CN107916254A - Homer1单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了Homer1单克隆抗体及其应用。本发明提供两株能稳定分泌特异性识别Homer1蛋白的单克隆抗体Homer1 1B1及Homer1 1B3的杂交瘤细胞株，其保藏编号分别为CCTCC NO：C2017191和CCTCC NO：C2017190。利用本发明提供的单克隆抗体制备了用于检测Homer1蛋白的免疫检测工具，含Homer1 1B1及Homer1 1B3的免疫组化试剂盒，以及制备用于诊断Homer1蛋白相关性肿瘤的试剂盒。本发明所述单克隆抗体Homer1 1B1及Homer1 1B3可与Homer1蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了Homer1蛋白免疫检测的特异性和敏感性。

Description

Homer1单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及Homer1 的单克隆抗体，产生该抗
体的杂交瘤细胞株，以及该抗体的免疫检测用途。
背景技术
Homer蛋白是在细胞内信号转导过程中非常重要的一种骨架蛋白，它参与了许多神经细胞的活动，包括调节钙离子的平衡及学习与记忆过程中突触重塑的细胞骨架的构成等。Homer蛋白家族包括了三个成员，Homer1、Homer2和Homer3，他们通过外显子不同的剪接，有形成了多种亚型。所有的亚型都含有N-端的EVH1区域，该区域可以和mGluR、IP3R、TRPC等富含脯氨酸蛋白结合，长型Homer蛋白在C-端存在CC区域，通过CC区域Homer蛋白之间可以形成同源或异源二聚体，而短型的Homer不存在CC-区域，则不能形成二聚体，但可以通过其EVH1区域与长型Homer竞争与富含脯氨酸的受体蛋白结合，从而来调节mGluR、IP3R、TRPC等受体的功能。Homer1蛋白是一种首先被发现于神经突触后密度的骨架蛋白，近年来，研究表明Homer1蛋白在心脏、肾脏、乳腺等组织中均有广泛的表达。Homer1蛋白包括Homer1a、Homer1b及Homer1c等成员，Homer1a是一种短片段的即早蛋白，其含有与受体蛋白结合的位点，但缺少长片段Homer蛋白之间形成同源二聚体或异源二聚体的C-端片段，其通过与Homer1b或Homer1c等长片段蛋白竞争与mGluR、IP3R、TRPC等受体蛋白结合，来调节相关通路的活性，从而来调节细胞的活动。本课题组前期工作证实乳腺癌细胞高表达跨膜型tmTNF-α从而抵抗凋亡。我们近期的研究还发现，在不同乳腺癌细胞株和乳腺癌患者的肿瘤组织切片中，Homer表达水平与tmTNF-α的表达呈负相关。通过抗tmTNF-α单克隆抗体处理后的乳腺癌组织中肿瘤细胞明显减少，tmTNF-α下降，而Homer1蛋白水平明显上升，且Homer1蛋白表达水平与乳腺癌细胞的侵袭能力有显著的关系。申请者前期已经制备Homer家族成员（Homer1、2、3）的多克隆抗体用于检测样本中Homer1、2、3的表达状况。鉴于多克隆抗体自身的局限性，其灵敏度和特异性均不高。因此，研制出一种结合特异性高的抗Homer1的单克隆抗体具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供两株能稳定分泌特异性识别Homer1蛋白的单克隆抗体Homer1 1B1及Homer1 1B3的杂交瘤细胞株以及该两种单克隆抗体在制备用于检测Homer1蛋白的免疫检测工具中的应用。本发明的单克隆抗体效价高、特异性强，尤其是单克隆抗体Homer1 1B1能成功识别Homer1a蛋白，因此具有更广泛的应用空间。
为实现上述目的本发明提供以下技术方案：
在本发明的第一方面，提供分泌Homer1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：C2017191和CCTCC NO：C2017190，其中保藏编号为CCTCC NO：C2017191的杂交瘤细胞株是His-Homer1b免疫小鼠后至尾血效价检测达1:25600后，加强免疫后进行细胞融合，His-Homer1b（110-354aa）肽段筛选获得，Homer1b对应的氨基酸序列为SEQ NO:1，Homer1b（110-354aa）的氨基酸序列对应SEQ NO:1的第110aa-354aa；其中保藏编号为CCTCC NO：C2017190的杂交瘤细胞株是His-Homer1b免疫小鼠后至尾血效价检测达1:25600后，加强免疫后细胞融合，His-sumo-Homer1b（130-180aa）筛选获得，Homer1b（130-180aa）的氨基酸序列对应SEQ NO:1的第130aa-180aa。
