CN111440241B - 一种包含特异性结合ros1的单克隆抗体的癌症检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含特异性结合ROS1的单克隆抗体的癌症试剂盒，其中的单克隆抗体是以筛选得到的ROS1激酶结构域作为抗原，通过免疫小鼠制备得到的，该抗体具有较好的结合特异性，并且验证了其具有抑制肿瘤细胞生长的功能，具有较好的应用前景。

Description

一种包含特异性结合ROS1的单克隆抗体的癌症检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物领域，更具体的涉及一种包含特异性结合ROS1的单克隆抗体的癌症检测试剂盒。
背景技术
ROS1是一种致癌基因序列，可与gag基因融合，融合后具有一定的致瘤性。野生型ROS1基因定位于6号染色体q12区。编码2347个氨基酸，分子量为259kDa。编码蛋白为跨膜型酪氨酸激酶受体蛋白，由酪氨酸激酶区、跨膜区及含糖基化位点的细胞外区三部分组成。N-端1861个氨基酸构成胞外区，跨膜区约由1882个氨基酸构成，C-端464个氨基酸构成胞质区。胞膜区由3个YWTD域折叠成3个β-螺旋结构，穿插在9个III型纤连蛋白骨架中。目前尚未发现与ROS1/RTK结合的配体。ROS1基因的突变、重排、过表达等皆会导致ROS1蛋白的失调，进而由异常的ROS1蛋白激酶活性激活下游多条致癌信号途径，包括PI3K/AKT/mTOR,STAT3,RAS-MAPK/ERK、VAV3和SHP-1/2等。
目前各项研究所报道的肺癌ROS1融合基因检测的阳性率差别较大，在腺癌中的阳性率约为1％-3.4％，除了病例选择的偏倚，检测方法及结果评价标准不统一等也可能是主要原因。重排基因常用的检测方法主要包括免疫组织化学(IHC),实时定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)和荧光原位杂交技术(FISH」等。美国食品与药品管理局(FDA)己批准FISH用于NSCLC患者中ALK融合基因检测，而ROS1融合基因检测手段还没有统一的标准。IHC方法快速、经济、简便，其敏感度取决于组织中ROS1融合蛋白的表达量和相应抗体的敏感性及特异性。RT-PCR方法可明确融合型，其所需组织量极少，但不能检测未知的融合基因类型，且RT-PCR对组织中DNA质量有较高要求。FISH在检测未知融合基因型方面具有独特的优势，是其他两种方法所不能及的，检测特异性也较高，但检测成本通常较高、结果难于判读。Yoshiyuki等基于NanoString技术检测肺癌肿瘤组织中的RNA，鉴定出GOPC-ROS1(FIG-ROS1融合基因并用RT-PCR进行确认。目前认为NanoString技术在所有转录水平的基因表达模式与实时定量PCR有着极佳的关联，且灵敏度和特异性与qPCR相当。
由于ALK和ROS1的激酶结构域的相似性，研究者尝试将ALK抑制剂应用于ROS1重排患者的身上，结果表明除了艾乐替尼外，所有的ALK抑制剂均能有效的控制ROS1融合患者的病情。
克唑替尼是一种针对ALK、MET及ROS1基因重排的酪氨酸激酶抑制剂。最初是作为MET抑制剂研发的，其后被批准用于ALK融合患者的一线治疗。由于ALK和ROS1在激酶结构域有49％的氨基酸序列同源性，在三磷酸腺苷(ATP)结合位点上有77％的同源性，2014年Shaw等将ROS1重排的NSCLC患者纳入临床研究PROFILE1001的扩展队列，共50例NSCLC患者入组，其中有3例达到完全缓解，总体反应率为72％，中位无疾病进展时间为19.2个月。基于以上研究结果，克唑替尼被FDA和欧洲药品管理局(EMA)批准治疗晚期ROS1-重排的NSCLC。
目前针对ROS1开发的检测或者治疗药物已经有上市，但是开发针对ROS1特定结构域的单克隆抗体还没有相关的报道。
发明内容
本发明通过对现有技术的改进，提供了一种特异性结合ROS1激酶结构域的单克隆抗体。
本发明一方面，提供了一种特异性的ROS1激酶多肽片段，其序列如下：
1 ggdlltylrk armatfygpl ltlvdlvdlc vdiskgcvyl ermhfihrdl aarnclvsvk
61 dytsprivki gdfglardiy kndyyrkrge gllpvrwmap eslmdgiftt qsdvwsfgil
该序列为经鉴定的PF-06463922特异性的结合片段。
本发明进一步的，提供一种特异性结合ROS1结构域的单克隆抗体，其轻链可变区如SEQ ID NO：1所示，其重链可变区如SEQ ID NO：2所示。
更进一步的，本发明将所述的单克隆抗体用于抑制肝癌细胞生长。优选的，所述肝癌细胞为HepG2细胞。
