CN104840954A - 罗非鱼无乳链球菌GapA蛋白亚单位疫苗、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及罗非鱼无乳链球菌GapA蛋白亚单位疫苗、其制备方法及应用。本发明的疫苗具有良好的免疫原性、安全性高、使用方便。

Description

罗非鱼无乳链球菌GapA蛋白亚单位疫苗、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及罗非鱼无乳链球菌GapA蛋白亚单位疫苗、其制备方法及应用。

背景技术

无乳链球菌是链球菌属的一个种。1896年按照Lancefield氏血清学分类法把无乳链球菌归为B群链球菌，因为该群仅有无乳链球菌一种，因此无乳链球菌又称B群链球菌(GBS)。GBS是重要的人畜共患病的细菌性病原之一，能引起婴儿败血症、脑膜炎等，新生儿晚发性感染的死亡率可达2％～6％。GBS也是动物，包括牛、山羊和绵羊等的急、慢性乳腺炎的主要病原菌。Robinson等人于1966年第一次报道在淡水鱼金色美鳊(Notemigonus crysoleucas)中分离出B群链球菌。随后相继有包括罗非鱼在内的多种鱼类受无乳链球菌感染而大量死亡的报道。鱼类受链球菌感染后出现的典型症状之一是运动失控，组织切片显示链球菌可侵袭鱼类脑部神经系统。罗非鱼是世界性养殖鱼类，也是我国重要的淡水养殖鱼类，近年来链球菌病给罗非鱼养殖业造成极大的威胁。

在链球菌的免疫预防上，以色列的Eldar等人在1993年开发了虹鳟海豚链球菌(Streptococcus iniae)全菌灭活疫苗，从1995年到1997年，以色列的养殖虹鳟使用该疫苗进行免疫，每年大约免疫300万尾，使虹鳟因受海豚链球菌感染所致的死亡率由每年的50％下降至低于5％。但1997年以后，以色列养殖虹鳟暴发的海豚链球菌病，发病症状有别于以往，原疫苗对此病失去了保护效果。对从1997--2000年连续4年采集的样品进行血清学分析表明新菌株的血清型与早期的不同，且试验证实这两种血清型疫苗无交叉保护作用。由于针对某种血清型制备的灭活疫苗难以对所有血清型产生有效的保护作用，因此成功的无乳链球菌疫苗必须要包含各种血清型均保守的抗原区段。而无乳链球菌的荚膜免疫被证明保护力低下。

鉴于此，克服以上现有技术中的缺陷，提供一种新的无乳链球菌亚单位疫苗成为本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的上述缺陷，提供了罗非鱼无乳链球菌GapA蛋白亚单位疫苗、其制备方法及应用。

本发明的目的可通过以下的技术措施来实现：

本发明提供了一种罗非鱼无乳链球菌GapA蛋白亚单位疫苗，包括：

（i）如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列的多肽或其同源物或片段；和/或

（ii）能够编码如以SEQ ID No：1所示的氨基酸序列或其同源物或片段的核酸序列。

优选地，该疫苗还包括药物学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。

优选地，该疫苗还包括弗氏佐剂，所述疫苗为如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列的多肽或其同源物或片段与完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂中的一种或两种形成的混合乳化物。

优选地，所述的核酸序列如SEQ ID No：2所示。

本发明还提供了一种重组构建体，该重组构建体包含如SEQ ID No：2所示的核酸序列，所述核酸序列被可操作地连接于表达调控区域。

本发明还一种用于制备如SEQ ID No：2所示的GapA蛋白的编码基因的试剂，该试剂包括核苷酸序列如SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示的引物。

本发明还提供了一种制备上述的疫苗的方法，其包括如下步骤：

（a）使用上述的试剂扩增得到GapA蛋白的编码基因SEQ ID No：2；

（b）获得含有GapA蛋白的编码基因SEQ ID No：2的重组构建体；

（c）用所得重组构建体转化宿主细胞；

（d）将转化后的宿主细胞置于足以表达所述GapA蛋白的编码基因的条件下进行培养；

（e）GapA蛋白的分离纯化。

本发明另外还提供了如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列的多肽或其同源物或片段在制备用于预防和/或治疗罗非鱼链球菌病药物中的用途。

