50mL离心管中，混合均匀后1000r/min离心10min，弃去上清，轻轻拍打离心管底部，使细胞沉淀松动，并于1min之内滴加1mL37℃水浴中预热的50％PEG(边滴加边轻轻振荡以混匀)，将离心管静置于37℃、5％CO₂培养箱中，10min后滴加无血清1640细胞培养液以终止融合，具体操作如下：第一分钟匀速滴加1mL，第二分钟匀速滴加2mL，第三分钟匀速滴加3mL，第四分钟匀速滴加4mL，第五分钟匀速滴加5mL，滴加时轻轻振摇混匀，之后缓慢添加无血清1640细胞培养液至40mL，800r/min离心10min，弃上清，并缓慢加入适量含20％FBS的HAT完全培养液并轻柔摇匀。将融合后的细胞加入到提前铺好饲养细胞的96孔板中，100μL/孔。一个免疫脾脏可铺制4块96孔细胞板。铺好的细胞板于37℃、5％CO₂及饱和湿度的培养箱内培养。融合后的细胞在第3、6天用含20％FBS的HAT完全培养液半量换液。至第9、12天用含20％FBS的HT完全培养液半量换液培养。

2.4抗体的检测

当杂交瘤细胞覆盖孔底10％～20％的面积时，吸取培养上清，采用间接ELISA方法进行抗体效价的检测，以筛选分泌抗牛支原体的杂交瘤细胞。具体操作如下：

2.4.1用包被液(包被液为0.05M，pH9.6的碳酸盐缓冲液：Na₂CO₃0.159g，NaHCO₃0.293g，H₂O1000mL)将步骤2.1.4中得到的纯化的牛支原体全菌蛋白稀释至50μg/mL，每孔加100μL，37℃孵育2h后再4℃过夜；

2.4.2倾去包被液并拍干残留液体，用300μl洗涤液(0.01M，pH7.4的PBST：KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄1.15g，NaCl8.0g，KCl0.2g，Tween-200.5mL，加蒸馏水至1000ml)洗涤3次；

2.4.3每个孔中加300μl封闭液(5％脱脂乳)，37℃孵育2h，倾去封闭液并拍干残留液体，用300μl洗涤液洗涤3次；

2.4.4加入1:100PBST稀释的待检细胞上清，100μl/孔，37℃孵育1h，倾去上清并拍干残留液体，用300μl洗涤液洗涤3次；同时做空白、阴性及阳性孔对照于反应孔中；

2.4.5每孔加入1:8000PBST稀释的酶HRP标记的羊抗兔二抗，100μl/孔，37℃孵育1h，倾去上清并拍干残留液体，用300μl洗涤液洗涤3次；

2.4.6显色：每孔中加入TMB底物溶液，100μl/孔，37℃孵育10～30分钟；

2.4.7终止反应：每孔中加入50μl2M的硫酸溶液终止反应；

2.4.8结果判定：应用酶标仪测定450nm的吸光值，P/N值大于2.1以上者，即为阳性克隆。

2.5阳性杂交瘤细胞的克隆

依据抗体检测的结果选择高水平抗体的培养孔，并对其中的细胞进行亚克隆。亚克隆操作采用有限稀释法，具体操作步骤如下：

2.5.1用200μL移液器将要克隆的阳性孔中的培养液吸出，加入200μL新的HT培养液，反复吹打将细胞悬起，并计数细胞；

2.5.2调整细胞数为3～10个/mL，取铺制好饲养细胞的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μL，置于37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱内培养；

2.5.36天左右会看到一些孔中长出微小的细胞集落，第7天换液，此后每2～3天换一次培养液，至9天左右时可看到细胞克隆的形成；

2.5.4对有细胞克隆的孔及时进行抗体检测，阳性孔的细胞再进行第二次亚克隆，方法同第一次亚克隆；

2.5.5连续三次亚克隆，得到100％表达牛支原体抗体的阳性杂交瘤细胞株时才完成杂交瘤细胞的建株过程。

2.5.6选择细胞生长良好，强阳性的单克隆生长孔，转移细胞到24孔板并进一步扩大培养。

2.6杂交瘤细胞的保藏

将经ELISA检测呈阳性反应并可以稳定传代和分泌预期抗体的杂交瘤细胞株进行保藏，细胞分类命名：杂交瘤细胞株NZYT-ZJC，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏日期：2015年11月8日，保藏编号：CCTCCC2015183。

