CN104450627A - 鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白orf132的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种保藏编号为CCTCCN O：C2014172的杂交瘤细胞株，以及该杂交瘤细胞株分泌鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白ORF132的单克隆抗体。所述的鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白ORF132的单克隆抗体，可以识别天然鲤疱疹病毒3型，并具有很好的特异性，可广泛用于鲤疱疹病毒3型的病原学诊断、血清学检测、免疫学检测及防治、ORF132蛋白功能研究等。

Description

鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白ORF132的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白ORF132的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)又称锦鲤疱疹病毒(KoiHerpesvirus，KHV)，属于疱疹病毒目(Herpesvirales)，异疱疹病毒科(Alloherpesviridae)，鲤疱疹病毒属(Cyprinivirus)，是一种双链线性DNA病毒，具有囊膜结构。该病毒严重威胁鲤(Cyprinus carpio)及其观赏品种：锦鲤，致死率高达80％-100％。鲤疱疹病毒3型基因组约295kb，编码156个不同的ORF，目前已经确定其中的14个ORF编码囊膜蛋白。囊膜蛋白位于病毒最外层，在病毒与宿主细胞的识别、互作以及入侵过程中发挥着重要作用，也是建立检测方法和防治手段的重要靶分子。

ORF132是鲤疱疹病毒3型的一个高度保守并且特异的囊膜蛋白分子，也是病毒的一个结构蛋白(Michel B,Leroy B等，The genome of cyprinid herpesvirus3encodes 40proteins incorporated in mature virions,Journal of General Virology,2010,91:452–462；Yi Y,Zhang H等，Extracellular virion proteins of two ChineseCyHV-3/KHV isolates,and identification of two novel envelope proteins,VirusResearch，2014,191:108–116)，对其核苷酸序列和氨基酸使用NCBI blast软件在蛋白质数据库和DNA数据库进行在线分析显示：ORF132是鲤疱疹病毒3型的特有基因，目前GenBank中已经登录了4个毒株的ORF132序列，包括GZ11株，美国株(U)、以色列株(I)、日本株(J)，其中GZ11株、U株、J株的ORF132基因序列完全一致，与上述3个毒株相比，I株的ORF132基因存在一个碱基的差异：第17位碱基由T变为A，对应的第6位氨基酸由异亮氨酸(Ile)变为天冬酰胺(Asn)。根据文献(刘振兴，柯浩等，锦鲤疱疹病毒囊膜蛋白ORF132的克隆及分析，广东农业科学，2011,6:134-136)报道，ORF132蛋白的97-170位氨基酸片段为主要B细胞表位区段，具有良好的免疫原性，并且该片段的氨基酸序列在已知的鲤疱疹病毒3型中完全一致，是一个理想的鲤疱疹病毒3型诊断靶位。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分泌鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白ORF132的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4E11。

本发明还提供了由上述保藏编号为CCTCCNO：C2014172的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体。

本发明还提供了上述单克隆抗体在检测鲤疱疹病毒3型上的应用。

本发明所采用的技术方案是：

一种分泌鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白ORF132的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4E11，已于2014年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CHINACENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION)，保藏编号为CCTCCNO：C2014172。

一种鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白ORF132的单克隆抗体，由保藏编号为CCTCCNO：C2014172的杂交瘤细胞株产生。

所述单克隆抗体为IgG1亚类。

一种检测鲤疱疹病毒3型的试剂盒，含有保藏编号为CCTCCNO：C2014172的杂交瘤细胞株产生的鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白ORF132的单克隆抗体。

本发明所述的分泌鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白ORF132的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4E11已于2014年10月23日保藏于国家知识产权局指定的保藏单位中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址：武汉大学)，保藏日期2014年10月23日，保藏编号CCTCCNO：C2014172。

本发明主要具有如下有益效果：

本发明通过发明人长期研究鲤疱疹病毒3型，选取了该病毒特有的，且具有较高的免疫原性的鲤疱疹病毒3型ORF132基因，通过大量的实验研究，筛选到能稳定分泌鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白ORF132的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4E11。