本发明的有益效果在于，本发明的疫苗具有良好的免疫原性、安全性高、使用方便。

附图说明

图1是实施例1中GapA基因PCR扩增结果图。

图2是实施例1中GapA基因重组质粒酶切鉴定结果图。

图3是实施例1中GapA蛋白的Western-blot结果图。

图4是应用例1的罗非鱼免疫后累计死亡率统计图。

图5是本发明的疫苗的制备过程的具体流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的实验材料无乳链球菌取样自受无乳链球菌感染的罗非鱼体内，为野生型无乳链球菌。

术语“多肽”以正常的意义使用，指通过相邻氨基酸的α-氨基和羧基基团之间的肽键彼此连接的一系列残基，通常是L-氨基酸，该术语与“蛋白质”是同意的。多肽可以从其天然环境分离，例如，从罗非鱼无乳链球菌提取或在罗非鱼无乳链球菌外部生成。

术语“同源物”指可源自另一品系或物种的多肽，其与初始蛋白质实施相同的功能，和/或可以预测为就其序列而言共享共同的进化史。

术语“片段”指多肽包含野生型氨基酸序列的部分。它可以包含序列的一个或多个大的连续部分或多个小的部分。多肽也可以包含序列的其他元件，例如，它可以是与另一种蛋白质的融合蛋白。片段可以包含野生型序列的至少50%，更优选地至少65%，最优选地至少80%。片段可以是或包含主题序列的亚单位。

同源蛋白质（或其片段）可以通过序列同源性（包括至关重要的残基的位置）、结构、生物物理、生物化学或功能性同源性来鉴定。

同源序列可以通过保守推定结构或氨基酸序列间的相似性，使得使用BLASTp比较的比对在全序列的相当一部分间产生1e-20或更小的E值。

同源序列可以通过氨基酸序列间的相似性或保守的推定结构来鉴定。

术语“核酸”可以是任何合适类型的核苷酸序列，如合成的RNA/DNA序列、重组RNA/DNA序列（即，通过使用重组DNA技术制备）、cDNA序列或部分基因组DNA序列。核酸可以自其天然环境分离，例如，从罗非鱼无乳链球菌提取或在罗非鱼无乳链球菌外部生成。

关于GapA（三磷酸甘油醛脱氢酶)蛋白

GapA蛋白是链球菌的具有三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）活性的蛋白，最早在A族链球菌中发现，GAPDH是糖酵解过程中的关键酶，该酶存在于细胞表面，能结合细胞分子，在引发癌症及细胞凋亡方面其重要作用。链球菌具有单拷贝的GAPDH基因，该单拷贝基因对细菌的生存是至关重要的。目前已发现能合成GAPDH的链球菌有A族链球菌（plasmin receptor，Pit），B组链球菌、C组链球菌、乳房链球菌、停乳链球菌、肺炎链球菌、猪链球菌I型、猪链球菌II型、口腔链球菌等。

以SEQ ID No：1显示的多肽（蛋白质）可源自罗非鱼无乳链球菌，此蛋白质显示出了GapA蛋白的活性。

以SEQ ID No：2显示的核酸序列可源自罗非鱼无乳链球菌，此核酸序列为GapA蛋白的编码基因。

关于弗氏佐剂

弗氏佐剂（Freundadjuvant）是目前常用于动物实验的佐剂，它是将抗原水溶液与油剂（石蜡油或植物油）等量混合，再加乳化剂（羊毛脂或叶吐温80）制成油包水抗原乳剂，称之为不完全弗氏佐剂。如在不完全佐剂中加入分枝杆菌（如死卡苗）则称为完全弗氏佐剂。其制备方法如下：弗氏佐剂是现在动物实验中最常用的佐剂，分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。不完全弗氏佐剂是液体石蜡与羊毛脂混合而成，组分比为1～5：1，可根据需要而定，通常为2：1。不完全佐剂中加卡介苗（最终浓度为2～20mg/mL）或死的结核分枝杆菌，即为完全弗氏佐剂（FCA）。在本发明的实施例中，一般首次注射时用1／2体积FCA加上1／2体积的抗原进行乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂，如不加佐剂，要达到同样的免疫或治疗效果，抗原用量要增大10～20倍。