2.7杂交瘤细胞的冻存与复苏

2.7.1用培养液将细胞瓶内扩大培养的细胞吹打下来，悬浮均匀，转移至15mL离心管中，800r/min离心10min；

2.7.2弃上清，用细胞冻存液(20％FBS，10％DMSO，70％的RPMI-1640培养液)悬浮细胞；

2.7.3准备若干个2mL细胞冻存管，每管分装1mL细胞悬液，4℃放置30min后-20℃放置1h，之后转入-80℃过夜，次日放入液氮罐内保存；

2.7.4复苏时迅速从液氮罐中取出，放入37℃水浴锅中迅速解冻，1000r/min离心5min，弃去上清液，用培养液将细胞重新悬浮并洗涤两次；

2.7.5将细胞转移至前一天已铺好饲养细胞的培养瓶中，37℃、5％CO₂及饱和湿度的培养箱内培养，当细胞形成集落时2.4中的方法检测抗体活性。

2.8杂交瘤细胞株的效价及稳定性测试

2.8.1将杂交瘤细胞株在RPMI-1640培养基中培养传代，每3～5天传代一次，传代到5代后应用2.4所述间接ELISA方法进行单抗效价测定，细胞培养液上清中单抗效价至少为1:100。

2.8.2将杂交瘤细胞株在RPMI-1640培养基中继续进行培养、传代，培养到8代后，杂交瘤细胞株仍然能生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1:100以上。

以上结果表明，所得杂交瘤细胞株能够稳定传代，可以持续、稳定分泌抗牛支原体的单克隆抗体。

2.9牛支原体特异性单克隆抗体的制备

2.9.1取8周龄的BALB/C小鼠，腹腔注射0.5mL的液体石蜡；

2.9.2注射石蜡9d后，将细胞瓶中生长良好的杂交瘤细胞悬浮，转移至离心管内1000r/min离心10min，将细胞重悬于培养液中，吸取少量计数，并将细胞稀释至3-5×10⁷/mL，每只小鼠腹腔注射5×10⁵-10⁶个杂交瘤细胞，10d后可产生腹水，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水；

2.9.3用酒精棉擦拭小鼠腹部进行消毒，用灭菌针头刺入腹腔，避免碰到脏器引起死亡，将腹水导入灭菌EP管内，每只小鼠大约可收集腹水5-10mL；

2.9.44℃，1200r/min离心3min，收集中间层，ELISA测定抗体效价，分装后-20℃保存备用，同时冻存细胞。

2.10单抗的纯化

采用辛酸-硫酸铵-蛋白A亲和层析法纯化小鼠腹水中的IgG，其基本步骤如下：

1)腹水用12000rpm离心10min，并经0.22μm滤器过滤，以除去脂质等杂质；

2)用4倍体积的醋酸钠缓冲液(60mmol/L，pH值4.0)稀释腹水，并用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至4.5；

3)在冰浴条件下，将辛酸(按25μL辛酸/mL原腹水计算)逐滴加入样品中，边滴加边搅拌，滴加完后继续搅拌30min；

4)5000g离心30min，取上清液按体积比10:1与10倍PBS混合，用0.1mmol/L的氢氧化钠溶液调pH值至7.4；

5)加入硫酸铵(每毫升混合液0.227g)，搅拌30min后，10000g离心15min，弃上清液，将沉淀悬浮于PBS(起始腹水体积的1/5)中。悬浮液用100倍体积的PBS(0.02mol/L，pH7.0)于4℃条件下透析过夜，并经PEG6000浓缩后进一步经ProteinA/G-PlusBeads纯化；

