KR20080005977A - 단일클론 항체 및 그의 자궁 경부 질환 검출에서의 이용방법 - Google Patents

단일클론 항체 및 그의 자궁 경부 질환 검출에서의 이용방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 환자 샘플에서 고등급의 자궁경부 질환을 진단하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 상기 조성물은 MCM2에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론 항체, 그의 변이체 및 그의 단편을 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 MCM2 항체의 결합 특징을 가진 단일클론 항체를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 MCM2 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 제공한다. 상기 조성물은, 환자의 자궁경부 샘플에서 MCM2의 과다 발현을 검출하는 단계를 포함하는 고등급의 자궁경부 질환의 진단 방법을 실시하는데 사용한다. 또한, 본 발명의 방법을 실시하기 위한 키트를 제공한다. 또한, 본 발명은 MCM2 에피토프에 대한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 항체 제조에 상기 폴리펩티드를 이용하는 방법에 관한 것이다.

Description

단일클론 항체 및 그의 자궁 경부 질환 검출에서의 이용 방법{MONOCLONAL ANTIBODIES AND METHODS FOR THEIR USE IN THE DETECTION OF CERVICAL DISEASE}
본 발명은 MCM2에 결합할 수 있는 항체 및 이들 항체를 이용하여 특히 자궁경부 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.
자궁경부암은 여성들에게서 2번째로 가장 많이 발생되는 종양으로, 전체 여성 암환자의 약 12%를 차지하고 있으며, 해마다 약 250,000명이 사망하고 있다. Baldwin et al. (2003) Nature Reviews Cancer 3:1-10를 참조한다. 집단 검진 프로그램(mass screening program)을 이용할 수 없는 많은 개발도상국에서는 임상적인 문제가 더욱 심각하다. 이들 국가에서는, 자궁경부암이 여성의 암 사망원인의 1위이다.
선암(adenocarcinoma)이 관찰되기도 하지만, 대부분의 자궁경부암은 편평표피 세포암을 나타낸다. 자궁경부암은 충분히 규명된 비침습적인 표피내 단계를 거쳐 발전하므로, 형태적으로 식별할 수 있는 집단 스크리닝으로 예방할 수 있다. Williams et al.(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14932-14937. 정상 세포가 변이되는 방법에 대해서는 파악되지는 않았지만, 정상적인 중층상피(stratified epithelium)에서 자궁경부 상피내 종양(cervical intraepithelial neoplasia, CIN) 을 거쳐 침습성 암으로 진행되는 연속적인 병리조직학적 변화 스펙트럼 개념이 수년간 광범위하게 인정되고 있다. 자궁경부암의 전구형태는, CIN 또는 편평 상피내 병변(squamous intraepithelial lesions, SIL)으로도 당업계에 알려있는 이형성증(dysplasia)이다. 편평 상피내 비정상성은 3단계(CIN) 또는 2단계(Bethesda) 시스템을 이용하여 분류할 수 있다. 베데스다 시스템에서, CINI 및 HPV 감염에 해당되는 낮은 등급의 편평 상피내 병변(LSIL)은 일반적으로 증식성 HPV 감염으로, 침습성 질환으로의 진행될 위험성이 낮다. LSIL과 HSIL는 둘다 잠재적인 악성 전구 형태이지만, 3단계 시스템에서 CINII 및 CINIII에 해당되는 고등급의 편평 상피내 병변(HSIL)이 LSIL 보다 자궁경부암으로 진행될 위험성이 더 높다. 또한, 환자의 샘플을 이러한 시스템에 따라 ASCUS(atypical squamous cells of unknown significance) 또는 AGUS(atypical glandular cells of unknown significance)로 분류할 수 있다.
자궁경부암과 타입 16, 18 및 31과 같은 고위험성 인간 파필로마 바이러스(HIPV) 타입에 의한 감염 사이에 밀접한 관련성이 확인되고 있다. 실제, 수많은 역학 및 분자 생물학적 증거들에서 자궁경부암의 병인으로서 HPV 감염이 확정되었다. 또한, 고등급의 자궁경부 질환들의 85% 이상에서 HPV가 관찰되었다. 그러나, HPV 감염은 30살 이상 여성의 5-15%에서 발생할 수 있는 매우 흔한 현상이지만, 소수의 HPV 양성 여성들에서만 고등급의 자궁경부 질환 또는 암으로 발병한다. HPV가 존재한다는 것은 단지 감염만을 나타내는 것일 뿐 고등급의 자궁경부 질환을 의미하는 것이 아니므로, 따라서 HPV 감염 테스트만으로는 위양성이 자주 나타난다. 예로, Wright et al. (2004) Obstet. Gynecol. 103:304-309를 참조한다.
현재 문헌들에서, HPV는 자궁경부의 하부 조직(underlying tissue)내 기저 줄기 세포에 감염되는 것으로 제시되어 있다. 줄기 세포의 성숙형 각질형성세포로의 분화와 그로 인한 세포의 중층 경부 상피로의 이동은 HPV 바이러스의 복제 및 세포 재감염과 관련 있다. 바이러스 복제 과정중에, 세포 주기의 조절이상, 활발한 증식, DNA 복제, 전사 활성화 및 게놈 불안정성을 포함한, 수많은 세포 변화가 이루어진다(Crum(2000) Modern Pathology 13:243-251; Middleton et al. (2003) J. Virol. 77:10186-10201; Pett et al. (2004) Cancer Res. 64:1359-1368).
대부분의 HPV 감염은 본래 일시적이며, 바이러스에 감염된지 12개월이내에 자체적으로 해결된다. 1종 이상의 HPV 발암성 서브타입에 의한 영구적인 감염을 나타내는 개체는, HPV에 감염되지 않는 환자들에 비해 종양이 발생할 위험성이 있다. 자궁경부암 발병에 있어서의 HPV의 중요성을 감안하면, HPV의 임상 검사가 자궁경부암 발병 위험이 있는 환자를 식별하는 중요한 진단 수단이 되고 있다. HPV를 기초로한 자궁경부 질환 스크리닝의 임상적 이용은 그것의 음성 예측치에 있다. 팝 스미어(Pap smear) 검사에서 정상이며 HPV에 음성인 결과는, 질병이 없는 상태이며 향후 1-3년간 자궁경부암 발병 위험성이 낮음을 나타내는 우수한 지표이다. 그러나, HPV 양성 결과는 자궁경부 질환의 진단이라기 보다는 감염이 있음을 나타내는 것이다. 대부분 HPV 감염은 일시적이며 12개월 이내에 자연적으로 없어지지만, 위험성이 높은 HPV 바이러스 서브타입의 지속적인 감염은 자궁경부암 발병 위험성이 높음을 의미한다. HPV 테스트를 보완하기 위해, 자궁경부암 관련 분자 마 커의 동정으로 자궁경부 질환 진단의 임상적 특이도를 개선시킬 수 있을 것으로 추측된다.
현재, 파파니콜로-염색성(Papanicolaou-stained) 자궁경부 팝 스미어(Pap smears)는 자궁경부암을 검사하기 위한 선택 방법이다. Pap 테스트는 60년간 실질적으로 변함없이 유지되고 있는 주관적인 방법이다. 그러나, 그 실행에 있어서는 여러가지 문제점이 있다. 단일 PaP 테스트는 민감도(테스트-양성이 질병 양성일 비율)가 낮고, 편차가 넓다(30-87%). 단일 Pap 테스트의 특이도(테스트-음성이 질병 음성일 비율)는 집단 스크리닝에서 86%로 낮으며, 잠재된 고등급 질병을 검사하는데 있어 ASCUS PLUS 집단에서 상당히 낮다. 상기 Baldwin 등의 문헌을 참조한다. LSIL 또는 CINI로 판단된 팝 스미어의 상당 비율은 실제 고등급 병변에 대해 양성을 나타낸다. 또한, 팝 스미어의 최대 10%는 ASCUS(atypical squamous cells of undetermined significance)로 분류되며, 즉 정상, 중간 또는 심각한 병변이나 암으로 명확하게 분류하기 어렵다. 그러나, 이러한 ASCUS 집단의 최대 10%는 경험상 고등급의 병변을 가지지만, 결과적으로 간과되고 있다. 예로, Manos et al(1999) JAMA 281:1605-1610를 참조한다. 따라서, 고등급의 자궁경부 질환을 진단하는 신뢰성 있는 방법을 수행하기 위한, 고등급의 자궁경부 질환에서 선택적으로 과다 발현되는 분자 마커 및 이들 분자마커를 검출하는 조성물이 요구된다.
미니염색체 유지(Minichromosome maintenance: MCM) 단백질은 진핵생물의 DNA 복제에 필수적인 역할을 담당한다. 미니염색체 유지(MCM) 단백질은 복제전 컴플렉스(prereplication complex)를 DNA 상에 부하하여 DNA 복제 초기 단계에서 기 능하며, 복제 DNA 가닥을 새로이 합성하는 동안에 헬리카제로 기능하여 이중가닥 DNA를 풀어준다. 각 MCM 단백질은 매우 보존적인 가운데 도메인에 DNA-의존적인 ATPase 모티프를 가지고 있다. MCM 단백질의 농도는 정상적인 세포가 G0에서 세포주기 G1/S 단계로 진행됨에 따라, 일반적으로 가변적인 양상으로 증가된다. G0 단계에서는, MCM2 및 MCM5 단백질이 MCM7 및 MCM3 단백질 보다 훨씬 적다. MCM6은 MCM2, MCM4 및 MCM7과 복합체를 이루어 히스톤 H3에 결합한다. 또한, 서브복합체인 MCM4, MCM6 및 MCM7은 MCM6의 ATP-결합 활성 및 MCM4의 DNA-결합 활성에 의해 매개되는, 헬리카제 활성을 가지고 있다. 예로, Freeman et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5:2121-2132; Lei et al. (2001) J. Cell Sci. 114:1447-1454; Ishimi et al. (2003) Eur. J. Biochem. 270:1089-1101을 참조하며, 이들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
초기 공개문헌들은, MCM 단백질, 특히 MCM-5가 자궁경부 질환(Williams et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 95:14932-14937) 뿐만 아니라 그외 암(Freeman et al. (1999) Clin Cancer Res. 5:2121-2132)을 검출하는데 유용함을 개시하였다. 공개된 문헌들에서, MCM-5 항체가 자궁경부의 신생 세포를 검출할 수 있다고 지적하고 있다. MCM-5의 고등급의 자궁경부 질환 검출의 특이성은 입증되지 않았다(Williams et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 95:14932-14937). MCM-5의 발현 검출은 고등급의 자궁경부 질환으로 제한되지 않으며, 낮은 등급의 이형성증과 고위험성의 HPV로 감염된 후 세포 주기로 재진입한 증폭성 세포도 검출한다. MCM-5 뿐만 아니라, MCM-2 및 MCM-7을 포함한 그외 MCM 패밀리에 속하는 일 원은, 조직 샘플에서 자궁경부 암을 검출하기 위한 잠재적으로 유용한 마커인 것으로 입증되고 있다(Freeman et al. (1999) Clin Cancer Res. 5:2121-2132; Brake et al. (2003) Cancer Res. 63:8173-8180). 최근 결과는, MCM-7이 면역화학적 형태로 고등급의 자궁경부 질환을 검출하기 위한 특이적인 마커인 것으로 보인다고 개시하고 있다(Brake et al. (2003) Cancer Res. 63:8173-8180; Malinowski et al. (2004) Acta Cytol. 43:696).