在本发明的第二方面，提供一种Homer1单克隆抗体Homer1 1B3，由编号为CCTCCNO：C2017190的杂交瘤细胞株分泌。
在本发明的第三方面，提供一种Homer1单克隆抗体Homer1 1B1，由编号为CCTCCNO：C2017191的杂交瘤细胞株分泌。
在本发明第四方面，提供单克隆抗体Homer1 1B1和Homer1 1B3在制备用于检测Homer1蛋白的免疫检测工具中的应用。
优选地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。
优选地，所述试剂盒为定量检测Homer1蛋白含量的双抗夹心酶联免疫（ELISA）试剂盒，优选地，Homer1 1B3作为包被酶标板的抗体，Homer1 1B1作为检测抗体。
本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于诊断Homer1相关性肿瘤的病理诊断试剂盒中的应用。
具体地，所述Homer1相关性肿瘤为乳腺癌。
本发明筛选获得的能够识别Homer1天然蛋白不同位点的抗体对，具有特异性强的特点；在间接ELISA实验中，本发明抗体的效价达到1：1*106，具有效价较高的特点；通过免疫组织化学的方法，可以观察到本发明的Homer1单克隆抗体识别皮质细胞浆内的Homer1蛋白。对比市场上存在的同类抗体，本发明的单克隆抗体还成功识别Homer1a蛋白。Homer1a作为即早蛋白，是一种短型的Homer蛋白，通过竞争调节长片段Homer蛋白与靶蛋白的结合，调节相关信号通路的活性，在多种生理病理过程中发挥了重要作用。本发明的双抗夹心ELISA方法批内变异系数为9.4%，且热稳定性良好，其最低检测浓度为34.17pg/ml。因此本发明的单克隆抗体具有更广泛的应用空间。
保藏信息
用于保藏的杂交瘤细胞株的科学描述为:
保藏单位全称: 中国典型培养物保藏中心；
保藏单位简称：CCTCC；
保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；
保藏日期：2017年9月20日
培养物名称（分类命名）：杂交瘤细胞株Homer1 1B3，保藏编号：CCTCC NO：C2017190；
和
培养物名称（分类命名）：杂交瘤细胞株Homer1 1B1，保藏编号：CCTCC NO：C2017191。
附图说明
图1 为western blot结果验证本发明单克隆抗体能特异性识别Homer1亚型蛋白，包括Homer1a、Homer1b、Homer1c, 同时不识别Homer 2、Homer 3等其他Homer家族蛋白。
图2为western blot验证His- Sumo-Homer1b（130-180aa）重组蛋白对本发明的Homer1 1B3单克隆抗体进行肽段阻断的效果。
图3为免疫组织化学法验证本发明的单克隆抗体对人脑组织的石蜡切片中Homer1蛋白的识别。
图4为双抗夹心ELISA法检测标准品蛋白，并绘制标准品曲线。
图5为使用本发明研制的Homer1双抗夹心试剂盒检测小鼠不同组织中的Homer1蛋白含量。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
以下将提供实施例详细说明Homer1单克隆抗体、特异性阻断肽段及Homer1双抗夹心ELISA试剂盒的具体制备过程。但本发明并不限于下述实例。未注明来源的实验用品均为市售。
【实施例1】 抗Homer1单克隆抗体的制备
一、His-Homer1b(Genebank: NM_004272.4)、His-Homer1b（110-354aa）及His-Homer1b（130-180aa）重组表达载体的构建
从人肝组织中提取RNA，逆转录为cDNA，设计特异性PCR引物，克隆得到His-Homer1b、His-Homer1b（110-354aa）及His-Homer1b（130-180aa）对应的DNA序列。全长Homer1b 的氨基酸序列如SEQ NO:1所示。His-Homer1b和His-Homer1b（110-354aa）重组入pET28a载体，构建pET28a-Homer1及pET28a-Homer1b（110-354aa）原核表达载体；His-Homer1b（130-180aa）DNA序列重组入pET28a-Sumo质粒中，构建pET28a -Sumo-Homer1b（130-180aa）原核表达载体。DNA测序验证序列的准确性。
二、His-Homer1b、His-Homer1b（110-354aa）及His- Sumo-Homer1b（130-180aa）重组蛋白的表达与纯化。
