CN105085648B - 抗卵巢癌单抗coc166-9的对应抗原及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗卵巢癌单抗COC166‑9的对应抗原及其应用，具体而言，本发明涉及抗卵巢癌单抗COC166‑9的对应抗原(CA166‑9)的克隆鉴定及其在判断卵巢癌预后及防治中的应用。本发明的研究表明，单抗COC166‑9可用于对卵巢癌患者预后的判断；单抗COC166‑9的对应抗原为IGHG1样蛋白，能促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，在卵巢癌的肿瘤发生发展中可能起重要作用。该抗原也有可能作为疫苗用于卵巢癌的防治。

Description

抗卵巢癌单抗COC166-9的对应抗原及其应用

技术领域

本发明涉及抗卵巢癌单抗COC166-9的对应抗原及其应用，具体而言，本发明涉及抗卵巢癌单抗COC166-9的对应抗原(本发明中将其命名为CA166-9)的克隆鉴定及其在判断卵巢癌预后及卵巢癌治疗中的应用。

背景技术

卵巢癌是女性生殖器官常见的肿瘤之一，虽然其发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位，但因卵巢癌致死者却居首位，对妇女的生命造成了严重威胁。目前在全球范围内，卵巢癌的发病率仍在逐年增加。由于卵巢的胚胎发育，组织解剖及内分泌功能较复杂，它所患的肿瘤可能是良性或者是恶性。由于卵巢癌临床早期无症状，鉴别其组织类型及良恶性在临床也存在一定困难，临床上诊断的卵巢癌大部分已经扩散到子宫双侧附件、大网膜及盆腔各器官，其五年生存率仅25％～30％。目前传统的预后指标(如肿瘤大小、临床分期(TNM)、病理分型、组织分级)不能完全正确判断卵巢癌患者的预后情况，因而导致对部分病人的治疗不当，因此，需要寻找更可靠的指标单独或结合其它指标，用于判断患者预后情况，以选择个体化的治疗方案。

COC166-9是北京大学人民医院妇科肿瘤中心在上世纪八十年代用上皮型卵巢癌组织粗提液免疫小鼠后经细胞融合制备获得的一株单克隆抗体，其与卵巢癌有较好的组织反应特异性(钱和年,抗卵巢上皮癌相关抗原单克隆抗体COC166-9的制备.北京大学学报(医学版),1987(4):p.35-37)。单抗COC166-9在卵巢癌的表达率在75％以上，与正常和非肿瘤组织极少发生交叉(张春玲,卵巢癌单抗免疫组化诊断试剂盒制备的研究.浙江肿瘤,1995.1(1):p.8-9)。其与同位素的交联物能明显延长荷瘤小鼠的生存期(李小平,卵巢癌COC166-9单克隆抗体片段的制备及其在放射免疫显像中的应用.中华妇产科杂志,1997.32(3):p.152-155)。用该抗体制备获得的抗独特型抗体(Ab2)6B11能成功诱导出淋巴细胞对卵巢细胞的有效杀伤作用(Chang,X.,et al.,Preparation of humanized ovariancarcinoma anti-idiotypic minibody.Hybrid Hybridomics,2003.22(2):p.109-15；昌晓红,卵巢癌6B11抗独特型微抗体诱导抗肿瘤免疫应答的体外实验.北京大学学报(医学版),2005.37(5):p.480-484)，并能诱导产生可与卵巢癌细胞特异结合的抗抗独特型抗体(Ab3)(倪俊,卵巢癌单克隆抗-抗独特型抗体32F2的制备及其特性研究.中国妇产科临床杂志,2007.18(6):p.448；张超,卵巢癌抗抗独特型单克隆抗体3D12的制备及初步研究.北京大学学报(医学版),2008.40(2):p.170-173)。通过与上海生源医药研究有限公司的合作，目前已完成对具抗原内影像的抗独特型抗体6B11的微型化改造及临床前相关研究的主要工作(张果,卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv/鼠HSP70融合蛋白复性条件的研究.中国医药生物技术,2009.4(6):p.424-429；Cui,H.,et al.,The anti-tumor immune responsesinduced by a fusion protein of ovarian carcinoma anti-idiotypic antibody6B11ScFv and murine GM-CSF in BALB/c mice.Int J Gynecol Cancer,2004.14(2):p.234-41；Shi,J.,et al.,Expression of an ovarian cancer anti-idiotype antibody(6B11VLVHCH3)in Chinese hamster ovary(CHO)cells with improved immunoactivityand stability over proteins expressed in prokaryotic cells.Hybridoma(Larchmt),2007.26(5):p.289-95)，并拟作为卵巢癌疫苗试用于临床。

然而，虽然单抗COC166-9对卵巢癌有良好的反应特异性和敏感性，无论是与同位素的标记物或是与免疫毒素的偶联物，还是源自COC166-9的小分子抗独特型疫苗，均展示出良好的潜在临床应用前景，但由于其对应抗原分子(CA166-9)迄今尚未获得克隆和鉴定，阻碍了它在临床的应用，同时也严重影响了相关产品的进一步开发和对其相关分子机制的研究。

发明内容

本申请的一个目的在于鉴定抗卵巢癌单抗COC166-9的对应抗原(本发明中将“COC166-9的对应抗原”命名为“CA166-9”)，并提供其相关功能。

本案发明人通过亲和层析、质谱鉴定和多种免疫学方法的相互验证，确定了单抗COC166-9的对应抗原(CA166-9)为人免疫球蛋白gamma-1重链恒定区样(IGHG1)蛋白，并通过卵巢癌细胞的表型实验初步探讨了CA166-9的生物学功能。

本发明提供了单抗COC166-9的对应抗原CA166-9。根据本发明的具体实施方案，所述的CA166-9包括如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白或其免疫性片段：

(a)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白或其免疫性片段；或

(b)与(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(a)具有相同功能的由(a)衍生的蛋白或其免疫性片段；

(c)在(a)限定的氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上同源性且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白或其免疫性片段。

本发明还提供了编码CA166-9的蛋白或其免疫性片段的多核苷酸序列；所述的多核苷酸序列优选包括SEQ ID No.1第1-597位所示的多核苷酸序列。

本发明中，综合运用亲和层析、MALDI-TOF-MS质谱分析、不同的免疫竞争抑制实验、抗原克隆和表达产物的鉴定分析等方法，对CA166-9进行了纯化、分析、鉴定和多角度的验证。其中，通过免疫细胞化学(ICH)等实验，确定了SKOV-3、Caov-3细胞为COC166-9对应抗原的阳性细胞系，而在后续的Western Blot和免疫沉淀实验中，在这些阳性细胞里并没有检测到与单抗COC166-9特异性反应条带，提示COC166-9对应抗原蛋白在细胞中的表达丰度较低，尚不足以用一般的免疫沉淀和Western Blot检测到。本发明将大量的Caov-3细胞(约2×10⁹)总蛋白通过免疫亲和层析柱纯化后，成功捕获了三条能够与单抗COC166-9特异性结合的条带，为Caov-3细胞总蛋白来源的COC166-9对应抗原的成功纯化提供了保证。进一步地，对纯化抗原蛋白经酶解之后，将酶解肽段进行MALDI-TOF MS质谱分析，其中有数条肽段经肽指纹图谱比对后与人免疫球蛋白gamma-1重链恒定区部分序列匹配，其肽段吻合率达到了39.7％以上。为了验证纯化的抗原确为单抗COC166-9的对应抗原，本发明通过竞争酶联免疫吸附实验、竞争免疫组织化学实验、竞争免疫细胞化学实验等不同方法证明，纯化的抗原蛋白确实可竞争抑制COC166-9与卵巢癌病人腹水蛋白、卵巢癌组织和卵巢癌细胞蛋白中相关蛋白的结合。为进一步验证鉴定纯化抗原，本发明用纯化抗原免疫小鼠制备获得了相应的抗血清，通过不同的免疫学实验表明，用纯化抗原免疫小鼠获得的抗血清与单抗COC166-9有同样的免疫反应特性；而从与COC166-9反应阳性的卵巢癌细胞Caov-3中克隆的人免疫球蛋白gamma-1样重链的恒定区，其原核或真核表达产物也均能被COC166-9所识别。这些结果充分表明，单抗COC166-9的对应抗原为人免疫球蛋白gamma-1重链样蛋白(IGHG1)。