그러므로, 고등급의 자궁경부 질환에서 선택적으로 과다 발현되는 바이오마커의 발현을 검출할 수 있는 항체가 당업계에 요구되고 있다. 이러한 항체는 HPV 감염 초기 단계 및 경증의 이형성증과 같이 임상 질환으로 간주되지 않는 증상들에서 고등급의 질병을 구별하는 방법에 사용할 수 있다.
발명의 개요
본 발명은 고등급의 자궁경부 질환을 진단하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 본 발명의 핵의 바이오마커 단백질, 특히 MCM 단백질, 보다 구체적으로는 MCM2 단백질에 결합할 수 있는 단일클론 항체를 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 단일클론 항체의 항원-결합성 단편 및 변이체, 상기 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주, 및 본 발명의 단일클론 항체를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 고등급의 자궁경부 질환을 진단하는 방법에 이용된다. 상기 방법은 하나 이상의 핵 바이오마커의 과다 발현을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 핵 바이오마커의 과다 발현은 고등급의 자궁경부 질환임을 나타내는 것이다. 구체적으로, 상기 방법은 본 발명의 항체를 이용하여 자궁경부 샘플에서 MCM2의 과다 발현을 검출하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 조성물은 MCM2 단일클론 항체에 결합할 수 있는 에피토프를 포함하는 분리된 폴리펩티드를 더 포함한다. 이들 폴리펩티드는 MCM2 항체를 제조하는 방법에 사용된다. MCM2 에피토프의 아미노산 서열을 코딩하는 분리된 핵산 분자도 제공한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 고등급의 자궁경부 질환을 진단하기 위한 조성물 및 방법을 제공하다. 조성물은 고등급의 자궁경부 질환에서 특이적으로 과다 발현되는 핵의 바이오마커 단백질, 특히 MCM 단백질, 보다 구체적으로는 MCM2에 결합할 수 있는 단일클론 항체를 포함한다. 또한, 본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주도 제시된다. 또한, 본원에 언급된 단일클론 항체를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 조성물은 고등급의 자궁경부 질환 환자를 진단하는 방법에 사용된다.
본 발명의 조성물은 MCM2 또는 그것의 변이체나 단편에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 포함한다. 특히, 27C5.6 및 26H6.19로 명명된 MCM2 항체를 제공한다. MCM2 단일클론 항체인 27C5.6 및 26H6.19를 생산하는 하이브리도마 세포주는 2005년 4월 14일자로 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스에 위치한 ATCC(American Type Culture Collection)의 특허기탁기관에 각각 기탁번호 PTA-6668 및 PTA-6667로 기탁되었다. 이들 기탁물은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약하에 유지될 것이다. 이들 기탁물은 당업자의 편의상 이루어졌으며, 기탁이 35 U.S.C. §112하에 요청되었음을 용인하는 것은 아니다.
단일클론 항체인 27C5.6 및 26H6.19의 결합 특징을 가지는 항체도 본원에 언급되어 있다. 이러한 항체로는 이들 항체와 경쟁적인 결합 분석에서 경쟁하는 항체와 단일클론 항체 27C5.6 또는 26H6.19에 결합할 수 있는 에피토프에 결합하는 항체가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. MCM2에 특이적으로 결합하는 능력이 보존된 단일클론 항체 27C5.6 및 26H6.19의 변이체 및 단편도 제공한다. 조성물은 본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 본원에 언급된 하나 이상의 단일클론 항체를 포함하는 키트를 추가적으로 포함한다.
"항체들" 및 "면역글로불린(Ig)"은 동일한 구조 특징을 가진 당단백질이다. 항체들은 항원에 대한 결합 특이성을 나타내지만, 면역글로불린은 항체 및 항원 특이성이 결손된 그외 항체 유사 분자 둘다를 포함한다. 후자 종류의 폴리펩티드는 예컨대, 림프계에서 낮은 수준으로 생산되며, 골수종에서 높은 수준으로 생산된다.
용어 "항체" 및 "항체들"은 광의적으로는 자연적으로 형성되는 항체 형태들 및 재조합 항체들, 예컨대 단쇄 항체들, 키메라 및 인간화된 항체들, 다중 특이성 항체들 및 전술한 것들의 단편 및 유도체들을 포함하며, 상기 단편 및 유도체들은 항원 결합 부위를 1곳 이상 가지고 있다. 항체 유도체들은 항체에 접합된 단백질 또는 화학 모이어티를 포함할 수 있다. 용어 "항체"는 본 명세서에서 광의의 의미로 사용되며, 완전히 조합된 항체, 항원에 결합할 수 있는 항체 단편(예, Fab', F'(ab)2, Fv, 단쇄 항체, 디아바디(diabody)), 및 전술한 것을 포함하는 재조합 펩티드를 포괄한다. 본원에서, "MCM2 항체"는 MCM2(서열번호 1) 또는 그것의 변이체나 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 단일클론 항체, 다클론 항체, 단쇄 항체 및 모 항체의 항원 결합 기능을 유지하는 그것의 단편을 포함한다.
본 발명의 MCM2 항체는 가장 적합하게는 단일클론 항체이다. 용어 "단일클론 항체"는 본원에서 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 수득되는 항체를 의미하며, 즉 집단을 구성하는 각 항체는 소량 존재할 수 있는 자연 돌연변이를 제외하고는 동일하다.
"천연 항체들" 및 "천연 면역글로불린"은 일반적으로 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유결합성 이황화 결합에 의해 중쇄와 연결되어 있으며, 서로다른 면역글로불린 이소타입의 중쇄에 따라 이황화 결합의 수는 달라진다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄에는 일정한 간격의 체인내(intrachain) 이황화 브릿지가 있다. 각각의 중쇄는 다수의 불변 도메인 다음에 한쪽 말단에 가변성 도메인(VH)를 가지고 있다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변성 도메인(V)과 다른쪽 말단에 불변 도메인을 가지고 있으며, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되어 있으며, 경쇄의 가변성 도메인은 중쇄의 가변성 도메인과 정렬되어 있다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄의 가변성 도메인과 중쇄의 가변성 도메인 사이에 인터페이스를 형성하는 것으로 생각된다.
용어 "가변성"은 항체들마다 가변성 도메인의 특정 영역의 서열이 매우 상이하며, 그것의 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성에 이용됨을 의미한다. 그러나, 가변력(variability)은 항체들의 가변성 도메인 전체에 균일하게 분포되어 있지 않다. 이는, 중쇄 및 경쇄의 가변성 도메인 둘다에서 상보성 결정부(complementarity determining region, CDR) 또는 초가변부(hypervariable region)라고 하는 3개의 세그먼트에 집중되어 있다. 가변성 도메인에서 보존성이 더욱 높은 영역을 프래임워크(FR) 영역이라고 한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 루프 연결을 형성하고 몇몇 경우 p-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 CDR이 연결된, 주로 p-시트 배위를 채용하는 4개의 FR 영역을 포함한다. 각 쇄의 CDR은 FR 영역에 의해 매우 근접한 위치에서 함께 유지되며, 다른 쇄의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위를 형성하는 데 기여한다 (Kabat et al., NIH Publ. No.91-3242, Vol. I, pages 647-669 (1991)).
불변 도메인은 항체의 항원 결합에 직접 참여하지는 않지만 여러 작용자 (effector) 기능, 예를 들어 항체 의존적인 세포 독성에서의 항체의 참여 기능을 나타낸다.
용어 "초가변부"는 본원에서 항원-결합에 책임을 지고 있는 항체의 아미노산 잔기이다. 초가변부는 "상보성 결정부" 또는 "CDR"로부터 아미노산 잔기(경쇄 가변성 도메인에서 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 중쇄 가변성 도메인에서 1-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, i 25 Bethesda, MD. [1991]) 및/또는 "초가변성 루프"로부터의 잔기(경쇄 가변성 도메인에서 잔기 26-32(L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 중쇄 가변성 도메인에서 2632(H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); Clothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 [1987])를 포함한다. "프래임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 언급된 바와 같이 초가변부 이외의 가변성 도메인의 잔기이다.
"항체 단편"은 완전한 항체의 일부, 바람직하기로는 항원-결합부 또는 완전한 항체의 가변부를 포함한다. 항체 단편의 예는, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; DB(diabody); 선형 항체(Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062); 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편들로 형성된 다중특이적인 항체들이 있다. 항체를 파파인으로 분해하면, 각각이 단일 항원-결합부를 가지고 있는 두개의 동일한 항원-결합 단편, "Fab" 단편과, 이름에 쉽게 결정화되는 그것의 능력이 반영된 "Fc" 단편이 형성된다. 펩신으로 처리하면 2개의 항원 결합 부위를 가지며 여전히 항원에 가교결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 얻어진다.
"Fv"는 완전한 항원 인지 부위와 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 2쇄의 Fv 종에서, 이 영역은 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 영역이 비공유 결합으로 단단하게 결부된 이량체로 구성되어 있다. 단쇄 Fv 종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변성 도메인은 유연한 펩티드 링커에 의해 공유결합으로 연결되어, 경쇄 및 중쇄가 2쇄 Fv 종과 유사한 "이량성" 구조로 조합될 수 있다. 이러한 배위에 의해 각 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면에 항원 결합 부위를 규정짓게 된다. 총괄적으로, 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변성 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 절반의 Fv)도, 전체 결합 부위보다는 친화성이 적지만, 항원을 인지하고 항원에 결합하는 능력을 가지고 있다.
