CN106366187A - 一株ii型鲤疱疹病毒orf72蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一株ii型鲤疱疹病毒orf72蛋白的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株II型鲤疱疹病毒ORF72蛋白的单克隆抗体，所述的单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2016141的杂交瘤细胞分泌，所述的杂交瘤细胞通过如下方法制得：以GST‑ORF72重组蛋白为抗原免疫小鼠获得小鼠脾细胞，将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。本发明还提供该单克隆抗体的应用。其优点表现在：本发明首次制得II型鲤疱疹病毒ORF72蛋白的单克隆抗体，可用于制备II型鲤疱疹病毒诊断试剂、抗II型鲤疱疹病毒的药物等。

Description

一株II型鲤疱疹病毒ORF72蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及技术领域，具体地说，是一株II型鲤疱疹病毒ORF72蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术
鲫(Crucian carp)饲养成本低，养殖地域广，在我国淡水养鱼上占有重要地位，我国鲫鱼养殖主要集中在东部、中部和南部地区，如江苏、湖北、江西、安徽、山东、广东、四川、辽宁、湖南、浙江等省。据统计，2013年我国鲫鱼年产量达259.44万吨，其中主要养殖品种为异育银鲫(Carassius auratus gibelio)。近年来，疱疹病毒性造血器官坏死病(herpesviral haematopoietic necrosis，HVHN)频发，对我国鲫鱼养殖业造成了严重影响。HVHN是鲫的一种高致病性病毒病，其病原为II型鲤疱疹病毒(cyprinid herpesvirus2，CyHV-2)。CyHV-2与分离自鲤科鱼类的另外两种病毒鲤疱疹毒1(Cyprinid herpesvirus1，CyHV-1)和鲤疱疹病毒3(Cyprinid herpesvirus 3，CyHV-3)亲缘关系较近，与沟鲶疱疹病毒(Ictalurid herpesvirus 1，IcHV-1)关系相对较远。Jung等在1995年对CyHV-2进行了第一次报道，发现CyHV-2是金鱼造血器官坏死病的致病病原。接着，美国、澳大利亚、中国台湾、英国养殖的金鱼也爆发该病。自从2011年匈牙利首次在养殖的鲫体内检测到CyHV-2后，近几年来关于CyHV-2感染鲫的报道也逐渐增多，捷克、意大利先后报道了CyHV-2感染鲫并引起鲫大批量死亡的情况。在我国，多个实验室在2012年和2013年先后报道了CyHV-2感染鲫的情况。虽CyHV-2有比较高的致死率，但其可以感染的种类比较少，只可以感染金鱼、鲫以及它的普通变种。组织病理学研究表明，被病毒感染的鲫体表出血，伴随眼球膨出，腹部膨胀，内脏器官严重出血，鳔壁斑点状出血。这些报道均表明CyHV-2是一种新生养殖鲫鱼病毒病，其发病区域在逐年扩大。CyHV-2病害已经引起我国水产养殖业管理部门及养殖户高度重视。
CyHV-2核衣壳呈六边形，直径为100～110nm，完整的病毒颗粒有囊膜，呈椭圆形，直径为175～200nm，基因组为线性双链DNA，全长290304bp，编码约150个基因。衣壳蛋白72是CyHV-2上的一个衣壳蛋白，鉴于病毒衣壳蛋白ORF72是病毒粒子上拷贝数最多的蛋白质之一，并且衣壳蛋白通常也是诱导宿主产生特异性免疫的主要蛋白，因此制备CyHV-2衣壳蛋白72的单克隆抗体。
中国专利文献CN104592383A公开了一种CyHV-2单克隆抗体，由杂交瘤细胞GFHNV-6G7、杂交瘤细胞GFHNV-3B5分泌产生。中国专利文献CN103667176A公开了一种鲤疱疹病毒II型敏感的异育银鲫脑组织细胞系及制备方法。中国专利文献CN104593388A公开了一种II型鲤疱疹病毒的疫苗。但是关于本发明的一株II型鲤疱疹病毒ORF72蛋白的单克隆抗体及其应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种II型鲤疱疹病毒ORF72蛋白的单克隆抗体。
本发明的再一的目的是，提供一种分泌II型鲤疱疹病毒ORF72蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
