CN110746504A - 抗牛支原体MbovP579蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗牛支原体MbovP579蛋白的单克隆抗体，它是由杂交瘤细胞株1A2分泌的，所述杂交瘤细胞株1A2保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2018219。该单克隆抗体能与牛支原体发生反应，不与无乳支原体、鸡毒支原体、精氨酸支原体、绵羊肺炎支原体等反应，具有很高的特异性，可用于鉴别牛支原体与无乳支原体。而且能与更多的牛支原体包括临床分离株和标准参考株反应，在牛支原体的检测方面具有一定的广谱性。

Description

抗牛支原体MbovP579蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物领域，涉及检测牛支原体的单克隆抗体。
背景技术
牛支原体(Mycoplasma bovis，M.bovis)是严重影响牛健康的主要病原，导致牛罹患严重呼吸系统疾病，此外还可导致关节炎、乳腺炎等多种疾病。牛支原体于1961年在美国首先从罹患乳腺炎奶牛的牛乳中分离得到，呈世界性流行，给全球养牛业造成严重的经济损失，华中农业大学于2008年首次报道了我国牛支原体肺炎。
牛支原体临床上治疗效果差，周期长，治愈率低，发病率可达50-100％，病死率平均10％，最高可达40％。研究发现牛支原体实验室参考菌株和野外分离菌株存在抗原和遗传学的变异，对现有抗原抗体检测方法形成了干扰，需要更好的可用于鉴别诊断的生物材料。无乳支原体(Mycoplasma agalactiae)是继丝状支原体后第二个被人类所知的支原体，1925年首次由患传染性无乳症并伴随乳腺炎、关节炎和角膜结膜炎的山羊中分离出来，牛支原体与无乳支原体有很高的同源性，采用PCR扩增很难区分。
支原体缺乏细胞壁，膜蛋白和膜相关蛋白(Membrane associated proteins,MAP)在支原体的定植和存活中起着重要作用。现有研究已鉴定一些抗原性蛋白质，它们包括暴露于膜表面的蛋白质，如可变表面蛋白(Variable surface lipoproteins,VSPs)、p26、p48样脂蛋白、免疫原性脂肪酶A(MilA)和免疫显性膜蛋白pMB67，以及许多细胞质蛋白，如热激蛋白、甘油醛(GAPDH)和丙酮酸脱氢酶(PDHB)β亚基。由于膜蛋白早期暴露于宿主且更为保守，故敏感和特异的膜蛋白是建立鉴别牛支原体及无乳支原体广谱新型诊断试剂及方法的最佳选择。
CN103509756A公开了一种以HB0801菌体作为抗原制备的牛支原体单克隆抗体，但该牛支原体单克隆抗体与无乳支原体有交叉反应，无法实现对牛支原体和无乳支原体的鉴别。CN103436496A公开了一种仅与临床分离的牛支原体反应的单克隆抗体，亦是以牛支原体分离株的菌体蛋白作为抗原，因此得到的单克隆抗体为未知抗原蛋白。CN105695417A公开了一株能特异性识别牛支原体的单克隆抗体，采用的免疫原是牛支原体脂蛋白P48。CN104726413A公开了一株牛支原体NADH氧化酶的单克隆抗体，该单抗不能区分牛支原体及无乳支原体。
CN107118262A公开了一种牛支原体MbovP579蛋白，该专利申请人华中农业大学前期通过对该蛋白进行功能验证，发现能够与牛支原体抗体反应，具有反应原性，因此可用于间接ELISA检测牛支原体抗体。
发明内容
申请人在对牛支原体MbovP579蛋白进行前期研究的基础上，进一步利用该蛋白的免疫原性制备单克隆抗体，该单克隆抗体能与牛支原体反应，可进行抗原的检测且具有很好的特异性，能用于鉴别牛支原体与无乳支原体。
本发明的技术方案如下所述：
本发明所使用的免疫原为rMbovP579重组蛋白，该蛋白已在CN107118262A的专利文献中公开，公开日为2017年9月1日。
首先，利用制备的重组蛋白rMbovP579免疫小鼠，取小鼠脾细胞进行细胞融合，利用间接ELISA法筛选融合后的杂交瘤细胞，随后进行三次亚克隆并进一步筛选，获得能稳定分泌高亲合力牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞，将筛选出的三株细胞分别命名为杂交瘤细胞株1A2、4C9和4C11，然后制备、纯化和鉴定单克隆抗体，并采用间接ELISA测定杂交瘤细胞的培养上清效价，结果发现1A2的效价较高且非常稳定，表明1A2细胞状态优于其余两株。