또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인과, 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. Fab1 단편은 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 항체 힌지 영역의 하나 이상의 시스테인을 포함하여 몇개의 잔기가 첨가되어 있다는 점에서, Fab' 단편과는 상이하다. Fab'-SH는 본 명세서에서는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'을 나타내는 것이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 단편들 사이에 힌지 시스테인을 가지고 있는 Fab' 단편 쌍으로 만들어졌다.
MCM2 항체 단편은 전장 항체의 원하는 친화성을 보유하고 있다면 본 발명에 포함된다. 따라서, 예로, MCM2 항체 단편이 MCM2 항원에 결합하는 능력을 보유할 것이다. 이러한 단편은 해당되는 전장 항체와 유사한 특성이 특징이며, 즉 상기 단편은 MCM2에 특이적으로 결합할 것이다. 이러한 단편은 "항원-결합성" 단편으로 본 명세서에 언급된다.
항체의 적정 항원-결합성 단편은 전장 항체의 일부, 일반적으로 그것의 항원-결합성 부위 또는 가변부를 포함한다. 항체 단편의 예로, Fab, F(ab')2, 및 Fv 단편과 단쇄 항체 분자가 있으나, 이로 한정되지 않는다. "Fab"은 경쇄와 중쇄의 일부분으로 구성된 면역글로불린의 일가 항원-결합성 단편을 의미한다. F(ab')2는 경쇄 양쪽과 중쇄 양쪽의 일부분을 포함하는 면역글루불린의 이가 항원-결합성 단편을 의미한다. "단쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단편으로, 상기 도메인은 폴리펩티드 단일쇄로 존재한다. 예로, 미국 특허 4,946,778, 5,260,203, 5,455,030, 및 5,856,456를 참조하며, 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 VH 및 VL 도메인 사이에 sFv가 항원 결합에 적합한 구조를 형성할 수 있게하는 폴리펩티드 링커를 더 포함한다. sFv에 대한 예로, Pluckthun (1994) in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, ed. Rosenburg and Moore (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315를 참조한다.
항체 또는 항체 단편은, 예컨대 McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554 (1990) 및 미국 특허 5,514,548에 기재된 기법을 이용하여 제조된 항체 파지 라이브러리로부터 분리할 수 있다. Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628 및 Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597에는, 파지 라이브러리를 이용하여 각각 설치류 항체 및 인간 항체를 분리하는 것이 기재되어 있다. 이후의 공개문헌들에서는, 체인 셔플링(shuffling)(Marks et al. (1992) Bio/Technology 10:779-783) 및 대규모의 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 조합성 감염 및 생체내 재조합(Waterhouse et al. (1993) Nucleic. Acids Res. 21:2265-2266)에 의해, 고친화성(nM 범위) 인간 항체를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 따라서, 이러한 기법은 단일클론 항체 분리를 위한, 기존의 단일클론 항체 하이브리도마 기법에 대한 실행가능한 대안책이다.
항체 단편 제조를 위한 다양한 기법이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 완전한 항체의 단백질 분해에 의해 파생된다(예, Morimoto et al. (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) and Brennan et al. (1985) Science 229:81). 그러나, 현재 이들 단편은 재조합 숙주 세포에서 직접적으로 제조할 수 있다. 예컨대, 항체 단편은 전술한 항체 파지 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 E. coli로 부터 직접 회수하고 화학적으로 커플링시켜, F(ab')2 단편을 만들 수 있다(Carter et al. (1992) Bio/Technology 10:163-167). 다른 방법으로, 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 F(ab')2 단편을 분리할 수 있다. 그외 항체 단편 제조 기법은 당업자에게 자명할 것이다.
바람직하기로는, 본 발명의 항체는 사실상 단일클론이다. 전술한 바와 같이, "단일클론 항체"는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻은 항체를 의미하며, 즉, 집단을 이루는 개별적인 항체들은 소량 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 상기 용어는 항체의 종 또는 기원으로 한정되지 않는다. 상기 용어는, 전체 면역글로불린과 Fab, F(ab')2, Fv와 같은 단편, 및 항체의 항원 결합 기능을 보유하는 그외의 것을 포함한다. 단일클론 항체는 하나의 항원성 부위, 후술되는 바와 같이 즉 MCM2 단백질내 특정 에피토프로 향하는 높은 특이성을 가지고 있다. 또한, 대개 상이한 항원 결정인자 (determinant)(에피토프)에 대해 유도되는 상이한 항체들을 포함하는 통상의 (다클론) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 항원 결정인자에 대해 유도된다. 수식어 "단일클론"은 항체가 실질적으로 동종 집단으로부터 얻어지는 것을 특징으로 한다는 것을 나타내며, 어떠한 특정 방법으로 항체를 생산할 것을 요구하는 것으로 파악되어서는 안된다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 Kohler 등, Nature 256:495 (1975)에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있으며, 또는 재조합 DNA 방법(예, 미국 특허 4,816,567 참조)에 의해 제조할 수 있다. "단일클론 항체"는 또한 예컨대 Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597; 및 미국 특허 5,514,548에 기재된 기법을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리할 수도 있다.
단일클론 항체는 Kohler et al. (1975) Nature 256:495-496의 방법이나 이의 수정된 방법으로 제조할 수 있다. 전형적으로, 항원이 함유된 용액으로 마우스를 면역화한다. 면역화는 염수, 특히 프레운드의 완전 보강체와 같은 보강체 중에 항원-함유 용액을 혼합하거나 또는 유화하고, 이 혼합물 또는 유화액을 비경구 주입함으로써 수행할 수 있다. 당업계에 공지된 모든 면역화 방법을 본 발명의 단일클론 항체를 수득하기 위해 사용할 수도 있다. 동물을 면역화한 다음, 비장(및 선택적으로 수개의 거대 림프절)을 적출하고 단일 세포로 분리한다. 세포 현탁물을 대상 항원이 코팅된 플레이트 또는 웰에 적용함으로써 비장 세포를 스크리닝할 수 있다. 항원에 특이적인 막 결합성 면역글로불린을 발현하는 B 세포(즉, 항체 생산 세포)는 플레이트에 결합하여 세정하여 제거되지 않는다. 수득되는 B 세포 또는 분리시킨 모든 비장 세포를 골수종 세포와 융합되게 하여, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 만들고, 이를 선별 배지에서 배양한다. 수득되는 세포를 연속 희석하여 평판 배양하고, 목적 항원에 특이적으로 결합하는 (무관련 항원에는 결합하지 않는) 항체 생산에 대해 분석한다. 이후, 선택된 단일클론 항체(mAb) 분비성 하이브리도마를 시험관내(예, 조직 배양 병 또는 중공사(hollow fiber) 반응기), 또는 생체내(마우스의 복수)에서 배양한다. 또한, 단일클론 항체는 RIMMS 기법(Repetitive Immunizations Multiple Site)으로 제조할 수 있다. 예로, Kilpatrick et al. (1997) Hybridoma 16(4):381-389; Wring et al. (1999) J. Pharm. Biomed. Anal. 19(5):695-707; and Bynum et al. (1999) Hybridoma 18(5):407-411을 참조하며, 이는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
하이브리도마 사용의 대안으로서, 원용에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 5,545,403; 5,545,405; 및 5,998,144에 개시된 바와 같이, CHO 세포주와 같은 세포주에서 항체를 생산할 수 있다. 간략하게는, 세포주에 경쇄 및 중쇄를 각각 발현할 수 있는 벡터를 형질전환시킨다. 2개의 단백질을 별개의 벡터로 형질전환함으로써, 키메라 항체를 제조할 수 있다. 다른 이점은 항체의 정확한 당화이다. 또한, 바이오마커 단백질을 이용하여 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리(예, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝하여 그에 따라 바이오마커 단백질에 결합하는 면역글로불리 라이브러리 일원을 분리함으로써 단일클론 항체를 동정 및 분리할 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리 제조 및 스크리닝 키트를 시중에서 구입할 수 있다(예, the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; and the Stratagene SurfZAPJ Phage Display Kit, Catalog No. 240612). 부가적으로, 항체 디스플레이 라이브러리 제조 및 스크리닝에 특히 사용가능한 방법 및 시약의 예는, 미국 특허 5,223,409; PCT 공개 번호 WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; 93/01288; WO 92/01047; 92/09690; 및d 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734에서 확인할 수 있다.
본 발명의 일부 측면에서, 조직 샘플이 아닌 세포 샘플의 바람직한 염색을 토대로 항체를 선별할 수 있다. 즉, 구체적인 예로, 항체를 최종 샘플 타입(예, 세포 준비물)을 고려하여 결합 특이성으로 선별한다. MCM2와 같은 원하는 특이적인 바이오마커에 대한 항체를 선별하고, 다단계 스크리닝 과정을 통해 정제한다. 이러한 항체 선별 방법은 계류중인 2005년 3월 23일자 미국 특허 출원번호 11/087,227, 표제 "자궁경부 질환 검출 방법 및 조성물"에 개시되어 있으며, 그 전체가 원용에 의해 포함된다.
또한, 본 발명의 단일클론 항체의 결합 특징을 가지고 있는 항체를 제공한다. 항체와 관련하여 사용될 때, "결합 특징" 또는 "결합 특이성"은 항체가 비교 항체와 동일한 또는 유사한 항원 에피토프를 인지하는 것을 의미한다. 이러한 항체의 예로는, 경쟁적인 결합 분석에서 본 발명의 단일클론 항체와 경쟁하는 항체가 있다. 당업자는 표준적인 방법을 이용하여 항체가 다른 항체와 경쟁적으로 간섭하는지를 결정할 수 있다.