本发明的另一的目的是，提供一种II型鲤疱疹病毒ORF72蛋白的单克隆抗体的用途。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种II型鲤疱疹病毒ORF72蛋白的单克隆抗体，所述的单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2016141的杂交瘤细胞分泌。
所述的杂交瘤细胞通过如下方法制得：以GST-ORF72重组蛋白为抗原免疫小鼠获得小鼠脾细胞，将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。
GST-ORF72重组蛋白为抗原免疫小鼠的方法为：第一次免疫为腹腔内注射，抗原与弗氏完全佐剂等体积充分混匀后免疫；第一次免疫后14天进行第二次免疫，仍为腹腔内注射，抗原与弗氏不完全佐剂等体积充分混匀乳化后对小鼠进行免疫；第三次免疫采用不加佐剂的抗原皮下注射。
GST-ORF72重组蛋白的制备方法：从II型鲤疱疹病毒扩增ORF72基因片段，将ORF72基因片段与空质粒PGEX-4T-3反应获得重组质粒，重组质粒转化到大肠杆菌中，培养大肠杆菌获得重组蛋白。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种分泌II型鲤疱疹病毒ORF72蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，所述的杂交瘤细胞的保藏号为CCTCC NO:C2016141。
所述的杂交瘤细胞通过如下方法制得：以GST-ORF72重组蛋白为抗原免疫小鼠获得小鼠脾细胞，将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：所述的单克隆抗体在制备II型鲤疱疹病毒诊断试剂中的应用。
所述的单克隆抗体在制备抗II型鲤疱疹病毒的药物中的应用。
本发明优点在于：
本发明首次获得了II型鲤疱疹病毒ORF72蛋白的单克隆抗体，特异性强、灵敏度高，可用于制备II型鲤疱疹病毒诊断试剂、制备抗II型鲤疱疹病毒的药物。
附图说明
附图1：融合成功的杂交瘤细胞长成的细胞堆，说明免疫小鼠脾细胞与瘤细胞的成功融合。
附图2：最后一次亚克隆后进行Dot-blot的验证结果，Dot-blot表明D8株细胞阳性最强。
附图3：在进行Dot-blot进行验证后，发现D8株细胞阳性最强，并对该株细胞进行扩大培养，并进行Western-blot验证，经Western-blot验证表明该株细胞为ORF72重组蛋白的抗体的细胞株。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1多克隆抗体的制备
1.1实验仪器与材料
含有CyHV-2-YC毒株ORF72基因的重组质粒PGEX-4T-3-ORF72由本实验室构建并保存；大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)感受态购自天根生物有限公司；限制性内切酶，PCR试剂盒，T4连接酶购自Takara公司；HRP标记的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG多克隆抗体购自碧云天生物有限公司；6周龄ICR小鼠购自上海实验动物研究中心；2-8℃冷藏箱：Haier；-20℃低温保存箱：Haier；-80℃低温保存箱：中科美菱；-150℃超低温保存箱：Thermo；细菌电热恒温培养箱：上海安亭科技仪器有限公司；低温恒温槽：上海贺德试验设备有限公司；旋涡混合器：上海琪特分析仪器有限公司；微波炉：Galanz；琼脂糖凝胶电泳仪：Tanon；聚丙烯胺凝胶电泳仪：Tanon；免疫印迹电转移：Tanon；凝胶成像系统：Tanon；T100Thermal Cycler：Bio-rad；台式高速冷冻离心机：力康生物医疗科技控股有限公司；THZ-91A气浴恒温振荡器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；净化工作台：上海博讯实业有限公司；基因研究型纯水仪：艾科浦；IX71倒置式研究型显微镜：Olympos。
1.2ORF72基因片段的扩增
根据CyHV-2ORF72的基因序列设计引物(上游：5'-CCGGAATTCCATGTACGGCTTAAACAACGC-3'(SEQ ID NO.1)；下游：5'-TAAAGCGGCCGCAAATGTAGAGGCCGTTGAAT-3'(SEQ ID NO.2))，在上下游引物序列中分别插入EcoR I和NoT I酶切位点，以已纯化好的CyHV-2中所提的DNA为模板，对ORF72基因进行PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，用纯化回收试剂盒对目的片段进行回收。