1、分别将pET28a-Homer1、pET28a-Homer1b（110-354aa）和pET28a -Sumo-Homer1b（130-180aa）转化Rosetta大肠杆菌表达目标重组蛋白 采用42℃热激90s 的方法将重组质粒转化Rosetta大肠杆菌，挑取抗卡那霉素的菌斑，DNA测序验证该菌落转化成功，放大培养至300ml LB培养基中，当菌液的OD为0.6-0.8时加入IPTG诱导目标蛋白的表达。30℃培养5小时后，收取菌体，超声破菌，离心收集上清。
2、重组蛋白纯化将菌体裂解液上清加入Ni-NTA琼脂糖凝胶中，4℃结合过夜，弃去上清。用5-10体积的10mM咪唑缓冲液洗去层析柱中未结合的蛋白。然后依次用20、50、250mM咪唑缓冲液洗脱重组蛋白。SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的特异性以及浓度。纯化得到的His-Homer1b，His-Homer1b（110-354aa）及His-Homer1b（130-180aa）融合蛋白用于单克隆抗体制备中的免疫及筛选，His-Homer1b用作双抗夹心ELISA实验中的标准品蛋白。
三、Bacl/c小鼠的免疫与效价检测。
1、选取Balb/c (8-12周龄)小鼠4只（来自湖北省疾病预防及控制中心）。
2、首次免疫： 取重组His-Homer1b融合蛋白200μg，添加PBS稀释到800μL，加入800μL的弗氏完全佐剂。搅拌乳化充分，每支注射器分装400μL，首次皮下多位点免疫Balb/c小鼠。
3、第二次免疫 ：两周后同样取重组His-Homer1b融合蛋白200μg，加PBS稀释到800μL，加入等体积的弗氏不完全佐剂。搅拌乳化充分，每支注射器分装400μL，第二次皮下多位点免疫Balb/c小鼠。
4、第三次免疫： 两周后进行，方法同第二次免疫。
5、第四次免疫 两周后进行，方法同第二次免疫。
6、测量第四次免疫后小鼠血清效价： 取重组His-Homer1b融合蛋白用CB稀释（pH=9.0）为2μg/ml包被酶标板，每孔100μL。4℃包被过夜。取出包被过夜的酶标板，TBST洗涤后，用5％的脱脂奶粉封闭，37℃温育两个小时；取出板条TBST洗三遍，4℃贮存待用。第四次免疫后3天，从小鼠尾部取血适量，12000 r/min 离心2 min后取上清。用样本稀释液将上清稀释为1:800，然后进行倍比稀释1:1600、1:3200、1:6400、1：12800、1:25600。每孔100μL加入封闭后的酶标板。37℃，孵育1小时。取出TBST洗三遍，加入HRP标记的羊抗鼠二抗，1:5000稀释，100μL/孔，37℃孵育40 min。取出板条，TBST洗涤5遍，加入TMB底物，90μL/孔。37℃孵育20 min。取出加入终止液，在酶标仪450 nm波长处测量OD值。选取效价高于1:25600的小鼠，作为细胞融合脾脏的来源。
7、强化免疫：在细胞融合进行前三天，对小鼠进行冲击免疫。取100μg His-Homer1b融合蛋白，PBS稀释为200μl，注射小鼠腹腔。作为杂交瘤细胞融合的脾脏来源。
四、杂交瘤细胞的融合、筛选与贮存
1、饲养层细胞的制备： 取成年未免疫Balb/c小鼠，拉颈处死，75％酒精中浸泡5 min后置于无菌操作台中，固定在解剖板上。用灭菌剪刀剪开最外层毛皮，用镊子撕开，暴露出腹部肌肉。用5 ml注射器吸取5 ml RPMI 1640培养液，注射入小鼠腹腔，待腹腔胀大后，用酒精棉对其腹部进行按摩以使RPMI 1640培养液充分进入腹腔各处后，小心吸出RPMI 1640培养基并注入50 ml离心管中；继续打开小鼠腹腔，取出小鼠脾脏，放入匀浆器中，加入5 mlRPMI 1640培养基，充分研磨后（组织变白）再加入5 ml RPMI 1640 培养液重悬，静置5min，吸出细胞悬液于上述50 ml离心管里，混匀，1500 r/min，离心5 min，弃上清，100 mlHAT培养基重悬。放入37℃CO2培养箱中，温育待用。
2、准备SP2/0骨髓瘤细胞 复苏一支8AG筛选过的SP2/0骨髓瘤细胞于10 cm培养皿中，用10％胎牛血清的RPMI 1640培养基培养。第二天观察细胞状态与密度，当细胞铺满培养皿80％进行传代。细胞融合时，取4-6皿SP2/0骨髓瘤细胞弃去培养基，用2 ml预先37℃温育1640培养基把细胞吹打下来，放入离心管中，再加入10 ml RPMI 1640培养基，吹打均匀。1500 r/min，离心5 min，弃去上清，待用。
3、免疫后的小鼠脾脏细胞的制备：第五次免疫后3天，选取第四次免疫后血清效价较高的小鼠，拉颈处死，75％酒精中浸泡5 min后置于无菌操作台中，固定在解剖板上。用灭菌剪刀剪开最外层毛皮，然后用镊子撕开，暴露出腹部肌肉。然后打开腹腔，取出小鼠脾脏，加入5 ml RPMI 1640培养基于匀浆器中，充分研磨后再加入5 ml RPMI 1640培养基重悬，静置5 min，吸出细胞悬液于上述50 ml离心管里（弃去沉淀），混匀，1500 r/min，离心5min，弃上清。
