CN112210006A - 鼠抗人afp单克隆抗体及应用 - Google Patents

鼠抗人afp单克隆抗体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鼠抗人AFP单克隆抗体及应用，鼠抗人AFP单克隆抗体由保藏日为2017年2月22日、保藏号为CGMCC No.13801的分泌AFP单克隆抗体杂交瘤细胞338c3a3a9产生；试验验证，本发明的杂交瘤细胞338c3a3a9产生的鼠抗人AFP单克隆抗体可应用于蛋白免疫印迹、免疫荧光和免疫组化等实验技术中，特异性强、灵敏度高。从而提供了有效检测AFP的检测工具。

Description

鼠抗人AFP单克隆抗体及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别是涉及一种单克隆抗体及应用。
背景技术
原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高，进展快，预后差，是世界第六大常见恶性肿瘤。就死亡率而言，肝癌在我国高居第二位，且呈上升趋势。近年来随着各种肝癌治疗手段的广泛应用，肝癌患者的生存率有所提高，早发现、早诊断、早治疗对于改善肝癌患者的预后具有非常重要的意义。肝癌患者的诊断，大多依据临床诊断标准，血清中的甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)作为原发性肝癌相对特异的肿瘤标志物，是重要的实验室诊断依据之一，临床上也常使用AFP作为原发性肝癌患者治疗效果的检测指标。
AFP是一种结构与人类血清白蛋白类似的酸性糖蛋白，其分子量为68KD，主要合成部位是啮齿类动物及人类胚胎的肝脏，但也可在卵黄囊及胃肠道合成。从胎儿出生3个月开始，含量逐渐下降直至出生第二年达到成人体内水平。在成人体内，AFP基因表达并未完全关闭，血清中含量极低。但是当成人处于病理或者肝脏损伤情况时，AFP含量会明显增高，这也是肝癌患者体内甲胎蛋白含量升高的原因。
诊断肝癌的技术手段主要集中在影像学技术。超声检查是最早应用于肝癌诊断的技术，但是其优势主要是在肝癌中晚期，而在早期诊断中的可靠性较差。自从Abelev发现AFP以及Ruoshlati和Seppala研发了针对AFP的定量分析以来，AFP作为肝癌的分子诊断标准被肯定并长期应用于临床。目前虽然开发了许多肝癌的血清学标志物，但仍局限于某些实验室中而并未大规模用于普查中，AFP依然是诊断原发性肝癌应用最为广泛的血清标志物。中国癌症协会报道正常人血清AFP浓度低于20ng/mL。而原发性肝癌患者血清AFP多数在500ng/mL左右。在排除活动性肝病，生殖腺胚胎瘤以及妊娠的情况下，血清中AFP含量高于400ng/mL持续四周，或者高于200ng/mL持续八周，即可诊断为原发性肝癌。AFP对原发性肝癌的临床诊断价值可以归纳为：⑴是一种仅次于病理检查的诊断方法；⑵为目前最好的早期诊断方法之一，可在临床症状出现前8-11个月作出诊断；⑶为反应病情变化和治疗效果的敏感指标；⑷有助于检出亚临床期，复发性和转移性肝癌。
AFP的检测方法报道很多，比较成熟的是化学发光免疫，酶联免疫吸附(ELISA)、电化学发光等，而这些技术都依赖于优质的AFP抗体。对于AFP单克隆抗体的研制，国内外均有报道，但对其在检测中的特异性及灵敏度的提高尚需进一步研究。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种特异性好，灵敏度高的鼠抗人AFP单克隆抗体。
本发明的第二个目的是提供含有上述鼠抗人AFP单克隆抗体的免疫荧光检测试剂。
本发明的第三个目的是提供含有上述鼠抗人AFP单克隆抗体的免疫印迹检测试剂。