此外，本发明还提供一种医药组合物，包含上述所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、以及药学上可接受的赋形剂。
一种多核苷酸，其含有编码所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区或者重链可变区的核苷酸序列。
一种表达载体，其包含上述所述的多核苷酸。
一种用上述表达载体进行了转化的宿主细胞，其由以下构成：
用所述的表达载体进行了转化的宿主细胞，所述表达载体包含含有编码上述所述单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸和含有编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸。
所述单克隆抗体或其抗原结合片段也包含其与其它肽及蛋白质的融合体、或使其结合修饰剂而成的修饰体。
有益效果
本发明以筛选得到的ROS1激酶结构域作为抗原，通过免疫小鼠制备得到了相应的单克隆抗体，该抗体具有较好的结合特异性，并且验证了其具有抑制肿瘤细胞生长的功能，具有较好的应用前景。
附图说明
图1泳道1的位置目的蛋白，泳道2为空白对照。
图2Western-blot检测结果图，1是对照，2是抗体与抗原结合结果。
图3抗体亚型检测结果图。
图4抗体针对细胞的抑制效果图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1免疫原的制备
根据据ROS1蛋白的结构特性，通过分析，选择了最优化的免疫多肽序列ggdlltylrkarmatfygplltlvdlvdlcvdiskgcvylermhfihrdlaarnclvsvkdytsprivkigdfglardiykndyyrkrgegllpvrwmapeslmdgifttqsdvwsfgil，采用多肽合成的方式获得了相应的氨基酸序列。将获得的蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果如图1所示。在泳道1的位置有目的蛋白产生，泳道2为空白对照。
实施例2单克隆抗体生产用杂交瘤细胞的制备
1、动物免疫
将己经纯化好的实施例1的多肽和免疫促进剂PEI(1:3)混匀后，溶于无血清无双抗DMEM溶液中，使其最终注射浓度为1mg/ml。100μl/只肌肉注射35日龄小鼠，间隔10天注射一次。三免后对小鼠局部采血，40C 10000r/min离心20min分离小鼠血清，对血清进行500-16000倍倍比稀释后，间接ELISA法检测血清抗体水平，选用没有注射多肽蛋白的小鼠血清作为对照，同时设计一组空白实验，其中效果最好的一个只小鼠检测结果见表1所示。
表1血清检测结果
稀释倍数 OD值
500 1.936
1000 1.705
2000 1.556
4000 1.407
8000 1.026
16000 0.829
对照 0.093
空白对照 0.021
从结果可见，间接ELISA法检测免疫小鼠血清稀释500-16000倍时的抗体水平，P/N值均远远大于2.1，说明免疫效果良好，小鼠可加强免疫进行下一步试验。
2、杂交瘤细胞的制备及筛选
对该抗体高的小鼠免PEI再免疫，4天后，处死小鼠取其脾清洗干净，用消毒后的手术剪除去脾脏脂肪和结缔组织。将处理完毕的脾脏放入新的DMEM培养液中，用玻璃研磨器将脾脏研磨均匀后，用紫外消毒完毕的移液枪取DMEM 5ml加入脾脏里，并将脾细胞吹打混匀，反复操作3-4次。最后，将制备好的脾细胞置于全新15ml离心管里备用。
从液氮罐中取出装有待复苏的SP2/0细胞冻存管，在此之前，应该提前将恒温水浴锅通电工作，设置为37℃。将冻存管迅速移到水浴锅内，为了使细胞较快解冻，需轻轻并不断摇动细胞冻存管。细胞溶解后，放入低速离心机中室温离心10-15min，转速为1000r/min即可。弃上清后，细胞沉淀用新的DMEM培养液吹打均匀，移入细胞培养皿中，置于37℃CO2培养箱中培养(5％饱和湿度)。直到细胞贴壁，继续换新的培养液培养。
弃去培养多天SP2/0细胞的培养液，尽量换成刚开封新或紫外杀菌后的DMEM基础液。移液枪反复吹使细胞在DMEM中分散充分，加入制备好的脾细胞中继续小心翼翼地吹打(SP2/0细胞:小鼠脾细胞＝＝1:4)，低速离心后弃上清液，再加入新的DMEM培养液，重复以上步骤两次。
洗涤完毕后，倒上清。将装有SP2/0细胞和脾细胞的离心管在超净台台面上轻轻磕打，使内容物充分分散混匀，从而扩大与PEG的接触面积，再放于37℃水浴锅中。
