CN110818778B - 一种用于制备单增李斯特菌单克隆抗体的抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于制备单增李斯特菌单克隆抗体的抗原，所述抗原的氨基酸序列为SEQ NO.1。本发明通过筛选、实验验证获得一段能够代表单增李斯特菌的特异性表面蛋白片段，以这一段特异性表面蛋白片段作为抗原序列采用细胞融合得到阳性细胞株，经过三轮亚克隆后，利用间接ELISA法检测阳性菌株并检测其分泌抗体与其他食源性致病菌株的交叉反应，获得特异性融合细胞株，最终得到了效价高、特异性好的一株单克隆杂交瘤细胞，制备了鼠单克隆抗体，效价为810000，特异性良好。本发明的单克隆抗体灵敏度较高，特异性好，稳定性强。

Description

一种用于制备单增李斯特菌单克隆抗体的抗原、单克隆抗体、 多克隆抗体和方法

技术领域

本发明属于单增李斯特菌的检测技术领域，尤其是一种用于制备单增李斯特菌单克隆抗体的抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和方法。

背景技术

单增李斯特菌属于李斯特菌属，革兰氏染色阳性菌、兼性胞内寄生菌，两端钝圆且无芽孢，不产生荚膜。需氧及兼性厌氧，最适生长温度为30-37℃，嗜冷、耐酸、耐碱、耐高浓度盐，耐热性强，灭菌需要60℃加热20min或70℃加热5min。

单增李斯特菌是一种人畜共患食源性致病菌，能导致败血症、脑膜炎、胃肠炎、脑脊髓炎及肺炎等，病死率高达20-30％，新生儿、孕妇及免疫功能不足人群更容易受到感染。由于巴氏杀菌奶受到污染，2007年美国马萨诸塞州发生一起单增李斯特菌感染疾病暴发事件，造成5人感染，导致3人死亡。

单增李斯特菌广泛分布于自然环境中，主要存在于土壤、蔬菜、肉制品、乳制品、饲料及冷冻水产品中等。受到感染的食品严重威胁人类的安全，因此，一种快速、简便、灵敏的检测方法对于提高单增李斯特菌的检验速度和准确性十分重要，以及时处理受到污染的食品，保证食品安全的进入流通领域，将危害消费者生命安全的风险降到最低。

单增李斯特菌主要检测方法包括细菌分离鉴定法、分子生物学检测方法及免疫学检测方法。传统的检测方法检测周期长并且操作复杂，需要分离培养、镜检观察、生化鉴定等多个步骤，已经越来越不能满足快速检测的需求。分子生物学检测技术具有检测快速、灵敏、特异的特点，但是对实验室和相关工作人员的要求较高。免疫学检测技术具有灵敏度高、特异性强、价格低廉、方便快捷等优点，在食源性致病菌的检测方面具有重要的应用价值。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种用于制备单增李斯特菌单克隆抗体的抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种用于制备单增李斯特菌单克隆抗体的抗原，所述抗原的氨基酸序列为SEQNO.1：

IAPELYNITDEIAKFSSEKTALIWKNEHGETKTWSYHHLLEQANKFANVAKDAGIKKGDHVIVMTPRLLETYAIYMGLWKAGAIIIPASELLKAHDLEYRIHHANVKAIVSYNGMTAEFDKIESIPSVSKKIIVGDKLSGWEQYETLMEAAPTEFERVETSRDDACLLAFTSGTTGNPKGVVHIHGWGYAHIRIAADH。

利用如上所述的抗原制备的单克隆抗体。

利用如上所述的抗原制备的多克隆抗体。.

而且，所述多克隆抗体是由所述抗原免疫动物后制备得到的。

如上所述的单克隆抗体在检测或辅助检测单增李斯特菌的检测产品方面中的应用。例如，在单增李斯特菌的试剂盒、试纸条以及其它检测产品中的应用。

如上所述的多克隆抗体在检测或辅助检测单增李斯特菌的检测产品方面中的应用。例如，在单增李斯特菌的试剂盒、试纸条以及其它检测产品中的应用。

一种利用如上所述的单克隆抗体检测或辅助检测单增李斯特菌的方法，所述方法中使用到单克隆抗体。

一种利用如上所述的单克隆抗体检测或辅助检测单增李斯特菌的方法，所述方法中使用到多克隆抗体。

一种利用如上所述的单克隆抗体的单增李斯特菌的免疫检测方法，所述单克隆抗体作为捕获抗体。

一种利用如上所述的多克隆抗体的单增李斯特菌的免疫检测方法，所述多克隆抗体作为检测抗体。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明通过筛选、实验验证获得一段能够代表单增李斯特菌的特异性表面蛋白片段，以这一段特异性表面蛋白片段作为抗原序列采用细胞融合得到阳性细胞株，经过三轮亚克隆后，利用间接ELISA法检测阳性菌株并检测其分泌抗体与其他食源性致病菌株的交叉反应，获得特异性融合细胞株，最终得到了效价高、特异性好的一株单克隆杂交瘤细胞，制备了鼠单克隆抗体，效价为810000，特异性良好。本发明的单克隆抗体灵敏度较高，特异性好，稳定性强。