1.3ORF72基因的克隆
将纯化回收得到的PCR产物和空质粒PGEX-4T-3分别在37℃中进行双酶切处理(体系：EcoR I 1μL，NoT I 1μL，10×buffer 3μL，PCR纯化回收产物≤200ng，加灭菌水到30μL；质粒体系：EcoR I 1μL，NoT I 1μL，10×buffer 5μL，质粒≤1μg，加灭菌水到50μL)1h后，酶切后用T4 DNA连接酶连接ORF72目的片段和PGEX-4T-3[T4Liqase 1μL，T4Liqase buffer2.5μL，PGEX-4T-3 98ng，ORF72目的片段220ng，加灭菌水到25μL]，将连接以后的产物转化到DH5α大肠杆菌中，筛选阳性克隆，菌液PCR鉴定为阳性的提取其重组质粒，经测序鉴定正确后，命名为PGEX-4T-3-ORF72。
1.4诱导表达和可溶性分析
将测序正确的PGEX-4T-3-ORF72转化到BL21大肠杆菌中，挑取LB/Amp平板筛选的阳性克隆，接种阳性菌落PGEX-4T-3-ORF72到5ml LB(Ampr+)培养基中，37℃摇床培养过夜。接着按照1:100的比例转移至刚配制的LB(Ampr+)液体培养基中培养，37℃，150r/min恒温摇床培养4h，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导，诱导5h后收集表达细菌，4℃，8500r/min离心20min；1×PBS洗涤两次，用适量1×PBS重悬后进行超声破碎处理30min(6s/6s)至溶液澄清。4℃，12000r/min离心10min后分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳，鉴定表达蛋白的可溶性。
1.5诱导表达条件的优化
将PGEX-4T-3-ORF72转化到BL21大肠杆菌中，挑取LB/Amp平板筛选的阳性克隆，接种阳性菌落到5ml LB(Ampr+)液体培养基中，37℃摇床培养过夜。将培养好的阳性菌液按1：100比例转移至新鲜配制的LB(Ampr+)培养基中，37℃，150r/min恒温摇床培养4h，加入IPTG诱导(IPTG终浓度设0.1、0.2、0.5和1.0mmol/L)，诱导5h后取50mL菌液离心，收集菌体，经SDS-PAGE分析不同浓度诱导下重组蛋白的表达量。
1.6目的蛋白的纯化
在优化的表达条件下诱导表达大量目的蛋白。然后将沉淀分别用2mol/L，4mol/L，6mol/L，8mol/L的尿素处理，每步均在4℃下8500r/min，离心20min，接着将洗脱下的蛋白用透析袋透析，依次放入含6、4、2和0mol/L尿素的PBS溶液中透析，每个浓度透析4h。透析后用BCA法微量蛋白浓度测量试剂盒测其浓度，于-80℃保存。
1.7多克隆抗体的制备
用已纯化好的目的蛋白免疫小鼠。200μg/只。第一次免疫为腹腔内注射，抗原与弗氏完全佐剂等体积充分混匀后免疫；第一次免疫后14天进行第二次免疫，仍为腹腔内注射，抗原与弗氏不完全佐剂等体积充分混匀乳化后对小鼠进行免疫。随后的第三次免疫是纯抗原，不加佐剂；主要采用皮下注射的方式。在免疫以后第三天，采取眼角采血；检测血清是否为阳性。
实施例2单克隆抗体的制备
2.1SP2/0小鼠骨髓瘤细胞以及实验用小鼠
SP2/0小鼠骨髓瘤细胞由实验室保存，实验前复苏并培养，使其处于对数生长期。实验用BABL/C小鼠购自上海市实验动物研究中心，在实验室暂养3天以备实验。
2.2仪器与设备
5％的CO2培养箱：Thermo Forma 3111
细胞培养瓶、细胞培养板(96、24、6孔)板：Thermo Fisher Scientific公司
其余1.1的仪器与设备。
2.3实验用药品与溶液配制
酶标板：Merck公司
聚乙二醇(PEG-4000)：北京鼎国生物公司
DMSO：SIGMA公司
进口胎牛血清(FBS)：GIBCO公司
RPMI-1640培养基、HAT选择培养基：Gibco公司
弗氏完全佐剂、弗氏(不)完全佐剂：Sigma公司
另外，配制的SP2/0培养液如下：
(1)RPMI1640完全培养液
在无菌的洁净工作台上混匀，然后在4℃保存待用。
(2)1％HAT选择培养基
在无菌的洁净工作台条混和均匀，4℃保存待用。
2.4抗异育银鲫衣壳蛋白72单克隆抗体的制备
以纯化的GST-72重组蛋白作为抗原，免疫小鼠，免疫步骤与多克隆抗体的制备步骤相同。最后一次免疫后三天，眼角采血，检测免疫效果，选择血清阳性者进行细胞融合。
2.4.1细胞融合及培养