本发明中，还用单抗COC166-9对111例具有五年以上随访资料的卵巢癌标本进行了免疫组化检测及统计分析，结果表明，卵巢癌组织的CA166-9表达阳性率为53.1％，并与肿瘤复发具有显著的相关性(P<0.001)；Kaplan-Meier单因素结果显示，CA166-9表达阳性患者的总生存期和无病生存期均显著低于表达阴性患者(P＝0.026；P＝0.002)；Cox多因素分析显示，CA166-9可作为影响卵巢癌患者总生存率(HR＝2.145，P＝0.027)和无病生存率(HR＝2.383，P＝0.013)的潜在独立预后指标。从而，本发明提供了CA166-9作为影响卵巢癌患者总生存率和无病生存率的预后指标中的应用，也提供了针对检测CA166-9在卵巢癌组织中的表达的试剂在制备用于卵巢癌病人预后判断的检测剂中的应用。

本发明中，还研究了CA166-9对卵巢癌细胞系表型的影响，结果表明单抗COC166-9能抑制抗原表达阳性卵巢癌细胞Caov-3的体外增殖、迁移和侵袭能力，而对抗原表达阴性的卵巢癌细胞HOC1A和人内皮细胞HMEC的增殖、迁移和侵袭能力无明显作用。外源性表达纯化的抗原能促进抗原表达阴性卵巢癌细胞HOC1A在体外的增殖、迁移和侵袭的能力；而对抗原表达阳性的卵巢癌细胞Caov-3和表达阴性的人内皮细胞HMEC的相关表型无明显影响。从而，本发明还提供了CA166-9在制备促进肿瘤细胞的增殖和/或迁移侵袭的制剂中的应用，也提供了拮抗CA166-9的拮抗剂(例如抗体)在制备抑制肿瘤细胞生长和/或迁移侵袭能力的制剂中的应用。本发明的抗原可作为疫苗用于卵巢癌的防治。从而，本发明还提供了所述CA166-9蛋白或其免疫性片段在制备卵巢癌治疗性蛋白疫苗制剂中的应用。本发明还提供了编码所述CA166-9蛋白的核苷酸序列在制备卵巢癌治疗性核酸疫苗制剂中的应用。

附图说明

图1：抗原的亲和层析分离纯化峰图。其中，图片A为腹水抗原洗脱液OD₂₈₀峰图，图片B为Caov-3细胞总蛋白抗原洗脱液OD₂₈₀峰图。

图2：Western Blot鉴定单克隆抗体COC166-9与纯化抗原的反应结果。其中，图片A：1为抗原蛋白溶液上样，正常小鼠IgG为一抗，HP标记的羊抗鼠IgG为二抗；2为抗原蛋白溶液上样，单抗COC166-9为一抗，HP标记的羊抗鼠IgG为二抗；3为抗原蛋白溶液上样，BSA蛋白为一抗，HP标记的羊抗人IgG为二抗。图片B：1为Caov-3细胞总蛋白纯化抗原1μg上样，单抗COC166-9为一抗，HP标记的羊抗鼠IgG为二抗；2为卵巢癌腹水纯化抗原1μg上样，单抗COC166-9为一抗，HP标记的羊抗鼠IgG为二抗。a、b、c、d、e为与单抗COC166-9特异反应条带。

图3：亲和层析纯化抗原的考马斯亮蓝染色结果。其中，图片A为Caov-3细胞总蛋白纯化抗原，图片B为卵巢癌腹水纯化抗原。a、b、c、d、e为与单抗COC166-9特异反应条带。

图4：纯化抗原指纹图谱的分析结果。其中，图片A：卵巢癌腹水纯化抗原质谱峰图；图片B：IGHG1蛋白的吻合肽谱图，红色的序列即为吻合肽。

图5：纯化抗原和人IgG的ELISA竞争抑制实验结果。结果显示，0.5μg/ml纯化抗原或0.5μg/ml人IgG可有效抑制单抗COC166-9与包被卵巢癌腹水蛋白的结合，而小鼠IgG无抑制作用。

图6：纯化抗原和人IgG的免疫组化竞争抑制实验结果。结果显示，1μg/ml纯化抗原或1μg/ml人IgG可有效抑制单抗COC166-9与卵巢癌组织的结合，而小鼠IgG无抑制作用。

图7：用Protein A直接进行免疫沉淀鉴定单抗COC166-9抗原的结果。其中，a1：经ProteinA吸附后的纯化抗原蛋白溶液，b1：纯化抗原与Protein A的结合蛋白；a2：经Protein A吸附后的正常人IgG蛋白溶液，b2：正常人IgG与Protein A的结合蛋白。

图8：免疫小鼠多抗血清的ELISA检测结果。

图9：免疫小鼠多抗血清的免疫组化和免疫细胞化学检测结果。其中，图片A：免疫小鼠多抗血清的免疫组化检测；图片B：免疫小鼠多抗血清的免疫细胞化学检测。

图10：2个不同克隆的IGHG1样蛋白的cDNA比对。

图11：pGEX-4T-1-IGHG1重组质粒的构建及其表达产物与单抗COC166-9的反应检测结果。其中，图片A：1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物：M为DNA marker；1-6为PCR扩增产物，扩增出约600bp目的片段；图片B：pGEX-4T-1-IGHG1重组质粒的酶切鉴定：M为DNAmarker，1-5为不同克隆，用BamHI/XholI双酶切，释放约600bp目的片段；图片C：原核表达IGHG1蛋白的诱导表达，1-3为诱导表达全菌，其IPTG诱导浓度分别为0.25,0.5,1μM，4为未诱导全菌，如箭头所示在55KD处有诱导蛋白表达；图片D：原核表达IGHG1蛋白的抗体检测，1-3为诱导表达全菌，其IPTG诱导浓度分别为0.25,0.5,1μM，4为未诱导全菌，行WesternBlot，上图为COC166-9为一抗，下图为阴性对照正鼠IgG为一抗。单抗COC166-9在诱导表达全菌蛋白55KD处检测到一条特异性条带。

图12：pcDNA3-myc-IGHG1重组质粒的构建及其表达产物与单抗COC166-9的反应检测结果。其中，图片A：pcDNA3-myc-IGHG1重组质粒的酶切鉴定：M为DNA marker，1为重组质粒经BamHI/XholI双酶切，释放约600bp片段；图片B：真核表达IGHG1蛋白与单抗COC166-9的反应检测。1为野生型卵巢癌细胞3AO总蛋白，2为转染了空载pcDNA3-myc的3AO细胞总蛋白，3为转染了质粒pcDNA3-myc-IGHG1的3AO细胞总蛋白，单抗COC166-9在3号泳道27KD处检测到特异性条带。

图13：免疫组化检测CA166-9在卵巢癌中的表达。其中，图片A为卵巢浆液性乳头状囊腺癌，100×；图片B为正鼠IgG对照；图片C为浆液性腺癌200×；图片D为透明细胞癌；图片E为良性卵巢癌肿瘤。

图14：Kaplan-Meier单因素分析CA166-9表达与生存期(OS/DFS)的关系。其中，图片A：CA166-9与DFS的Kaplan-Meier曲线，图片B：CA166-9与OS的Kaplan-Meier曲线。

图15：MTT检测COC166-9对人卵巢癌细胞及人内皮细胞增殖的影响结果。其中，mIgG为正常小鼠IgG阴性对照，COC166-9抗体浓度为10μg/mL。COC166-9能有效抑制Caov-3(P<0.01)和SKOV-3(P<0.05)的体外增殖能力，对3AO、HOC1A和HMEC的增殖无影响。