4、细胞融合：在细胞计数板上计数脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞的数量，根据脾细胞的数量取SP2/0骨髓瘤细胞的数量，是脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞数量之比在5:1至1:1之间。用5 ml预先37℃温育的RPMI 1640培养基重悬免疫过的脾细胞沉淀。然后将重悬的免疫过的脾细胞加入SP2/0骨髓瘤细胞中，吹打均匀。1500 r/min，离心5 min，弃去上清，用手指轻轻击打离心管底部，使细胞分布均匀、蓬松。取出37℃温育的1 ml PEG4000，混匀后吸出，将PEG4000逐滴加入混合的细胞中，加入过程中要轻轻混匀，控制滴速，此过程尽量把时间控制在90秒左右。取出37℃预先温育的终止液（RPMI 1640培养基）40 ml，然后在第1 min逐滴加入1 ml，均匀滴入，边滴加边缓慢旋转混匀，第2 min加入2 ml终止液，第3 min加入3ml终止液，此后以适当加快速度，共加入40ml终止液，注意此过程先慢后快。轻轻混匀，800 r/min，离心5 min，弃去上清。
5、铺板：用加入饲养层细胞的HAT培养基重悬上述融合细胞，然后移入HAT培养基的血清瓶中，混匀。取96孔培养板5块，然后将细胞培养液加入96孔培养板中，每孔200μL。放入37℃ CO2培养箱中培养。
6、筛选稳定产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，首先制作测量细胞上清效价的酶标板，方法如下：用CB包被液（pH=9）分别将His-Homer1b（110-354aa）及His- Sumo-Homer1b（130-180aa）重组蛋白稀释为2μg/ml，以每孔100μL包被酶标板，4℃，过夜。第二天取出，弃去包被液，每孔加入200μL 5％脱脂奶粉，37℃孵育2小时。取出TBST洗3遍，放置4℃待用。
7、第一次克隆化：细胞融合后第5天可以在显微镜下看到4、5个细胞聚集在一起的细胞集落，进行第一次换HAT培养基，吸出80μL，然后加入100μL HAT培养基。第7天进行第二次换液，方法同上。第9天进行第三次换液。第10天，细胞集落接近铺满1/10孔，从每个孔里取出50μL加入预先制备的封闭过的酶标板中进行效价检测。分光光度计检测每个孔的吸光度。选取吸光度值在2.0以上的细胞孔，显微镜下观察对应孔是否有明显的细胞集落。选取其中存在细胞集落的细胞孔，采用有限稀释法进行克隆化。首先制作饲养层细胞，用RPMI1640培养液稀释为50 ml，每孔加入100μL，置于37℃ CO2培养箱待用。然后稀释杂交瘤细胞：将目标孔的杂交瘤细胞吹打均匀，吸取100μL加入900μL的20％胎牛血清HT培养基中，在显微镜下进行计数，根据细胞密度，将细胞稀释到1000个/毫升，然后吸取50μL加入到放有5ml的20％胎牛血清HT 的RPMI 1640培养液培养基的离心管中。将离心管中的细胞混匀，加入铺有饲养层细胞的96孔板中，每孔100μL，即1个细胞每孔，每个原始孔杂交瘤细胞铺半块96孔板，铺完后，放入37℃ CO2培养箱中培养。
8、换液方法同上，将20％胎牛血清HAT RPMI 1640培养液换为20％胎牛血清HTRPMI 1640培养液，待细胞培养板中细胞铺满1/10孔，进行第二次克隆化。第二次亚克隆后将培养基换为20％胎牛血清RPMI 1640培养液。第二次、第三次克隆化方法同上，比对细胞集落与效价检测的结果，如果出现假阳性或假阴性，则继续进行克隆化，如果未出现假阴性和假阳性，则克隆化完成。选取若干个具有单细胞集落的细胞孔，吹打均匀细胞，移入预先铺有滋养层细胞的24孔板中。
9、确定亚型：当24孔板中的细胞达到一定的密度后，吸取50μL细胞上清，放入预先分别用His-Homer1b（110-354aa）及His-Sumo-Homer1b（130-180aa）重组蛋白包被且封闭过的酶标板中，37℃温育1 h，然后加入标记HRP羊抗鼠免疫球蛋白亚型的抗体作为二抗，1:1000稀释。37℃温育40 min。TBST洗涤5遍后，加入底物TMB，37℃温育20 min显色，酶标仪450 nm波长处测量OD值，确定单克隆抗体的亚型。结果显示本发明以His-Homer1b（110-354aa）重组蛋白筛选的单克隆抗体Homer1 1B1的亚型为IgG2b型，以His-Sumo-Homer1b（130-180aa）重组蛋白筛选的Homer1 1B3为IgG2a亚型。
【实施例2】腹水的获得与单克隆抗体的纯化