在最后一次免疫后的第三天，拉颈处死小鼠并将小鼠泡在75％的乙醇溶液中，将另外没有经过处理的4周龄小鼠也处死泡在75％的乙醇溶液消毒处理，并在无菌条件下取免疫小鼠的脾脏和未免疫小鼠的胸腺细胞，并于100目网筛上进行研磨，用RPMI1640培养液吹下形成单细胞悬液，在25℃条件下，1000rpm离心3min，去上清，用预热的1％HAT选择性培养基重悬细胞沉淀，备用。将其脾细胞的悬液和处于对数生长期的SP/2小鼠骨髓瘤细胞混合均匀，并在25℃离心3min，弃去上清，然后缓慢滴加50％PEG溶液1ml，缓慢滴加37℃RPMI1640培养液10ml，5分钟后补加RPMI 1640培养液至40ml，25℃条件下1000rpm，离心5min，去上清。然后加入预热的1％HAT选择性培养基至40ml，滴至96孔板中，每孔100μl，在5％CO2恒温培养箱内37℃的恒温培养。
2.4.2采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆
用HAT选择培养液培养小鼠骨髓瘤细胞的细胞，培养7～10d后，将有细胞堆的孔换用HT选择培养基，培养3～4d后，用RPMI 1640完全培养基对阳性孔内细胞进行稀释至96孔细胞培养板中，选择单个细胞的阳性孔再一次进行克隆，直至达100％阳性孔率，总共进行了3次亚克隆。并采用Dot-blot法检测，筛选阳性杂交瘤细胞，转孔并扩大培养并建立细胞株用DMSO保存。
2.4.3对阳性细胞上清液进行Western blot验证
以纯化后的GST-ORF72蛋白加入500ul 2×SDS-PAGE上样缓冲液，制备上样样品，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，采用电转膜法(100V，60min)转至硝酸纤维素膜，使用5％牛奶4℃封闭过夜。用0.1M PBST清洗三次，将Dot-blot法删选到的抗GST-ORF72的阳性杂交瘤细胞作为一抗(37℃，2小时)，HRP作为二抗(1：3000稀释，37℃，1小时)孵育硝酸纤维素膜，期间保持缓慢摇动，用DAB显色缓冲液避光显色，检测阳性杂交瘤细胞。
本发明获得的杂交瘤细胞D8进行了保藏：杂交瘤细胞株CyHv-2-ORF72-D8，分类命名：杂交瘤细胞(hybridoma cell)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国湖北省武汉市武汉大学，保藏日期：2016年8月24日。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种II型鲤疱疹病毒ORF72蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2016141的杂交瘤细胞分泌。
2.根据权利要求1所述的II型鲤疱疹病毒ORF72蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述的杂交瘤细胞通过如下方法制得：以GST-ORF72重组蛋白为抗原免疫小鼠获得小鼠脾细胞，将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，GST-ORF72重组蛋白为抗原免疫小鼠的方法为：第一次免疫为腹腔内注射，抗原与弗氏完全佐剂等体积充分混匀后免疫；第一次免疫后14天进行第二次免疫，仍为腹腔内注射，抗原与弗氏不完全佐剂等体积充分混匀乳化后对小鼠进行免疫；第三次免疫采用不加佐剂的抗原皮下注射。
4.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，GST-ORF72重组蛋白的制备方法：从II型鲤疱疹病毒扩增ORF72基因片段，将ORF72基因片段与空质粒PGEX-4T-3反应获得重组质粒，重组质粒转化到大肠杆菌中，培养大肠杆菌获得重组蛋白。
5.一株分泌II型鲤疱疹病毒ORF72蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，所述的杂交瘤细胞的保藏号为CCTCC NO:C2016141。
6.根据权利要求5所述的杂交瘤细胞，其特征在于，所述的杂交瘤细胞通过如下方法制得：以GST-ORF72重组蛋白为抗原免疫小鼠获得小鼠脾细胞，将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。
7.根据权利要求1-4任一所述的单克隆抗体在制备II型鲤疱疹病毒诊断试剂中的应用。
8.根据权利要求1-4任一所述的单克隆抗体在制备抗II型鲤疱疹病毒的药物中的应用。
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