图16：MTT检测抗原IGHG1(即CA166-9)对人卵巢癌细胞及人内皮细胞增殖的影响结果。其中，hIgG为正常人IgG对照，IGHG1为纯化抗原，浓度为10μg/mL。抗原IGHG1能有效促进3AO(P<0.05)和HOC1A(P<0.05)细胞的体外增殖能力，而对Caov-3、SKOV-3和HMEC的增值无影响。

图17：单抗COC166-9对人卵巢癌细胞及人内皮细胞体外迁移能力的影响结果。其中，左图片为细胞迁移能力示意图，右图片为加入COC166-9后对细胞迁移能力影响的量化图(*：P<0.01)。mIgG为正常小鼠IgG阴性对照，COC166-9抗体浓度为10μg/mL。

图18：纯化抗原对卵巢癌细胞及人内皮细胞体外迁移能力的影响结果。其中，左图片为细胞迁移能力示意图，右图片为加入纯化抗原后对细胞迁移能力影响的量化图(*：P<0.01)。hIgG为正常人IgG对照，IGHG1为纯化抗原(即CA166-9)，浓度为10μg/mL。

图19：单抗COC166-9对人卵巢癌细胞及人内皮细胞体外侵袭能力的影响结果。其中，左图片为细胞侵袭能力示意图，右图片为加入COC166-9后对细胞侵袭能力影响的量化图(*：P<0.01)。mIgG为正常小鼠IgG阴性对照，COC166-9抗体浓度为10μg/mL。

图20：抗原IGHG1(即CA166-9)对人卵巢癌细胞及人内皮细胞体外侵袭能力的影响结果。其中，左图片为细胞侵袭能力示意图，右图片为加入纯化抗原后对细胞侵袭能力影响的量化图(*：P<0.01)。hIgG为正常人IgG对照，IGHG1为纯化抗原，浓度为10μg/mL。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明的实质，下面通过具体实施例并配合附图进一步详细说明本发明，但本发明并不因此而受到任何限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：CA166-9的分离纯化及其鉴定

本实施例中，综合运用亲和层析、MALDI-TOF-MS质谱分析、不同的免疫竞争抑制实验、抗原克隆和表达产物的鉴定分析等方法，对CA166-9进行了纯化、分析、鉴定和多角度的验证。

实验材料：

谷胱甘肽巯基转移酶(GST)原核表达载体pGEX-4T-1，真核表达质粒pcDNA3-myc和大肠杆菌菌株BL21均由北京大学临床肿瘤学院生化与分子生物学实验室保存。

Trizol为Invitrogen产品；分子克隆所用的各种DNA限制性内切酶，Taq DNA聚合酶为New England Biolab Co.产品；pGEM-T Easy试剂盒为Promega公司产品；凝胶DNA纯化试剂盒QIAquick为Qiagen产品，质粒提取试剂盒(Plasmid Maxprep kit)为Vigorous产品；RNA酶、酚试剂购自华美生物技术公司；ΜLtrapure dNTP set为Pharmacia Biotech公司产品。其它常用试剂与耗材由北京大学临床肿瘤学院供应室提供。

人卵巢癌细胞系SKOV-3、Caov-3、3AO由北京大学人民医院妇科肿瘤中心保存提供。人卵巢癌细胞系HOC1A为北京大学人民医院妇科肿瘤中心建立的人永生化卵巢癌细胞系。6、24、96孔板和培养皿为Greiner Bio-one公司产品。5周龄雌性Balb/c小鼠及昆明鼠购自维通利华实验动物中心，由北京大学临床肿瘤学院动物室饲养(SPF级)。

Protein A-Sepharose、CNBr-Sepharose-4B和ECL试剂盒为Amersham产品；正辛酸、乙醇胺、硫酸铵和叠氮钠购自华美生物技术公司；Lipofectamin 2000为Invitrogen公司产品；3G漏斗购自上海乐远实验仪器有限公司；HP标记的组化检测试剂盒(ENVISION^TM+System HP Mouse)购自DAKO公司；人卵巢癌患者腹水样本以及单克隆抗体COC166-9腹水由北京大学人民医院妇科肿瘤中心提供。

完全弗氏佐剂(Complete Freund’s Adjuvant)、不完全弗氏佐剂(IncompleteFreund’s Adjuvant)为Sigma公司产品；抗人IgG抗体，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(HP-羊抗鼠IgG)，辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG(HP-羊抗人IgG)购自中杉生物公司；抗体亚类试剂盒购自Sigma公司。

细胞裂解缓冲液(RIPA)：50mmol/L Tris-Cl(pH 7.5)，150mmol/L NaCl，1％Nonidet P-40(NP-40)，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，临用前加入蛋白酶抑制剂混合物。

蛋白酶抑制剂混合物：购自Merck公司；抑肽酶(Aprotinin)：1mg/mL溶于PBS，500倍稀释使用；抑亮肽素(Leupeptin)：5mg溶于1.054mL水即10mM，-20℃保存，100倍稀释使用；抑胃肽素(Pepstatin)：1mg溶于1.553mL50％醋酸，终浓度为1mM，-20℃保存，1000倍稀释使用。

细胞培养液：RPIM1640、DMEM、胎牛血清为Gibco公司产品；

细胞消化液：

A.0.02％EDTA：称取0.02g EDTA溶于100mL PBS中，高压灭菌，4℃存放。

B.4％Typsin：称取4g Typsin溶于100mL 100。

C.PBS配成4％储存液，0.22μm滤器过滤除菌，-20℃保存。使用前用0.02％EDTA将Typsin稀释为0.04％，4℃保存。Typsin为Sigma公司产品。

亲和层析试剂：

酸性洗脱缓冲液：100mmol/L Glycin-HCl(pH 2.8)

A液：0.2mol/L Glycin：3.25g溶于250mL去离子水中

B液：0.2mol/L HCl：100mL

A液250mL+B液30mL左右，并调pH至2.8。

中和缓冲液：2M的Tris-base，pH12.0，每100μL中和缓冲液可以中和洗脱buffer1mL到pH 7.0。醋酸缓冲液：0.06M的醋酸，pH4.0。

抗体交联液：0.1M NaHCO₃，0.5M NaCl，pH8.3，21g NaHCO₃加73.05g NaCl定容至2500mL。

主要仪器和设备：

Smartspect 3000紫外分光光度计：Bio-Rad；蛋白转膜装置：2051Midget；蛋白电泳装置：Bio-Rad；凝胶成像系统：Gene Genius；CO₂培养箱：Hereus instruments；TZ-2AG台式往返旋转震荡器：北京沃德电子实验设备厂；96孔板酶标仪：Model 550Microplatereader Bio-Rad Co.；Model 3000X电泳仪：Bio-Rad Co.Model200/20；电泳电源EPS 3500：Pharmacia Biotech；电泳仪：Bio-Rad Co；转移电泳仪：2051MDGE1MμLtiBlot LKBrommaCo.；细菌电转化仪：BIO-RAD；PCR仪：PTC-200Peltier Thermal Cycler；MALDI-TOF MS：Autoflex；Bruker,Karlsruhe。

(一)单克隆抗体COC166-9对应抗原(CA166-9)的分离纯化及检测

1.单克隆抗体COC166-9亲和层析柱的制备

使用正辛酸-饱和硫酸铵沉淀分步法对单克隆抗体COC166-9腹水进行纯化，并验证其特异性，作为亲和层析纯化抗原的腹水来源。COC166-9单抗6mg(约5ml)对交联透析液过夜(此间换液一次)，取出测OD₂₈₀nm。称取0.7g CNBr-Sepherose 4B，用新鲜配置的1mMHCl室温浸泡15min，用3G漏斗负压吸引，洗完吸干后迅速加入经透析的抗体。混合透析过的COC166-9单抗与CNBr-Sepherose 4B，在摇床上室温作用2h。1000rpm，离心2-3min，再用交联液洗一次，加入10ml 1M乙醇胺(pH8.0)，摇床上室温反应2h。抗原封闭：5％脱脂奶粉(PBS配制)封闭室温2h。离心，弃上清，用Tris-HCl缓冲液及醋酸缓冲液轮流洗(至少5倍胶体积)3遍(每次保留部分洗液测OD₂₈₀nm)。再用0.01M，pH7.2的PBS洗两次，测定最后1次洗涤液的OD₂₈₀nm，悬于2倍胶体积的PBS中，加入NaN₃至终浓度为0.1g/L，保存于4℃备用。