洗涤完毕的脾细胞和SP2/0细胞混合物加入1ml,60s内将PEG沿着管壁加入并转动离心管。再加入DMEM培养液沿着管壁加入并转动离心管在60s内完成，后面可加速直到加到30ml结束。超净台放置2min，低速离心后，只保留底部可见固体物，并加入HAT细胞培养液3ml混匀。再加HAT细胞培养液至30ml混匀充分，每孔取100μl分装于每孔含50μl饲养细胞的96孔板中。最后，将细胞板转移到37℃培养箱里。
为了防止细胞污染，应勤快地观察细胞生长情况，如果有出现污染的孔及时加入10％NaOH溶液，避免污染孔污染其他的孔。一般情况下，细胞融合后l0d左右就能清楚观察到杂交瘤细胞群落。当培养液颜色变较黄，每孔取100μl用作阳性杂交瘤检测，并且要用新的100μl培养液补上。
细胞融合后第8天96孔板中的细胞培养液变黄，且超过一半的孔内细胞占孔底面积的1/4-3/4。第9天，用间接ELISA方法对细胞培养液进行初步筛选。第12天，以同样的方法进行第二次筛选，将两次OD490值较高的细胞株进行亚克隆。通过3次克隆化后，有5株杂交瘤细胞克隆板中所有被检测细胞孔均为阳性。筛选出的3株分泌抗ROS1多肽的杂交瘤细胞株，其中最高效价的杂交瘤细胞株是ROS1-5F2，其细胞培养液上清效价为1:6400。将该细胞扩增培养并冻存备用。
实施例3单克隆抗体腹水的制备
准备好50-56日龄小鼠，注射通过高压锅灭菌好的石蜡油850μl(腹腔注射)。
6-9天后，向己经注射过石蜡油的小鼠继续注入杂交瘤细胞ROS1-1。将复苏的杂交瘤细胞用1ml RPMI 1640细胞培养液吹起并稀释后，腹腔注射小鼠，每天应观察小鼠的身体状态并记录下来。当腹部胀大到一定程度时，应该及时用5ml无菌注射器抽取小鼠腹水。
提取腹水操作规程中，首先固定好小鼠的身体后，进行腹部酒精消毒。通过注射器扎入小鼠腹部进行提取腹水。收集腹水完毕，次口继续观察情况。如果小鼠腹部再次胀大可以继续采集腹水，小鼠身体不良应立即拉颈处死。
采集的腹水应立马上处理，低速离心后，用注射器谨慎将黄色透明液体抽出，此过程可以获取我们所需的腹水。在抽取过程中，避免采集到离心管底部的石蜡油或细胞沉淀等杂物。通过间接ELISA方法检测腹水效价，结果腹水效价达到了5.12×106，具有较好的效果。
实施例4Western-blot检测
取实施例1的蛋白，以制备的ROS1-5F2单克隆抗体腹水作为一抗，HRP标记的山羊抗鼠抗体作为二抗，进行Western blot试验，检测ROS1-5F2单克隆抗体与实施例1蛋白的反应性。结果如图2所示，ROS1-5F2单克隆抗体能与实施例1的多肽蛋白发生反应，且反应性良好，同时条带单一，表明单克隆抗体的特异性也较好。
实施例5单克隆抗体序列的鉴定
单克隆抗体杂交瘤细胞采用本领域常规的RNA提取试剂盒提取总RNA，以此为模版反转录成cDNA，用针对小鼠单克隆抗体重链和轻链可变区基因序列的特异性引物分别进行PCR反应，其中特异性引物分别是引物序列为:重链:上游引物:5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAGAGGTGCAACTGCAGCAGTCAGG-3'，下游引物为5'-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3'(S/M/R是碱基兼并码)。轻链:上游引物:5'-GATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCC-3'，下游引物:5'-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3'。PCR产物连接入载体，经筛选阳性克隆、酶切鉴定后送测序，测序结果进行生物信息学分析。成功克隆了单克隆抗体FMMUB4重链和轻链可变区基因，其编码的氨基酸序列分别如下：
结果显示，轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。
实施例6单克隆抗体亚型鉴定
在细胞超净台中收集培养好的杂交瘤细胞，在室温下300g离心lOmin后将收集到的上清用于抗体亚型鉴定。亚型鉴定采用Sigma的抗体亚型鉴定试剂盒，其操作步骤如下：
(1)包被:分别包被HRP-labeled Goat Anti-Mouse IgM,HRP-labeled GoatAnti-Mouse IgG1,HRP-labeled Goat Anti-Mouse IgGaa,HRP-labeled Goat Anti-MouseIgGab,HRP-labeled GoatAnti-Mouse IgG3,HRP-labeled Goat Anti-Mouse IgA各100μ1，浓度为1μg/ml,4℃孵育过夜；
(2)封闭:用PB S'T洗3次，每孔加入200μ1封闭液，室温孵育1h；