2、本发明还针对所获得的特异性表面蛋白片段制备了多克隆抗体，基于制备的单克隆抗体与多克隆抗体，本发明还公开了以此为基础建立的快速、灵敏、特异性高的单增李斯特菌双抗夹心ELISA检测方法，利用鼠单克隆抗体作为捕获抗体，兔源多克隆抗体作为检测抗体，0.5％脱脂乳粉在37℃下封闭1.0h，酶标羊抗兔抗体作用时间为0.5h，检测限为10⁴CFU/mL，选取5株种内单增李斯特菌、5株李斯特菌属内菌种，以及5株非李斯特菌进行特异性检测，检测结果显示特异性良好。为市场上产品中单增李斯特菌的检测提供了可靠的方法，并且为进一步试纸条检测方法的开发奠定了基础。

附图说明

图1为本发明中抗原在大肠杆菌中重组表达后纯化的结果图；其中，M：marker，1：粗蛋白，2：纯化后；

图2为本发明中捕获抗体包被量的优化图；其中，捕获抗体包被量为a-e：0.1、0.25、0.5、0.75和1.0μg/孔；

图3为本发明中封闭液种类的优化图；其中，a：0.5％脱脂乳粉，b：0.5％BSA，c：0.5％明胶；

图4为本发明中检测抗体稀释倍数的优化图；其中，a：1：50，b：1：100，c：1：200，d：1：400；

图5为本发明中单增李斯特菌双抗夹心ELISA检测方法的标准曲线图；

图6为本发明中单增李斯特菌双抗夹心ELISA检测方法的特异性图。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种用于制备单增李斯特菌单克隆抗体的抗原，所述抗原的氨基酸序列为SEQNO.1：

IAPELYNITDEIAKFSSEKTALIWKNEHGETKTWSYHHLLEQANKFANVAKDAGIKKGDHVIVMTPRLLETYAIYMGLWKAGAIIIPASELLKAHDLEYRIHHANVKAIVSYNGMTAEFDKIESIPSVSKKIIVGDKLSGWEQYETLMEAAPTEFERVETSRDDACLLAFTSGTTGNPKGVVHIHGWGYAHIRIAADH。

利用如上所述的抗原制备的单克隆抗体。

利用如上所述的抗原制备的多克隆抗体。.

较优地，所述多克隆抗体是由所述抗原免疫动物后制备得到的。

如上所述的单克隆抗体在检测或辅助检测单增李斯特菌的检测产品方面中的应用。例如，在单增李斯特菌的试剂盒、试纸条以及其它检测产品中的应用。

如上所述的多克隆抗体在检测或辅助检测单增李斯特菌的检测产品方面中的应用。例如，在单增李斯特菌的试剂盒、试纸条以及其它检测产品中的应用。

一种利用如上所述的单克隆抗体检测或辅助检测单增李斯特菌的方法，所述方法中使用到单克隆抗体。

一种利用如上所述的单克隆抗体检测或辅助检测单增李斯特菌的方法，所述方法中使用到多克隆抗体。

一种利用如上所述的单克隆抗体的单增李斯特菌的免疫检测方法，所述单克隆抗体作为捕获抗体。

一种利用如上所述的多克隆抗体的单增李斯特菌的免疫检测方法，所述多克隆抗体作为检测抗体。

具体地：

本发明选定特异性强的氨基酸序列为抗原序列在大肠杆菌中进行表达并制备抗原。本发明进一步将所制备的抗原纯化后免疫Balb/c小鼠,将经过单增李斯特菌重组蛋白免疫后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0进行融合，融合后用HAT培养基进行筛选，没能成功融合的骨髓瘤细胞、脾细胞等因HAT的筛选作用逐渐凋亡，只有成功融合的有双核存在的杂交瘤细胞得以存活下来。继续通过有限稀释法进行克隆化，直到筛选出生长能力强、适应力强且能稳定分泌单增李斯特菌单克隆抗体的细胞株。

分别用以该抗原免疫新西兰兔后制备完成的兔源多克隆抗体、此次制备的单克隆抗体作为捕获抗体，对应检测抗体分别为单抗(1:3000-1:81000)与兔源多抗(1:50-1:400)；分别选用羊抗鼠酶标二抗(1：5000)、与羊抗兔酶标二抗(1：10000)；进行双抗夹心ELISA实验。当选择鼠单抗作为捕获抗体、兔多抗作为检测抗体时，空白值最低。所以确定最佳抗体组合为鼠单抗作为捕获抗体、兔多抗作为检测抗体。之后对捕获抗体包被量进行优化，根据线性相关性，确定最佳包被量为0.5μg/孔。对封闭液种类进行优化，选择0.5％脱脂乳粉、0.5％BSA和0.5％明胶作为封闭液，根据双抗夹心ELISA实验选择0.5％脱脂乳粉作为封闭液。对检测抗体稀释倍数进行优化，将兔多抗作为检测抗体用PBS溶液梯度稀释，双抗夹心ELISA实验显示稀释倍数为1：100时，空白值最低且线性相关性较好，因此确定兔多抗作为检测抗体的稀释倍数为1：100。