"에피토프"는 항체를 만들로 항체가 결합하게 되는 항원성 분자의 일부분이다. "MCM2 에피토프"는 MCM2 단일클론 항체가 결합하는 MCM2 단백질의 일부분을 포함한다. 에피토프는 선형 아미노산 잔기(즉, 선형으로 에피토프 잔기가 순차적으로 교대로 정렬되어 있음), 비선형 아미노산 잔기(본원에서 "비선형 에피토프"라 함; 이러한 에피토프는 순차적으로 정렬되어 있지 않음), 또는 선형 및 비선형 아미노산 잔기 둘다를 포함할 수 있다. 전형적으로, 에피토프는 짧은 아미노산 서열, 약 아미노산 5개이다. 에피토프를 동정하는 체계적인 기법이 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 미국 특허 4,708,871 및 하기 실시예에 언급되어 있다. 간략하게는, 일 예로, 항원으로부터 유래된 중첩되는 올리고펩티드 세트를 합성하여 각 핀에 고유한 올리고 펩티드로 이들 세트를 핀의 고상 어레이에 결합시킬 수 있다. 핀 어레이는 예컨대 바이오마커-특이적인 단일클론 항체 결합에 대해 모든 96개의 올리고펩티드를 동시에 분석 가능한 96웰 마이크로타이터 플레이트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 현재 에피토프 맵핑을 위한 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리 키트(New England BioLabs)를 구입가능하다. 해당 항체에 결합하는 에피토프를 동정하기 위해, 이러한 방법을 이용하여, 연속적인 아미노산의 모든 가능한 서브 세트에 대한 결합 친화성을 결정할 수 있다. 또한, 에피토프 길이의 펩티드 서열을 사용하여 항체가 수득되는 동물을 면역화하고 그 결과로 에피토프를 동정할 수 있다.
또한, 본 발명은 MCM2 단일클론 항체에 결합하는 에피토프를 포함하는 분리된 폴리펩티드를 포함한다. 이들 폴리펩티드는 단일클론 항체에 결합하는 항원(즉, MCM2)의 일부분에 해당된다. 이러한 폴리펩티드는 MCM2에 선택적으로 결합하는 항체 제조 방법에 사용된다. 항체 제조에 사용되는 폴리펩티드 능력을 본원에서는 "항원성 활성"이라고 한다. 예를 들면, 서열번호 3, 4 및 14(서열번호 1에 기재된 MCM2 아미노산 서열에서 각각 잔기 369-382, 688-710 및 683-692에 해당됨)에 기재된 아미노산 서열 세트는, MCM2 단일클론 항체, 보다 구체적으로는 단일클론 항체 27C5.6 및 26H6.19에 의해 인지되는 에피토프를 포함한다. 상세한 사항은 실시예 4를 참조한다. 원형 폴리펩티드의 항원성 활성을 보유하고 있는, 서열번호 3, 4 및 14에 기재된 MCM2 에피토프 서열의 변이체 및 단편도 제공된다. 본 발명은 MCM2 에피토프 및 그것의 변이체 및 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 핵산 분자를 더 포함한다.
본 발명의 MCM2 에피토프를 포함하는 폴리펩티드는 전술한 바와 같이, MCM2에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 제조 방법에 사용할 수 있다. 또한, 이러한 폴리펩티드는 MCM2 다클론 항체의 제조에 사용할 수도 있다. 예로, 다클론 항체는 적정 개체(예, 토끼, 염소, 마우스 또는 그외 포유류)를 MCM2 에피토프(즉, 면역원)을 포함하는 폴리펩티드로 면역화함으로써 제조할 수 있다. 면역화된 개체의 항체 역가는 고정화된 바이오마커 단백질을 이용한 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)와 같은 표준 기법으로 경시적으로 모니터링할 수 있다. 면역화한 후 적정 시점에, 예컨대 항체 역가가 최고일 때, 항체 생산 세포를 개체에서 수득하여, Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497에 의해 최초 개시된 하이브리도마 기법, 인간 B 세포 하이브리도마 기법(Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72), EBV-하이브리도마 기법(Cole et al. (1985) in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld and Sell (Alan R. Liss, Inc., New York, NY), pp. 77-96) 또는 트리오마(trioma) 기법과 같은 표준 기법에 의해 단일클론 항체를 제조할 수 있다. 하이브리도마 제조 기법은 잘 알려져 있다(일반적으로, Coligan et al., eds. (1994) Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., New York, NY); Galfre et al. (1977) Nature 266:550-52; Kenneth (1980) in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses (Plenum Publishing Corp., NY; and Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402를 참조함).
본원에 개시된 MCM2 에피토프를 포함하는 단일클론 항체 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체도 본 발명에 포함된다. 대상 항체를 코딩하는 클로닝한 DNA 서열내 돌연변이에 의해 변이체를 제조할 수 있다. 돌연변이 유발 및 뉴클레오티드 서열 변이 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예로, Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol. 154:367-382; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York); 미국 특허 제 4,873,192호와, 이에 인용된 참조문헌을 참조하며, 이들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 대상 폴리펩티드의 생물학적 활성에는 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 지침은 Dayhoff et al. (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)의 모델에서 확인할 수 있으며, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 하나의 아미노산을 동일한 특성을 가진 다른 것과 교체하는 것과 같은 보존적인 치환이 바람직할 수 있다. 보존적인 치환의 예로는 Gly ⇔ Ala, Val ⇔ Ile ⇔ Leu, Asp⇔ Glu, Lys ⇔ Arg, Asn ⇔ Gln, 및 Phe ⇔Trp ⇔ Tyr가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
대상 폴리펩티드의 변이체 구축에서, 변이체가 계속 원하는 활성을 보유하도록, 즉 바이오마커에 대한 유사한 결합 친화성을 보유하도록 변형된다. 명백하게는, 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에서의 임의 돌연변이는 리딩 프래임 이외의 서열에 위치되지 않아야 하며, 바람직하기로는 이차 mRNA 구조를 형성할 수 있는 상보적인 부위가 형성되지 않을 것이다. 유럽 특허 공개 번호 75,444를 참조한다.
바람직하기로는, 기준 폴리펩티드(reference polypeptide)의 변이체는 기준 항체 분자나 또는 기준 항체 분자의 더욱 짧은 부분과 아미노산 서열이 적어도 70% 또는 75% 동일한, 바람직하기로는 적어도 80% 내지 85% 동일한, 더욱 바람직하기로는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95% 동일하다. 더 바람직하기로는, 상기 분자는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 본 발명에서, 서열 동일성은 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘을 이용하여, 갭 오픈 페널티 12, 갭 연장 페널티 2, BLOSUM 매트릭스 62로 결정된다. Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘은 Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489에 개시되어 있다. 변이체는, 기준 항체와 예컨대 1 내지 15개의 아미노산 잔기로, 1 내지 10개의 아미노산 잔기로, 예컨대 6-10, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 잔기로 적은 수가 상이할 수 있다.
2개의 아미노산 서열의 최적 정렬에 있어서, 변이체 아미노산 서열의 연속적인 세그멘트(contiguous segment)는 상기 기준 아미노산 서열에 비해 추가적인 아미노산 잔기를 가지거나 또는 아미노산 잔기가 결손될 수 있다. 기준 아미노산과의 비교에 사용된 연속적인 세그멘트는 적어도 20개의 연속된 아미노산 잔기를 함유할 것이며, 30, 40, 50 또는 그 이상의 아미노산 잔기들일 수 있다. 보존적인 잔기 치환 또는 갭의 서열 동일성에 대한 보정을 실시할 수 있다(참조, Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘).
본 발명의 MCM2 단일클론 항체를 후술한 바와 같이 검출가능한 물질로 표지하여, 샘플내 바이오마커 단백질 검출을 용이하게 할 수 있다. 이러한 항체는 본 발명의 방법을 실시하는데 사용된다. 본 발명의 항체 및 항체 단편을 검출가능한 물질과 커플링하여 항체 결합성을 검출하는 것을 용이하게 할 수 있다. 단어 "표지"는 본원에서 "표지된" 항체를 제조하기 위하여 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 자체적으로 (예, 방사선동위원소 표지 또는 형광 표지)로 검출가능할 수 있으며, 또는 효소적 표지의 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다. 항체를 표지하기 위한 검출가능한 물질의 예로는 다양한 효소, 보결기(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질 및 방사능 물질이 있다. 적합한 효소의 예로는 서양고추냉이 페록시다제, 알카리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제가 있으며, 적합한 보결기의 예로는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴이 있으며, 적합한 형광 물질의 예로는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 있으며, 발광 물질의 예로는 루미놀이 있으며; 생물발광 물질의 예로는 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿠오린이 있으며, 적합한 방사능 물질의 예로는 125I, 131I, 35S, 또는 3H가 있다.
본 발명의 하나 이상의 MCM2 단일클론 항체를 포함하는 키트가 또한 제공된다. "키트"는 MCM2의 발현을 특이적으로 검출하기 위한, 한가지 이상의 시약, 예컨대 항체를 포함하는 임의의 제조물(예, 패키지 또는 용기)로 의도된다. 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 유니트(unit)로서 조성하거나, 분배하거나 또는 판매할 수 있다. 부가적으로, 키트는 키트와 그의 사용 방법이 설명된 패키지 삽입물을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 일반적으로 MCM2에 대한 하나 이상의 단일클론 항체, 항체 결합을 검출하기 위한 화합물, 대조 염색 및 선택적으로 양성 염색 세포의 동정을 용이하게 하기 위한 청색화제(bluing agent)를 포함하다. 항원-항체 결합을 검출하는 임의 화합물은 본 발명의 키트에 사용할 수 있다. 일부 예에서, 검출 화합물은 이차 항체가 접합된 표지된 폴리머를 포함한다. 예컨대, 항원-항체 결합부에 발색단 침착(deposition)을 촉매하는 효소가 접합되어 있는 이차 항체를 제공할 수 있다. 이러한 효소 및 이를 항체 결합 검출에 이용하기 위한 기법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일 예로, 키트는 HRP-표지된 폴리머가 접합된 이차 항체를 포함한다. 접합된 효소(예, HRP-표지된 이차 항체의 경우 DAB) 및 하이드로겐 페록사이드와 같은 비특이적인 염색을 차단하기 위한 용액과 함께 사용할 수 있는 발색단을 추가적으로 제공할 수 있다. 다른 예로, 바이오마커 단백질에 항체 결합은 단일클론 항체에 결합하는 마우스의 프로브 시약을 이용한 다음 마우스 프로브 시약에 결합하는 HRP가 접합된 덱스트란 폴리머를 첨가함으로써, 검출한다. 이러한 검출 시약은 예컨대 Biocare Medical에서 구입가능하다.