6)取适量ProteinA/GAgarose悬液，装入层析柱，用10倍柱体积的PBS洗涤平衡层析柱；

7)将上述经辛酸-硫酸铵法纯化的抗体与等体积2×PBS缓冲液混合，调整pH以及离子浓度后，缓慢加入层析柱；

8)用10倍柱体积以上的PBS洗涤，至流出液无蛋白检出；

9)加入2倍柱体积0.1M柠檬酸(pH2.7)，夹住流出管，静置5分钟后收集穿出液，重复洗涤三次，洗脱液经SDS-PAGE鉴定，结果见图4；

10)洗脱后的抗体加入2/5体积的Tris(1M，pH8.0)中和，使用Millipore蛋白浓缩管切换至2×PBS(含0.02％NaN₃以及1mMEDTA)；

11)浓缩到所需体积，加入50％甘油，并分装保存于-20℃。

实施例2牛支原体特异性单克隆抗体的特异性检测

1.1单克隆抗体的间接ELISA分析

将pET-28a(+)转化的大肠杆菌BL21(DE3)诱导后菌体蛋白、沙雷氏菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、鸡毒支原体、无乳支原体、牛沙门氏菌的菌体蛋白作为抗原分别包被ELISA板，5μg/孔，并用间接ELISA法检测单克隆抗体的特异性(具体操作同2.4)。ELISA结果参见图5。

1.2单克隆抗体westernblot分析

Westernblot检测具体操作步骤如下：

1.2.1蛋白质样品制备：取1.1中所有样品，与2×SDS上样缓冲液混匀，置于沸水中加热10min，冷却后12000r/min离心15min，取上清液作为样品；

1.2.2电泳：取2.7.2.1所得样品6μL上样，进行SDS-PAGE；

1.2.3转膜：电泳结束后，用半干转法将蛋白转印到硝酸纤维素膜上，并用0.01MPBST洗膜，10min×3次；

1.2.4封闭及一抗孵育：用5％脱脂乳37℃封闭2h后，将封闭的硝酸纤维素膜浸入1:1000稀释的小鼠腹水中，37℃孵育1h；

1.2.5二抗孵育及显色：一抗孵育的硝酸纤维素膜用0.01MPBST洗涤，10min×3次，之后将膜用1:3000稀释的IgG-HRP孵育，37℃孵育1h，0.01MPBST洗涤(10min×3次)后，用DAB显色液显色后观察，结果参见图6。

1.3单克隆抗体Ig类及亚类鉴定

应用Roche公司的单抗亚类鉴定试纸条来鉴定本发明的单克隆抗体亚类。鉴定时将腹水用PBS1:100稀释后，加入到检测管中，轻轻晃动30s，放入检测试纸条，室温静置5min左右，待对照区条带出现后终止反应，进行结果判定。结果显示：两株单克隆抗体重链均为IgG1型，轻链为λ链(图7)。

实施例3将牛支原体单克隆抗体用于制备检测试剂盒

将步骤2.10纯化所获得的单克隆抗体用0.01MPBST稀释5000倍后并应用于间接酶联免疫法来检测牛支原体，具体如下：

1)抗原包被：取对数生长中后期的牛支原体培养物，经用0.05M，pH9.6的碳酸盐缓冲液洗涤2次后，按2×10⁸，2×10⁷，2×10⁶，2×10⁵，2×10⁴，2×10³CFU/100μL的稀释度进行包被ELISA平板，每孔加100μL，4℃过夜包被后弃孔内溶液，用洗涤缓冲液洗(0.01MPBST)3次，每次3分钟；

2)封闭：每孔中加入200μL5％的脱脂乳溶液(0.01MPBST稀释)，37℃2小时，甩干并用洗涤液洗涤3次；

3)一抗孵育：每个反应孔加入200μL1:5000稀释的纯化单克隆抗体，37℃孵育1小时后洗涤3次；

4)二抗孵育：于各反应孔中，加入1:10000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗各100μL，37℃孵育30分钟后洗涤4次；