通过上述优化，确定双抗夹心ELISA方法的最佳工作条件：鼠单抗以0.5μg/孔包被96孔板，100μL/孔；0.5％脱脂乳粉作为封闭液，37℃封闭1.0h；兔多抗作为检测抗体稀释倍数为1：100；羊抗兔酶标二抗稀释倍数为1：10000。将单增李斯特菌菌液浓度作为x轴，吸光度值作为y轴，绘制标准曲线。通过公式计算得到检测限为10⁴CFU/mL。选择单增李斯特菌5株种内菌株、5株属内菌株，并且选择5株属外的肠炎沙门氏菌ATCC 13076、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、阪崎克罗诺杆菌IQCC 10409、腐生葡萄球菌ATCC 49907、表皮葡萄球菌CICC10294进行特异性验证，结果显示特异性良好。

更为具体地，相关制备及验证如下：

一、免疫原的制备

1.1重组载体的构建

将目的基因片段和双酶切后的载体进行连接，转化大肠杆菌感受态DH5α并筛选阳性克隆。

1.2单增李斯特菌重组蛋白的表达

1.2.1转化。取10μL构建好的重组质粒，转化到表达菌株E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有Kana的LB琼脂平板37℃倒置过夜培养。

1.2.2菌株扩增。分别从转化平板上挑取生长较好的菌落接种于含有100μg/mLKana的5mL LB培养液中37℃过夜振荡培养。

1.2.3转培养及诱导。取50μL过夜培养液，按1:100体积比比例转接到新的5mL LB培养液(含100μg/mLKana)里，转培养3小时左右至菌液浓度的OD600达到0.6-1.0左右时，取出500μL菌液作为对照，剩余部分加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导，继续培养5h。将诱导后的菌液分别取出4mL，于室温下，5000rpm离心5min，收集菌体。用500μL1×PBS悬起，5000rpm离心5min，重复两次，洗去LB培养基，再将沉淀复溶于1mLPBS中。在冰浴中超声1s、间歇4s，全程20min，功率200W。将破碎后菌液于4℃，12000rpm离心10min，收集上清和沉淀，将沉淀用500μL 1×PBS重悬，分别取50μL上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳检测。

1.2.4检测可溶性表达。取2mL诱导后的菌液，5000rpm，5min，去掉上清；用500μL1×PBS重悬菌体，冰浴；进行超声破碎，超1s，停3s，反复99次，超声过程中会产热，因此实验的整个操作需在冰浴上进行，防止蛋白质降解；冰浴结束后，10000rpm，4℃离心10min；吸出上清，沉淀用500μL 1×PBS重悬；分别取10μL上清和沉淀，进行SDS-PAGE，若蛋白在上清中，则是可溶性表达，若蛋白在沉淀中，则表明形成了包涵体，要进行变性复性。

1.2.5重组蛋白诱导条件的优化。选取不同的IPTG终浓度诱导表达特异性蛋白，诱导条件为37℃5h，30℃8h，20℃12h。IPTG终浓度分别为0.05mM、0.1mM。取诱导后的菌液分别进行SDS-PAGE。

1.3单增李斯特菌重组蛋白的纯化

1.3.1机械破碎。将大规模表达的菌液，4℃6000rpm离心10min，弃掉上清，菌体使用20mL1×PBS悬起，添加TritonX-100至浓度为0.2％。进行超声波机械破碎，间隔3s，超声1s，全程40min。将超声破碎获得的溶液，4℃，10000rpm离心10min。若是可溶性表达，则可以直接过Ni-NTA·His·Bind纯化蛋白，若为包涵体则要进行包涵体变性复性。

1.3.2变性复性。用PBS重悬起沉淀，4℃，12000rpm离心10min，弃去上清，将沉淀进行以下处理：用20mL BufferA将包涵体悬起，充分混匀，4℃，10000rpm离心20min，弃上清，重复此步骤一次。用20mL Buffer B将沉淀悬起，充分混匀，10000rpm离心20min，弃上清，重复此步骤一次。用20mLBuffer C将沉淀悬起，充分混匀，于37℃，220rpm快摇1h，4℃，10000rpm离心10min，去除沉淀，保留上清。将上清液小心装入透析袋，置于50倍体积的透析液中，4℃透析12h，再用不同浓度的透析液继续透析(2M尿素2次，1M尿素1次，0.5M尿素1次，不含尿素2次，透析12h)。取出复性液于4℃，10000rpm离心10min，保留上清，弃沉淀。

1.3.3Ni-NTA·His·Bind亲和柱纯化蛋白。

a.将实验中用到的所有缓冲液和溶剂超声15min，排除气泡。

b.将1mL 50％Ni-NTA·His·Bind树脂悬液加入到4mL1×Ni-NTA结合缓冲液中，轻柔混匀。待树脂自然沉降后，用枪头吸去4mL上清。

c.加入4mL制备好的裂解液，轻柔摇动混匀，4℃结合60min。

d.将裂解液Ni-NTA·His·Bind树脂混合物加入下端封闭的空色谱柱中。

e.除去柱子下端封闭的盖子，收集流出液，保存用于SDS-PAGE。

f.用4mL1×Ni-NTA·His·Bindwashing buffer洗两次，收集漂洗组分，用于SDS-PAGE.