본 발명의 키트는 페록시다제 블록킹 시약(예, 하이드로겐 페록시다제), 단백질 블록킹 시약(예, 정제한 카세인) 및 대조 염색(예, 헤마톡실린)을 추가적으로 포함할 수 있다. 청색화제(예, 암모늄 하이드록사이드 또는 TBS, pH　7.4, 트윈-20 및 소듐 아자이드 첨가됨)를 키트에 추가적으로 제공하여, 양성 염색 세포의 검출을 용이하게 할 수 있다. 또한, 키트는 질적 관리를 위해 양성 및 음성 대조군 샘플을 포함할 수도 있다.
다른 예로, 본 발명의 키트는 2개의 MCM2 단일클론 항체, 보다 구체적으로는 단일클론 항체 27C5.6 및 26H6.19를 포함한다. 2개의 MCM2 단일클론 항체와 토포이소머라제 II 알파(Topo2A)에 대한 3차 항체를 포함하는 키트를 추가적으로 제공한다. 복수개의 항체가 키트에 존재하는 경우, 각 항체는 개별 시약으로 또는 대안적으로 대상 항체들 모두 함유하는 항체 칵테일로서 제공할 수 있다. 더욱이, 임의 또는 모든 키트 시약은 밀폐된 용기와 같이 외부 환경으로부터 차폐시키는 용기내로 제공할 수 있다. 본 발명의 키트는 고등급의 자궁경부 질환의 진단에 유용하며, Pap 염색용 시약(예, EA50 및 오렌지 G)를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 계류중인 2005년 3월 23일자 미국 출원 11/087,227, 표제 "고등급의 자궁경부 질환 검출 방법 및 조성물"에 개시된 바와 같은 환자에서 고등급의 자궁경부 질환을 진단하는 방법에 사용되며, 상기 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. "고등급의 자궁경부 질환 진단"은, 예컨대 자궁경부 질환의 존재 진단 또는 검출, 질병의 경과 모니터링, 및 고등급의 자궁경부 질환임 나타내는 세포 또는 샘플의 동정 또는 검출을 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "고등급의 자궁경부 질환의 진단, 검출 및 동정"은 본원에서 상호 호환적으로 사용된다. "고등급의 자궁경부 질환"은 질경 검사로 분류한 전악성 병리, 악성 병리, 중간 내지 중증의 이형성 및 자궁경부암과 같은 증상을 의미한다. 잠재적인 고등급의 자궁경부 질환은 CINII, CINIII, HSIL, 내관성(in situ) 암종, 선암종(adenocarcinoma) 및 암(FIGO stages I-TV)의 조직학적 동정을 포함한다.
본 발명의 방법은 고등급의 자궁경부 질환에서 선택적으로 과다 발현되는 하나 이상의 핵의 바이오마커의 과다 발현을 검출하는 단계를 포함한다. "핵의 바이오마커"는 세포의 핵에서 우세적으로 발현되는 임의 단백질의 유전자이다. 핵의 바이오마커는 세포의 다른 부위에서 낮게 발현될 수 있다. "고등급의 자궁경부 질환에서 선택적으로 발현된"은 대상인 핵의 바이오마커가 LSIL, CINI, 어떠한 이형성이 없는 HPV-감염 샘플, 미성숙 화생성 세포(immature metaplastic cell) 및 임상 질환으로 간주되지 않는 그외 상태로 분류된 상태에서는 발현되지 않으나, 고등급의 자궁경부 질환에서 과다 발현되는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 핵 바이오마커 검출은 양성 증식, HPV 감염 초기 단계 또는 경증의 이형성을 나타내는 샘플로부터 잠재적인 고등급의 자궁경부 질환을 보이는 샘플을 식별할 수 있게 한다. 특히 관심있는 핵의 바이오마커는 MCM 단백질, 특히 MCM2 및 Topo2A이다.
본 발명의 특정 측면에서, 본 방법은 환자에서 자궁경부 샘플을 수득하는 단계, 본 발명의 하나 이상의 MCM2 단일클론 항체를 상기 샘플과 접촉시키는 단계 및 상기 항체의 MCM2 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 다른 예로, 상기 샘플을 MCM2, 특히 단일클론 항체 27C5.6 및 26H6.19에 특이적으로 결합하는 2종 이상의 단일클론 항체와 접촉시킨다. 다른 예로, 상기 샘플을 Topo2A에 특이적으로 결합하는 3차 항체 및 상기 2개의 MCM2 단일클론 항체와 접촉시킨다. 항체 결합 검출 기법은 당업계에 잘 알려져 있다. 대상인 바이오마커에 대한 항체 결합은 항체 결합 정도, 즉 바이오마커 단백질 발현 정도에 상응하는 검출가능한 신호를 형성하는 화학 시약을 이용하여 검출할 수 있다. 항체-항원 결합을 검출하는 모든 방법을 사용하여 본 발명의 방법을 실시할 수 있다.
본원에서, "자궁경부 샘플"은 바이오마커의 발현을 검출할 수 있는 모든 세포, 조직 또는 체액 샘플링을 의미한다. 이러한 생체 샘플의 예로는, 부인성 체액(gynecological fluid), 생검 및 스미어(smear)를 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 자궁경부 샘플은 예컨대, 부위 스크랩핑 또는 스위빙(swabbing) 또는 바늘을 이용한 생체 체액 흡입에 의한 것을 포함한, 다양한 방법으로 환자로부터 채취할 수 있다. 자궁경부 샘플의 채취 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 특정 예로, 자궁경부 샘플은 자궁경부 세포, 특히 액체-기재의 조제물의 자궁경부 세포이다. 일 예로, 자궁경부 샘플은 예컨대 SurePath®(TriPath Imaging, Inc.) 또는 ThinPrep®preparation(CYTYC, Inc.)과 같은 액체 기재의 조직 검체 제조 가이드라인에 따라 채취한다. 자궁경부 샘플은 현미경에서 검경하기 위해 글라스 슬라이드로 이동시킬 수 있다. 고정제 및 염색 용액을 글라스 슬라이드 상의 세포에 적용하여, 검체를 보존시키고 검경을 용이하게 할 수 있다. 일 예로, 자궁경부 샘플은 미국 특허 제 5,346,831호에 기재된 바와 같이 채취하고 처리하여 단일층 샘플로 제공하며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
당업자는 본 발명의 방법에서 임의의 또는 모든 단계들을 수동적으로 또는 자동화 양상으로 수행될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 자궁경부 샘플의 준비, 항체 및 항체 결합 검출 단계들을 자동화할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 고등급의 자궁경부 질환의 보다 정확한 진단을 위해 기존의 Pap 염색 기법과 조합할 수 있다.
하기 실시예는 예시하기 위한 것일 뿐 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: MCM2의 마우스 단일클론 항체의 제조
MCM2에 특이적인 마우스 단일클론 항체를 제조하였다. 항원(면역성 폴리펩티드)은 6개의 히스티딘이 달린 전장 재조합 MCM2 단백질이었다. 항원은 Tni 세포 에서 베큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 발현시켰다. 구체적으로, 6개의 히스티딘이 달린 MCM2(서열번호 10)의 코딩 서열을 Tni 세포 발현용 pFastBac1 플라스미드(Invitrogen)에 클로닝하였다. 베큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 재조합 단백질을 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 표지가 달린 MCM2 단백질을 Ni+2 이온(Ni-NTA from Qiagen)으로 하전된 킬레이팅 아가로즈를 이용하여 정제하여 면역원으로 사용하였다. 면역성의 MCM2 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 11로 제공된다.
마우스 면역화 및 하이브리도마 융합은 기본적으로 Kohler et al. (1975) Nature 256:495-496에 개시된 바에 따라 수행하였다. 용액중의 표지가 달린 MCM2 단백질로 마우스를 면역화하였다. 항체 생산 세포를 면역화된 마우스에서 분리하여 골수종 세포와 융합시켜, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조하였다. 하이브리도마는 선별 배지에서 배양하였다. 제조된 세포는 연속 희석으로 평반 배양하고, MCM2에 특이적으로 결합하는 (무관한 항원에는 결합하지 않는) 항체 생산에 대해 분석하였다. 대상인 단일클론 항체가 오직 MCM2 단백질와만 반응하고 6개의 히스티딘 표지와는 반응하지 않는지를 확인하기 위해, 선별한 하이브리도마를 MCM2-FLAG-표지된 단백질에 대해 스크리닝하였다. MCM2-FLAG 단백질의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 12 및 13에 나타낸다. 이후, 선별한 단일클론 항체(mAb)를 분비하는 하이브리도마를 배양하였다.
"고갈된(exhausted)" 하이브리도마 세포(즉, 생활성이 0-15%가 될때까지 배 양한 세포)의 배양 배지 상층액으로부터 재조합 단백질 A가 코팅된 수지(STREAMLINE®, Amersham, Inc.)를 이용하여, 항체를 정제하였다. 낮은 pH로 항체를 용출시키고, 바로 pH를 중성화하였다. 280 nM에서 현저한 흡광을 보이는 분획으로 풀을 형성하였다. 수득한 풀은 PBS로 투석하였다. 정제한 항체를 추가적으로 특정화하였다. MCM2 단일클론 항체인 26H6.19 및 27C5.6 둘다 IgG1 이소타입인 것으로 결정되었다. 이들 항체의 에피토프 맵핑은 하기에 상세하게 기재되어 있다.
실시예 2: 하이브리도마 세포에서 단일클론 항체 분리
하기 과정으로 하이브리도마 세포에서 단일클론 항체를 분리하였다:
배지 제조
- 멸균한 1,000 ml 보관용 병에, Hyclone FBS(Fetal Bovine Serum) 100 ml을 넣는다.
- MEM 비필수 아미노산 용액 10 ml을 첨가한다.
- 페니실린-스트렙토마이신-L-글루타민 용액 10 ml을 첨가한다.
- ExCell 610-HSF 배지를 첨가하여 총 부피가 약 1000 ml이 되도록 만든다.
- 병에 멸균 마개를 꽉 닫는다. 서서히 돌려 혼합한다.
- 진공 펌프 시스템에 1000 ml의 멸균 아세테이트 진공 필터 유닛(0.2 ㎛)을 연결한다.