1、取8周龄大的雌性Balb/C小鼠腹腔注射0.5 ml弗氏不完全佐剂，7-12天后，将扩大培养的杂交瘤细胞用PBS悬浮，每只小鼠腹腔注射1×106个杂交瘤细胞。注射杂交瘤细胞7天后，小鼠腹部明显膨大，此时用无菌注射器抽取腹水，置离心管中4000 rpm 4℃离心10min。收集上清，即得到了单克隆抗体腹水。
2、用1% NaAc平衡Protein G 琼脂柱料填充的柱子。
3、将腹水用孔径为0.2 um的滤膜过滤，腹水用1% NaAc稀释，然后加入平衡过的柱子中，用阀门控制流速。
4、腹水上柱完毕后，然后用1% NaAc洗涤，G250检测洗涤液，不变蓝为止。
5、用3.5％的冰乙酸溶液洗脱单克隆抗体，G250检测洗脱液，不变蓝为止。
6、将洗脱液（用饱和Na2CO3调节pH为6-7之间）放入超滤管中4℃ 3500 rpm离心30min。将超滤后的洗脱液吸入透析袋中，PBS透析过夜。将纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
【实施例3】 单克隆抗体特异性及效价
一、Western blot实验
1、将Homer1a、Homer1c、Homer2、Homer3转染的293T细胞以及小鼠的皮质、小脑、海马组织用RIPA裂解液裂解。12000 r/min，4℃离心20 min。收集上清，BCA试剂盒检测蛋白浓度。
2、将细胞及组织裂解液加入12％ PAGE中，120V电泳1h。然后将PAGE胶置于PVDF膜上，40mA转膜90 min。
3、将PVDF膜放入1％的酪蛋白中室温封闭1h。然后分别用1:2000本发明的Homer1B1和Homer1B3单抗隆抗体作为一抗4℃孵育过夜。
4、取出PVDF膜PBST漂洗3次，每次3min。置于1:5000稀释的HRP标记的二抗中室温孵育1h。弃去二抗， PBST洗涤5次，每次5min。
5、将DAB试剂盒中A液与B液1:1混合，避光，混匀，将膜加入显色液中避光显色15min左右终止反应，记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存。
6、如图1，结果显示Homer1B1和Homer1B3单抗隆抗体均特异性识别人源重组的Homer1蛋白及小鼠组织中的的Homer1蛋白，提示Homer1B1和Homer1B3单抗隆抗体均具有良好的特异性。此外，Homer1B3单克隆能够识别Homer1a及Homer1c蛋白； Homer1B1单克隆抗体识别Homer1c片段，不识别Homer1a片段，说明Homer1B3单克隆识别Homer1a及Homer1c中相同的的序列，而Homer1B1识别位点则位于Homer1c和Homer1a不同的序列中。
二、肽段阻断试验
1、将Homer1B3单抗隆抗体与50倍摩尔数的Homer1b 130-180aa 肽段4℃孵育过夜。同时用同等体积的肽段缓冲液与Homer1B3单抗隆抗体孵育作为阴性对照。
2、Western blot实验验证Homer1B3单抗隆抗体的识别位点。方法同上。
3、如图2所示，相对于对照组，与His- Sumo-Homer1b（130-180aa）肽段孵育的Homer1B3单抗隆抗体识别Homer1蛋白效能明显减弱，提示Homer1b 130-180aa能够有效阻断Homer1B3单抗隆抗体的识别功能，说明Homer1B3单抗隆抗体的识别位点位于Homer1b130-180aa区间内。
三、组织免疫化学实验
1、取小鼠脑组织进行固定、石蜡包埋、切片，组织厚度为 5μm ； 2、脱蜡与水化 ：分析纯二甲苯 3次 ×10min，无水乙醇 3次 ×10min，95%乙醇 5min，85% 乙醇 5min，75% 乙醇5min，去离子水浸泡 3min×3 次 ； 3、加入抗原修复液 （ 0.01M， pH6.0 枸橼酸钠缓冲液） 高压锅高压热修复2min，待高压锅温度降至约 90℃时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。 去离子水浸泡3min×3 次。 4、使用 3% 过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置 10min。去离子水浸泡5min×3 次。 5、加上封闭液（10% 正常山羊血清），37℃孵育 60min。 6、去除封闭液，勿冲洗，加入 1:150 比例稀释的本发明单克隆抗体Homer1B3；置于湿盒中，37℃孵育 60min。PBST（含0.1%Tween-20）洗涤 2 次，每次洗涤 5min。PBST（含0.02%Tween-20）洗涤1次，每次洗涤5min。 7、二抗工作液孵育，37℃ 1小时，使用PBS 洗涤 3 次，每次 5min。