g.用0.5mL 1×Ni-NTAeluting buffer洗脱4次，将洗脱组分分四部分收集，用于SDS-PAGE。

h.将纯化前后的样品进行SDS-PAGE，从而确定含有目的蛋白的样品。

结果见图1，纯化后的结果显示，在约26kDa的位置有一条清晰且单一的条带，这表明目的蛋白的表达正确并且纯化效果良好，可以用于之后多克隆抗体和单克隆抗体的制备。

二、多克隆抗体的制备

2.1动物免疫实验

大量纯化特异性蛋白。取健康、体重、年龄、性别一致的新西兰白兔两只，预饲一周，免疫前取血作为阴性对照。将蛋白分别与弗氏完全佐剂1:1混合，乳化。加强免疫时，抗原与弗氏不完全佐剂1:1混合，乳化。每隔两周免疫一次，共免疫5次。第三次免疫后，用间接法酶联免疫吸附测抗体效价水平。最后一次免疫后的7-10天，从动脉取全血。离心获得抗血清，分装-20℃保存。

2.2间接ELISA检测抗血清效价水平

白兔耳静脉取血，室温放置半个小时，4℃放置4h以上，离心获得血清，分装-20℃保存。采用间接ELISA方法对兔子免疫之后的血清的IgG抗体水平进行检测。方法如下：

(1)将抗原蛋白用包被液稀释后，以100μL×1μg/孔的包被量包被96孔酶标板，于4℃包被过夜或者37℃包被3-4h。

(2)封闭：甩掉酶标板孔内的液体，每孔加入PBST 250μl/well洗板三次，每次2min,最后一次吸水纸上拍干。加入含1％脱脂乳粉的PBS缓冲液100μL/well，37℃封闭1h。

(3)去掉酶标板孔内的液体，用PBST缓冲液洗板三次后，最后一次吸水纸上拍干。加入用1×PBS梯度稀释的抗血清100μL/well，室温孵育1h。

(4)去掉酶标板孔内的液体，用PBST洗板四次后，最后一次吸水纸上拍干。加入用1×PBS稀释的酶标二抗100μL/well，室温孵育30min。

(5)去掉酶标板孔内的液体，用PBST洗板五次后，最后一次吸水纸上拍干。加入邻苯二胺底物体系150μL/well，室温显色30min。

(6)加入1.25mol/L浓硫酸50μL/well，终止反应。

(7)使用酶标仪在双波长方式以450nm为测定波长，650nm为参照波长，读取OD值，选择吸光度值在0.8-1.2范围内的抗血清稀释倍数，即为抗体效价。

结果显示rabbit-1和rabbit-2的抗血清效价都可达到后续实验要求，且都随着免疫时间的延长而持续上升。此外，数据显示，在所有条件一致的情况下，即同种免疫原、免疫途径和免疫周期下，它们的抗血清效价间也会有略微差异，这可能是由于免疫动物本身的个体差异造成的.

2.3抗体的纯化

本实验采用免疫亲合层析法对兔抗血清进行纯化，所用填料为ProteinA－SepHarose4B。

具体步骤如下：

a.将实验中用到的缓冲液和溶剂超声15-20min，排除里面的气泡。

b.平衡纯化柱：先用pH7.4的磷酸缓冲液(Binding buffer)冲洗管路2min，流速6.5mL/min。安装好纯化柱之后仍用pH7.4的磷酸缓冲液平衡柱子，流速1mL/min。待程序屏幕中紫外和电导两条基线平行，即可停止冲柱。

c.上样：上样之前，在液体入口处留一段气泡，以便于观察样品的流程。将待纯化的兔抗血清用等体积的磷酸缓冲液(Binding buffer)稀释后上柱，流速0.5mL/min。抗血清中的免疫球蛋白会特异性吸附在ProteinA－SepHarose4B的结合位点上，而其他的蛋白脂肪等杂质不会被吸附，会随缓冲液流出。

d.洗脱：上样完成后，继续用磷酸缓冲液冲洗整个柱子，待基线达到平衡后停止冲洗。用pH2.7的甘氨酸-盐酸缓冲液(Elution buffer)冲洗整个柱子，流速0.5mL/min。此时与ProteinA-SepHarose4B结合的免疫球蛋白IgG会被洗脱下来。

e.收集：观察柱子中甘氨酸-盐酸缓冲液的流程，当其进入凝胶时，开始收集样品，每管接取1mL，大约接取10管。在收集样品的过程中，用紫外分光光度计测样品的A280值，用Elutionbuffer调空白。A280>0.2的收集液是纯度符合要求的免疫球蛋白IgG。收集完毕后立即用Tris-HCl调节抗体溶液的pH至7.0，以免抗体中蛋白质在酸性条件下变性失活。

f.处理纯化柱：抗体收集完后调整流速为2mL/min，用0.1mol/L醋酸迅速冲洗柱子2min，然后再用磷酸缓冲液冲洗以平衡柱子，用pH试纸测定流出缓冲液的pH值，至中性为止。然后用20％乙醇溶液冲洗柱子30min，最后将柱子中灌满20％乙醇溶液，封存于4℃。

g.透析除盐：首先将透析袋用水进行处理，用移液器缓慢地将纯化后的抗体溶液加入到透析袋中，夹紧，浸于装满PBS溶液的透析杯中，放入4℃冰箱内透析3天。期间每6h换一次PBS。

h.抗体浓度测定：吸取透析后的纯化抗体3.5μL，用PBS稀释20倍，用紫外分光分度计测定280nm处的吸光度值，以不加抗体的PBS为空白对照。抗体浓度可由公式(2-1)计算得出：