接着，通过Western blot鉴定单克隆抗体的特异性。结果表明，3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体都能与牛支原体临床分离株发生特异性反应，而牛支原体标准株PG45仅与1a2(杂交瘤细胞株1A2、4C9、4C11分泌的单抗分别简称1a2、4c9、4c11)发生明显免疫印迹反应，与其余两株单抗的反应弱或无反应，说明1a2单克隆抗体能更广泛地鉴别牛支原体。
本发明中的杂交瘤细胞株1A2，于2018年11月6日送交湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C2018219。
本发明的有益效果是：
1)首次鉴定出牛支原体MbovP579重组蛋白的免疫原性，能够通过免疫动物制备单克隆抗体。
2)制备的单克隆抗体能与牛支原体发生反应，不与无乳支原体、鸡毒支原体、精氨酸支原体、绵羊肺炎支原体等反应，具有很高的特异性，可用于鉴别牛支原体与无乳支原体。
3)单克隆抗体能与更多的牛支原体包括临床分离株和标准参考株反应，在牛支原体的检测方面具有一定的广谱性。
4)所提供的ELISA检测方法具有很高的灵敏度，高于现有的大多数同类产品。
5)所提供的杂交瘤细胞具有较高的效价和稳定性，适合在液氮条件下长期冻存。
附图说明
图1：单克隆抗体1a2、4c9和4c11纯化后的SDS-PAGE照片。泳道M：参考蛋白；泳道1，2：纯化后的单克隆抗体1a2；泳道3，4：纯化后的单克隆抗体4c9；泳道5，6：纯化后的单克隆抗体4c11。
图2：单克隆抗体1a2、4c9和4c11与牛支原体HB0801株全菌蛋白的反应性结果。(A)牛支原体HB0801株全菌蛋白的SDS-PAGE结果。(B)单克隆抗体与牛支原体HB0801株全菌蛋白的Western blot结果，泳道M：参考蛋白；泳道1：1A2杂交瘤细胞上清；泳道2：4C9杂交瘤细胞上清；泳道3：4C11杂交瘤细胞上清。
图3：Western blot鉴定牛支原体单克隆抗体特异性。(A)：rMbovP579蛋白及不同支原体的SDS-PAGE分析；(B)，(C)，(D)：不同支原体与1a2，4c9和4c11的Western blot结果；泳道M.参考蛋白；泳道1：纯化后的rMbovP579蛋白；泳道2：牛支原体HB0801株F1代全菌蛋白；泳道3：牛支原体HB0801株F150代全菌蛋白；泳道4：无乳支原体标准株PG2全菌蛋白；泳道5：鸡毒支原体F株全菌蛋白；泳道6：牛支原体标准株PG45全菌蛋白；泳道7：精氨酸支原体全菌蛋白；泳道8：绵羊肺炎支原体标准株Y98全菌蛋白。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对发明作进一步说明。
实施例1：牛支原体rMbov579单克隆抗体的制备
所使用的抗原为纯化的rMbovP579重组蛋白，该蛋白由重组大肠杆菌制备，该重组大肠杆菌为Escherichia coli pET-30-Mbov-579，于2015年12月18日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2015763，并已在CN107118262A的专利文献中公开，公开日为2017年9月1日。
将重组大肠杆菌Escherichia coli pET-30-Mbov-579按常规方法进行复苏、诱导纯化后即可得到rMbovP579重组蛋白，具体操作方法可参考CN107118262A。
1.1小鼠免疫
用纯化的rMbovP579重组蛋白免疫6周龄雌性Balb/C鼠，免疫程序为：皮下多点注射与弗氏完全佐剂等体积混合乳化的抗原各100μg/只；以后每间隔两周免疫一次，抗原与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化，免疫2次。三免后两周用间接ELISA法检测小鼠产生的抗体滴度，健康小鼠血清作阴性对照。选择抗体滴度高的小鼠，在融合前第3天腹腔注射不加佐剂的抗原100μg/只。
1.2制备饲养细胞