本发明的第一方面涉及一种疫苗，其可以包括多种氨基酸/核酸序列，其对应来自于罗非鱼无乳链球菌的不同品系和/或物种的SEQ ID No：1同源物和/或能够编码如以SEQ ID No：1所示的氨基酸序列或其同源物或片段的核酸序列。

疫苗还可以包括药物学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂，例如，疫苗还包括弗氏佐剂，该疫苗为如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列的多肽或其同源物或片段与完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂中的一种或两种形成的混合乳化物。更一步地，该多肽与弗氏佐剂的体积比为1：（1～2）；进一步地，该多肽与弗氏佐剂的体积比为1：1；更进一步地，该疫苗可进行二次免疫，第一次免疫使用体积比为1:1的多肽与完全弗氏佐剂混合物，第二次免疫使用体积比为1:1的多肽与不完全弗氏佐剂的混合物。

疫苗可以用于预防和/或治疗疾病；“预防”意指对尚未染上疾病和/ 或没有显示任何疾病症状的受试者施用疫苗以阻止或削弱疾病（例如感染）的原因或者降低或阻止至少一种与疾病有关的症状的形成；“治疗”（“处理”）意指对具有现有疾病的受试者施用疫苗以减轻、减少或改善至少一种与疾病有关的症状和/ 或减缓、降低或阻断疾病的进展。如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列的多肽直接用作免疫原进行罗非鱼免疫接种，能够降低罗非鱼的死亡率，显示出了良好的免疫原性（参见实施例1）。

本发明第二方面提供了一种重组构建体，其包含如SEQ ID No：2所示的核酸序列，所述核酸序列被可操作地连接于表达调控区域。

本发明第三方面提供了一种用于制备如SEQ ID No：2所示的GapA蛋白的编码基因的试剂，其包括核苷酸序列如SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示的引物。

本发明第四方面提供了一种制备上述疫苗的方法，其主要包括如下步骤：（a）使用上述的试剂扩增得到GapA蛋白的编码基因SEQ ID No：2；（b）获得含有GapA蛋白的编码基因SEQ ID No：2的重组构建体；（c）用所得重组构建体转化宿主细胞；（d）将转化后的宿主细胞置于足以表达所述GapA蛋白的编码基因的条件下进行培养；（e）GapA蛋白的分离纯化。具体地，请参见图5所示。

本发明第五方面还提供了一种用途，如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列的多肽或其同源物或片段在制备用于预防和/或治疗罗非鱼链球菌病药物中的用途。

实施例1：

GapA基因的克隆表达

主要包括重组质粒的构建、细菌的培养、GapA蛋白的诱导表达及纯化。

（1）重组质粒的构建：通过提取无乳链球菌的基因组，利用PCR的技术设计引物，其中：

上游引物（Upper Primer）：

5’----CAAGAATTCAAAGTTGGTATTAACGGTTTC----3’（SEQ ID No：3），

下游引物（Lower Primer）：

5’----CATCTCGAGTTTTGCAAAGTATTCAAGTGT----3’（SEQ ID No：4）

用上述引物将GapA基因从无乳链球菌基因组上扩增下来，其中，GapA基因如SEQ ID No：2所示，并且将PCR产物和质粒同时酶切，经过液体纯化试剂盒进行回收，然后构建连接体系，进行酶切之后的连接。

（2）细菌的培养：将上述连接成功的重组质粒转化进入大肠杆菌BL21，其具体方法是：①取50微升冰上融化的感受态细胞BL21，加入上述重组质粒，轻轻混匀，在冰浴中放置30min。②42℃水浴中热激45s，然后快速将管转移到冰浴中2min，该过程不要摇动离心管。③向每个离心管中加入500微升无菌的LB培养基，混匀后置于37℃，200rpm培养1h，是细菌复苏。④取100微升转化产物加到含有氨苄抗生素的LB平板上，将细胞均匀涂开。将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板，37℃过夜培养。

