CN114524880B - 一种能够增强免疫原性和免疫保护作用的rtg融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种能够增强免疫原性和免疫保护作用的RTG融合蛋白，是将金黄色葡萄球菌TRAP的一个表位肽经突变后获得的修饰肽配体APLR106A与无乳链球菌GapC1‑150通过Linker‑(GS)4串联融合表达而成，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明还公开了RTG融合蛋白的功能。本发明将APLR106A通过柔性Linker与GapC1‑150进行串联融合表达，获得重组融合蛋白RTG，APLR106A能够显著增强GapC1‑150所诱导的细胞免疫应答以及体液免疫应答水平，重组融合蛋白RTG具有很好的免疫原性，可同时提高机体的抗链球菌和金黄色葡萄球菌的能力。

Description

一种能够增强免疫原性和免疫保护作用的RTG融合蛋白
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种RTG融合蛋白，特别涉及一种能够增强免疫原性和免疫保护作用的RTG融合蛋白。
背景技术
链球菌是一种广泛分布的致病菌，可引起多组织器官感染以及致命性的败血症和脑膜炎，近年来，孕妇、老年人以及免疫力低下人群的感染率逐年升高。除此之外，链球菌也是引起奶牛乳房炎的重要病原菌之一，给全球的奶牛养殖业造成巨大的经济损失。尽管抗生素治疗可缓解症状，但由于耐药性的日益增强使得抗生素的治疗效果逐年下降，疫苗接种是抗生素治疗最有效的替代方式。早期链球菌疫苗研发主要关注于增强体液免疫应答。研究表明，细胞免疫应答尤其是CD4+T细胞分化产生的Th1和Th17细胞通过表达IFN-γ与IL-17A在抗链球菌感染免疫中发挥重要作用。理想的高效疫苗应在诱导体液免疫应答的同时还可诱导强烈的细胞免疫应答，双管齐下的疫苗可能是实现防御链球菌感染的全面且有效的重要策略。因此，能够提高链球菌抗原诱导体液免疫应答以及细胞免疫应答能力的研究具有重要意义和应用价值。
GapC(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase C，GapC)是一种具有甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性的链球菌表面蛋白，对细菌的生长存活至关重要，不同链球菌GapC蛋白的同源性达90.77％以上，已被证实具有较好的免疫原性，可介导机体产生特异性抗体，发挥抗链球菌感染作用，但其诱导的细胞免疫应答水平较弱。进一步的研究发现，第1至150位氨基酸序列GapC1-150诱导的免疫反应以及免疫保护作用与GapC全蛋白基本一致，可对多种链球菌感染发挥交叉保护作用，是重要的候选疫苗抗原。APLR106A是金黄色葡萄球菌TRAP优势表位肽经突变后获得的修饰肽配体，能够诱导CD4+T细胞显著增殖，使得IFN-γ与IL-17A的表达量极显著的升高。因此，可以考虑将以上两个片段联合制备融合蛋白，以克服单纯的GapC诱导的细胞免疫应答水平不太强的问题。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种能够增强免疫原性和免疫保护作用的RTG融合蛋白，克服目前单纯使用GapC制备疫苗，诱导的细胞免疫应答水平较弱的问题。
本发明的第二目的是提供上述RTG融合蛋白的用途。
本发明通过以下技术方案来实现：
一、一种能够增强免疫原性和免疫保护作用的RTG融合蛋白，是将金黄色葡萄球菌TRAP的一个表位肽经突变后获得的修饰肽配体APLR106A与无乳链球菌GapC1-150通过Linker-(GS)4串联融合表达而成，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步的，所述的修饰肽配体APLR106A的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
进一步的，所述的无乳链球菌GapC1-150的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
二、上述的RTG融合蛋白在制备预防链球菌和金黄色葡萄球菌感染疫苗及相关制剂中的应用。
采用上述技术方案的积极效果：本发明将APLR106A通过柔性Linker与GapC1-150进行串联融合表达，获得重组融合蛋白RTG，APLR106A能够显著增强GapC1-150所诱导的细胞免疫应答以及体液免疫应答水平，重组融合蛋白RTG具有很好的免疫原性，可同时提高机体的抗链球菌和金黄色葡萄球菌的能力，可作为制备抗链球菌和金黄色葡萄球菌感染疫苗以及相关制剂的理想候选抗原。
附图说明
图1为RTG重组融合蛋白设计示意图；
图2为免疫小鼠血清中抗体水平；
图3为重组蛋白诱导特异性CD4+T细胞增殖水平；
图4为重组蛋白诱导CD4+T细胞分泌IFN-γ和IL-17A水平；
图5为链球菌攻毒后小鼠的存活率结果；
图6为金黄色葡萄球菌攻毒后小鼠的存活率结果。
具体实施方式
本发明中生物材料的来源：
1、无乳链球菌HLJ-6菌株：Chen J,Yang S,Li W,Yu W,Fan Z,Wang M,Feng Z,Tong C,Song B,Ma J,Cui Y.IL-17A Secreted by Th17 Cells Is Essential for theHost against Streptococcus agalactiae Infections.J MicrobiolBiotechnol.2021May 28；31(5):667-675.doi:10.4014/jmb.2103.03053.PMID:33879639.