2.CA166-9的分离纯化

应用以上制备的交联了单克隆抗体COC166-9亲和层析柱对卵巢癌腹水蛋白中的抗原和Caov-3细胞总蛋白中的抗原进行分离纯化。具体操作如下：

卵巢癌腹水中抗原的分离纯化：卵巢癌腹水经12000g离心后，避开油脂吸取上清，以预冷的PBS稀释5倍，通过0.45μm滤器过滤。将稀释的腹水加入亲和层析柱中4℃反应过夜。经PBS洗去杂蛋白后，以pH2.6的酸性洗脱液进行洗脱，以每1mL为一单位进行收集并测OD₂₈₀nm，收取OD₂₈₀>0.2的组分，最后每毫升中加入100μL 2M Tris-base中和液进行中和以保持抗原蛋白稳定，于PBS中4℃透析过夜。将纯化的抗原分装冻存于-70℃，部分-20℃保存。

卵巢癌细胞总蛋白中抗原的分离纯化：提取细胞总蛋白，以预冷的PBS稀释5倍，通过0.45μm滤器过滤。应用以上制备的交联了单克隆抗体COC166-9亲和层析柱进行抗原的分离纯化，纯化方法同上。将纯化的抗原分装冻存于-70℃，部分-20℃保存。

腹水抗原洗脱液OD₂₈₀峰图及Caov-3细胞总蛋白抗原洗脱液OD₂₈₀峰图分别参见图1中的A和B。最终收集腹水抗原约18mL，紫外分光光度计测其蛋白浓度为1.5μg/μL；Caov-3细胞总蛋白来源抗原约17mL，紫外分光光度计测其蛋白浓度约为0.5μg/μL。

3.Wesstern Blotting检测亲和层析分离获得的抗原CA166-9

取卵巢癌腹水纯化抗原进行12％SDS-PAGE和Western Blotting鉴定，单抗COC166-9、正常小鼠IgG或BSA蛋白为一抗，HP标记的羊抗鼠IgG或羊抗人IgG为二抗。结果如图2中图片A所示，在加入正常小鼠IgG作为一抗、用HP标记的羊抗鼠IgG为二抗的第一泳道中未见任何反应条带，说明纯化的抗原中不存在从抗体柱上意外洗脱下来的单抗COC166-9，没有鼠抗体蛋白的污染；第二泳道中用COC166-9抗体对纯化抗原进行检测有多条反应条带，提示这些不同分子量蛋白有可能来自同一家族；在未加一抗而直接加入酶标羊抗人IgG的第三泳道中，也存在类似第二泳道的反应条带，提示纯化的抗原蛋白有可能是人IgG样蛋白。

取卵巢癌腹水纯化抗原与Caov-3细胞总蛋白纯化抗原行12％SDS-PAGE进行Western Blotting对比鉴定，用COC166-9为一抗，HP标记的羊抗鼠IgG为二抗，结果如图2中的图片B所示，在第2泳道的卵巢癌腹水纯化抗原中可检测到分子量分别为170KD，130KD，65KD，55KD和45KD的五条特异性结合蛋白(分别命名为a,b,c,d与e)，而在第1泳道的Caov-3细胞总蛋白纯化抗原中可见分子量分别为170KD，130KD和55KD三条特异性结合蛋白，与卵巢癌腹水纯化抗原中的a,b和d条带相对应。

(二)卵巢癌单抗COC166-9对应抗原的鉴定

1.卵巢癌单抗COC166-9对应抗原指纹图谱分析

取5μg卵巢癌腹水纯化抗原与Caov-3细胞总蛋白纯化抗原行12％的SDS-PAGE电泳，至溴酚蓝到达胶的最下缘时停止。行考马斯亮蓝染色。结果参见图3。在图2中与COC166-9特异性反应的五条蛋白相对应的条带如图3所示，纯化抗原条带a、b、c、d、e的分子量分别为170KD，130KD，65KD，55KD和45KD。

用一次性手术刀片将染色的能与抗体反应的a、b、c、d与e五条蛋白条带切下，放入Eppendorf管中，胰酶消化，使用α-cyano-4-hydroxycinnamic acid和ethanol/acetonitrile/0.1％trifluoroacetic acid(TFA)(6:3:1,v/v/v)溶解，分别进行MALDI-TOF MS测序，得到的蛋白指纹图谱如图4中的图片A。将获得的蛋白片段序列提交Mascotprotein search engine(Matrix Science,Boston,MA,USA)进行序列比较分析，结果表明(图4中的图片B)，获得的抗原为人免疫球蛋白gamma-1重链恒定区样蛋白(IGHG1)。

2.竞争ELISA鉴定卵巢癌单抗COC166-9对应抗原

上述Western Blot和蛋白质谱的分析等结果均提示，单抗COC166-9的对应抗原为人IgG样免疫球蛋白。为验证其可能性，分别用纯化抗原和人IgG与卵巢癌腹水蛋白进行竞争ELISA(以正常小鼠为对照)。用卵巢癌腹水蛋白5μg/mL铺96孔板(50μL/孔)。分别将不同浓度的亲和层析纯化抗原(0.2、0.5、1μg/mL)、正鼠IgG及正常人IgG蛋白与单抗COC166-9(1μg/mL)于室温孵育4h，然后将该混合液作为一抗加入96孔板，50μL/孔，检测单抗COC166-9与包被卵巢癌腹水蛋白的反应性。

结果如图5所示：纯化抗原与正常人IgG蛋白均可竞争抑制单抗COC166-9与包被抗原的结合，而且呈现明显的量效关系，表明纯化抗原蛋白与人IgG蛋白与COC166-9的反应性相同，COC166-9的对应抗原为人IgG样蛋白。

3.竞争免疫组化鉴定卵巢癌单抗COC166-9对应抗原

在上述竞争ELISA实验中，纯化抗原或正常人IgG蛋白均可竞争抑制单抗COC166-9与包被抗原的结合。为进一步验证该结果，进行了竞争免疫组化。取连续切片的卵巢癌阳性组织石蜡切片若干张，先将等浓度的纯化抗原、正鼠IgG和正常人IgG蛋白分别与单抗COC166-9(1μg/mL)于室温孵育4h后，然后以该单抗COC166-9混合液作为一抗常规检测其与卵巢癌组织的反应性。结果参见图6，与竞争ELISA相似，纯化抗原与正常人IgG蛋白均可竞争抑制单抗COC166-9与卵巢癌组织细胞的反应，进一步表明纯化抗原蛋白与人IgG蛋白与COC166-9的反应性相同，COC166-9的对应抗原为人IgG样蛋白。

4.免疫沉淀(IP)鉴定卵巢癌单抗COC166-9对应抗原

用免疫沉淀的方法来进一步鉴定所得抗原是否与Ig类蛋白的重链恒定区同源。将1μL卵巢癌腹水用PBS稀释至1mL，加入20μL Protein A-Sepharose珠子，4℃吸附4h，1500g离心2min分离上清和沉淀珠子。用pH2.8的酸性洗脱液洗脱珠子上的结合蛋白，每毫升中加入100μL 2M Tris-base中和液进行中和，得Protein A珠结合蛋白溶液。以原始等量的卵巢癌腹水稀释液，Protein A珠结合蛋白溶液和离心上清，用包被液稀释并铺96孔板，以单抗COC166-9(2μg/mL)为一抗进行ELISA检测。