抗体(mg/mL)＝(A-A_空白)/1.35×20 式(2-1)

其中，A：抗体蛋白在280nm处的吸光度值；A_空白：空白对照在280nm处的吸度值；1.35：蛋白系数；20是抗体稀释倍数。

抗体保存：在4℃条件下，将纯化的抗体溶液用PBS透析三天，然后加入等体积的丙三醇混匀，于-20℃保存备用。

结果显示rabbit-1产生抗体的效价更高，因此选择效价较高的rabbit-1继续后续实验。

三、单克隆抗体的制备

3.1动物免疫

将纯化后的重组蛋白溶于新鲜配置的生理盐水，得到浓度为1mg/mL的蛋白溶液，取相同体积弗氏完全佐剂与之乳化，进行小鼠腹腔注射初次免疫，Balb/c小鼠的免疫剂量为每只100μg蛋白抗原/100μL乳化液。两周后，换为弗氏不完全佐剂，按照上述方法将蛋白乳化，相同剂量进行加强免疫，以此重复3次。每次免疫后一至两周内，将小鼠尾动脉处取血，进行ELISA方法检测抗血清效价及特异性。标记效价高、特异性好的小鼠继续进行冲剌免疫，三天后进行细胞融合。

3.2抗血清效价和特异性的测定

通过间接ELISA方法检测小鼠抗血清的效价及特异性：将重组蛋白用包被液稀释至0.1mg/mL，100μL/孔包被在96孔酶标板中，4℃下过夜孵育，PBST洗涤液洗板3次；加入200μL/孔1％脱脂乳粉37℃下封闭1h，PBST洗涤液洗板3次；将抗血清用PBS溶液3倍梯度稀释(1：1000-1：81000)，100μL/孔，37℃下反应1h，PBST洗涤液洗板3次；将羊抗鼠酶标二抗用PBS溶液稀释5000倍，100μL/孔，37℃下结合30min，PBST洗涤液洗板5次；加入新鲜配制的TMB底物，100μL/孔，37℃下显色30min；50μL/孔浓硫酸终止显色、利用酶标仪在450-650nm波长下测定吸光值(OD)，选择在0.7-1.2区间内的稀释倍数为抗血清效价。

小鼠抗血清效价测定结果显示小鼠血清中已经含有较高的特异性抗体，可以准备进一步的细胞融合，结果见表1。

表1最后一次抗血清效价的测定

3.3细胞融合

前两周左右复苏sp2/0骨髓瘤细胞，在冲刺免疫三天后进行细胞融合。

(1)细胞实验所需溶液保证无菌，将实验器材、枪头、蒸馏水等灭菌备用；

(2)脾细胞的制备：

a.使用摘除眼球法将冲免后的小鼠进行采血，离心管收集血清，离心后吸出上清液于20℃保存。断颈法将小鼠处死，置于装满75％乙醇的大烧杯中浸泡5-10min除菌。期间，取四个无菌平皿置于灭好菌的超净台上，分别倒入10mLDMEM培养基，将200目细胞筛网置于最后一个平皿内。分别取1mLPEG 4000细胞融合剂、15mL DMEM培养基置于两个15mL离心管中，37℃水浴备用；

b.取出乙醇中的小鼠，将小鼠左侧腹部朝上，用灭菌过的大头针将其固定在超净台内的无菌解剖台上；

c.利用解剖剪将左侧腹部皮肤与腹膜掀开，按照动物解剖正规程序取出脾脏，依次置于上述平皿中，充分洗涤并去除粘连在周围的结缔组织。谨慎操作，避免划破小鼠肠胃与脾脏，防止造成细菌污染；

d.将脾脏放入最后一个平皿中的200目细胞筛网内，利用无菌一次性注射器的活塞，将其轻轻研磨直到脾细胞通过细胞筛网进入下端培养液中。只余结缔组织时即停止，用一次性移液管将细胞吹打成单细胞悬液，移入50mL无菌离心管中；

e.再吸取10mLDMEM清洗平皿、活塞与筛网，移入上述50mL离心管中，静置10min使结缔组织沉降；

(3)脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞的处理：

a.取两个15mL离心管，分别倒入新鲜的2mL GIBCO胎牛血清；

b.待沉降完毕，分别吸取10mL脾细胞悬液，以相当缓慢的速度地加入到上述两个15mL离心管中，使细胞悬液与GIBCO胎牛血清充分分层，目的是过滤支原体等；

c.1000rpm离心5min，倒掉上清，分别吸取l0 mLFree DMEM倒入两管中使细胞混匀，合并于新的50mL离心管中；

d.1000rpm离心5min，倒掉上清，吸取2mL红细胞裂解液缓慢加入，不断吹打2min后加入2mL GIBCO胎牛血清，使裂解反应终止，吸取8mLFree DMEM倒入将其混匀，1000rpm离心5min，倒掉上清。如果仍有少量红细胞存在，继续重复上述裂解过程；