- 배지 용액의 거의 절반을 멸균 아세테이트 진공 필터 유닛에 조심스럽게 붓고 진공 펌프를 가동한다.
- 일차 배지 절반을 여과하고, 나머지 배지를 필터 유닛에 부어 여과를 계속한다.
- 배지 모두를 여과한 다음 진공 호스를 진공 필터 유닛에서 빼내고 진공 펌프를 끈다. 필터 병에서 필터 유닛의 리시버 부분을 제거한다. 병에 새로운 멸균 병 마개를 장착한다.
- 2℃ 내지 10℃에서 보관한다. 광은 차단시킨다.
일차 하이브리도마 세포 배양
- 하이브리도마의 동결시킨 스톡 배양물의 바이얼을 미리 데워둔 37℃ H2O 수조에서 해동시킨다.
- 동결 바이얼 외면에 70% 에탄올을 분무한다.
- 해동시킨 바이얼을 생물학적으로 안전한 캐비넷(Biological Safety Cabinet)에 이동시킨다.
- 동결 바이얼에서 세포를 세거하여 15 ml 원심분리 튜브로 이동시킨다.
- 세포 배양 배지 7 ml을 해동시킨 세포가 있는 15 ml 원심분리 튜브에 점적한다.
- 해동시킨 세포와 배양 배지가 있는 15 ml 원심분리 튜브를 5분간 200 g에서 원심분리한다.
- 세포가 원심분리기에 있는 동안, 세포 배양 배지 45 ml을 멸균 T-225 플라 스크에 첨가한다.
- 원심분리한 후, 튜브에서 세포 펠렛 존재를 육안으로 조사한다.
- 세포 펠렛을 제거하지 않게 조심스럽게 원심분리 튜브에서 배지를 제거한다. 주의: 세포 펠렛이 흐트러지면 원분리 단계를 재수행한다.
- 세포 배양 배지 5 ml을 펠렛화된 세포가 있는 15 ml 원심분리 튜브에 넣는다. 파이펫으로 세포 펠렛을 배지에 재현탁한다.
- 재현탁된 세포와 배양 배지 전부를 배지 45 ml이 있는 T-225 플라스크로 이동시킨다.
- T-225 플라스크에 뚜껑을 덮는다.
- 현미경으로 완전한 세포의 존재를 관찰한다. T-225 플라스크를 즉시 이산화탄소 인큐베이터로 옮겨 세포를 철야 배양한다.
하이브리도마 세포주의 증폭
- 생활성, 농도 및 오염원의 존재에 대해 세포 배양물을 계속적으로 모니터링한다.
- 농도가 약 600,000 cells/ml 내지 800,000 cells/ml이고 총 배지가 200 내지 250 ml이 될때까지 처음 T-225 플라스크의 세포 현탁물을 모니터링하고 조절한다.
- 세포를 이동시키고, 추가적인 배지를 필수 최소 세포 밀도가 되도록 첨가하다. 세포 현탁물을 나누어 다른 새로운 멸균 T-225 플라스크로 옮긴다. 2 x T-225 플라스크를 이산화탄소 인큐베이터에 넣는다.
- 농도가 약 600,000 cells/ml 내지 800,000 cells/ml이고 각 플라스크의 총 배지가 200 내지 250 ml이 될때까지 2 x T-225 플라스크의 세포를 모니터링한다.
- 세포를 이동시키고, 추가적인 배지를 필수 최소 세포 밀도가 되도록 첨가하다. 세포 현탁물을 나누어 다른 새로운 2개의 멸균 T-225 플라스크로 옮겨 총 4 x T-225 플라스크를 만든다. 플라스크 모두 이산화탄소 인큐베이터에 넣는다.
- 세포를 모니터링하고 총 부피 약 250 ml/T-225 플라스크(또는 대략 총 1000 ml)로 세포 농도가 약 600,000 cells/ml 내지 800,000 cells/ml가 될때까지 4 x T-225 플라스크의 부피를 조절한다.
- 세포가 최종 세포 생활성이 0 내지 15%로 고갈 상태가 될때까지 4 x T-225 플라스크의 세포를 계속 모니터닝한다. 세포 배양 상층액은 투명화 과정(Clarification Process)에 사용하기 위해 준비된다.
상층액의 투명화
- 테이블탑 원심분리기의 전원을 넣는다. 로터 버켓에 500 ml 튜브 어댑터를 장착하고 뚜껑을 덮고 온도를 4℃ (+/-) 4℃로 설정한다.
- 살균 기법을 이용하여, 현재 고갈된 T-225 플라스크 총 4개로부터 배지를 2 x 500 ml 코니칼 원심분리 튜브로 이동시킨다.
- 2 x 500 ml 튜브의 균형을 맞춘다. 균형을 맞추기 위해, 한쪽 튜브에서 다른 튜브로 상층물을 이동시킨다.
- 고갈된 상층물을 15분간 1350 g (+/- 40 g)로 2℃ 내지 10℃에서 원심분리한다.
- 원심분리를 종료한 후, 무균적으로 상층액을 멸균한 1000 ml의 보관용 병에 이동시키고 멸균 마개로 밀봉한다.
- 무균적으로 1 ml을 미세원침관(microfuge tube)에 넣는다. 샘플이 든 미세원침관을 2℃ 내지 10℃에서 보관한다(광 차단).
- 투명화한 상층액 샘플은 Easy-Titer® Assay을 이용한 IgG 평가를 위해 준비된다.
완충액 제조
결합 완충액:
- 깨끗한 비이커에 DI H2O 약 600 ml을 넣는다.
- 붕산 용액 77.28 ml(4% W/V)을 넣는다. 깨끗한 교반 막대를 넣어 실온에서 교반한다.
- 소듐 클로라이드 233.76 g을 측정하여 교반하는 중에 상기 용액에 첨가한다.
- 상기 용액이 약 950 ml이 되도록 DI H2O를 가하고, 계속 교반한다.
- 소듐 클로라이드가 용해되어 용액이 투명해지면, 소듐 하이드록사이드로 pH를 9.0 + 0.2로 조절한다.
- 상기 용액을 청결한 1000 ml의 눈금 실린더에 옮기고, DI H2O를 총 부피 1000 ml이 되도록 넣는다.
- 전체 완충액을 적절한 보관용 병에 옮긴다. 이 완충액은 사용하기 전에 최대 7일간 보관할 수 있다.
- 전체 과정을 반복하여 결합 완충액 0.2 L 내지 1.0 L를 더 만든다.
용출 완충액
- 소듐 포스페이트(모노베이직) 1.725 g을 측정하여 깨끗한 교반 막대가 있는 250 ml의 깨끗한 비이커에 넣는다.
- 소듐 사이트레이트 3.676 g을 측정하여 상기 동일한 깨끗한 250 ml 비이커에 넣는다.
- DI H2O를 약 175 ml 첨가하여 용해될때까지 실온에서 교반한다.
- 소듐 클로라이드 4.38 g을 측정하여, 계속 교반하면서 상기 용액에 첨가한다.
- DI H2O를 최종 부피 약 225 ml이 되도록 용액에 첨가하고 계속 교반한다.
- 소듐 클로라이드가 용해되어 용액이 투명해지면, 염산으로 pH를 3.5 + 0.2로 조절한다.
- 용액을 깨끗한 250 ml의 눈금 실린더로 옮기고, DI H2O로 총 부피 250 ml을 만든다.
- 진공 펌프 시스템에 멸균 아세테이트 진공 필터 유닛(0.2 ㎛)을 연결하고, 상기 용액을 필터-멸균한다.
- 필터를 제거하고 멸균 마개로 용기를 밀봉한다.
항체 흡착
- 투명화된 상층액(~1L)를 깨끗한 교반 막대가 있는 깨끗한 4000 ml 플라스틱 비이커에 붓는다.
- 결합 완충액을 거의 동량(~1L)으로 상기 투명화된 상층액이 있는 깨끗한 4000 ml 플라스틱 비이커에 첨가한다. 깨끗한 교반 막대를 넣는다.
- 깨끗한 플라스틱 랩으로 비이커를 덮고 "항체 결합"이라고 표시한다.
- 표 1의 데이타를 이용하여 STREAMLINE® 단백질 A의 대략적인 필요량을 계산한다.
표 1: 단백질 A 수지의 필요량
상층액내 IgG 함량(㎍/ml) 단백질 A 수지의 필요량(ml)
>180 - < 200 12.0
>160 - < 180 11.0
>140 - < 160 10.0
>120 - < 140 9.0
>100 - < 120 8.0
>80 - < 100 7.0
>60 - < 80 6.0
>40 - < 60 4.5
>20 - < 40 3.5
< 20 2.0
- 깨끗한 일회용 컬럼과 마개(stopcock)를 링 스텐드와 클램프에 조립한다. 마개를 덮는다.
- 병을 수차례 거꾸로 흔들어 적당량의 STREAMLINE 단백질 A 비드를 혼합한다. 필요량을 취하여 상기 일회용 컬럼에 넣는다.
- DI H2O 10 ml로 STREAMLINE 단백질 A 비드를 헹군다. 마개를 열고 DI H2O 를 배출시킨다. 마개를 덮는다. DI H2O 10 ml을 넣어 반복한다.
- STREAMLINE 단백질 A 비드를 결합 완충액 10 ml로 헹군다. 마개를 열어 결합 완충액을 배출시킨다. 마개를 덮는다. 다시 결합 완충액 10 ml을 넣어 반복한다.
- STREAMLINE 단백질 A 비드를 상기 투명화한 상층액 및 결합 완충액 용액 ~ 10 ml(4000 ml 비이커)에 재현탁하고, 비드를 투명화한 상층액 및 결합 완충액이 있는 4000 ml 비이커에 이동시킨다. 나머지 비드를 모두 이동시킬때까지 반복한다. 완료되면, 컬럼과 마개를 버린다.
- 이 혼합물을 2℃ 내지 10℃에서 약 18시간동안 왕성하게 혼합한다.
- 혼합을 종료하고, 교반 플레이트를 끄고 완충화한 상층액과 비드 현탁물이 있는 "항체 결합" 비이커를 랩 벤치로 다시 이동시킨다. STREAMLINE 단백질 A 비드가 비이커 바닥에 가라앉도록 둔다(약 5분).