5)加底物液显色：于各反应孔中加入TMB底物溶液100μL，37℃10～15分钟；

6)终止反应：于各反应孔中加入50μL2M的硫酸溶液终止反应，并测定490nm的OD值；

7)结果判定：阴性样本为SP2/0细胞注射小鼠后所得腹水，若OD值大于阴性对照的2.1倍，即为阳性；

8)结果显示此ELISA法检测的灵敏度为10⁶CFU/100μL(见表3)。

表3基于单克隆抗体的间接ELISA对牛支原体检测的灵敏度

实施例4将单克隆抗体用于制备胶体金免疫试纸条

胶体金试纸条主要由样品垫、胶体金垫、固相硝酸纤维素膜(NC)和吸收垫4部分组成。

只要能够制备出胶体金，可以采用现有技术中的任何方法。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>甘肃农业大学

<120>一株分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>1407

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atgaaaaaaaacaaattctatctatttttaggagccgctcctgttctatcagtgccattg60

gttgctgcttcatgtggtgataaatactttaaagaaactgaagttgatggagtgaaaact120

gttacaacactttcacacatcgtgtctcgtaaaggattaaaactaagagatggtttaacc180

gttgataatgcaccaagggcagcatttataactgatgaaggatctgtgcatgatgaatca240

ttcaatcaatctggttgggaagcagttcataaaatttcatatgaacttggattagataag300

gcgcaagttagtggtaataaaaacttaagaaataaagtttacgaacctaaaaagggtgaa360

ttagcatcttcatacaaaaacgctattgatagtagttttagatacattgttctttgtgga420

tttactcacaaagcagcgctttatggtttagaaccagaatacattaaaaagattaaagat480

aataatattgtctttattactgttgactttgatatccaacaagatgcaagcactggcgaa540

cctgcagcaaaagcatttgttgacaaaattggtcaaggacgcttaattcctgtaatattt600

gacactaaacaagctgcatatattgctggtcgtgctcttgctgactacttctcaaaaatt660

tacaaggataatcctgaaaaacgtacaataggtgccttcggtggtattccttggccagca720

gtttctgactttatagctggtacattccaaggtattattgactggaataaagaacaccca780

gaagctaagactaaatcattaaataacacaattgaattaaaaacatcatttacttctggt840

gaacccgttgcagttgctgctattaactcagtaattaaggccacagcttcatatccagtt900

gcaggatcattatcttctgacacagctaaagaaattaagaagttaggcgataaaaacaaa960

ttcattattggtgttgacgctgaccaaaagaatgcattaaagggtcatagaatatttaca1020

tcagttatgaaattaattggtcaagctgtttataacgttttagctgacttatactctcaa1080

ggtgaaaatagtctatcgcttcaaccaggctttgaaattggtaaaaaaaatggtgaggct1140

aaagtatttggttatggtgaaaatgaagcaagcaaatatgtaggtgttgcaacttcagga1200

ttattagactcaaagaatgatgagattgctaataaagcattggaagaagctactaaatac1260

tacgaaagtaaaaaagcggaaattcaaaaaactttatcaggtcaattggaagaagctaaa1320

aaagctttaggtacaaaatggccagaccaacctgctgaccaatttgggaaaatgattaac1380

tggttggctaaagaaacacaaaaatag1407

<210>2

<211>468

<212>PRT

<213>人工蛋白

<400>2

MetLysLysAsnLysPheTyrLeuPheLeuGlyAlaAlaProValLeu

151015

SerValProLeuValAlaAlaSerCysGlyAspLysTyrPheLysGlu

202530

ThrGluValAspGlyValLysThrValThrThrLeuSerHisIleVal

354045

SerArgLysGlyLeuLysLeuArgAspGlyLeuThrValAspAsnAla

505560

ProArgAlaAlaPheIleThrAspGluGlySerValHisAspGluSer

65707580

PheAsnGlnSerGlyTrpGluAlaValHisLysIleSerTyrGluLeu

859095

GlyLeuAspLysAlaGlnValSerGlyAsnLysAsnLeuArgAsnLys

100105110

ValTyrGluProLysLysGlyGluLeuAlaSerSerTyrLysAsnAla

115120125

IleAspSerSerPheArgTyrIleValLeuCysGlyPheThrHisLys

130135140

AlaAlaLeuTyrGlyLeuGluProGluTyrIleLysLysIleLysAsp

145150155160

AsnAsnIleValPheIleThrValAspPheAspIleGlnGlnAspAla

165170175

SerThrGlyGluProAlaAlaLysAlaPheValAspLysIleGlyGln

180185190

GlyArgLeuIleProValIlePheAspThrLysGlnAlaAlaTyrIle

195200205