8、应用 DAB 溶液显色，显色 3~10min。蒸馏水洗涤。 9、苏木精复染细胞核1min，蒸馏水漂洗，1% 盐酸分化。蒸馏水漂洗 3 次，室温静置1min。 10、脱水和透明 ：75％乙醇5min，100% 乙醇 5min×3 次，85％乙醇 5min，95％乙醇5min，100％乙醇 3×5min ；二甲苯 3×5min，中性树胶封片。 11、镜检，结果如图3所示，相比于非免疫小鼠血清的对照组，本发明的Homer 1B3单克隆抗体能够特异性识别小鼠脑组织中的Homer1蛋白。
四、单克隆抗体的效价
1、以His-Homer1b融合蛋白2μg/ml作为包被抗原，每孔100μL包被，4℃过夜。
2、把本发明的单克隆抗体做1:1000、1:2000、1：4000、1：8000.......稀释，100μL/孔，37℃孵育2 h。
3、取出酶标板TBST洗涤后加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，每孔100μL，37℃孵育1 h。
4、TBST洗涤后，TMB底物显色，20 min后终止液终止反应。用酶标仪读取450nm波长处的OD值，与阴性对照450 nm波长处OD比值大于2.1时的最大稀释倍数作为本发明单克隆抗体的效价，检测结果显示，本发明的单克隆抗体Homer1 1B3与Homer1 1B1的效价均达到1：1.024×106。
【实施例4】双抗夹心试剂盒的制备
一、筛选抗体对
1、将单克隆抗体Homer1 1B3与Homer1 1B1分别标记生物素，进行双抗夹心ELISA。分别用未标记的单克隆抗体2μg/ml、4μg/ml包被酶标板，4℃ 放置过夜。
2、取出TBST洗涤一次，加入5 ％脱脂牛奶封闭，37℃，2 h。
3、将原核表达的Homer1b蛋白标准品500 pg/ml，每孔100μL加入酶标板，同时用标准品蛋白稀释液做阴性对照，37℃，孵育1 h。
4、取出TBST洗涤3次，分别将标记生物素的Homer1单克隆抗体1:4000稀释加入酶标板孔中，每孔100μL，放入37℃，孵育1 h。
5、取出洗涤三次，加入1:4000稀释的亲和素HRP，每孔100μL，37℃孵育1 h。
6、取出TBST洗涤五遍，加入TMB底物，37℃显色20 min。取出，加终止液。酶标仪（波长n=450 nm）读取不同蛋白浓度梯度下的OD值。根据标准品的OD值与阴性对照孔的背景值，选择Homer1 1B3作为包被抗体，Homer1 1B1作为检测抗体。
二、双抗夹心ELASA法的建立
1、本发明的Homer1 1B3单克隆抗体用CB（pH=9）包被液稀释为2μg/ml，包被酶标板，4℃放置过夜。
2、取出酶标板TBST洗涤一次，加入2％BSA封闭，37℃ ，2 h。
3、将原核表达的Homer1b蛋白标准品从5000 pg/ml、2500 pg/ml、1250 pg/ml、625pg/ml、312.5 pg/ml、156.25 pg/ml、78.13 pg/ml倍比稀释，每个稀释梯度3个重复孔加入酶标板中，37℃，孵育1 h。
4、取出TBST洗涤3次，将标记生物素的Homer1B1单克隆抗体1:4000稀释加入酶标板孔中，每孔100μL，放入37℃，孵育1 h。
5、取出洗涤三次，加入1:4000稀释的亲核素HRP，每孔100μL，37℃孵育1 h。
6、取出TBST洗涤五遍，加入TMB底物，37℃显色20 min。取出，加终止液。酶标仪（波长=450 nm）读取不同蛋白浓度梯度下的OD值。
7、根据OD值与不同梯度的蛋白浓度可以绘制出OD值与 Homer1蛋白浓度的关系曲线图，得出检测样本中Homer1蛋白含量的标准曲线，
y=52.149x2+990.61x-112.11, R2=0.9991
用于计算样本中Homer1蛋白的含量。通过对反应参数的不断优化，从而开发出一种可以用于科研及临床诊断中检测的样本中Homer1蛋白含量的双抗夹心ELISA的方法，其最低检测浓度为34.17pg/ml。
三、确定本发明的双抗夹心ELISA方法的批内变异系数
1、本发明的Homer1 1B3单克隆抗体用CB（pH=9）包被液稀释为2μg/ml，包被酶标板，4℃放置过夜。
2、取出TBST洗涤一次，加入2％ BSA封闭，37℃ ，2 h。
3、取出TBST洗涤3次。加入500 pg/ml His-Homer1b的标准品，20个重复孔，37℃，孵育1 h。
4、取出TBST洗涤3次，将标记生物素的Homer1 1B1单克隆抗体1:4000稀释加入酶标板孔中，每孔100μL，放入37℃，孵育1 h。
5、取出洗涤三次，加入1:4000稀释的亲核素HRP，每孔100μL，37℃孵育1 h。