2、金黄色葡萄球菌Newman标准株：金黄色葡萄球菌凝集因子A的免疫原性，冯昊、刘乐峰、迟佳琦、王宁、李闰婷、佟春玉、马金柱、朱战波、崔玉东，生物工程学报，2009，25(8)：1180-1186；
3、重组质粒为自行设计并委托吉林省库美生物科技有限公司合成。
下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：
实施例1
本实施例说明融合蛋白RTG的免疫原性。
1、重组融合蛋白的构建
根据Genebank已发表的无乳链球菌GapC的氨基端序列(ID:AAM73770.1)，选用GSGSGSGS蛋白柔性Linker将APLR106A的氨基酸序列(RNFGGFKSYRLLAPAKGTTY)与无乳链球菌GapC的第1-150个氨基酸进行串联，形成重组融合蛋白APLR106A-GapC1-150，命名为RTG(如图1所示)。使用Codon optimization进行密码子优化，并运用Primer 5.0设计特异性上下游引物，在上游引物5’末端引入BamH I限制性酶切位点，在下游引物3’末端引入XhoⅠ限制性酶切位点，引物序列如表1所示，下划线代表限制性酶切位点。PCR扩增目的基因，连接pET-28a表达载体。将合成的重组质粒转化到感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，提取重组质粒后，使用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ对含有目的基因的重组质粒37℃酶切3h，酶切产物经2％琼脂糖凝胶电泳进行分析。将鉴定正确的重组菌株等体积加到50％甘油溶液中，混匀后冻存于-80℃。
表1重组融合蛋白RTG的PCR引物设计
2、重组融合蛋白的表达与纯化
将活化后的重组菌株，按照1:100的比例接种至1L含有Kan+的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600为0.6-0.8，加IPTG至1mM，诱导表达4h，离心(6000rpm/min，4℃，30min)弃上清，使用破菌裂解缓冲液重悬菌体，冰浴超声破碎菌体直至菌液清澈，12000rpm/min 4℃离心30min，使用破菌裂解缓冲液重悬，加入His-binding-resin蛋白纯化柱中，将收集流出的液体重复过柱3次，再使用洗杂缓冲液过柱，直至流出液体检测不到蛋白成分，加入蛋白洗脱液洗脱目的蛋白，加入透析袋内使用PBS梯度透析，收集纯化后的蛋白，测量蛋白浓度，将细胞浓度调整至1mg/mL，保存在-70℃条件下备用。
3、实验动物的免疫接种
取SPF级的4-6周龄雌性BALB/c小鼠，随机分为RTG实验组、APLR106A实验组、GapC1-150实验组以及PBS对照组，自由采食饮水，饲养一周后，将纯化后的蛋白分别与弗氏完全佐剂按体积比1:1比例进行乳化，采用腿部肌肉注射方式，每只小鼠注射50μg，初次免疫三周后，将等量的免疫原与弗氏不完全佐剂乳化后再次免疫接种小鼠。同时将PBS与相同佐剂乳化作为对照。
4、血清抗体水平的检测
分别在初次免疫和加强免疫后的第7天、14天和21天分离小鼠血清，通过间接ELISA方法检测血清内IgG水平。将稀释后的蛋白液加至酶标板中，每孔100μL，4℃包被过夜后弃去包被液，PBST重复清洗3次，每孔加100μL 5％脱脂乳37℃孵育2h，PBST清洗3次；每孔加100μL以1:1000比例稀释的小鼠血清，37℃孵育1h，PBST清洗3次，每孔加入100μL以1:5000比例稀释的Goat anti-mouse HRP-IgG，37℃孵育1h，PBST清洗3次，每孔加100μL TMB显色液，显色后加入50μL终止液终止反应，使用酶标仪测定450nm波长处样品的吸光度。结果显示，RTG免疫小鼠血清中的抗体水平极显著的高于其他组(详见图2)，表明通过连接APLR106A可极显著的增强GapC1-150诱导机体产生的体液免疫应答水平。
5、抗原提呈细胞的制备
无菌条件下分离未免疫接种的BALB/c小鼠脾脏，研磨制备细胞悬液，1200rpm室温离心5min后弃去上清液，加入1mL红细胞裂解液，37℃水浴处理2min，加入10mL RPMI-1640细胞培养液终止反应，1200rpm室温离心5min后弃上清，使用RPMI-1640培养液清洗3次。加入1mL RPMI-1640完全细胞培养液(含10％胎牛血清，100U青霉素/mL，100U链霉素/mL)，重悬制备脾淋巴细胞悬液。计数并将细胞悬液稀释至1×108cells/ml浓度后转移于100mm细胞培养皿中，放置于细胞培养箱中(37℃、5％CO2)培养，24h后弃去未贴壁细胞和上层细胞培养液，加入10mL含100μg丝裂霉素C的RPMI-1640完全细胞培养液，继续放入细胞培养箱中，3h后将贴壁细胞吹下，清洗细胞3次，使用1mL RPMI-1640完全细胞培养液重悬细胞，稀释计数，并将细胞悬液稀释至1×106cells/mL备用。
6、CD4+T细胞的分选