e.取一周前复苏的sp2/0骨髓瘤细胞，选择形态良好、生长稳定的细胞，用移液管将细胞轻轻吹下，与培养基一起置于新的50mL离心管中，做出标记；

f.分别将脾细胞、sp2/0骨髓瘤细胞1000rpm离心5min清洗三次，第三次保证等体积。

(4)细胞计数：分别取2组50μL清洗后的脾细胞、骨髓瘤细胞悬液，滴入血球计数板上，置于显微镜上计数；

(5)细胞融合：

a.按照脾细胞：骨髓瘤细胞＝5：l的比例将两种细胞混合，置于新的50mL无菌离心管中，用DMEM培养液1000rpm离心5min清洗两次；

b.将上清液完全弃掉，轻磕底部将细胞块拍成疏松糊状，使两种细胞均匀混合；

c.在37℃水浴中，吸取上述37℃水浴的l mL 50％PEG 4000细胞融合剂，在l min内速度由慢到快滴加到离心管中，滴加同时保持振荡，滴加完毕后继续晃动1min；

d.同样，吸取上述37℃水浴的15mLFree DMEM培养液，在5min内速度由慢到快滴加到离心管，目的是稀释、终止反应；

e.1000rpm离心5min，弃去上清，根据细胞数量加入完全DMEM培养液，混匀后倒入一次性平皿中；

f.50μL/孔加入到无菌96孔板中，每块96孔板中约放置2-3×10⁷个细胞，将骨髓瘤细胞和脾细胞作为对照分别加入其中两个孔中；

g.放入37℃5％CO2培养箱中培养，保持观察。

(6)培养：融合后第二天起，隔天向孔内添加一次HAT培养液，50μL/孔。第七天开始观察细胞状态，十天左右时换为添加HT培养液，50μL/孔。如果孔内培养液已满，则需要吸出多余液体，再加入新的培养液。

3.4细胞筛选

(1)第一次筛选：完成细胞融合后，持续观察细胞融合及生长情况，第七天左右开始有杂交瘤细胞群产生，记在培养板上标记下来，并用有杂交瘤细胞存在的孔数除以总孔数计算融合率；当杂交瘤细胞生长至可以铺满96孔板孔底部1/10时，利用间接ELISA方法进行第一次细胞筛选，将测得OD值>1.0的孔内细胞转移到24孔细胞培养板中，换用HT培养液继续扩大培养。

第一次筛选结果显示细胞融合率达到80.56％，其中阳性率为71.12％，结果见表2。

表2第一次筛选的结果

(2)第二次筛选：当杂交瘤细胞生长至可以铺满24孔板中孔底部1/10时，同样以上述方法进行第二轮筛选，选择效价高的细胞转移到25cm2培养瓶中，继续扩大培养。

第二次筛选结果显示阳性率为6.67％，特异性抗体率为45.45％，结果见表3。

表3第二次筛选的结果

(3)第三次筛选：当杂交瘤细胞生长至可以铺满25cm2培养瓶底部l/3时，同样以上述方法进行第三次筛选。利用间接ELISA法确定细胞上清液效价，检测阳性菌株与其他食源性致病菌株的交叉反应。选择效价高、特异性好的细胞扩大培养，以备细胞克隆，此时可以换为完全DMEM培养液。得到细胞上清液OD值较大的单增李斯特菌单抗细胞(D1)B-3、(D1)C-9、(D3)E-5三株细胞，进行克隆化。

3.5细胞克隆

新融合的杂交瘤细胞，由于其生长能力、适应性及稳定分泌抗体的能力都较差，且每个细胞培养瓶中可能有多株杂交瘤细胞存在。因此必须进行细胞克隆化，直到筛选得到生长能力强、适应性强且可以稳定产生特异性抗体的同株杂交瘤细胞。

(1)第一次细胞克隆化：由于此时新融合的杂交瘤细胞还不稳定，利用有限稀释法将杂交瘤细胞稀释至5个细胞/孔进行第一次细胞克隆化。具体操作如下：

a.用一次性移液管将细胞瓶内的细胞轻轻吹起，加入10mL DMEM培养液混匀，再用移液管将细胞悬浮移至15mL无菌离心管中，血球计数法进行计数；

b.用完全DMEM培养液将细胞稀释至5×10²/10mL，加到96孔细胞培养板中，100μL/孔。置于37℃5％CO2培养箱内培养一周，期间切勿移动振荡；

c.第7天时通过显微镜观察细胞生长情况，在96孔板盖板上标记出有细胞群落生长的孔，并记录细胞群落的个数。继续添加完全DMEM培养液进行培养，当杂交瘤细胞生长至孔底1/10时，间接ELISA方法检测上清液效价，筛选出阳性细胞克隆孔，转移至24孔培养板进行扩大培养；