空白小鼠眼球放血(阴性对照)，37℃放置30min，4000rpm离心15min，取上清作为阳性对照。断颈处死后放入75％酒精中浸泡5min，右侧卧固定小鼠(便于取脾)，用镊子夹起皮肤，剪一小口，撕开皮肤，显露腹膜，提起腹膜并剪开，显露脾脏，取脾放入匀浆器中。加入3mL RPMI-1640培养基，研磨至无明显红色组织，取出匀浆棒，加入7mL RPMI-1640，静置2min，吸取上层细胞悬液于50mL离心管中，如此重复三次。1000rpm，室温(25℃)离心10min去上清，转入到预装50mL含有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)的完全1640培养基(1％HAT，20％胎牛血清FBS，1％青/链双抗，RPMI-1640培养基)的盐水瓶中，先重悬后转入。用滴管滴加到96孔板，每孔两滴约100μL，共铺满5块，于5％CO2、37℃培养箱中培养24h待用。
1.3细胞融合
经超免的Balb/C小鼠，采集眼球血作为阳性对照，脾细胞制备过程参考2.2，最后用2mL不完全1640培养基重悬。弃去培养至对数期的骨髓瘤细胞培养基，加入10mL不完全1640培养基将细胞吹散，转至50mL离心管，1000rpm，室温(25℃)离心10min去上清，2mL不完全1640培养基重悬。
将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞以10:1比例混合(一只小鼠用2个T75细胞培养瓶)，于尖底离心管中，1000rpm，室温(25℃)离心10min弃上清，灭菌滤纸吸干多余液体，轻敲管底使细胞松动。将离心管放于37℃水浴中，在1min内慢慢加入0.8mL的PEG4000(提前预热)，边加边轻轻搅拌。加毕，继续慢搅30s，静置1min，然后慢慢加入10mL预热到37℃的RPMI-1640培养基：第1min逐滴加入1mL，第2min加1mL，第3-4min加3mL，第5min加5mL(每次加入需轻轻搅拌)，最后缓慢加入30mL，终止融合。
在室温(25℃)按照1000rpm，离心10min后弃上清，37℃放置5-8min，HAT完全1640培养基重悬(1％HAT，20％胎牛血清FBS，1％青/链双抗，RPMI-1640培养基)，再转至50mL盐水瓶中(轻柔)，加入到已预铺饲养细胞的96孔板中，5％CO2、37℃培养箱中培养。
1.4阳性杂交瘤的筛选及亚克隆
阳性杂交瘤的筛选采用间接ELISA方法：取牛支原体HB0801株全菌蛋白(实验室保存)，用包被液稀释至5μg/mL，加入96孔板，每孔100mL，于4℃放置12h，PBST(1×PBS中含0.5％的吐温20)洗涤3次，5％的脱脂奶每孔200μL于37℃封闭1h，PBST洗涤三次，吸取60μL细胞培养上清37℃孵育1h，PBST洗涤3次，羊抗鼠IgG-HRP1:5000倍稀释每孔100μL于37℃孵育45min，PBST洗涤5次，加入TMB底物A(武汉科前动物生物制品有限责任公司)和TMB底物B(武汉科前动物生物制品有限责任公司)各50μL，避光显色10min，每孔加50μL终止液(武汉科前动物生物制品有限责任公司)终止反应，用酶标仪在630nm波长下测定OD值。
结果显示为阳性的继续做亚克隆，同时扩大培养并冻存。采用有限稀释法对所选的杂交瘤细胞进行3次亚克隆。具体步骤为：提前一天制备好饲养细胞，步骤同1.2，将要克隆的杂交瘤细胞用200μL吸头轻轻吹下后计数，将细胞用RPMI-1640完全培养基(1％HAT，20％胎牛血清FBS，1％双抗(青霉素/链霉素，RPMI-1640培养基)稀释至每毫升培养基含20个细胞，每孔100μL，5％CO2、37℃培养箱中培养。培养至第5天补液50μL，第7-10天，当细胞长到视野1/5-1/3时，检测杂交瘤细胞的抗体效价，选择抗体效价高、集落形态好、呈单集落生长的孔，继续亚克隆。亚克隆使用的为含有次黄嘌呤-胸腺嘧啶核苷(HT)的1640培养基，至少克隆三次。
三次克隆之后将阳性的杂交瘤细胞移至24孔细胞培养板中培养，原孔加HAT培养基。待24孔板中细胞生长良好时，冻存杂交瘤细胞。
共筛选得到三株阳性杂交瘤细胞，分别命名为1A2、4C9、4C11。
1.5杂交瘤细胞的冻存与复苏
杂交瘤细胞的冻存方法：同其它细胞系的冻存方法一样，原则上每支冻存管的细胞量应在1×106个以上，但原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而数量不同。细胞冻存液配方(体积比)：90％小牛血清，10％DMSO(二甲基亚砜)。冻存液最好预冷，操作时务必动作轻柔、迅速。冻存时从室温转入含有异丙醇的冻存盒，并放入-80℃超低温冰箱，次日转入液氮中。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。