结果参见图7，结果显示，不管是用纯化抗原蛋白或正常人IgG蛋白直接包被，还是用Protein A-Sepharose珠子与这些蛋白结合后的洗脱液包被，都可以与单抗COC166-9发生反应(图7中的b1、b2)；而用经Protein A吸附后的纯化抗原蛋白或经Protein A吸附后的正常人IgG蛋白溶液包被，其包被物几乎不被COC166-9识别(图7中的a1、a2)，再次说明COC166-9的对应抗原为人IgG样蛋白。

5.小鼠抗CA166-9血清的制备和免疫活性鉴定

(1).小鼠抗CA166-9血清的制备

抗原：亲和层析纯化抗原IGHG1，免疫时抗原量为50μg/只/次，背部皮下多点注射，每只总体积为200μL。动物：6～8周龄雌性Balb/c小鼠，体重20g/只。

免疫方法：初次免疫前，取Balb/c小鼠的尾静脉血2μL作为阴性对照；初次免疫时将纯化的抗原蛋白和等量的完全弗氏佐剂充分混匀直至取一小滴在水中不扩散，背部皮下多点免疫Balb/c小鼠；四周后，进行第一次加强免疫，将纯化的抗原蛋白和等量的不完全弗氏佐剂混匀乳化，同样背部皮下多点免疫；7-14天后，取小鼠尾静脉血通过ELISA方法检测抗体效价。

(2).酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗血清活性

卵巢癌腹水蛋白用包被液稀释至5μg/mL，包被96孔板，50μL/孔，4℃过夜。0.05％Tween20/PBS洗两遍。4％的脱脂奶粉(PBS配制)200μL/孔，室温2h或4℃过夜，0.05％Tween20/PBS洗两遍，-70℃保存备用。检测步骤如下：取小鼠多抗血清稀释液(1:5000)，50μL/孔，室温1h。0.05％Tween-20/PBS洗5遍。加HP标记的羊抗鼠IgG(1：3000)，50μL/孔，室温45min。0.05％Tween-20/PBS洗5遍。加入OPD底物反应液，100μL/孔，避光显色。显色充分后加终止液50μL/孔，观察结果并用酶标仪检测OD₄₉₂nm。

结果见图8，其中pAb#1和pAb#2分别为从两只用纯化抗原免疫小鼠后获得的多抗血清，单抗COC166-9为阳性对照，mIgG为免疫前小鼠IgG作为阴性对照。结果显示，用纯化抗原免疫小鼠获得的鼠多抗血清与单抗COC166-9一样，均与卵巢癌腹水蛋白有较强的结合反应。

(3).免疫组化和细胞化学鉴定用纯化抗原免疫小鼠后获得的多抗血清的反应特异性

分别通过免疫组化及免疫细胞学方法对用纯化抗原免疫小鼠后获得的抗血清(前述pAb#2)的反应特异性进行进一步的鉴定，结果参见图9，其中，pAb为纯化抗原免疫小鼠后获得的多抗血清，COC166-9为单抗阳性对照，mIgG为免疫前小鼠IgG作为阴性对照。结果表明，获得的小鼠抗血清与卵巢癌组织(图9中的图片A)和卵巢癌细胞Caov-3(图9中的图片B)的反应特异性及染色定位与单抗COC166-9相似，阳性反应颗粒呈棕黄色弥散分布于胞浆，表明获得的抗原确实为单抗COC166-9的对应抗原。

6.GST-IGHG1重组蛋白载体的构建、表达及鉴定

(1).引物设计与合成

根据人免疫球蛋白gamma-1重链恒定区的cDNA序列，本发明通过RT-PCR及对PCR产物的克隆测序，图10显示其中2个不同克隆的IGHG1样蛋白的cDNA比对，部分核苷酸不一致，但从读码框架看，上面的序列读得长，能够通读的cDNA片段为597bp(序列全长参见SEQ IDNo.1，编码核苷酸为SEQ ID No.1的第1-597位)，编码199个氨基酸(SEQ ID No.2)。经过氨基酸序列比对，其与人免疫球蛋白gamma-1重链恒定区部分序列有较高同源性。故依据该序列设计引物，进行GST融合表达蛋白的表达，并用该表达产物进行了相关的生物学活性实验。

根据cDNA的编码序列，本发明设计了相应的PCR扩增引物，并于引物两端分别引入BamHI和XholI的酶切位点；正义引物为：5’-CGC GGA TCC ATG GCC TCC ACC AAG GGC C-3’(SEQ ID No.3)，反义引物为：5’-AAT CTC GAG TTA GGT CAG GGG CA G GGT CCT C-3’(SEQID No.4)，划线处为限制性内切酶酶切位点，由上海生工生物公司合成。

(2).细胞总RNA的提取和逆转录

按TRIZOL试剂说明书提取Caov-3细胞的总RNA。稀释样品使各样本的RNA浓度大致相等，按照试剂盒的说明书(Imprim-Ⅱ^TM，Promega)进行RNA的逆转录。

(3).PCR扩增IGHG1样蛋白的cDNA

将1OD IGHG1上下游引物分别使用TE 33μL配成1μg/μL的储液，37℃溶解，上下游引物各取1μL混匀稀释到10μL中，取1μL进行PCR反应，体系如下：cDNA 1μL，2.5mM dNTPs2μL，引物混合液(25μM)1μL，10×PCR buffer(含25mM MgCl₂)2.5μL，Taq聚合酶1μL，ddH₂O17.5μL，总计25μL。

在PCR仪上进行扩增反应：94℃初始变性4min；94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸90s，重复该循环3个，94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸90s，重复该循环24个，然后72℃延伸10min，最后温度缓慢降至室温，取扩增产物5μL，加入上样buffer，行1.0％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定(参见图11中的图片A，PCR扩增得到大小约600左右的特异片段)。

(4).构建原核表达载体pGEX-4T-1-IGHG1

(4-1).胶回收PCR扩增产物：目的基因片段IGHG1

PCR产物行1.0％琼脂糖胶，紫外灯下观察结果，并用一次性手术刀片将目的基因IGHG1切下，放入Eppendorf管中，用QIAGEN试剂盒回收目的基因，回收过程如下：

1)0.1g胶加300μL Solution Buffer，50℃水浴10min，经常晃动，使胶溶解。2)将胶溶液转移到纯化柱子中，12000g室温离心1min。3)加Washing Buffer 0.7mL，12000g室温离心1min。4)重复3)操作。5)12000g室温离心1min。6)取不少于25μL TE洗脱DNA，12000g室温离心1min。7)取1μL行1.2％琼脂糖胶定量。

(4-2).目的基因片段IGHG1和pGEX-4T-1载体片段的酶切与回收

将回收的IGHG1目的片段和原核载体pGEX-4T-1分别用BamHI和XholI双酶切，体系如下：IGHG1(或pGEX-4T-1)1μg，10×Buffer5μL，BamHI/XholI各2μL，BSA0.5μL，dd H₂O适量，总计50μL。

37℃水浴4h，将上述两种酶切产物同时用QIAGEN试剂盒回收。回收后产物各取1μL行1.0％琼脂糖胶定量。

(4-3).连接目的基因片段和载体

取回收后目的基因片段IGHG1和pGEX-4T-1载体用T4DNA连接酶进行连接，并设阴性对照，4℃连接过夜，体系为：目的基因片段2μL，pGEX-4T-1 1μL，10×连接Buffer 1μL，T4DNA连接酶1μL，dd H₂O 5μL，总计10μL。