- 깨끗한 일회용 컬럼과 마개(stopcock)를 링 스텐드와 클램프에 조립한다. 마개를 덮는다.
- 깨끗한 250 ml의 병 또는 적당한 용기에 "컬럼 세정 - 결합 후(column Wash-Post Binding)"라고 표시한다.
- 깨끗한 플라스틱 비이커에 "상층액-결합 후"라고 표시한다.
- 4000 ml 비이커의 상층액을 표시해둔 깨끗한 2 L 플라스틱 비이커로 옮기고, 비드는 4000 ml의 비이커 바닥이 두었다. "상층액-결합 후" 용액이 있는 2000 ml 비이커를 깨끗한 랩으로 밀봉하여, 2℃ 내지 10℃에 보관한다.
- 결합 완충액 15 ml을 상기 옮긴 4000 ml의 "항체-결합" 비이커에 첨가한다. STREAMLINE 단백질 A 비드를 재현탁하고 이것을 컬럼에 이동시킨다. 마개를 열어 결합 완충액이 "컬럼 세정 - 결합후" 용기로 배출시킨다. 배출한 후 마개를 덮는다.
- 상기 단계와 같이 추가적으로 결합 완충액을 첨가하여, 혼합하고 컬럼에 넣어, "항체 결합" 비이커에 남아있는 모든 STREAMLINE 단백질 A 비드를 이동시킨다. 배출한 후 마개를 덮는다.
- 표 2의 데이타를 이용하여 컬럼에서 STREAMLINE 단백질 A 비드를 세정하는데 필요한 결합 완충액의 적당량을 계산한다.
표 2: 컬럼 세정에 필요한 결합 완충액의 양
상층액내 IgG 함량(㎍/ml) 결합 완충액의 필요량(ml)
> 180 - < 200 각각 15.0 ml로 5번 컬럼 세정
> 160 - < 180 각각 15.0 ml로 5번 컬럼 세정
> 140 - < 160 각각 12.5 ml로 5번 컬럼 세정
> 120 - < 140 각각 12.5 ml로 5번 컬럼 세정
> 100 - < 120 각각 12.5 ml로 5번 컬럼 세정
> 80 - < 100 각각 10.0 ml로 5번 컬럼 세정
> 60 - < 80 각각 10.0 ml로 5번 컬럼 세정
> 40 - < 60 각각 7.5 ml로 5번 컬럼 세정
> 20 - < 40 각각 5.0 ml로 5번 컬럼 세정
< 20 각각 5.0 ml로 5번 컬럼 세정
- 적절한 세정 회수로 컬럼내 STREAMLINE 단백질 A 비드를 적당량의 결합 완충액으로 세정하고, 유출액은 "컬럼 세정 - 결합 후" 용기에 계속적으로 모운다.
- 완료한 후, 마개를 덮는다. "컬럼 세정 - 결합 후" 용기는 2℃ 내지 10℃에 보관한다.
- 표 3으로부터 컬럼내 STREAMLINE 단백질 A 비드를 용출시키는데 필요한 용출 완충액 및 중성화 완충액의 총 부피를 결정한다.
표 3: 용출 완충액 및 중성화 완충액의 양 결정
상층액내 IgG 함량(㎍/ml) 용출 완충액의 총 필요량(ml) 중성화 완충액의 총 필요량(ml) 분획 당 용출 완충액의 총 필요량(ml) 분획 당 중성화 완충액의 총 필요량(ml)
> 180 - < 200 72 7.2 12 1.2
> 160 - < 180 66 6.6 11 1.1
> 140 - < 160 60 6.0 10 1.0
> 120 - < 140 54 5.4 9 0.9
> 100 - < 120 48 4.8 8 0.8
> 80 - < 100 42 4.2 7 0.7
> 60 - < 80 36 3.6 6 0.6
> 40 - < 60 27 2.7 4.5 0.45
> 20 - < 40 21 2.1 3.5 0.35
< 20 12 1.2 2 0.2
- 9개의 멸균 코니컬 원심분리 튜브에 "용출된 항체" 분획 #(1에서 9)을 표시한다.
- 분획 당 필요한 중성화 완충액의 적당량(상기 표 3에서 결정된 바에 따라)을 9개의 "용출된 항체" 분획 튜브에 넣고, 컬럼 마개 아웃렛(stopcock outlet) 하에 안전하게 둔다.
- 적당량의 분획당 필요한 용출 완충액으로 컬럼내 STREAMLINE 단백질 A 비드 분획을 용출시키고, 동시에 중성화 완충액이 함유된 "용출된 항체" 튜브 각각으로 용출물을 모운다.
- 용출을 완료하면, 여러번 흔들면서 "용출된 항체" 분획 튜브 각각을 부드럽게 혼합한다. 분획 3번에서 50 ㎕을 취하여 pH 테스트 종이 스트립에 떨어뜨려, 용출물이 거의 pH 6.5 - 8.5인지를 확인한다. 필요에 따라 중성화 완충액 또는 용 출 완충액을 첨가하여 pH를 상기 범위로 조절한다.
- pH 확인이 끝나면, 280 nm - 400 nm에서 각 분획의 샘플 흡광 스캔을 수행하여, 투석 단계를 수행하기 전에 용출물내 IgG의 농도를 대충 결정한다.
A280-A400 수치가 > 0.200이면 분획을 용출액 풀(eluate pool)로 수용한다.
A280-A400 수치가 < 0.200이면 분획을 용출액 풀로 수용하지 않는다.
- 멸균 코니컬 원심분리 튜브를 "용출된 항체", "용출액 풀"로 표시하고, 풀의 일부분으로서 수용한 모든 분획을 조합한다.
- 용출액 풀의 샘플을 흡광 스캔하여, 투석 단계를 수행하기 전에 용출액내 IgG 농도를 대충 결정한다.
- 용출액 풀의 부피를 추정하고, IgG의 총 mg을 대략적으로 계산한다.
- 용출액 풀의 부피: ____ml x ____IgG mg/ml = _____IgG 총 mg
항체 투석
- "용출된 항체" 튜브를 2℃ 내지 10℃에 이동시킨다.
- 용출액의 대략적인 부피 및 표 4의 데이타를 이용하여 항체 투석에 필요한 투석관(Dialysis Tubing)의 길이를 대략적으로 계산한다.
표 4: 필요한 투석관의 길이 계산
용출액의 대략적인 부피(ml) 투석관의 체적/길이 비 용출액 샘플에 필요한 대략적인 길이(cm) 20%의 헤드 스페이스(cm) 샘플+헤드스페이스에 필요한 대략적인 길이(cm) 관을 묶는데 필요한 대략적인 길이(cm) 투석관의 대략적인 총 필수 길이(cm)
39.6 2 20 4 24 15 63
36.3 2 18 4 22 15 59
33.0 2 17 3 20 15 55
29.7 2 15 3 18 15 51
26.4 2 13 3 16 15 47
23.1 2 12 2 14 15 43
19.8 2 10 2 12 15 39
14.85 2 7 1 9 15 33
11.55 2 6 1 7 15 29
6.6 2 3 1 4 15 23
- 필요한 대략적인 투석관의 길이대로 자른다(Spectra/Por® 2 Regenerated Cellulose Membrane, 12,000 - 14,000 Dalton Molecular Weight Cutoff (MWCO), 16 mm Diameter, Spectrum Laboratories Inc., Cat. No. 132678)
- 투석관은 30분 이상 1000 ml의 DIH2O에서 수화시킨다.
- 표 5의 데이타를 이용하여 항체 용출액 투석에 필요한 투석 완충액의 대략적인 용량을 계산한다.
표 5: 필요한 투석 완충액의 용량
상층액내 IgG 양 (㎍/ml) 용출된 항체의 최종 부피(ml) 투석관의 필수 길이(cm) 필수 투석 완충액 용량(1 X PBS)
> 180 - < 200 39.6 ml 63 cm 4.0L, 3회 교체
> 160 - < 180 36.3 ml 59 cm 3.6L, 3회 교체
> 140 - < 160 33.0 ml 55 cm 3.3L, 3회 교체
> 120 - < 140 29.7 ml 51 cm 3.0L, 3회 교체
> 100 - < 120 26.4 ml 47 cm 2.6L, 3회 교체
> 80 - < 100 23.1 ml 43 cm 2.3L, 3회 교체
> 60 - < 80 19.8 ml 39 cm 1.9L, 3회 교체
> 40 - < 60 14.85 ml 33 cm 1.5L, 3회 교체
> 20 - < 40 11.55 ml 29 cm 1.2L, 3회 교체
< 20 6.6 ml 23 cm 0.7L, 3회 교체
- 적당한 크기의 플라스틱 비이커에 투석 완충액 적량을 넣는다. 비이커에 "투석된 항체"라고 표시한다. 깨끗한 교반 막대를 넣고 비이커를 냉장고 또는 2℃ - 10℃의 저온실에 있는 교반 플레이트 위에 올린다.
- DI-H2O로 투석관을 잘 헹군다. 투석관은 한 쪽 말단의 약 7 cm 지점에서 2번 매듭으로 꽉 묶는다.
- DI-H2O 약 5 ml을 투석관에 넣는다.
- "용출된 항체" 채집 튜브에서 용출된 항체를 꺼내 투석관에 넣는다.
- 투석관의 나머지 한쪽 끝에서 약 7 cm 지점에서 2분 매듭으로 꽉 묶는다. 헤드스페이스는 표 4에서와 같은 길이가 되게 하다.
- 적량의 1X PBS가 있는 투석조(dialysis reservoir)에 투석관을 넣고 닫는다(표 5).
- 비이커를 플라스틱 랩으로 덮는다. 교반 플레이트 위에 두고, 투석 샘플이 자유롭게 돌지만 투석액의 소용돌이 쪽으로 내려가지 않도록 속도를 조절한다. 투석은 총 24시간 동안 3번 완충액을 교체하면서 2℃ 내지 10℃에서 수행하여야 한다.
항체 여과
- 멸균 채집용 튜브를 "투석한 항체"로 표시한다.
- 투석한 투석관을 투석 비이커에서 꺼낸다. 투석관 한 쪽 끝을 잘라 개봉하여, 투석한 샘플을 "투석한 항체"로 표시한 원심분리 튜브로 이동시킨다.
- 다른 멸균 채집용 투브에 "투석한 항체"라고 표시한다.