d.当杂交瘤细胞生长至可以铺满24孔板底部1/10时，间接ELISA方法同上进行第二次筛选；

e.当杂交瘤细胞生长至可以铺满25cm²培养瓶底部1/3时，间接ELISA方法同上进行第三次筛选；

f.通过三次筛选，将可以分泌效价高且特异性好抗体的杂交瘤细胞继续培养，以备亚克隆。

初次克隆特异性结果显示，D1、D2、D3三株细胞对单增李斯特菌的特异性良好，结果见表4。

表4单增李斯特菌单抗杂交瘤细胞初次克隆特异性检测结果

注：+，P/N＞2.1，阳性反应：-，P/N＜2.1，阴性反应。

(2)亚克隆：亚克隆方法同第一次克隆化，杂交瘤细胞经过多次筛选，生长能力逐渐增强，适应力也得到提高，只需将细胞稀释到0.8-1个细胞/孔。结果见表5。

表5单增李斯特菌单抗杂交瘤细胞再次克隆特异性检测结果

注：+，P/N＞2.1，阳性反应：-，P/N＜2.1，阴性反应。

对杂交瘤细胞进行亚克隆化，最后得到单增李斯特菌单抗杂交瘤细胞株3株，分别为D-1、D-2、D-3，间接ELISA法再次进行测定，从表中可以看出D-3的效价较高，且特异性好。

3.6单克隆抗体的大量制备

将筛选得到的杂交瘤细胞注射于小鼠腹腔中，数日后即可形成腹水瘤，腹水中抗体含量可以达到5-10mg/mL。提前一周，选取12周龄大雌性Balb/c小鼠，将500μL降植烷或石蜡油注射到小鼠腹腔中。一周后取0.8-1×10⁶个细胞与300μL DMEM同时接种于小鼠腹腔内，7-10d会有腹水瘤产生。用5mL一次性注射器从腹腔内收集腹水，二至三天腹水瘤再次产生时继续收集，反复收集腹水至小鼠死亡。每只小鼠一共可收集3-5mL腹水。将收集得到的腹水10000rpm离心10min，弃掉上层脂肪和下层纤维蛋白及细胞、血红细胞等杂志，收集中层液体，-20℃冻存备用。

3.7单克隆抗体的纯化

使用辛酸-硫酸按法纯化腹水，具体操作如下：

(1)吸取1mL收集得到的腹水，0.06mol/mL pH 4.0醋酸缓冲溶液将其进行3倍稀释，然后用1mol/mL NaOH溶液调节pH值至4.8；

(2)向其中逐滴缓慢加入33μL正辛酸，同时搅拌，于4℃下静置2h；

(3)15000rpm离心30min，弃去沉淀，取上清液；

(4)取约为上清液体积1/10的0.1mol/LpH 7.4PBS缓冲液，加入到上清液中，用1mol/mLNaOH溶液调节pH值至7.4左右；

(5)置于4℃下，按照每毫升上清液加入0.277g硫酸铵的比例，搅拌30min；

(6)5000rpm离心15min，弃去上清液，收集沉淀；

(7)取pH 7.4PBS缓冲液将沉淀溶解，于4℃下透析过夜；

(8)将透析后的抗体于4℃下，5000rpm离心10min，弃去沉淀，收集上清液将其稀释至原体积1mL。

3.8单克隆抗体浓度的确定

同上述多克隆抗体浓度测定的方法。

四、单增李斯特菌双抗夹心ELISA检测方法的建立

利用间接ELISA法测定单克隆抗体的效价，用包被液将单增李斯特菌10倍稀释，包被于96孔板中。

4.1捕获抗体与检测抗体组合的优化

分别选择制备完成的兔源多克隆抗体、单克隆抗体作为捕获抗体，以0.5、1.0、1.5和2.0μg/孔包被酶标板，100μL/孔；PBS缓冲液稀释菌液上样，对应检测抗体分别为单抗(1:3000-1:81000)与兔源多抗(1:50-1:400)；分别选用羊抗鼠酶标二抗(1：5000)、与羊抗兔酶标二抗(1：10000)；进行双抗夹心ELISA实验，绘制菌液浓度与吸光度值的曲线。

当选择鼠单抗作为捕获抗体、兔多抗作为检测抗体时，空白值最低。所以确定最佳抗体组合为鼠单抗作为捕获抗体、兔多抗作为检测抗体。结果见表6、表7。

表6兔多抗作为捕获抗体时的空白值

表7鼠单抗作为捕获抗体时的空白值

4.2捕获抗体包被量的优化

通过上述优化，将确定的捕获抗体用包被液稀释，以0.1、0.25、0.5、0.75和1μg/孔包被96孔板，100μL/孔；检测抗体稀释倍数1：100；进行双抗夹心ELISA实验，绘制菌液浓度与吸光度值的曲线。

结果显示当鼠单抗包被量为0.5μg/孔时，空白值最低，且线性相关性好，所以确定最佳包被量为0.5μg/孔。结果见图2。

4.3封闭液种类的优化

选择确定的捕获抗体包被量包被96孔板，100μL/孔；选择0.5％脱脂乳粉、0.5％BSA和0.5％明胶作为封闭液，分别孵育1h；检测抗体稀释倍数1：100；进行双抗夹心ELISA实验，绘制菌液浓度与吸光度值的曲线。