本发明的第四个目的是提供含有上述鼠抗人AFP单克隆抗体的免疫组化检测试剂。
本发明的第五个目的是提供鼠抗人AFP单克隆抗体在制备用于检测人肿瘤组织和细胞样品中甲胎蛋白的免疫印迹检测试剂、免疫荧光检测试剂或免疫组化检测试剂中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种分泌AFP单克隆抗体杂交瘤细胞。
本发明的技术方案概述如下：
一种鼠抗人AFP单克隆抗体，由保藏日为2017年2月22日、保藏号为CGMCCNo.13801的分泌AFP单克隆抗体杂交瘤细胞338c3a3a9产生。
含有上述鼠抗人AFP单克隆抗体的免疫荧光检测试剂。
含有上述鼠抗人AFP单克隆抗体的免疫印迹检测试剂。
含有上述鼠抗人AFP单克隆抗体的免疫组化检测试剂。
鼠抗人AFP单克隆抗体在制备用于检测甲胎蛋白的免疫印迹检测试剂、免疫荧光检测试剂或免疫组化检测试剂中的应用。
一种分泌AFP单克隆抗体杂交瘤细胞，是保藏号为CGMCC No.13801，保藏日为2017年2月22日的名为分泌AFP单克隆抗体杂交瘤细胞338c3a3a9。
本发明的优点：
试验验证，本发明的杂交瘤细胞338c3a3a9产生的鼠抗人AFP单克隆抗体可应用于蛋白免疫印迹、免疫荧光和免疫组化等实验技术中。且特异性强、灵敏度高。
附图说明
图1为AFP重组蛋白小量表达考马斯亮蓝染色结果。将诱导前及诱导后的大肠杆菌裂解后，分别上样进行10％的SDS-PAGE电泳分离蛋白，后经考马斯亮蓝染色，可见16KD处诱导后有明显外源蛋白表达条带。BSA(牛血清白蛋白)为对照。
图2为AFP重组蛋白镍柱纯化考马斯亮蓝染色结果。SDSPAGE胶上样顺序依次为：菌液：细菌裂解物，上清：裂解液离心后的上清，FT：过柱液，W1-W5：第一至五次漂洗液，M：蛋白marker，蛋白质标准，E1-E6：洗脱液收集的第一至六个组分。
图3为单克隆抗体亚型鉴定结果。将针对Ig M，Ig G1，Ig G3，Ig G2b，Ig G2a的特异性抗体包被酶标板，加入稀释好的待测单克隆抗体，二抗为羊抗鼠Ig G+Ig M-HRP。酶标仪读取OD450。最终确定此AFP单克隆抗体亚型为Ig G3。
图4为采用本发明的鼠抗人AFP单克隆抗体进行免疫荧光试验的结果，具体可发现本发明的单克隆抗体能够特异性的结合主要定位于胞浆中的AFP上。
图5为采用本发明的鼠抗人AFP单克隆抗体进行免疫印迹试验的结果。将肝癌细胞HepG2裂解后进行10％凝胶电泳，待检测的AFP单克隆抗体稀释比例为1:200，二抗为羊抗鼠IgG 1:200稀释，曝光时间为1min，AFP的预测大小为68KD。
图6为采用本发明的鼠抗人AFP单克隆抗体进行免疫组化试验的结果。具体可发现本发明的AFP抗体主要在胞浆着色。该结果表明此抗体可在免疫组化试验中特异性的检测AFP蛋白。
具体实施方式
一种分泌AFP单克隆抗体杂交瘤细胞338c3a3a9，保藏号为CGMCC No.13801，于2017年2月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
免疫原的制备
1.重组质粒的构建
以AFP的cDNA(GenBank No.BC027881)为模板，根据AFP序列(SEQ ID No.1，447)对应的基因设计特异引物，引物两段连入BamH I和Kpn I酶切位点：
AFP-Sense:5'CCCGGATCCACCTCGTCGGAGCTGATGG3'(SEQ ID No.3)
AFP-Antisense:5'TTCGGTACCGCAGACTTCCTGTTCCTGGC3'(SEQ ID No.4)PCR扩增得到AFP的443-591氨基酸(SEQ ID No.2)的表达外片(PCR参数：95℃ 4min；94℃ 1min，58℃30s，72℃ 30s，共35个循环；72℃ 10min。)以BamH I，Kpn I酶切位点插入载体pRSET A(商品)中构建成重组质粒pRSET A-AFP，对其进行测序，验证序列无误。