每次连接时载体和目的片段用量分子比例为4:1。

(4-4).制备BL21的CaCl₂感受态细菌

取-70℃冻存的BL21菌种划线接种于不含抗生素的琼脂平板上。37℃，倒置培养12～16h。从平板中挑取单克隆菌落，至3mL LB中，225rpm，37℃振荡过夜。将3mL培养过夜的细菌稀释至300mL，继续培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8。离心(4℃，7000g，10min)，弃上清，尽量弃尽管内液体。加300mL预冷的0.1M CaCl₂吹打均匀，冰上静置30min。离心(4℃，4000g，10min)，沉淀用1/2体积预冷的CaCl₂吹打均匀。冰上静置30min，离心(4℃，4000g，10min)。沉淀用1/100体积含15％甘油的预冷0.1M CaCl₂悬浮，冰上静置40min。无菌条件下分装100μL/管，4℃过夜后使用或-70℃冻存。

(4-5).连接产物的转化

取pGEX-4T-1-IGHG1的连接产物5μL，加入到50μL的CaCl₂感受态细胞中，轻柔混匀，置冰上30min；之后置于42℃温水中休克90s，快速放置冰上2min，再加入500μL不含抗生素的LB培养液，吹打均匀，37℃，225rpm，培养40min，让转化的质粒抗性得以表达；涂于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃，倒置培养12～16h。

(4-6).质粒DNA的小量提取(碱裂解法)

从LB平板挑取几个单克隆置于2mL含氨苄(50μg/mL)的LB培养基中。37℃，225rpm，过夜培养，离心(12000g，1min)收集菌体。弃上清，沉淀加入Solution A 100μL，充分混匀。加入Solution B 200μL，缓慢颠倒混匀5次，冰上裂解3min。加入Solution C150μL，颠倒温和混匀，冰上3～5min进行中和。离心，12000g，4℃，10min取上清。加等体积Tris饱和酚：氯仿(1：1)，混匀；离心，12000g，4℃，10min。取上层水相，加入等体积氯仿混匀，离心，12000g，4℃，5min。取上层水相，加1mL无水乙醇，混匀，室温10min。离心，12000g，4℃，10min(沉淀质粒DNA)。弃上清，加入预冷70％乙醇1mL，离心，12000g，4℃，10min。吸弃上清，室温吹干。加20μL TE(含有RNase A 0.1mg/mL)37℃溶解10min，-20℃保存。

(4-7).质粒双酶切鉴定

将克隆质粒进行酶切鉴定，以确定阳性克隆：质粒DNA0.5μg，10×Buffer1.5μL，BamHI/XholI各0.5μL，BSA0.15μL，dd H₂O适量，总计15μL。

置37℃水浴2h，加入3μL上样buffer行1.0％的琼脂糖胶鉴定。

结果参见图11中的图片B，显示酶切后能释放预期大小的DNA的片段，送测序，证明序列完全正确。

(5).GST-IGHG1的小量诱导表达

挑取单个克隆，置于2mL LB培养液中，37℃摇菌过夜，次日取200μL稀释至2mL，继续培养到波长为600nm的光密度值OD₆₀₀为1.0时，取1mL不加诱导剂做阴性对照，余1mL菌液加入IPTG至终浓度为0.2mM，27℃诱导3h。将诱导菌液与未诱导菌液，6000g离心5min，沉淀加入PBS 200μL，溶菌酶至终浓度0.5mg/mL，PMSF至终浓度1mM，室温裂解20min，加入10％Triton/PBS稀释至1％Triton/PBS，混匀，冰上静置30min，冰上间歇超声裂解，18KHz，超声30s，停30s，反复4次。然后12000g 4℃离心20min，分别将上清与沉淀加入上样缓冲液，煮沸后进行SDS-PAGE电泳，电压100v，2h，染色考马斯亮兰染液染45～60min，脱色液脱色30min，观察融合蛋白的表达情况。

原核表达载体pGEX-4T-1-IGHG1中具有乳糖操纵子，在大肠杆菌BL21中，加入IPTG，可以诱导表达IGHG1融合蛋白；通过先对pGEX-4T-1-IGHG1进行小量诱导表达，用12％SDS-PAGE对表达产物进行分析，可见经IPTG诱导后在菌体上清中出现融合蛋白条带(图11中的图片C)，诱导表达后阳性条带位置与预期分子量位置相符，而未经IPTG诱导的细菌总蛋白在此位置无蛋白条带出现。

将诱导融合蛋白GST-IGHG1行12％SDS-PAGE进行Western Blotting鉴定，单抗COC166-9(1μg/mL)为一抗、正常小鼠IgG(1μg/mL)为阴性对照，HP标记的羊抗鼠IgG为二抗。结果显示：融合蛋白GST-IGHG1可以与单抗COC166-9发生反应，可在分子量为55KD处检测到一条特异性条带(图11中的图片D)。

7.真核表达质粒pcDNA3-myc-IGHG1的构建及表达产物与COC166-9的反应检测

(1).目的基因片段IGHG1和pcDNA3-myc载体片段的酶切与回收

将回收的IGHG1目的片段和真核表达载体pcDNA3-myc分别用BamHI和XholI双酶切，体系如下：IGHG1(或pcDNA3)1μg，10×Buffer 5μL，BamHI/XholI各2μL，BSA 0.5μL，ddH₂O适量，总计50μL。

37℃水浴4h，将上述两种酶切产物同时用QIAGEN试剂盒回收。回收后产物各取1μL行1.0％琼脂糖胶定量。

(2).连接目的基因片段和载体

取回收后目的基因片段IGHG1和pcDNA3-myc载体用T4DNA连接酶进行连接，并设阴性对照，4℃连接过夜，体系为：目的基因片段2μL，pcDNA3-myc 1μL，10×连接Buffer 1μL，T4DNA连接酶1μL，dd H₂O 5μL，总计10μL。

(3).连接产物的转化

取pcDNA3-myc-IGHG1的连接产物5μL，加入到50μL的CaCl₂感受态细胞中，轻柔混匀，置冰上30min；之后置于42℃温水中休克90s，快速放置冰上2min，再加入500μL不含抗生素的LB培养液，吹打均匀，37℃，225rpm，培养40min，让转化的质粒抗性得以表达；涂于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃，倒置培养12～16h。

(4).质粒DNA的小量提取

碱裂解法提取质粒DNA。

(5).质粒双酶切鉴定

将克隆质粒进行酶切鉴定，以确定阳性克隆：质粒DNA 0.5μg，10×Buffer 1.5μL，BamHI/XholI各0.5μL，BSA 0.15μL，dd H₂O适量，总计15μL。置37℃水浴2h，加入3μL上样buffer行1.0％的琼脂糖胶鉴定。结果显示，酶切后能释放预期大小的片段(图12中的图片A)，送测序，证明序列完全正确。

(6).pcDNA3-myc-IGHG1质粒的大量提取

使用威格拉斯生物技术有限公司质粒大量提取纯化试剂盒，对pcDNA3-myc-IGHG1质粒进行大量提取。

(7).pcDNA3-myc-IGHG1质粒的纯化

使用威格拉斯生物技术有限公司的质粒大量提取纯化试剂盒，对pcDNA3-myc-IGHG1质粒进行纯化。

(8).Western Blot检测

瞬时转染：接种3.0×10⁵3AO细胞于35mm培养皿，培养液中不含抗生素，24h后按照Lipofectamine 2000说明书进行转染，稀释要转染的pcDNA3-myc-IGHG14μg到250μL无血清RPIM1640培养液中，同时稀释Lipofectamine 200010μL到250μL无血清RPIM1640培养液中，5min内将上述质粒和转染液混合，室温放置20min，补加RPIM1640到1mL，加入到弃去培养液的六孔板细胞中，继续培养6h后，将转染液弃去，原孔补上含有10％血清的RPIM 1640，继续培养48h后，收集以上细胞总蛋白行12％SDS-PAGE进行Western Blotting鉴定，单抗COC166-9、正常小鼠IgG为一抗。结果见图12中图片B。结果显示，单抗COC166-9可在转染pcDNA3-myc-IGHG1的细胞总蛋白中检测到一条分子量大小约27KD的特异蛋白条带，而在转染了空载pcDNA3-myc的细胞总蛋白和野生3AO细胞总蛋白中无特异条带与之结合。