当选择明胶或BSA作为封闭液时，空白值较大；选择脱脂乳粉作为封闭液，空白值最低，因此选择0.5％脱脂乳粉作为封闭液。结果见图3。

4.4检测抗体稀释倍数的优化

选择确定的捕获抗体包被量包被96孔板，100μL/孔；选择确定的封闭液封闭1h；将检测抗体用PBS溶液梯度稀释1：50、1：100、1：200、1：400；进行双抗夹心ELISA实验，绘制菌液浓度与吸光度值的曲线。

当稀释倍数为1：50时，空白值较大；稀释倍数为1：100时，空白值最低且线性相关性较好；稀释倍数为1：200、1：400时，导致检测限偏高。因此确定兔多抗作为检测抗体的稀释倍数为1：100。结果见图4。

4.5双抗夹心ELISA检测方法标准曲线的绘制

根据优化的条件，将单增李斯特菌菌液用PBS缓冲液进行10倍稀释(1×10²CFU/mL-1×10⁷CFU/mL)，进行双抗夹心ELISA实验。将单增李斯特菌菌液浓度作为x轴，吸光度值作为y轴，绘制标准曲线。将单增李斯特菌菌液浓度作为x轴，吸光度值作为y轴，绘制标准曲线。

根据单增李斯特菌双抗夹心ELISA检测方法的标准曲线，通过公式计算得到检测限为10⁴CFU/mL，结果见图5。

4.6单增李斯特菌双抗夹心ELISA检测方法的特异性

选择单增李斯特菌5株种内菌株、5株属内菌株，并且选择5株属外的肠炎沙门氏菌ATCC 13076、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、阪崎克罗诺杆菌IQCC 10409、腐生葡萄球菌ATCC49907、表皮葡萄球菌CICC 10294进行特异性验证。

特异性检测结果显示，所有被检测的单增李斯特菌都产生阳性反应，而所有被检测的非单增李斯特菌都产生阴性反应，显示该检测方法特异性良好，结果见图6。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种用于制备单增李斯特菌单克隆抗体的抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 198

<212> PRT

<213> 抗原的氨基酸序列(Unknown)

<400> 1

Ile Ala Pro Glu Leu Tyr Asn Ile Thr Asp Glu Ile Ala Lys Phe Ser

1 5 10 15

Ser Glu Lys Thr Ala Leu Ile Trp Lys Asn Glu His Gly Glu Thr Lys

20 25 30

Thr Trp Ser Tyr His His Leu Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn

35 40 45

Val Ala Lys Asp Ala Gly Ile Lys Lys Gly Asp His Val Ile Val Met

50 55 60

Thr Pro Arg Leu Leu Glu Thr Tyr Ala Ile Tyr Met Gly Leu Trp Lys

65 70 75 80

Ala Gly Ala Ile Ile Ile Pro Ala Ser Glu Leu Leu Lys Ala His Asp

85 90 95

Leu Glu Tyr Arg Ile His His Ala Asn Val Lys Ala Ile Val Ser Tyr

100 105 110

Asn Gly Met Thr Ala Glu Phe Asp Lys Ile Glu Ser Ile Pro Ser Val

115 120 125

Ser Lys Lys Ile Ile Val Gly Asp Lys Leu Ser Gly Trp Glu Gln Tyr

130 135 140

Glu Thr Leu Met Glu Ala Ala Pro Thr Glu Phe Glu Arg Val Glu Thr

145 150 155 160

Ser Arg Asp Asp Ala Cys Leu Leu Ala Phe Thr Ser Gly Thr Thr Gly

165 170 175

Asn Pro Lys Gly Val Val His Ile His Gly Trp Gly Tyr Ala His Ile

180 185 190

Arg Ile Ala Ala Asp His

195

Claims (9)

1.一种用于制备单增李斯特菌单克隆抗体的抗原，其特征在于：所述抗原的氨基酸序列为SEQ NO.1。

2.利用如权利要求1所述的抗原制备的单克隆抗体。

3.利用如权利要求1所述的抗原制备的多克隆抗体。

4.如权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测或辅助检测单增李斯特菌的检测产品中的应用。

5.如权利要求3所述的多克隆抗体在制备检测或辅助检测单增李斯特菌的检测产品中的应用。

6.一种利用如权利要求2所述的单克隆抗体的检测或辅助检测单增李斯特菌的方法，其特征在于：所述方法中使用到权利要求2所述的单克隆抗体，所述方法不以疾病的诊断或治疗为目的。

7.一种利用如权利要求3所述的多克隆抗体的检测或辅助检测单增李斯特菌的方法，其特征在于：所述方法中使用到权利要求3所述的多克隆抗体，所述方法不以疾病的诊断或治疗为目的。

8.一种利用如权利要求2所述的单克隆抗体的单增李斯特菌的免疫检测方法，其特征在于：所述单克隆抗体作为捕获抗体，所述方法不以疾病的诊断或治疗为目的。

9.一种利用如权利要求3所述的多克隆抗体的单增李斯特菌的免疫检测方法，其特征在于：所述多克隆抗体作为检测抗体，所述方法不以疾病的诊断或治疗为目的。

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