(3)加一抗:用PB S'T洗3次，加入收集的细胞上清作为一抗，37℃孵育2h，每孔100μ1，室温孵育1h；
(4)弃一抗，洗板；
(5)加二抗:用HRP标签鼠抗作为二抗，37℃孵育1h；
(6)弃二抗，洗板；
(7)加底物:加入TMB缓冲液，100μ1/孔加入到ELISA板中，室温避光孵育15min；
(8)终止:显色完后每孔加入50μl 3M H2S04终止反应，用酶标仪在OD450nm时读数；
(9)抗体轻链类型鉴定:用移液枪吸取50μ1的杂交瘤培养上清，直接滴在抗体轻链类型鉴定试纸条上，在室温反应l0min后直接观察。结果如图3所示该单克隆抗体为IgG2b亚型。
实施例7抗体亲和力测定
根据ProteOn XPR36(BIO-RAD)仪器及相应芯片说明，将抗原通过氨基偶联试剂1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride(EDAC,100mM)and N-hydroxysulfosuccinimide(sulfo-NHS,25mM)(ProteOn氨基偶联试剂盒)连接到GLC芯片上，然后不同浓度(600,300,150,75,37.5,and 18.75nM in PBST,pH 7.4)的待测抗体溶液注入仪器进行检测。鉴于蛋白稳定性影响，我们利用了绿色荧光蛋白和实施例1的ROS1结构域的融合蛋白和芯片交联，以不同浓度的抗体作为流动相，进行测定。表面等离子共振仪SPR方法的亲和力测定结果显示抗体和抗原的识别具有很高的亲和力，解离常数达到Kd＝3.56×10-11M。
实施例8细胞抑制试验
1、试验细胞的制备
实验中使用到肝癌细胞系:人肝母细胞瘤的细胞系HepG2,购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
实验中肝癌细胞系均用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基进行培养。将细胞放于5％CO2,37℃恒温的培养箱中进行培养，每两至三天更换一次培养基，待细胞生长到密度大约80％--90％时，则进行细胞传代。细胞传代步骤如下：
(1)将培养板或培养皿取出，用移液器将其中培养基吸净；
(2)加入消毒后的细胞级PBS(1X)缓冲液于培养板或培养皿中，轻轻晃动培养板或培养皿，重复此过程两遍后吸去；
(3)加入少量0.25％含EDTA不含酚红指示剂的胰蛋白酶，晃动培养板或培养皿，显微镜下观察细胞即将脱离，根据胰酶对细胞系的消化能力，确定终止细胞的胰酶消化时间；
(4)加入含10％的胎牛血清的。MEM培养基终止胰酶消化，用移液枪轻轻吹打数次直至细胞全部脱离，吹打过程应轻柔，以防损伤细胞；
(5)用移液器将多余的液体吸去，保留1/3-1/4的细胞于原培养板或培养皿中，加入适量的10％的DMEM高糖培养基，“十”字交叉轻轻晃动动培养板或培养皿，使细胞分布均匀。
2、CCK-8细胞毒性试验
细胞毒性实验运用CCK-8试剂盒检测单抗对肝细胞癌细胞的毒性杀伤作用。
(1)细胞处于对数生长期进行铺板时，弃去培养皿中的培养基，PBS洗涤两遍后用1mL胰酶进行消化，观察细胞不再贴壁时，用含有10％血清的1mL培养基终止胰酶消化后，轻轻吹打成单细胞悬液；
(2)吸去细胞悬液，稀释20倍后，将10uL液体至细胞计数板中，进行细胞计数，最后计算出细胞悬液的细胞密度；
(3)将细胞悬液的密度，根据所需要的细胞数里，计算出所需要的细胞悬液体积，然后配置不同浓度的细胞悬液，接种前轻轻吹打混匀，准备96孔板，每孔加入液体为100μL,HepG2每孔细胞数为2000个，接种5行7列共35孔细胞，注意在96孔板周围加入PBS 200μL，这样能够减少96孔板边缘的水分丢失，防止边缘孔液体蒸发，这样就会影响实验结果，在超净台静，5分钟后，放于培养箱中进行培养；
(4)第二天观察细胞贴壁良好，更换无血清的MEM培养基，无血清处理过夜；
(5)细胞饥饿处理过夜后，加入不同浓度的单克隆抗体，第1列加入无血清的培养基不加任何药物以作为空白对照组，第2列至第7列依次加入不同浓度的单克隆抗体，其中浓度依次为0,1.56，3.12,6.25,12.5,25及50μM，放入培养箱张继续培养48小时；
(6)吸出含药物的培养基以停止作用，在避光的条件下临时配制CCK-8:无血清DMEM培养基＝＝1:9,将此10％CCK-8的DMEM培养基迅速加入96孔板中，每孔混合液体积为100uL，除原有的35孔外，另在没有细胞的5个空孔中也加入此混合液以作为空白对照，最终一共加40孔，将96孔板放入细胞培养箱中并开始计时；
(7)CCK-8孵育完成前，打开酶标仪及检测软件，设置好参数，含CCK-8的混合液在培养箱中孵育2小时后拿出，呈十字形迅速晃匀96孔板中液体，用加热过的针头迅速戳破孔中的气泡，将96孔板放入酶标仪中，在波长为450nm下检测吸光度，记录酶标仪读取各孔的吸光度值；