实施例2：CA166-9在卵巢癌组织中的表达检测

本实施例中，首先选择了有完整临床病理和随访5年以上资料的111例原发卵巢癌患者的石蜡标本，用免疫组织化学方法检测了卵巢癌组织中CA166-9的表达水平，并分析了其与临床参数及预后的相关性。

组织标本：收集北京大学人民医院妇科肿瘤中心2001年1月至2005年12月间有完整临床和随访资料的原发卵巢癌患者的存档蜡块111个原发灶蜡块。肿瘤分期参照国际抗癌联盟(Union Internationale Contre Le Cancer，UICC)的TNM分期标准。组织标本的使用通过人民医院人民委员会的批准(该部分标本由人民医院妇科肿瘤中心提供)。

随访方式为门诊复查、信访和电话随访相结合；对上述病例进行了5年以上的随访，中位随访为61个月。无病生存期(Disease Free Survival，DFS)是指从手术之日至转移/复发或最后一次随访时间；总生存期(Overall Surivival，OS)是指从手术之日至死亡或最后一次随访时间。所有患者资料完整，并受到严格保密。

试剂及仪器：APES(3-Aminopropyl–Trie thoxysilane)、中性树胶、30％H₂O₂、抗人IgG抗体均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品；HRP标记的组化检测试剂盒(ENVISION^TMSystem HRP Mouse)购自DAKO公司；苏木精购自Sigma公司；其余生化试剂均购自北京化学公司，为国产分析纯。图像采集系统为Applied Imaging Corp产品。COC166-9单抗腹水由人民医院妇科肿瘤中心提供。

免疫组化流程：采用两步法对卵巢癌组织石蜡切片/组织芯片进行免疫组化染色，同时以正常鼠IgG为阴性对照，以前期实验中的阳性卵巢癌切片标本为阳性对照。

结果判定标准：由病理科两位医生根据如下的标准独立进行阳性判断：因为前期试验证实CA166-9主要在肿瘤细胞胞浆中表达，所以在判断着色时以胞浆着色为准：以无染色或染色细胞少于10％评分为阴性；以大于10％肿瘤细胞染色评分为阳性，着色较弱评分为1+；染色中等强度或高强度分别评分为2+。

数据统计：利用描述性分析对病人的病理资料进行初步分析，应用Pearson χ2检验比较CA166-9与多种临床指标的关系；采用Kaplan-Meier曲线估计总生存率(OverallSurvival)和无病生存率(Disease Free Survival)，以log rank检验对各种临床指标的单一因素对生存期的影响进行检验；运用Cox regression模型(后退法)进行多因素分析，判断预后影响因素的独立性及风险系数(Hazard Ratios，HR)95％的可信区间；整个过程中使用SPSS15.0软件进行统计分析，以双侧检验P<0.05认为有统计学意义。

(一)免疫组化检测CA166-9在卵巢癌中的表达

以单克隆抗体COC166-9为一抗，免疫组化二步法检测111例卵巢癌标本的中CA166-9的表达水平，如图13所示，CA166-9主要定位于肿瘤细胞的细胞浆，在53.1％(59/111)的卵巢癌组织中可检测到CA166-9的表达。

(二)CA166-9的表达与临床病理学参数的关系

根据111例卵巢癌患者的病理资料，将CA166-9的表达与各种临床病理学参数的关系进行Pearsonχ2检验，结果发现CA166-9的表达与患者年龄、肿瘤大小、TNM分期、肿瘤分型、CA125等因素均无相关性，但与肿瘤复发具有相关性(P<0.05)(表1)，CA166-9在复发阳性病例中的表达率(60.3％)高于复发阴性病例(36.4％)。CA166-9的表达与患者肿瘤大小有相关性趋势但未达到统计学意义(P＝0.057)。

表1 CA166-9的表达与卵巢癌患者各种病理参数之间的关系

(三)CA166-9的表达与卵巢癌患者的预后显著相关

根据随访资料及CA166-9的组化检测结果可见，111例患者5年总生存率(OS)和5年无病生存率(DFS)分别为46.8％(52/111)及25.2％(28/111)。应用Kaplan-Meier单因素分析，log rank检验分别探讨各种临床病理学参数及CA166-9的表达与本组病例OS和DFS的相关性，结果可见CA166-9的表达与卵巢癌患者的OS和DFS均相关，有显著的统计学意义。OS生存率为：51.1％vs 41.9％(P＝0.026)；DFS生存率为34.7％vs 24.2％(P＝0.002)；Kaplan-Meier曲线见图14。复发(P<0.001)、病理分期(P<0.001)也都与DFS和OS显著相关，而年龄、肿瘤大小、组织分型、CA125与DFS和OS均没有相关性(表2)。

表2单因素分析临床病理学参数及CA166-9与生存期(OS与DFS)的相关性

将单因素分析的所有因素纳入Cox比例风险模型进行多因素分析，结果显示CA166-9仍然是总生存率(OS)及无病生存率(DFS)的独立预后因素，风险系数分别为：HR＝2.454，95％CI：0.825-2.563，P＝0.016(OS)；HR＝2.331，95％CI：1.383-3.929，P＝0.021(DFS)。此外，肿瘤大小、复发和临床分期也是影响患者生存的独立预后指标，三者风险系数分别为1.284、7.808和2.026(OS)，1.740、7.137和2.886(DFS)，可见复发对卵巢癌患者总生存期的影响大于CA166-9表达对生存期的影响，它和一些其它未知因素共同作为卵巢癌的预后因素对卵巢癌病人的预后产生影响(表3)。

表3多因素分析临床病理学参数及CA166-9与生存率的相关性

实施例3：CA166-9对肿瘤细胞表型的影响

人乳腺内皮细胞HMEC由北京市肿瘤防治研究所生化室保存；人卵巢癌细胞系SKOV-3，Caov-3，3AO由北京大学人民医院妇科肿瘤中心保存提供。HOC1A为北京大学人民医院妇科肿瘤中心建立人永生化卵巢癌细胞系。Transwell Chamber购自Corning Co.，型号3422。Matrigel^TM(Lot：354234)购自BD Co.。

利用SPSS15.0软件进行统计学分析，组间差异利用方差分析，组内差异利用双侧t检验进行统计分析。

(一)细胞增殖实验

将细胞消化后铺96孔板，根据细胞的生长速度和体积大小选择合适的接种细胞数，一般每孔细胞数2000～5000个。细胞贴壁生长后，加入纯化抗原或单抗COC166-9使其终浓度为10μg/mL，正常人IgG或正常小鼠IgG作为阴性对照，继续培养。继续培养4h后，吸弃其培养孔中的培养基(不要搅动或吸弃细胞)，加入150μL DMSO，室温放置15min，并不时震荡(使甲瓒蓝充分溶解)，测其OD₄₉₂值，作生长曲线分析。

1单抗COC166-9能抑制抗原表达阳性卵巢癌细胞的增值能力

利用抗原表达阳性卵巢癌细胞SKOV-3、Caov-3和抗原阴性卵巢癌细胞3AO、HOC1A以及人内皮细胞HMEC进行增殖实验。

将生长状态良好的细胞消化后接种于96孔，每孔2500个细胞。细胞贴壁生长后，加入单抗COC166-9使其终浓度为10μg/mL，正常小鼠IgG作为阴性对照，继续培养。分别于24h、48h、72h、96h和120h时进行MTT分析。每个处理组设3个平行孔，实验重复2次。

实验结果表明，抗原阳性细胞SKOV-3、Caov-3在加入单抗COC166-9后，细胞生长均减慢，表明单抗COC166-9对IGHG1阳性细胞Caov-3(P<0.01)和SKOV3(P<0.05)生长具有抑制作用。而抗原阴性细胞3AO、HOC1A，以及人内皮细胞HMEC加入单抗COC166-9后与阴性对照组生长速度没有区别，表明单抗COC166-9对抗原阴性卵巢癌细胞3AO、HOC1A，以及人内皮细胞HMEC的增值作用没有影响(图15)。