2.重组蛋白的表达
1)取重组质粒pRSET A-AFP转化BL21(DE3)感受态细胞，抗生素筛选得到阳性克隆，挑取阳性克隆接种于2mL含氨苄(100μg/mL)的LB培养液中，37℃，220rpm震荡培养过夜。
2)接种0.5mL过夜培养物到50mL离心管含10mL预热37℃的LB培养液(含氨苄100μg/mL)，37℃震荡培养直到OD600值为0.6，留取1mL至新EP中，放置于冰上，作为诱导前对照。
3)向其余的培养物中加入IPTG至终浓度为1mM，30℃继续震荡培养4hr诱导蛋白表达。诱导后的菌株经超声后离心，取细菌裂解物进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色结果显示蛋白条带，结果见图1。
3.重组蛋白的纯化
含重组质粒pRSET A-AFP的BL21大肠杆菌在大规模培养后，加入IPTG进行诱导表达。将诱导后的菌株经超声和离心处理后得到的细菌裂解物加入到预处理好的Ni-NAT亲和层析柱中，并通过多次漂洗洗脱AFP蛋白。将每次漂洗和洗脱留取的样品分别上样进行SDS-PAGE检测，后经考马斯亮蓝染色鉴定，确证表达产物为AFP重组蛋白，结果见图2。
实施例2
杂交瘤细胞的建立
一、小鼠免疫方案
初次免疫AFP重组蛋白50μg/只(100μL)加等体积的弗氏完全佐剂皮下注射，然后分别于第2周、第4周、第6周后进行免疫，每次25μg/只(100μL)加等体积的弗氏不完全佐剂皮下注射。采血间接法ELISA检测血清的效价，效价>1:12000才合格。合格后，再25μg/只(100μL)加等体积的弗氏不完全佐剂加强免疫(融合前三天)皮下注射。三天后取脾融合。
二、饲养细胞制备
饲养吞噬细胞在融合前一天制备，BALB/c小鼠8周龄，2只，颈椎脱臼致死浸泡于75％酒精，消毒5分钟，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，用无菌注射器注入5mL DMEM培养基，反复冲洗，吸出冲洗液放入10mL离心管，1000rpm，离心10分钟，用20％胎牛血清(FBS)的培养液混悬，调整细胞数1.0×105/mL加入96孔板中，0.1mL/孔，放入37℃5％CO2孵箱培养。
三、脾细胞制备
1.处死加强免疫的小鼠，将小鼠浸泡在75％的洒精5min，然后打开腹腔取出脾脏。
2.将脾脏放在消毒的平皿中(含有2％FBS的DPBS，5mL)去除边缘脂肪。
3.用2％FBS的DPBS，5mL冲洗脾脏用研磨器收集脾细胞。
4.900rpm，离心9分钟，去上清，用10mL DPBS不含FBS重悬。重复一次。重悬计数，调整到1.0×108个/mL。
四、骨髓瘤细胞制备
复苏SP2/0细胞。融合当天，观察SP2/0细胞状态并进行计数，大约需要1×107个细胞。转移骨髓细胞到50mL离心管中，离心900rpm，9分钟，吸去上清，用10mL无血清DMEM重悬细胞。
五、细胞融合
1.在50mL离心管中按细胞个数比为1：10的比例混合骨髓瘤细胞和脾细胞，并留1/96(96孔板)的混合细胞作空白对照，1000rpm，离心8min，去上清。
2.向管中加入1mL提前预热的50％PEG1450，在水浴中慢慢搅拌，1min后加入7mL的DMEM。
3.缓慢加入8mL 1×HT DMEM(含20％FBS)，800rpm，离心10min，吸去上清，重悬细胞在40mL1×HT DMEM(含20％FBS)中。
4.接种细胞到含饲养细胞的96孔板中，置5％CO2 37℃培养24小时后，小心吸半量上清，并加100μl预热的HAT(含20％FBS)培养液。