挑取单菌落到5mL的LB培养基中（含5微升氨苄抗生素），置于200rpm摇床上培养12h。

（3）GapA蛋白（氨基酸序列如SEQ ID No：1所示）的诱导表达及纯化：取5mL菌液加入到500mL的LB液体培养基（含500微升氨苄抗生素），在37℃的摇床上200rpm转速下摇至菌液OD0.6，随后加入1mL的IPTG，继续摇菌20h。然后将得到的产物进行离心5000rpm，10min收集菌液，弃上清，收集沉淀，最后加入50微升的PBS重悬菌液，然后通过高压破碎仪破碎。随后4℃，5000rpm离心10min收集沉淀，通过GST吸附柱及超滤的作用得到纯化后的蛋白。

以野生型无乳链球菌的基因组为模板，扩增得到去除了信号肽编码序列的gapA基因（SEQ ID No：2所示），请参见图1所示，结果显示成功获得无乳链球菌中gapA序列片段，克隆至表达载体pGEX5X-1的EcoRI和XhoI 两酶切位点之间，获得重组质粒 pGEX5X-1-gapA，随后转化到大肠杆菌表达菌株 BL21 (DE3)中，如图2所示，重组质粒的酶切鉴定，结过显示gapA基因片段已被成功构建至表达载体pGEX5X-1中。再用终浓度为 0.8μg/mL 的 IPTG 诱导表达组氨酸标签融合蛋白 GST-GapA，通过镍柱亲和层析的方法纯化了GapA，并用GST多克隆抗体对纯化后的GST-GapA进行了Western blot鉴定，结果如图3所示。

本实施例所得GapA蛋白调整浓度至30mg/mL至70mg/mL，直接用作免疫原进行罗非鱼免疫接种，能够降低罗非鱼的死亡率。

本实施例的GapA蛋白作为疫苗具有如下有益效果：

通过大肠杆菌诱导表达的GapA蛋白化学性质更为确定，免疫特异性更为稳定；

无乳链球菌外膜蛋白亚单位疫苗高效安全，无药物残留污染；

该蛋白经过纯化，只含有GapA蛋白，其余残留毒性蛋白均被洗脱掉，安全性高，不存在毒性回复的隐患；

由于所选取的GapA蛋白高度保守，所以适合于各种由无乳链球菌引起的链球菌病；

使用方便，价格低廉，便与推广。

本实施例中的如SEQ ID No：2所示的GapA基因的获得，除了按照上述步骤中从无乳链球菌基因组上扩增下来的方法，还可以进行人工合成。

实施例2：

本实施例提供了一种疫苗，包括实施例1所得的GapA蛋白，该GapA蛋白具有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列，还包括佐剂。

按照蛋白：佐剂=1:1（体积比）的比例进行乳化。

在本实施例中，所述佐剂为弗氏佐剂（包括完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂） 。

本实施例的疫苗在进行罗非鱼免疫接种时分两次进行：首免使用蛋白与完全弗氏佐剂混合乳化所得疫苗进行免疫接种；然后，7天后进行第二次免疫，使用蛋白与不完全弗氏佐剂混合乳化所得疫苗进行免疫接种。免疫接种途径为均腹腔注射，每次注射量均为1mL。

对比例1：

将弗氏佐剂（完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂）和生理盐水（PBS）按照体积比1:1进行混合。

对比例2：

将Montanid佐剂和生理盐水（PBS）按照体积比1:1进行混合。

对比例3：

将实施例1所得GapA蛋白（浓度为30mg/mL至70mg/mL）和 Montanid佐剂按照体积比1:1进行混合。

对比例4：

将灭活无乳链球菌与弗氏佐剂（完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂）按照体积比1:1进行混合。

对比例5：

将灭活无乳链球菌与Montanid佐剂按照体积比1:1进行混合。

应用例1：

将实施例2、对比例1至对比例5的疫苗分别对罗非鱼进行免疫接种，二次免疫后观察0至12天的罗非鱼的死亡情况。

实施例2的疫苗在进行罗非鱼免疫接种时分两次进行：首免使用蛋白与完全弗氏佐剂混合乳化所得疫苗进行免疫接种；然后，7天后进行第二次免疫，使用蛋白与不完全弗氏佐剂混合乳化所得疫苗进行免疫接种；其中，每次注射量均为1mL。