本发明制备得到的杂交瘤细胞株4E11能稳定、大量制备鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白ORF132的单克隆抗体，该抗体为IgG1亚类，可以识别天然鲤疱疹病毒3型，并且与同属于异疱疹病毒科的斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus，CCV；又称为鮰疱疹病毒1型，Ictalurid herpesvirus 1，IcHV-1)无交叉反应，表现出很好的特异性，可广泛用于鲤疱疹病毒3型的病原学诊断、血清学检测、免疫学检测及防治等。

本发明制备的单克隆抗体可以特异性识别鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白ORF132，可以与该蛋白特异性结合，应用于免疫共沉淀、抗体封闭等ORF132相关的蛋白功能研究。

附图说明

图1为重组CyHV-3ORF132的诱导表达，其中，1：未诱导的重组CyHV-3ORF132蛋白工程菌裂解液，2：IPTG诱导的重组CyHV-3ORF132蛋白工程菌裂解液，3：纯化的重组CyHV-3ORF132蛋白。

图2为重组蛋白的Western Blot鉴定结果，其中，1：纯化的重组CyHV-3ORF132蛋白，2：诱导的重组CyHV-3ORF132蛋白工程菌裂解液。

图3为CyHV-3感染的CCB细胞IFA检测结果；其中，A1：DAPI染色，示细胞核；A2：Cy3免疫染色A3：A1、A2叠加图。

图4为未感染的CCB细胞IFA检测结果；其中，B1：DAPI染色，示细胞核；B2：Cy3免疫染色，B3：B1、B2叠加图。

图5为CCV感染的CCO细胞IFA检测结果；其中，C1：DAPI染色，示细胞核；C2：Cy3免疫染色，C3：C1、C2叠加图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

主要实验材料和来源：按照水产动物诊断试验手册(OIE,2013)的方法分离鲤疱疹病毒3型，分离的毒株命名为：HZ419株。

实施例1：杂交瘤细胞株CCTCC NO：C2014172，单克隆抗体4E11的制备和应用

一、免疫原的制备

1、鲤疱疹病毒3型ORF132重组表达载体的构建、重组蛋白的诱导表达、纯化与鉴定

参照文献(刘振兴，柯浩等，锦鲤疱疹病毒囊膜蛋白ORF132的克隆及分析，广东农业科学，2011,6:134-136)以末端带有EcoRI和HindIII酶切位点的引物ORF132F(CCGGAATTCCGCCGTATATCGAGGCACTT SEQ ID NO.1)/ORF132R(CCCAAGCTTTCTTAGACCTTTTAGACGATTTTGG，SEQ IDNO.2)扩增该基因的主要B细胞表位区段编码序列(289～510位核苷酸)，反应程序：94℃预变性2min，之后35个循环：94℃30s，58℃30s，72℃30s，最后72℃5min。将上述PCR产物纯化后，经HindIII、EcoRI双酶切后插入pET-32a(+)载体，构建重组ORF132的表达载体，转化大肠杆菌Top10。测序证实，该段基因正确插入到表达载体，并且此段序列与GZ11株，U株、J株、I株的对应核苷酸序列一致性为100％。将包含上述载体的Top10工程菌扩大培养，提取质粒，转入Rosetta菌株中。参照pET表达手册(Novagen)，进行重组蛋白的诱导表达，参照MERCK蛋白纯化说明书纯化重组蛋白并进行Western Blot鉴定。结果见图1，图2。如图所示，构建的重组工程菌株诱导以后可以观察到一条28kDa的目的条带，经Western Blot鉴定为重组表达的鲤疱疹病毒3型ORF132蛋白。

二、动物免疫及抗体效价检测

以纯化的重组ORF132蛋白作为抗原免疫12周龄BALB/c小鼠，免疫3次，每次间隔两周，第一次免疫，抗原加等体积的弗氏完全佐剂，后两次加等体积的弗氏不完全佐剂，免疫剂量为60μg/只，免疫途径为背部和腹部皮下多点注射。采用间接ELISA检测免疫小鼠的血清抗体效价。具体方法如下：