2纯化抗原CA166-9能促进抗原表达阴性卵巢癌细胞的增值

同上，利用抗原阳性卵巢癌细胞SKOV-3、Caov-3和抗原阴性卵巢癌细胞3AO、HOC1A以及人内皮细胞HMEC进行增殖实验。

将生长状态良好的细胞消化后接种于96孔，每孔2500个细胞。细胞贴壁生长后，加入纯化抗原CA166-9使其终浓度10μg/mL，正常人IgG作为阴性对照，继续培养。分别于24h、48h、72h、96h和120h时进行MTT分析。每个处理组设3个平行孔，实验重复2次。结果表明，抗原阴性卵巢癌细胞3AO、HOC1A在加入纯化抗原CA166-9后，与正常人IgG组相比，细胞生长速度有所增加，表明加入纯化的抗原CA166-9对抗原阴性卵巢癌细胞3AO(P<0.05)、HOC1A(P<0.05)生长具有促进作用。而抗原阳性卵巢癌细胞SKOV-3、Caov-3以及人内皮细胞HMEC加入纯化抗原CA166-9后，与对照组生长速度没有区别，表明纯化抗原CA166-9对抗原阳性卵巢癌细胞SKOV-3、Caov-3以及人内皮细胞HMEC的增值作用没有影响(图16)。

(二)Transwell细胞迁徙实验

将3组细胞(1个空载，2个SNCG细胞系)，当细胞密度达到80％，且生长状态良好时，以无血清培养液洗涤细胞两次，消化待检测细胞，无血清培养基稀释并进行细胞记数，调整细胞浓度为1.5×10⁵/ml。取出37℃温育的Chamber，下室加入800μl含10％血清的培养液，上室加入150μl待测细胞悬液，加入纯化抗原IGHG1或单抗COC166-9使其终浓度为10μg/mL，正常人IgG或正常小鼠IgG作为阴性对照，于37℃，5％CO₂孵箱中继续培养36hr。弃去上室培养液，将小室轻轻取出，用湿棉签擦去小室内部膜表面未侵袭的细胞。甲醇室温固定30min。结晶紫染色30min，清水漂洗2次，室温干燥。滴一滴中性树胶，盖上盖玻片，封片保存。200倍显微镜视野下观察，随机取5个视野进行细胞记数。重复实验2次。

1单抗COC166-9能抑制抗原阳性卵巢癌细胞的迁移能力

利用抗原阳性卵巢癌细胞Caov-3，抗原阴性卵巢癌细胞HOC1A及人内皮细胞HMEC进行细胞体外迁移实验。

将Matrigel将生长状态良好的细胞消化后悬浮于无血清培养液中，垂直加入Chamber的上室内进行培养。在温箱培养1h后，加入单抗COC166-9使其终浓度为10μg/mL，正常小鼠IgG作为阴性对照，继续培养。24小时后固定染色，实验重复2次。实验结果显示，抗原阳性细胞Caov-3在加入单抗COC166-9以后，细胞体外迁移能力减弱(304±28.3vs 139±12.9,P<0.05)，表明单抗COC166-9对抗原阳性细胞Caov-3的体外迁移能力具有抑制作用。而抗原阴性细胞HOC1A(69±7.3vs 71±5.5)和人内皮细胞HMEC(114±2.3vs 103±4.6)在加入单抗COC166-9以后与阴性对照组的迁移能力没有区别，表明单抗COC166-9对抗原阴性卵巢癌细胞HOC1A和人内皮细胞HMEC的体外迁移能力没有影响(图17)。

2纯化抗原CA166-9能促进抗原阴性卵巢癌细胞的体外迁移

同上，利用抗原阳性卵巢癌细胞Caov-3，抗原阴性卵巢癌细胞HOC1A及人内皮细胞HMEC进行细胞体外迁移实验。

将生长状态良好的细胞消化后悬浮于无血清培养液中，垂直加入Chamber的上室内进行培养。在温箱培养1h后，加入纯化抗原使其终浓度为10μg/mL，正常人IgG作为组间对照，继续培养。24小时后固定染色，实验重复2次。实验结果如图18，抗原阴性卵巢癌细胞3AO、HOC1A在加入纯化抗原以后，细胞体外迁移能力有所增强，表明抗原对阴性卵巢癌细胞HOC1A(45±11.1vs 67±15.4,P<0.05)的体外迁移能力具有促进作用。而阳性卵巢癌细胞Caov-3(86±6.2vs 97±7.7)以及人内皮细胞HMEC(152±11.1vs 143±15.4)在加入纯化抗原以后与阴性对照组的迁移能力没有区别，表明纯化抗原对阳性卵巢癌细胞Caov-3以及人内皮细胞HMEC的体外迁移能力没有影响。

(三)Transwell细胞体外侵袭实验

将Matrigel在4℃过夜融化。用4℃预冷的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度1mg/mL，稀稀释过程在冰上操作。在Chamber的上室底部中央垂直加入100μL稀释过后的Matrigel，37℃温浴4-5h使其干燥成为胶状。后续步骤同迁移实验。

1单抗COC166-9能抑制抗原阳性卵巢癌细胞的侵袭能力

细胞与基底膜间的相互作用是调控细胞行为的重要因素之一。Matrigel是一种可溶性的基底膜基质，它可以模拟类似于哺乳动物细胞基底膜的生物活性基质。利用抗原阳性卵巢癌细胞Caov-3，阴性卵巢癌细胞HOC1A及人内皮细胞HMEC进行细胞体外侵袭实验。将Matrigel铺在Chamber上室的膜上并使其凝成固状，其余步骤同迁移实验，实验重复2次。实验结果显示，阳性细胞Caov-3在加入单抗COC166-9后细胞侵袭能力减弱，表明单抗COC166-9对抗原表达阳性细胞Caov-3(121±10.5vs 57±5.9,P<0.05)的体外侵袭能力具有抑制作用。而阴性细胞HOC1A(127±7.4vs 108±9.2)和人内皮细胞HMEC(101±3.4vs 96±4.9)在加入单抗COC166-9以后与阴性对照组的侵袭能力没有区别，表明单抗COC166-9对阴性卵巢癌细胞HOC1A和人内皮细胞HMEC的体外侵袭能力没有影响(图19)。

2抗原CA166-9能促进阴性卵巢癌细胞的体外侵袭能力

同上，利用IGHG1阳性卵巢癌细胞Caov-3，IGHG1阴性卵巢癌细胞HOC1A及人内皮细胞HMEC进行细胞侵袭实验。实验过程同上，加入纯化抗原CA166-9组使其终浓度为10μg/mL，正常人IgG和未给药组作为组间对照，实验重复2次。实验结果如图20，阴性卵巢癌细胞HOC1A在加入纯化抗原CA166-9以后，细胞体外侵袭能力有所增强，表明纯化抗原CA166-9对IGHG1阴性卵巢癌细胞HOC1A(25±2.1vs 46±2.3,P<0.05)的体外侵袭能力具有促进作用。而IGHG1阳性卵巢癌细胞Caov-3(58±2.5vs 64±3.3)，以及人内皮细胞HMEC(122±8.6vs119±11.3)在加入纯化抗原CA166-9以后与阴性对照组的侵袭能力没有区别，表明纯化抗原CA166-9对阳性卵巢癌细胞Caov-3和人内皮细胞HMEC的体外侵袭能力没有影响。

Claims (5)

1.如下(a)所示的蛋白：

(a)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白。

2.编码权利要求1所述的蛋白的多核苷酸。

3.根据权利要求2所述的多核苷酸，该多核苷酸的序列如SEQ ID No.1第1-597位所示。

4.权利要求1所述蛋白在制备促进肿瘤细胞的增殖和/或迁移侵袭的制剂中的应用，所述肿瘤细胞为卵巢癌细胞。

5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述肿瘤细胞为COC166-9抗原表达阴性细胞。