无菌条件下分离加强免疫一周后的BALB/c小鼠脾脏，制备脾淋巴细胞悬液，1200rpm室温离心5min后弃去上清液，1mL RPMI-1640细胞培养液重悬并计数。依照美天旎公司CD4(L3T4)MicroBeads mouse的产品说明进行操作：按每1×107个细胞使用90μL细胞分选Buffer和10μL CD4+T细胞分选磁珠的比例加入细胞分选Buffer和分选磁珠重悬细胞，4℃孵育15min，将500μL分选Buffer加入细胞磁珠分选柱，自然流尽后将孵育结束的细胞液加入分选柱内，用500μL分选Buffer洗涤3次，再向分选柱内加入1mL分选Buffer，使用分选柱内芯将分选柱中液体推出，收集随分选Buffer流出的CD4+T细胞；将分选获得的CD4+T细胞离心，使用1mL RPMI-1640完全细胞培养液重悬细胞，稀释计数并将细胞悬液稀释至5×106cells/mL备用。
7、CD4+T细胞增殖试验
将上述制备好的抗原提呈细胞和CD4+T细胞各100μL于96孔细胞培养板中混匀，并加入5μL浓度为1mg/mL的蛋白刺激物，使用等剂量PBS作为阴性对照，将96孔细胞培养板置于细胞培养箱中(37℃，5％CO2)培养24h；每孔加入10μL的CCK-8，继续培养4h，使用酶标仪测定450nm波长处样品的吸光度，通过计算刺激指数(SI值)，确定CD4+T细胞增殖情况。SI＝(OD450实验组-OD450空白组)/(OD450未刺激-OD450空白组)。结果显示，RTG免疫组小鼠CD4+T细胞的增殖水平极显著的高于其他组(详见图3)，表明通过连接APLR106A可增强GapC1-150蛋白诱导CD4+T细胞增殖的水平。
8、细胞因子检测
将抗原提呈细胞与CD4+T细胞以及蛋白刺激物共孵育48h后转移至2mL离心管中，2500rpm离心20min，收集上清，根据达科为公司Mouse IFN-γ、Mouse IL-17A、Mouse IL-4Precoated ELISA kit操作说明进行细胞因子检测。结果显示，RTG免疫组小鼠CD4+T淋巴细胞分泌IFN-γ以及IL-17A的水平极显著的高于其他各个免疫组(详见图4)。表明通过连接APLR106A能够极显著地增强GapC1-150蛋白所诱导的CD4+T细胞免疫应答水平。
实施例2
本实施例说明融合蛋白RTG的免疫保护作用。
1、实验动物的免疫接种
取SPF级的4-6周龄雌性BALB/c小鼠，随机分为RTG实验组、APLR106A实验组、GapC1-150实验组以及PBS对照组，自由采食饮水，饲养一周后，将纯化后的蛋白分别与弗氏完全佐剂按体积比1:1比例进行乳化，采用腿部肌肉注射方式，每只小鼠注射50μg，初次免疫三周后，将等量的免疫原与弗氏不完全佐剂乳化后再次免疫接种小鼠。同时将PBS与相同佐剂乳化作为对照。
2、菌种的培养及实验动物的攻毒试验
从-80℃的超低温冰箱中取出甘油菌无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)HLJ-6菌株和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Newman菌株，将菌株在固体培养基上划线，37℃恒温培养12-18h，挑取单个菌落加入3mL液体培养基内，放置于振荡培养箱(180rpm/min，37℃)培养10h，按1:100比例将菌液转接至100mL液体培养基中培养5h，室温4000r/min离心30min，弃去培养液，收集菌体，无菌PBS重悬并洗涤菌体3次，用10mL无菌PBS重悬菌体，倍比稀释后涂布计数，使用无菌PBS将菌液稀释至不同浓度；S.agalactiae HLJ-6菌株选用BHI培养基，S.aureus Newman菌株用TSB培养基；加强免疫14d后，对各免疫组小鼠以腹腔注射的方式进行攻毒，在攻毒后的14d内，每天观察并记录小鼠的生存情况。结果显示：感染S.agalactiae或S.aureus后，RTG免疫组的存活率均高于其他各组(详见图5和6)，进一步说明通过连接APLR106A可极显著的增强GapC1-150赋予机体防御S.agalactiae感染的免疫保护作用，并且对S.aureus感染也产生一定的交叉免疫保护作用。
以上结果表明，本发明RTG融合蛋白诱导的细胞免疫应答、体液免疫应答以及所产生的免疫保护作用均明显优于各蛋白单独免疫组，APLR106A明显增强了GapC1-150诱导的抗链球菌感染免疫保护作用，同时对金黄色葡萄球菌感染也可发挥一定的交叉免疫保护作用，是制备抗链球菌感染和金黄色葡萄球菌感染疫苗以及相关制剂的理想候选抗原。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 一种能够增强免疫原性和免疫保护作用的RTG融合蛋白
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Asn Phe Gly Gly Phe Lys Ser Tyr Arg Leu Leu Ala Pro Ala Lys
1 5 10 15
Gly Thr Thr Tyr Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Met Val Val Lys
20 25 30
Val Gly Ile Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Leu Ala Phe Arg Arg
35 40 45