6、取出TBST洗涤五遍，加入TMB底物，37℃显色20 min。取出，加终止液。酶标仪（波长=450 nm）读取检测样本OD值。根据500 pg/ml His-Homer1b标准品20个重复孔OD值，计算出该批内ELISA试剂盒的变异系数CV=SD/X¯*100％=9.4%。
四、确定本发明的双抗夹心ELISA方法的热稳定性
1、本发明的Homer1 1B3单克隆抗体用CB（pH=9）包被液稀释为2μg/ml，包被酶标板，4℃放置过夜。
2、取出TBST洗涤一次，加入2％ BSA封闭，37℃ ，2 h。取出TBST洗涤3次。
3、加入浸板液，37℃孵育2 h，取出酶标板，弃去浸板液。
4、倍比稀释标准品蛋白，5000 pg/ml、2500 pg/ml、1250 pg/ml、625 pg/ml、312.5pg/ml、156.25 pg/ml、78.13 pg/ml，检测样本为500pg/ml的标准品His-Homer1b蛋白。进行首日的双抗夹心ELISA。
5、将酶标板置入37℃恒温箱中，按照上述方法分别在第3日、第7日进行双抗夹心ELISA实验。
6、根据置于37℃中不同天数的标准品蛋白的OD值，分析本发明的双抗夹心ELISA试剂盒的热稳定性。结果显示相对于首日检测结果，第3日和第7日检测计算的标准品蛋白浓度分别降低4.7%和11.4%，提示本试剂盒热稳定性良好。
五、采用本发明建立的双抗夹心ELISA的方法检测小鼠组织中的Homer1蛋白的含量
1、取昆明小鼠取出其小脑、海马、皮质组织，PBS清洗后，置入研钵中，加入液氮研磨粉末后，收集入EP管中，加入适量PBS（含1％蛋白酶抑制剂PMSF），反复吹打混匀后，13000 rpm,4℃离心20 min，取上清。BCA试剂盒检测小鼠裂解液总蛋白浓度。使用样本稀释液，将组织裂解液稀释为相同的浓度200µg/ml。
2、采用本发明的ELISA试剂盒检测各组织中Homer1蛋白的含量，上样量为100μL，进行双抗夹心ELISA实验。
3、绘制本发明的双抗夹心ELISA法的标准曲线：将Homer1b标准品蛋白进行倍比稀释，浓度依次为25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.13ng/ml、1.57ng/ml、0.79ng/ml，进行双抗夹心ELISA实验。根据不同梯度的标准品蛋白浓度及波长为450 nm处读取的OD值，通过EXCEL软件绘制出标准曲线，如图4所示，标准方程为y=52.149x2+990.61x-112.11, R2=0.9991。
4、采用本发明研制的Homer1双抗夹心试剂盒检测小鼠不同组织中的Homer1蛋白含量。小鼠组织采用液氮研磨的方法获取裂解液，PBS作为缓冲液。用样本稀释液将小鼠组织裂解液稀释为200μg/ml,作为检测样本。酶标仪450 nm波长处读取样本的OD值，根据标准品曲线，分别计算出小鼠小脑、海马、皮质中的Homer1蛋白的含量。如图5所示本方法测得小鼠皮质、海马及小脑中的Homer蛋白含量分别为203.24、78.16及14.78pg/µg。
序列表
<110> 武汉大学
<120> Homer1单克隆抗体及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 354
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Gly Glu Gln Pro Ile Phe Ser Thr Arg Ala His Val Phe Gln Ile
1 5 10 15
Asp Pro Asn Thr Lys Lys Asn Trp Val Pro Thr Ser Lys His Ala Val
20 25 30
Thr Val Ser Tyr Phe Tyr Asp Ser Thr Arg Asn Val Tyr Arg Ile Ile
35 40 45
Ser Leu Asp Gly Ser Lys Ala Ile Ile Asn Ser Thr Ile Thr Pro Asn
50 55 60
Met Thr Phe Thr Lys Thr Ser Gln Lys Phe Gly Gln Trp Ala Asp Ser
65 70 75 80
Arg Ala Asn Thr Val Tyr Gly Leu Gly Phe Ser Ser Glu His His Leu
85 90 95
Ser Lys Phe Ala Glu Lys Phe Gln Glu Phe Lys Glu Ala Ala Arg Leu
100 105 110
Ala Lys Glu Lys Ser Gln Glu Lys Met Glu Leu Thr Ser Thr Pro Ser
115 120 125
Gln Glu Ser Ala Gly Gly Asp Leu Gln Ser Pro Leu Thr Pro Glu Ser