对比例1的疫苗在进行罗非鱼免疫接种时分两次进行：首先使用PBS与完全弗氏佐剂混合乳化所得疫苗进行免疫接种；然后，7天后进行第二次免疫，使用PBS与不完全弗氏佐剂混合乳化所得疫苗进行免疫接种；其中，每次注射量均为1mL。

对比例4的疫苗在进行罗非鱼免疫接种时分两次进行：首先使用灭活无乳链球菌与完全弗氏佐剂混合乳化所得疫苗进行免疫接种；然后，7天后进行第二次免疫，使用灭活无乳链球菌与不完全弗氏佐剂混合乳化所得疫苗进行免疫接种；其中，每次注射量均为1mL。

对比例2、对比例3和对比例5的疫苗在进行罗非鱼免疫接种时分两次进行：第一次免疫接种7天之后进行第二次免疫接种，每次注射量均为1mL。

请参阅图4所示，结果显示：二免后12天后，对比例1（弗氏佐剂+生理盐水）、对比例2（Montanid佐剂+生理盐水）的罗非鱼死亡率均达到100%；实施例2（GapA蛋白+弗氏佐剂组）死亡率为40%；对比例3（GapA蛋白+ Montanid佐剂）的死亡率为60%；对比例4（灭活无乳链球菌+弗氏佐剂组）以及对比例5（灭活无乳链球菌+ Montanid佐剂组）的死亡率分别为20%和30%。以上结果说明对比例4（灭活无乳链球菌+弗氏佐剂组），对比例5（灭活无乳链球菌+ Montanid佐剂组）的保护效果最好，达到80%和70%； 实施例2（GapA蛋白+弗氏佐剂组）则能够提供60%的保护率。虽然采用了灭活全菌苗的对比例4和对比例5的保护效果更好，但在生产应用中，灭活全菌苗存在更大隐患，容易因制备疫苗时操作不当导致菌体灭活效果不好，产生动物感染。实施例2的疫苗安全性更高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1. 一种罗非鱼无乳链球菌GapA蛋白亚单位疫苗，其特征在于，该疫苗包括：

（i）如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列的多肽或其同源物或片段；和/或

（ii）能够编码如以SEQ ID No：1所示的氨基酸序列或其同源物或片段的核酸序列。

2. 根据权利要求1所述的罗非鱼无乳链球菌GapA蛋白亚单位疫苗，其特征在于，该疫苗还包括药物学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。

3. 根据权利要求1所述的罗非鱼无乳链球菌GapA蛋白亚单位疫苗，其特征在于，该疫苗还包括弗氏佐剂，所述疫苗为如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列的多肽或其同源物或片段与完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂中的一种或两种形成的混合乳化物。

4. 根据权利要求1所述的罗非鱼无乳链球菌GapA蛋白亚单位疫苗，其特征在于，所述的核酸序列如SEQ ID No：2所示。

5. 一种重组构建体，其特征在于，所述重组构建体包含如SEQ ID No：2所示的核酸序列，所述核酸序列被可操作地连接于表达调控区域。

6. 一种用于制备如SEQ ID No：2所示的GapA蛋白的编码基因的试剂，其特征在于，该试剂包括核苷酸序列如SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示的引物。

7. 一种制备如权利要求1所述的疫苗的方法，其特征在于，该方法包括：（a）使用权利要求6所述的试剂扩增得到GapA蛋白的编码基因SEQ ID No：2；（b）获得含有GapA蛋白的编码基因SEQ ID No：2的重组构建体；（c）用所得重组构建体转化宿主细胞；（d）将转化后的宿主细胞置于足以表达所述GapA蛋白的编码基因的条件下进行培养；（e）GapA蛋白的分离纯化。

8. 如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列的多肽或其同源物或片段在制备用于预防和/或治疗罗非鱼链球菌病药物中的用途。