2.1 ELISA所用溶液的配制：

包被缓冲液：(0.05mol/L碳酸盐缓冲液pH9.6)：1.59g Na₂CO₃，2.93gNaHCO₃溶于800mL双蒸水中，调节pH值至9.6，并定容至1000mL。

洗涤缓冲液(pH7.4PBST)：0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，8.0g NaCl，0.2gKCl，0.5mL Tween-20(0.05％V/V)以上各物质准确称量后，加双蒸水完全溶解后，调pH值至7.4，定容至1000mL。

封闭液：牛血清白蛋白(BSA)1g加入100mL的PBST中，混匀溶解。

抗体稀释液：0.1g BSA溶于100mL PBST中，混匀溶解。

底物缓冲液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 7.16g溶于100mL双蒸水；B液：C₆H₈O₇·H₂O 2.1g，溶于100mL双蒸水。

TMB底物显色液：TMB 50mg溶于25mL无水乙醇中4℃避光保存。

TMB工作液：临用前配制，TMB底物显色液0.5mL,底物缓冲液：A液2.57mL，底物缓冲液：B液2.43mL，双蒸水5mL，再加入30％H₂O₂0.8μL混匀，现用现配。

终止液：(2mol/L H₂SO₄)：双蒸水178.3mL，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7mL。

2.2 间接ELISA步骤：

1、包被：用包被液稀释重组ORF132蛋白至浓度为3.125μg/mL，100μL/孔，加入96孔ELISA板，4℃包被过夜；弃去包被液，加入200μL/孔PBST洗涤液，静置3min，弃洗涤液，将ELISA板在吸水纸上用力拍干，重复三次。

2、封闭：加封闭液，100μL/孔，37℃条件下封闭2h，弃去封闭液，加入200μL/孔PBST，静置3min，弃洗涤液，将ELISA板在吸水纸上用力拍干，重复三次。

3、加样：每孔加入100μL血清，37℃作用1h，作用完毕后弃去血清样品。加入200μL/孔PBST，静置3min，弃洗涤液，将ELISA板在吸水纸上用力拍干，重复三次。

4、加酶标二抗：每孔加100μL 1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠抗体，37℃作用1h，作用完毕后弃去二抗，加入200μL/孔PBST，静置3min，弃洗涤液，将ELISA板在吸水纸上用力拍干，重复三次。

5、加显色液：加入100μL/孔的TMB底物显色液，显色液要用新鲜配制的，37℃避光显色10min。

6、加入终止液：显色完毕后，立即加入终止液终止反应，每孔50μL。

7、测OD值：用酶标仪测定OD450nm处吸光值。

三、杂交瘤细胞的融合、筛选与扩大培养

根据上述间接ELISA的检测结果，取效价较高的免疫小鼠进行细胞融合，融合前三天加强免疫，用不加佐剂抗原腹腔注射，剂量为60μg/只。取加强免疫后的小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞，按常规PEG融合法制备杂交瘤细胞；用重组表达的ORF132包被ELISA板，进行间接ELISA检测(操作方法同二)，初步筛选到43株阳性克隆，再通过鲤疱疹病毒3型全病毒包被的ELISA板(包被浓度为20μg/mL)，采用间接ELISA(除包被抗原更换为全病毒外，其他操作方法同二)从初筛的阳性克隆中筛选能够识别天然鲤疱疹病毒3型的阳性克隆4株，并扩大培养；同时采用有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆，进行3次；对亚克隆后的细胞株进行3次冻存、复苏试验，最终筛选到2株稳定分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。经过抗体亚类分析，2株细胞分泌的单克隆抗体分别为IgM和IgG1亚类，由于小鼠IgM半衰期短，并且通常会形成多聚体，分子量大，在免疫组化等试验中会影响其组织、细胞的穿透性，因此，我们对IgG1亚类的单克隆抗体进一步研究，并将分泌IgG1亚类单克隆抗体的杂交瘤细胞株4E11，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年10月23日，保藏编号为CCTCCNO：C2014172。其中，杂交瘤细胞4E11分泌抗体的稳定性分析和单克隆抗体亚类鉴定如下。