(8)每1列5个复孔，去除最高值及最低值，取剩下3孔的平均值，第1列为O加药，其吸光度值最小，第2-7列为不同浓度的药物处理组，第8列为CCK-8空白组。
细胞活力*(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]X100
A(加药):具有肝癌细胞、CCK-8溶液和单抗药物溶液的孔的吸光度；
A(空白):具有DMEM培养基、CCK-8溶液而没有肝癌细胞和单抗药物的孔的吸光度；
A(0加药):具有肝癌细胞、CCK-8溶液而没有添加单抗药物溶液的孔的吸光度；
这样就求得6个不同浓度下单抗对肝癌细胞的相对存活率，运用SPSS软件可计算出IC50值(半数抑制浓度)，即细胞被抑制一半时单抗的浓度。
从图4的结果可以看出，本发明的单克隆抗体作用于HepG2细胞48h后，计算出IC50值为3.12μM，具有较好的抑制效果。
虽然已描述并详细举例说明本发明至足以使本领域技术人员制备和使用它，但是在不背离本发明的精神和范围的情况应清楚各种替代方案、修改和改进。本文所提供的实施例代表优选的实施方案，为示例性的，并且不旨在为对本发明的范围的限制。其中的修改和其他用途将是本领域技术人员能够想到的。在本发明的精神内涵盖这些修改并且由权利要求书的范围限定这些修改。
序列表
<110> 北京岳昊科技发展有限公司
<120> 一种包含特异性结合ROS1的单克隆抗体的癌症试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 108
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Tyr
1 5 10 15
Glu Lys Arg Thr Ile Thr Cys Asp Ser Ala Leu Thr Ile Ala Ser Arg
20 25 30
Tyr Phe Ile Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ile Ser Pro Lys Pro Trp
35 40 45
Ile Tyr Gly Tyr Gln Asn Ser Tyr Cys Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Cys Tyr Thr Thr Leu Ala Ser
85 90 95
Gln Asp Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 2
<211> 116
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
Glu Val Gln Leu Glu Ala Ser Gly Thr Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Glu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Ala Ile
20 25 30
Gln Ser Ser Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Phe Ser Tyr Pro Glu Gln Ile Asp Thr Pro Ala Thr Gln Thr Gly
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Ala Ser Gly Ala Tyr Tyr Glu Trp Gly Leu Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Ala Val Ser Ser
115

Claims (5)

1.一种特异性结合ROS1片段的单克隆抗体，其中所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：所述抗体是Fab，Fv，scFv或(Fab’)2的抗体形式。
3.一种检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求2所述的单克隆抗体。
4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备抑制癌细胞增殖的药物中的用途，其中所述癌细胞是HepG2细胞。
5.权利要求2所述的单克隆抗体在制备特异性检测ROS1基因的试剂中的用途。
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