AlaGlyArgAlaLeuAlaAspTyrPheSerLysIleTyrLysAspAsn

210215220

ProGluLysArgThrIleGlyAlaPheGlyGlyIleProTrpProAla

225230235240

ValSerAspPheIleAlaGlyThrPheGlnGlyIleIleAspTrpAsn

245250255

LysGluHisProGluAlaLysThrLysSerLeuAsnAsnThrIleGlu

260265270

LeuLysThrSerPheThrSerGlyGluProValAlaValAlaAlaIle

275280285

AsnSerValIleLysAlaThrAlaSerTyrProValAlaGlySerLeu

290295300

SerSerAspThrAlaLysGluIleLysLysLeuGlyAspLysAsnLys

305310315320

PheIleIleGlyValAspAlaAspGlnLysAsnAlaLeuLysGlyHis

325330335

ArgIlePheThrSerValMetLysLeuIleGlyGlnAlaValTyrAsn

340345350

ValLeuAlaAspLeuTyrSerGlnGlyGluAsnSerLeuSerLeuGln

355360365

ProGlyPheGluIleGlyLysLysAsnGlyGluAlaLysValPheGly

370375380

TyrGlyGluAsnGluAlaSerLysTyrValGlyValAlaThrSerGly

385390395400

LeuLeuAspSerLysAsnAspGluIleAlaAsnLysAlaLeuGluGlu

405410415

AlaThrLysTyrTyrGluSerLysLysAlaGluIleGlnLysThrLeu

420425430

SerGlyGlnLeuGluGluAlaLysLysAlaLeuGlyThrLysTrpPro

435440445

AspGlnProAlaAspGlnPheGlyLysMetIleAsnTrpLeuAlaLys

450455460

GluThrGlnLys

465

<210>3

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tatggatccatgaaaaaaaacaaattctatctatttttagg41

<210>4

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tatctcgagctatttttgtgtttctttagccaaccagttaat42

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

attcaatcaatctggttgggaagcagttcat31

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

atgaactgcttcccaaccagattgattgaat31

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ggtggtattccttggccagcagtttct27

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

agaaactgctggccaaggaataccacc27

<210>9

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ccaaggtattattgactggaataaagaacaccc33

<210>10

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

gggtgttctttattccagtcaataataccttgg33

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

gtacaaaatggccagaccaacctgc25

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

gcaggttggtctggccattttgtac25

Claims (10)

1.一株分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编号为：CCTCCC2015183，保藏日期为：2015年11月8日。

2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。

3.权利要求2所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：是将权利要求1所述的杂交瘤细胞株细胞种植到实验动物腹腔产生腹水而获得的。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤如下：向小鼠腹腔注射0.5mL的液体石蜡，9天后，每只小鼠腹腔注射5×10⁵-10⁶个杂交瘤细胞，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水，4℃，1200r/min离心3min，收集中间层，获得单克隆抗体。

5.权利要求1所述的杂交瘤细胞株的应用，其特征在于：将杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体用于检测牛支原体。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：将所述的单克隆抗体配置在检测牛支原体的免疫试剂盒中。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：将所述的单克隆抗体制成用于检测牛支原体的胶体金免疫试纸条。

8.检测牛支原体的间接法酶联免疫试剂盒，包括一抗，其特征在于：所述一抗为权利要求1所述的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括酶标二抗，所述酶标二抗为羊抗鼠酶标二抗。

10.检测牛支原体的胶体金免疫试纸条，包括胶体金垫，其特征在于：胶体金垫中含有权利要求1所述的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。