杂交瘤细胞4E11分泌抗体的稳定性分析：

将杂交瘤细胞CCTCCNO：C2014172在液氮中冻存1个月后复苏，以纯化的鲤疱疹病毒3型全病毒为抗原包被ELISA板，(包被浓度为20μg/mL)采用间接ELISA法(除包被抗原更换为全病毒外，其他操作方法同二)测定细胞培养上清液中的抗体效价，然后再次放入液氮中冻存；1个月后再次取出复苏，如此连续重复冻融3次。比较分析几次杂交瘤细胞培养上清的抗体效价的测定值。结果表明，杂交瘤细胞CCTCCNO：C2014172经过3次反复冻融，其细胞培养上清液抗体效价恒定，均为1:2560,说明分泌的单抗具有良好的稳定性。

单克隆抗体亚类鉴定：

采用Sigma公司的Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents，测定杂交瘤细胞4E11分泌的免疫球蛋白的亚类类型，结果表明本发明所述的单克隆抗体4E11为IgG1亚类。

四、杂交瘤细胞株4E11培养上清与腹水单抗效价的测定

将杂交瘤细胞培养上清和制备的腹水，连续倍比稀释，然后用间接ELISA(操作方法同上)测定其效价。结果显示，杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1:2560，腹水抗体效价为1:102400。

五、单克隆抗体4E11腹水的大量制备

取10周龄雌性健康BALB/c小鼠，1mL/只腹腔注射石蜡油；1周后，0.5mL/只腹腔注射浓度为5×10⁷/mL的杂交瘤细胞CCTCCNO：C2014172；待腹水产生足量后，收集腹水并以2000g离心5min，上清液即为含单克隆抗体4E11的腹水。所获得的腹水可于－80℃或液氮中保存。

六、单克隆抗体4E11的纯化

采用rProteinG(GE Healthcare)亲和层析方法从上述腹水中纯化单克隆抗体，具体步骤按试剂盒的说明书操作。纯化后的单克隆抗体4E11调整到250μg/mL,经ELISA测定(操作方法同二)，其效价为1:102400。

七、单克隆抗体4E11用于鲤疱疹病毒3型的免疫荧光检测

相关试剂配制同上。免疫荧光操作步骤参考博士德公司SABC-Cy3免疫组化试剂盒进行，具体步骤如下。

1、样品制备：鲤疱疹病毒3型(HZ419株)接种96孔板培养的CCB细胞(鲤脑细胞系)，待出现CPE后，用-20℃预冷甲醇固定，室温固定30min。弃去甲醇，加入200μL/孔PBST，静置3min，弃洗涤液，重复3次。

2、封闭：加入200μL/孔封闭液，37℃孵育2h，弃去封闭液，加入200μL/孔PBST，静置3min，弃洗涤液，重复3次。

3、单抗结合：用抗体稀释液将纯化的4E11单克隆抗体(250μg/mL)1:100稀释，37℃孵育1h，弃去抗体反应液，加入200μL/孔PBST，静置3min，弃洗涤液，重复3次。

4、二抗结合：用抗体稀释液将生物素标记的羊抗小鼠IgG 1:100稀释，37℃孵育1h，弃去抗体反应液，加入200μL/孔PBST，静置3min，弃洗涤液，重复3次。

5、SABC-Cy3结合：用抗体稀释液将SABC-Cy31:100稀释，37℃孵育30min，弃去SABC-Cy3，加入200μL/孔PBST，静置3min，弃洗涤液，重复3次。

6、DAPI染色：加入100μL/孔DAPI染色5min，弃去染液，加入200μL/孔PBST，静置3min，弃洗涤液，重复3次。

7、荧光倒置显微镜(Axio Observer A1)观察拍照。

结果见图3。结果显示，在CCB细胞的胞质区能观察到红色荧光，单克隆抗体4E11可以特异性识别鲤疱疹病毒3型的天然抗原(ORF132蛋白)，能够应用于鲤疱疹病毒3型的检测。