细胞复苏方法：将细胞冻存管自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，将细胞转至15mL尖底离心管，加入9mL的RPMI-1640培养基，1000rpm室温(25℃)离心10min去上清，用RPMI-1640完全培养基(20％胎牛血清FBS，1％青/链双抗，RPMI-1640培养基)重悬，转至12孔细胞培养板培养。为提供杂交瘤细胞良好的生长环境，也可在前一天制备好饲养层细胞于12孔板内，置37℃、5％CO2温箱中培养。当细胞形成集落时，检测抗体活性。
1.6单抗腹水的制备及纯化
选取8周龄的雌性Balb/C小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5mL/只，7天后将培养至对数生长期的杂交瘤细胞吹下，离心后用RPMI 1640培养基重悬，腹腔注射106个/只，相当于12孔板单孔的细胞量注射一只小鼠。7-10天后待小鼠腹部明显膨大，16号针头收集小鼠腹水，4000rpm离心10min，收集上清，即为含有单克隆抗体的腹水。腹水的纯化使用Protein G亲和层析柱，纯化流程如下：
(1)含有重组蛋白的琼脂糖微球填料装入层析柱，用3-5倍柱体积的去离子水洗涤。
(2)用5倍柱体积的结合Buffer(0.15M NaCl，20mM Na2HPO4，PH 7.0)平衡层析柱。1mL预装柱流速为1mL/min。
(3)利用注射器上样，所有过柱液体全部用0.22μm滤膜过滤。
(4)离心后腹水用结合Buffer进行5倍稀释过滤器后上柱，重复过柱3次。
(5)用洗杂Buffer(结合Buffer)冲洗柱子，一般10个柱体积。
(6)用洗脱Buffer一步法洗脱，5倍柱体积。
(7)1/10体积的中和液(1M Tris-HCl，PH 8.5)中和洗脱液。
将洗脱液装入透析袋，用PEG 20000浓缩洗脱液至上柱时体积，在100体积的1×PBS中于4℃冰箱透析24小时，期间换液3次，并用PEG 20000进行浓缩，测定蛋白浓度后分装，于-20℃保存。取少量纯化后单抗进行SDS-PAGE分析。结果见附图1，三种单克隆抗体在纯化后可见两条链，重链大小为55KDa，轻链大小为25KDa，无明显杂带，结果说明该方法纯化效果好。
实施例2：牛支原体单克隆抗体的鉴定
2.1单克隆抗体与牛支原体全菌蛋白反应性
将杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液于-20℃保存。用PPLO培养基(PPLO 10.5g，酵母粉2.5g，丙酮酸钠0.5g，超纯水定容至440mL，121℃灭菌20min后，加入马血清50mL，灭菌10×MEM 5mL，无菌8万单位/mL青霉素溶液5mL，无菌1％酚红溶液500μL)培养牛支原体HB0801株(华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原学分室分离并保存)，超声破碎的方法提取全菌蛋白，进行SDS-PAGE电泳，经过湿转印到PVDF膜上(65V，100min)，5％脱脂奶在4℃封闭过夜，TBST洗膜三次，用杂交瘤细胞株上清液作为一抗在室温下作用1小时，用TBST洗膜三次，与1：5000倍稀释的羊抗鼠IgG-HRP孵育1小时，用TBST洗膜三次，再用TBS洗膜三次，ECL(购自Advansta)显色。
如图2所示，三株杂交瘤细胞1A2、4C9和4C11分泌的单抗均可识别牛支原体菌株中82.5KD大小的蛋白，与MbovP579分子量相符。1A2杂交瘤细胞株所分泌单抗较4C9及4C11与全菌蛋白的免疫印迹反应条带更浓。
2.2杂交瘤细胞培养上清效价检测
将建株后的杂交瘤细胞扩大培养，当传至第5、10、15代及液氮冻存3个月后复苏，收集细胞培养上清，间接ELISA测定效价。
利用间接ELISA法，包被P579蛋白100ng/孔4℃过夜，细胞传代后48小时取100μL开始倍比稀释作一抗，SP2/0培养上清作阴性对照，37℃孵育1h；羊抗鼠HRP-二抗1:5000稀释，每孔100μL，37℃孵育45min；最后用TMB显色液显色，氢氟酸终止后OD630 nm处读取值。结果如表1所示，只有1A2株杂交瘤细胞在液氮冻存3个月后分泌抗体效价未下降，而其它两株4C9和4C11均下降一半，表明1A2细胞状态优于其余两株。
表1杂交瘤细胞上清效价检测
Figure BDA0002262445280000081