5.一周后换液每孔加入200μL/孔HT培养基。
6.一周后取96孔板中的培养液上清进行ELISA检测。
7.选效价是阳性的比值≧2.1(按照公式P/N＝(阳性-空白)/(阴性-空白))并选值高的孔扩大到24孔板中培养，长到70％再扩大到25mL培养瓶中培养，最后扩大到100mL培养瓶中培养，将杂交瘤细胞冻存于液氮。
8.取300个杂交瘤细胞加在6mL培养基中，5个/孔(96孔板的24孔，每孔100μL)，在余下的3.6mL液中加3.6mL 1×HT DMEM(含20％FBS)(加36个孔，每孔100μL)，在余下的3.6mL液中加3.6mL 1×HT DMEM(含20％FBS)(加36个孔，每孔100μL)，7天后作标记。
9.重复6，7，8，直到阳性率达100％才能结束筛选。
六、杂交瘤培养上清的检测
筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交瘤细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。在杂交瘤细胞布满孔底80％面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。表1为所选的稳定的阳性杂交瘤细胞株的培养上清ELISA检测结果，确定其效价为1:64000。
表1.AFP单抗效价的确定
Figure BDA0002717125240000051
通过抗体亚型鉴定试剂盒(Sigma，USA)确定AFP单克隆抗体的亚型，鉴定结果见图3所示。
将针对Ig M，Ig G1，Ig G3，Ig G2b，Ig G2a的特异性抗体包被酶标板，加入稀释好的待测单克隆抗体，二抗为羊抗鼠Ig G+Ig M-HRP。酶标仪读取OD450。最终确定此AFP单克隆抗体亚型为Ig G3。
七、细胞冻存
对数生长的细胞占满底面积80％左右即可冻存。收集上清且去除死细胞等杂质，上清存于-20℃。直接将冻存细胞放4℃半小时，然后放-20℃两小时，转-80℃冻存过夜，次日放液氮罐。
实施例3
鼠抗人AFP单克隆抗体的制备
一、制备腹水
先腹腔注射液体石腊于BaLb/c鼠(商品)，每只1mL，10天后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/mL。
二、抗体纯化
用Protean G琼脂糖凝胶纯化单克隆抗体。
1.Protean G琼脂糖凝胶装柱，0.75×2cm，柱床体积为1mL；
2.用缓冲液A平衡5-10个床体积；
3.将1mL小鼠腹水用缓冲液A稀释到5mL，0.45μm滤膜过滤上样。
4.用缓冲液A再洗5-10个床体积；
5.用缓冲液B洗脱，流速为1mL/min，收集洗脱抗体，立即用缓冲液C中和抗体到中性，测OD280并收集大于0.2的峰值；
6.用纯水流洗10个柱床体积，再用20％的乙醇流洗10个柱床体积，使柱子再生并置于4～8℃环境中保存。
缓冲液组成：
缓冲液A：20mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4，即pH 7.4的PBS溶液。
缓冲液B：100mM甘氨基酸-盐酸缓冲液，pH 2.7。
缓冲液C：1M Tris-HCl缓冲液，pH 9.0。
实施例4
鼠抗人AFP单克隆抗体的用途验证-免疫荧光
一、实验步骤：
1、取生长至接近汇合、状态良好的HepG2细胞，经胰蛋白酶消化后制备细胞悬液，并进行细胞计数；
2、向放有无菌盖破片的35mm培养皿中加入0.3×106个细胞，置于37℃,5％CO2的培养箱中培养过夜；
3、4％多聚甲醛固定30min；
4、0.1％TritonX-100打孔5min；
5、含10％驴血清的PBS溶液封闭30min；