130 135 140
Ile Asn Gly Thr Asp Asp Glu Arg Thr Pro Asp Val Thr Gln Asn Ser
145 150 155 160
Glu Pro Arg Ala Glu Pro Thr Gln Asn Ala Leu Pro Phe Ser His Ser
165 170 175
Ser Ala Ile Ser Lys His Trp Glu Ala Glu Leu Ala Thr Leu Lys Gly
180 185 190
Asn Asn Ala Lys Leu Thr Ala Ala Leu Leu Glu Ser Thr Ala Asn Val
195 200 205
Lys Gln Trp Lys Gln Gln Leu Ala Ala Tyr Gln Glu Glu Ala Glu Arg
210 215 220
Leu His Lys Arg Val Thr Glu Leu Glu Cys Val Ser Ser Gln Ala Asn
225 230 235 240
Ala Val His Thr His Lys Thr Glu Leu Asn Gln Thr Ile Gln Glu Leu
245 250 255
Glu Glu Thr Leu Lys Leu Lys Glu Glu Glu Ile Glu Arg Leu Lys Gln
260 265 270
Glu Ile Asp Asn Ala Arg Glu Leu Gln Glu Gln Arg Asp Ser Leu Thr
275 280 285
Gln Lys Leu Gln Glu Val Glu Ile Arg Asn Lys Asp Leu Glu Gly Gln
290 295 300
Leu Ser Asp Leu Glu Gln Arg Leu Glu Lys Ser Gln Asn Glu Gln Glu
305 310 315 320
Ala Phe Arg Asn Asn Leu Lys Thr Leu Leu Glu Ile Leu Asp Gly Lys
325 330 335
Ile Phe Glu Leu Thr Glu Leu Arg Asp Asn Leu Ala Lys Leu Leu Glu
340 345 350
Cys Ser

Claims (8)

1.分泌Homer1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：C2017191和CCTCC NO：C2017190，其中保藏编号为CCTCC NO：C2017191的杂交瘤细胞株是His-Homer1b免疫小鼠后至尾血效价检测达1:25600后，加强免疫后进行细胞融合，His-Homer1b（110-354aa）肽段筛选获得，Homer1b对应的氨基酸序列为SEQ NO:1，Homer1b（110-354aa）的氨基酸序列对应SEQ NO:1的第110aa-354aa；其中保藏编号为CCTCC NO：C2017190的杂交瘤细胞株是His-Homer1b免疫小鼠后至尾血效价检测达1:25600后，加强免疫后细胞融合，His-sumo-Homer1b（130-180aa）筛选获得，Homer1b（130-180aa）的氨基酸序列对应SEQ NO:1的第130aa-180aa。
2.一种Homer1单克隆抗体Homer1 1B3，其特征在于，由编号为CCTCC NO：C2017190的杂交瘤细胞株分泌。
3.一种Homer1单克隆抗体Homer1 1B1，由编号为CCTCC NO：C2017191的杂交瘤细胞株分泌。
4.权利要求2和3所述的Homer1单克隆抗体在制备用于检测Homer1蛋白的免疫检测工具中的应用。
5.权利要求4所述的应用，其特征在于，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。
6.权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为定量检测Homer1蛋白含量的双抗夹心酶联免疫（ELISA）试剂盒，其中权利要求2所述的Homer1 1B3作为包被酶标板的抗体，权利要求3所述的Homer1 1B1作为检测抗体。
7.权利要求2和3所述的Homer1单克隆抗体在制备用于诊断Homer1相关性肿瘤的病理诊断试剂盒中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述Homer1相关性肿瘤为乳腺癌。
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