对该细胞系进行了染色体计数，结果显示，杂交瘤细胞的染色体数目平均值为102.1条，满足SP2/0的染色体数为62～68条，脾细胞染色体为40条，说明融合细胞的确是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。将该细胞株经腹腔注射Balb/C小鼠，生产单克隆抗体。采用购自Thermo Scientific公司的鼠单克隆抗体(Monoclonal antibody,Mab)快速ELISA同型试剂盒对所得到的单克隆抗体的亚型和轻链进行鉴定，结果为小鼠IgG1亚型。
2.3单抗亲和力实验
将牛支原体HB0801全菌蛋白以500ng/孔包被在酶标板上，3株纯化的单克隆抗体以1mg/mL的浓度从100开始倍比稀释，作为一抗，以HRP标记山羊抗鼠IgG为二抗。将OD630nm平坦区的值视为100％，曲线上OD630nm为50％的值所对应的单抗浓度(mol/L)的倒数就是亲和常数。计算所得1a2、4c9和4c11的亲和常数分别为1.28×109、1.26×109和1.8×109。
实施例3：牛支原体单克隆抗体的特异性鉴定
在PPLO培养基(PPLO 10.5g，酵母粉2.5g，丙酮酸钠0.5g，超纯水定容至440mL，121℃灭菌20min后，加入马血清50mL，灭菌10×MEM 5mL，无菌8万单位/mL青霉素溶液5mL，无菌1％酚红溶液500μL)中分别培养下列用于检测的单克隆抗体的抗原表位和特异性鉴定的菌株。牛支原体HB0801株、无乳支原体标准株PG2(购自美国典型培养物保藏中心，编号ATCCNO:35890)、牛支原体标准株PG45(购自美国典型培养物保藏中心，编号ATCC NO:25523)、精氨酸支原体(购自中国兽医药品监察所兽用典型培养保藏中心，编号CVCC 346)、绵羊肺炎支原体标准株Y98(购自美国典型培养物保藏中心，编号ATCC NO:29419)和鸡毒支原体，通过超声破碎的方法提取各自的全菌蛋白。将纯化的牛支原体P579蛋白、牛支原体HB0801株F1代全菌蛋白、牛支原体HB0801株F150代全菌蛋白、无乳支原体标准株PG2全菌蛋白、鸡毒支原体F株全菌蛋白、牛支原体标准株PG45全菌蛋白、精氨酸支原体全菌蛋白及绵羊肺炎支原体标准株Y98全菌蛋白进行SDS-PAGE电泳，经过半干转印到硝酸纤维素膜上(25V，40min)，在4℃使用5％脱脂奶封闭过夜，TBST洗膜三次，用纯化的单抗(体积比1：1000稀释)作为一抗在室温下作用1小时，用TBST洗膜三次，与1：10000倍稀释的HRP-羊抗鼠IgG孵育1小时，用TBST洗膜三次，再用Super Signal West Pico Trial Kit(购自Thermoscientific)显色。
结果如图3所示，3株单克隆抗体均能与牛支原体P579蛋白、牛支原体HB0801株F1代全菌蛋白和牛支原体HB0801株F150代全菌蛋白发生特异性反应，而牛支原体标准株PG45仅与1a2单抗发生明显反应，与其余两株单抗的反应弱或无反应，说明1a2能与更多的牛支原体包括临床分离株和标准株发生特异性反应。
实施例4单克隆抗体的检测效果评价
以100ng/孔的浓度包被rMbovP579蛋白，直接ELISA法将标记的单克隆抗体1a2-HRP、4c9-HRP和4c11-HRP以梯度稀释来进行反应。如下表2所示，同样的稀释倍数条件下，1a2-HRP的P/N值始终比其它两株酶标单抗大，证明1a2抗体的检测效果显著优于4c9和4c11。
表2 3株单抗检测效果比较
Figure BDA0002262445280000101

Claims (6)

1.一种抗牛支原体MbovP579蛋白的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：它是由杂交瘤细胞株1A2分泌的，所述杂交瘤细胞株1A2保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2018219。
3.一株杂交瘤细胞株1A2，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2018219。
4.权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备牛支原体检测试剂盒中的应用。
5.包含权利要求1或2所述单克隆抗体的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒是检测牛支原体的酶联免疫试剂盒。
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