6、加本发明的鼠抗人AFP单克隆抗体(1:100稀释)暗盒中孵育2h；
7、FITC标记的羊抗鼠二抗(中杉金桥，1：200稀释)暗盒中孵育lh；
8、0.25ug/uL DAPI溶液染细胞2min；
9、将盖玻片取出盖在滴有10u1抗荧光衰减封片剂的载玻片上，在激光扫描共聚焦显微镜下观察。
二、实验结果：
实验结果显示本发明的鼠抗人AFP单克隆抗体能够用于免疫荧光检测，并且在胞浆中显示出明确定位，结果见图4。其中DAPI指的是用于免疫荧光染色的核指示剂，Merge指的是这两种染色的融合图片。
实施例5
鼠抗人AFP单克隆抗体的用途验证-免疫印记
一、实验步骤：
1、将裂解后的肝癌细胞HepG2进行SDS-PAGE凝胶电泳；
2、PVDF膜甲醇处理后350mA,转膜1h；
3、将膜置于含5％脱脂奶粉的TBST封闭液中室温封闭2h；
4、加鼠抗人AFP单克隆抗体(1：200稀释)4℃孵育过夜；
5、用相应羊抗鼠二抗(中杉金桥，1：2000稀释)室温孵育2h；
6、用ECL显影液显影，并将膜置于曝光盒中，在暗室中对感光胶片进行曝光1min，而后进行显影、定影处理。
7、胶片用LabWorksTM凝胶成像及分析系统进行拍照。
二、实验结果：
实验结果显示本发明的鼠抗人AFP单克隆抗体能够特异性检测到AFP蛋白的表达，具有很好的免疫印迹应用前景。结果见图5。
实施例6
鼠抗人AFP单克隆抗体用途验证-免疫组化
一、材料来源：
本实施例所用肝癌组织标本来源于中山医科大学组织标本库，样本取材是经手术切除的新鲜肝癌组织经生理盐水洗涤后，放入液氮保存。标本均经病理证实，并有患者知情同意书。
二、实验步骤：
1、肝癌组织用3％H2O2-甲醇室温浸泡10分钟，然后PBS洗3次,每次5min；
2、将步骤1获得的组织在0.01mol/L枸橼酸钠缓冲溶液煮沸进行热修复；
3、滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20min
4、滴加鼠抗人AFP单克隆抗体(1：50稀释)湿盒孵育4℃过夜；
5、滴加羊抗鼠二抗(1:200稀释)，室温孵育30min；
6、DAB-H2O2显色，镜下控制3-5min，PBS漂洗，终止显色；
7、苏木素复染45s，然后1％盐酸酒精分化；
8、自来水冲洗；
9、梯度乙醇(50％、70％、85％、95％、100％)脱水各5min，二甲苯透明，中性树胶封片。
三、实验结果
结果如图6所示，鼠抗人AFP单克隆抗体主要在胞浆中着色。该结果表明此抗体可在免疫组化检测试验中特异地检测AFP蛋白。
序列表
<110> 天津赛尔生物技术有限公司
<120> 鼠抗人AFP单克隆抗体及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 4
ttcggtaccg cagacttcct gttcctggc 29

Claims (6)

1.一种鼠抗人AFP单克隆抗体，由保藏日为2017年2月22日、保藏号为CGMCC No.13801的分泌AFP单克隆抗体杂交瘤细胞338c3a3a9产生。
2.含有权利要求1的鼠抗人AFP单克隆抗体的免疫荧光检测试剂。
3.含有权利要求1的鼠抗人AFP单克隆抗体的免疫印迹检测试剂。
4.含有权利要求1的鼠抗人AFP单克隆抗体的免疫组化检测试剂。
5.权利要求1所述的鼠抗人AFP单克隆抗体在制备用于检测甲胎蛋白的免疫印迹检测试剂、免疫荧光检测试剂或免疫组化检测试剂中的应用。
6.一种分泌AFP单克隆抗体杂交瘤细胞，其特征在于，所述细胞是保藏号为CGMCCNo.13801，保藏日为2017年2月22日的名为分泌AFP单克隆抗体杂交瘤细胞338c3a3a9。
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