Ile Gln Asn Val Glu Gly Val Glu Val Thr Arg Ile Asn Asp Leu Thr
50 55 60
Asp Pro Asn Met Leu Ala His Leu Leu Lys Tyr Asp Thr Thr Gln Gly
65 70 75 80
Arg Phe Asp Gly Thr Val Glu Val Lys Asp Gly Gly Phe Glu Val Asn
85 90 95
Gly Ser Phe Val Lys Val Ser Ala Glu Arg Glu Pro Ala Asn Ile Asp
100 105 110
Trp Ala Thr Asp Gly Val Asp Ile Val Leu Glu Ala Thr Gly Phe Phe
115 120 125
Ala Ser Lys Ala Ala Ala Glu Gln His Ile His Ala Asn Gly Ala Lys
130 135 140
Lys Val Val Ile Thr Ala Pro Gly Gly Asn Asp Val Lys Thr Val Val
145 150 155 160
Tyr Asn Thr Asn His Asp Ile Leu Asp Gly Thr Glu Thr Val Ile Ser
165 170 175
Gly Ala
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Asn Phe Gly Gly Phe Lys Ser Tyr Arg Leu Leu Ala Pro Ala Lys
1 5 10 15
Gly Thr Thr Tyr
20
<210> 3
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Val Val Lys Val Gly Ile Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Leu
1 5 10 15
Ala Phe Arg Arg Ile Gln Asn Val Glu Gly Val Glu Val Thr Arg Ile
20 25 30
Asn Asp Leu Thr Asp Pro Asn Met Leu Ala His Leu Leu Lys Tyr Asp
35 40 45
Thr Thr Gln Gly Arg Phe Asp Gly Thr Val Glu Val Lys Asp Gly Gly
50 55 60
Phe Glu Val Asn Gly Ser Phe Val Lys Val Ser Ala Glu Arg Glu Pro
65 70 75 80
Ala Asn Ile Asp Trp Ala Thr Asp Gly Val Asp Ile Val Leu Glu Ala
85 90 95
Thr Gly Phe Phe Ala Ser Lys Ala Ala Ala Glu Gln His Ile His Ala
100 105 110
Asn Gly Ala Lys Lys Val Val Ile Thr Ala Pro Gly Gly Asn Asp Val
115 120 125
Lys Thr Val Val Tyr Asn Thr Asn His Asp Ile Leu Asp Gly Thr Glu
130 135 140
Thr Val Ile Ser Gly Ala
145 150
<210> 4
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagcaaatgg gtcgcggatc ccgtaatttc ggcggtttta aaagctatcg cctgctggcc 60
ccggccaaag gtac 74
<210> 5
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtggtggtgg tgctcgaggg caccgctaat cacggtttcg gtgccatcca gaatatcatg 60
attggtatta 70

Claims (4)

1.一种能够增强免疫原性和免疫保护作用的RTG融合蛋白，其特征在于：是将金黄色葡萄球菌TRAP的一个表位肽经突变后获得的修饰肽配体APLR106A与无乳链球菌GapC1-150通过Linker-(GS)4串联融合表达而成，RTG融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的RTG融合蛋白，其特征在于：所述的修饰肽配体APLR106A的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求1所述的RTG融合蛋白，其特征在于：所述的无乳链球菌GapC1-150的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
4.权利要求1所述的RTG融合蛋白在制备预防链球菌和金黄色葡萄球菌感染疫苗中的应用。
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