八、单克隆抗体4E11的特异性检测

采用七中的免疫荧光检测方法，对未感染鲤疱疹病毒3型的CCB细胞(鲤脑细胞系)和感染斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus，CCV；又称为鮰疱疹病毒1型，Ictalurid herpesvirus 1，IcHV-1)的CCO细胞(斑点叉尾鮰卵巢细胞系)进行免疫荧光检测。结果见图4和图5。其中，图4显示，在未感染CyHV-3的细胞中未检测到红色荧光，说明单抗4E11与CCB细胞无交叉反应。图5显示，在感染CCV的CCO细胞中未检测到红色荧光，说明单抗4E11与CCV无交叉反应。

从实验结果可知，单克隆抗体4E11与CCB细胞以及CCV无交叉反应，显示了良好的特异性。

九、单克隆抗体4E11应用于鲤疱疹病毒3型的抗原捕获ELISA

相关试剂配制同上，具体步骤如下：

1、捕获抗体包被：用包被液稀释纯化的单克隆抗体4E11至终浓度为4μg/mL，100μL/孔，加入ELISA板，4℃包被过夜；弃去包被液，加200μL/孔PBST洗涤液，静置3min，弃洗涤液，将ELISA板在吸水纸上用力拍干，重复三次。

2、封闭：加封闭液，100μL/孔，37℃条件下封闭2h，弃去封闭液，加200μL/孔PBST，静置3min，弃洗涤液，将ELISA板在吸水纸上用力拍干，重复三次。

3、加样：加入感染鲤疱疹病毒3型(采用OIE推荐的PCR检测方法确诊)的锦鲤的血清以及设立健康锦鲤血清的阴性对照，100μL/孔，37℃作用1h，作用完毕后弃去样品。加200μL/孔PBST，静置3min，弃洗涤液，将ELISA板在吸水纸上用力拍干，重复三次。

4、加检测抗体：加100μL/孔，终浓度5μg/mL的鸡抗鲤疱疹病毒3型IgY(制备方法参照Zhenxing Liu,Hao Ke等，Oral Passive Immunization of Carp Cyprinuscarpio with Anti-CyHV-3Chicken Egg Yolk Immunoglobulin(IgY),Fish Pathology,2014,49(3):113–120)，37℃作用1h，作用完毕后弃去检测抗体，加200μL/孔PBST，静置3min，弃洗涤液，将ELISA板在吸水纸上用力拍干，重复三次。

5、加酶标抗体：加100μL/孔1:8000稀释的辣根过氧化物酶标记兔抗鸡抗体(Sigma)，37℃作用1h，作用完毕后弃去酶标抗体，加200μL/孔PBST，静置3min，弃洗涤液，将ELISA板在吸水纸上用力拍干，重复三次。

6、加显色液：加入100μL/孔TMB底物显色液，显色液要用新鲜配制的，37℃条件下避光显色5min。

7、加入终止液：显色完毕后，立即加入终止液终止反应，每孔50μL。

8、测OD值：用酶标仪测定OD450nm处吸光值。

结果显示，阳性血清与阴性血清的OD值分别为1.102、0.245，P/N>2.1，由杂交瘤细胞CCTCCNO：C2014172产生的单克隆抗体4E11可以应用于鲤疱疹病毒3型感染的血清学诊断。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.一种分泌鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白ORF132的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCCNO：C2014172。

2.鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白ORF132的单克隆抗体，其特征在于，其由保藏编号为CCTCCNO：C2014172的杂交瘤细胞株产生。

3.根据权利要求2所述的鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白ORF132的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为IgG1亚类。

4.权利要求2-3任一项所述的鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白ORF132的单克隆抗体在制备检测鲤疱疹病毒3型的试剂中的应用。

5.一种检测鲤疱疹病毒3型的试剂盒，其特征在于，包括有保藏编号为CCTCCNO：C2014172的杂交瘤细胞株产生的鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白ORF132的单克隆抗体。