- 투석한 샘플의 최종 용량을 수용할 수 있는 적정 수용량의 멸균된 Luer Lok 시린지를 선택한다.
- Acrodisc® 시린지 필터를 시린지 개방구(opening)(0.2 ㎛ HT Tuffryn® Membrane, Low Protein binding, Gelman Laboratories, Cat. No. 4192)에 부착한다. 시린지에서 플런저를 빼고 시린지를 수직으로 세운 채 "투석한 항체" 튜브에서 시린지로 투석한 단일클론 항체를 이동시킨다. 플런저를 다시 장착한다.
- 개방된 멸균한 "정제한 항체"로 표시한 채집용 튜브 위에 Acrodisc® 시린 필터를 유지시키고, 시린지 플런저를 밀어 정제된 항체를 "정제한 항체" 튜브로 여과한다.
- 여과가 끝나면, "정제한 항체" 튜브를 막아 2℃ 내지 10℃에 보관한다.
- 정제한 단일클론 항체의 농도를 A280 공정으로 결정한다.
실시예 3: 일반적인 에피토프 맵핑 방법
일반적인 방법
특정 단일클론 항체에 의해 인지되는 항원성 단백질(즉, 에피토프)의 선형 아미노산 서열을 동정하기 위해 에피토프 맵핑을 수행하였다. 일반적인 에피토프 맵핑 방법에는 전장 단백질 뿐만 아니라 상기 단백질의 여러가지 단편(즉, 절단된 형태)의 이종 발현 시스템에서의 발현이 필요하다. 이후, 이들 다양한 재조합 단백질을 사용하여, 특이적인 단일클론 항체가 표적 단백질의 절단형 하나 이상과 결 합할 수 있는 지를 결정한다. 반복적인 절단과 중첩되는 아미노산 부위를 이용한 재조합 단백질 제조를 이용하여, 조사중인 단일클론 항체가 인지하는 부위를 동정 가능하다. 웨스턴 블롯 분석 또는 ELISA는 조사중인 특이적인 단일클론 항체가 하나 이상의 재조합 단백질 단편에 결합할 수 있는지를 결정하는데 사용된다. 이러한 방법은 궁극적으로 에피토프를 함유하는 펩티드 부위를 동정할 수 있으며, 일부 경우에는 8-11 아미노산 서열로 에피토프를 정확하게 정제할 수 있다.
구조체 설계 및 제조
에피토프 맵핑의 제1 단계는 네스티드 유전자 절단체(nested gene truncation)를 설계하는 것이다. 흔히, 유전자는 추가적인 분석을 위해 4개의 동등한 파트로 나눈다.
유전자 클로닝 전략
일반적인 클로닝 전략은 클로닝된 유전자 단편의 PCR을 이용한 제조로 시작한다. 클론닝된 단편을, 특히 작은 아미노산 영역을 이용할때 효율적으로 발현시키기 위해, 클로닝된 단편을 융합 단백질, 즉 시스템에서 안정적으로 발현되는 다른 캐리어 단백질에 융합된 상태로 발현시킨다. GFP(Green fluorescent protein)는 흔히 사용되는 캐리어 단백질이다. GFP는 절단 단편을 안정화시키고, 이후의 시험관내 단백질 발현 단계에서 발현을 개선시키기 위한, 융합 파트너로서 포함된다. 또한 GFP는 항-GFP 항체를 이용하여 융합 단백질 발현을 추적 가능하다.
GFP-단백질 구조체를 제조하기 위한 클로닝은, 메가-프리밍 방법(mega-priming approach)을 이용하거나 또는 플라스미드를 pScreen-GFP 벡터로 클로닝함 으로써 수행한다. 일반적으로, 절단 단편을 GFP와 메가프리밍이라고 하는 기법을 이용하여 단백질 발현에 필수적인 조절 서열과 융합시킨다.
메가프리밍은 해당 단편의 끝에 상동한 영역을 어닐링하고 열에 안정적인 DNA 중합효소로 어닐링된 단일가닥 DNA를 연장함으로써, 2 이상의 DNA 단편을 연결하는 것이다. 이러한 과정으로 공유된 서열로 연결된 2 이상의 소형 단편들로부터 하나의 거대한 DNA 단편이 만들어진다. 이러한 거대 단편은 이후 표준적인 PCR로 증폭시킨다.
메가프리밍을 성공적으로 실시할 수 없다면, 절단 단편을 GFP 및 단백질 발현 조절 서열이 함유된 플라스미드로 클로닝할 수 있다. 이러한 클로닝으로 에피토프 맵핑에 필요한 GFP/단편 융합체가 제조된다. 나머지 프로토콜은 후술한 바와 같이 진행할 수 있다.
단백질 발현
예컨대 메가프리밍에 의해 제조된 발현 구조체를 RTS(Rapid Translation System)에 도입한다. RTS는 E. coli 용균물(lysate) 유래의 무세포성 단백질 발현 시스템이다. 이러한 시스템으로 DNA 주형으로부터 단백질의 신속한(3-4시간) 발현이 가능하다.
RTS로 단백질 발현을 적절한 수준으로 형성하지 못한다면, 절단 단편을 GFP 단백질-발현 플라스미드로 클로닝한다. 이들 융합 플라스미드를 단백질 발현에 대해 최적화된 E. coli 균주로 형질전환한다. 박테리아 배양 배지에서 단백질 발현을 유도하고, 생장시킨 다음 세포를 용균시킨다. 세포 용균물 복합체의 단백질을 PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리시키며, 나머지 프로토콜은 하기와 같다.
단백질 검출 및 에피토프 맵핑
RTS로 제조한 단백질 단편을 PAGE로 분리하여 나이트로셀룰로스막으로 이동시킨다. 막에 결합된 단백질을 이후 용액중의 조사 항체에 노출시킨다. 당업계에 공지된 색도계 기법으로 항체/단백질 결합을 동정한다.
전장 단백질 및 절단된 단백질 단편의 일부 서브세트에 대한 항체 결합은 양성 결과를 보인다. 만약, 단백질의 특정 섹션의 부재가 항체 결합성을 없앤다면, 에피토프는 그 단편에 있는 것이다.
만약 맵핑한 항체가 나이트로셀룰로스막에 결합된 단백질을 인지하지 못한다면, 예컨대 ELIAS 또는 면역침강과 같은 항체/단백질 상호작용을 검출하는 다른 방법을 사용한다. 항체/단백질 상호작용을 검출하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
에피토프 위치의 구체화
전술한 프로토콜은 에피토프의 위치를 약 1/4 단백질 이하로 좁힐 뿐이므로, 에피토프의 위치를 더욱 규명하기 위해서는 에피토프를 포함하는 것으로 결정된 단백질의 1/4에 프로세스를 반복 실시할 필요가 있다. 매우 큰 단백질의 경우, 에피토프를 8-15개의 아미노산으로 좁히기 위해서는 상기 과정을 2-3번 반복해야할 수 있다.
실시예 4: MCM2 단일클론 항체인 27C5.6 및 26H6.19에 대한 에피토프 특정화
MCM2 단일클론 항체인 27C5.6 및 26H6.19의 에피토프 맵핑은 근본적으로는 실시예 3에 개시된 바에 따라 수행하였다. 구체적으로, PCR로 MCM2 유전자 절단을 만들고, RTS를 수행하여 MCM2 단백질 단편을 제조한 다음, 마지막으로 웨스턴 블롯으로 MCM2에 항체 결합을 검출하였다. PCR 2번째 라운드에서 MCM2 유전자 절단에 GFP를 연결시켜, RTS에서 양호하며 안정적인 발현을 확보하였다.
MCM2(서열번호 2; NM_004526)의 전장 코딩 서열은 2715 bp이다. 그러나, 재조합 MCM2 단백질을 발현시키기위해 사용되며 MCM2 항체 제조시에 마우스에 면역화시키는 cDNA의 유전자 크기는 2688 bp(서열번호 5)이다. 절단된 MCM2 cDNA는 MCM2 단백질의 5' 말단에 27 bp 영역, 특히 ATGGCGGAATCATCGGAATCCTTCACC(서열번호 6)이 없다. MCM2-27C5.6 항체의 에피토프를 맵핑하기 위해, 하기 순차적인 단계를 수행하였다:
MCM2 유전자는 매우 크기에(>1000bp), 필요한 PCR 반복 횟수를 최소화하기 위해, 유전자를 약 400 bp로 6 영역(1-6)으로 똑같이 나누었다. 2차 PCR 사이클에서 메가프리밍을 허용하기 위한 상동 서열과 pScreen-GFP 플라스미드로 서브-클로닝하는 2번째 옵션을 위한 제한효소 부위를 포함하는, 중첩 서열을, 1차 PCR을 수행하는 동안에 대상 유전자에 부가하였다. 1차 PCR 라운드에서 하기 영역을 포함하는 MCM2 뉴클레오티드 서열(서열번호 5)의 절단 단편이 제조되었다: 영역 [1]은 1-426 bp이고, 영역 [1-2]는 1-888 bp이고, 영역 [1-3]은 1-1377 bp이고, 영역 [1-4]는 1-1845 bp이고, 영역 [1-5]는 1-2241 bp이고, 영역 [1-6]은 1-2688 bp이고, 영역 [2-6]은 427-2688 bp임. 각 영역(예, 영역 [5])은 발현되지 않아, 영역들간의 접합(junction) 서열에 존재하는 에피토프가 빠지는 것을 방지하였다.
MCM2의 1차 PCR 산물은 메가프리밍하기에는 너무 커서, pSCREEN-GFP (BamH1-Xho1)에 서브클로닝하였다. 성공하지 못한 절단체는 전장 길이의 영역[1-6]이었다. 전장 유전자 및 절단체를 증폭시키는데 사용한 오리지날 프라이머를 제한효소 부위(5' 말단에 BAMH1; 3' 말단에 XHO1)를 포함하도록 조작하여, pSCREEN-GFP에 서브클로닝을 직접할 수 있게 하였다.
제조된 GFP-유전자 융합물은 Roche 사의 RTS 100 E. coli HY 키트를 이용한 RTS 반응으로 단백질을 제조하는데 주형으로 사용하였다. RTS로부터 단백질 산물을 아세톤 침전시키고, 직접 변성형 폴리아크릴아미드 젤에 로딩하여, 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 웨스턴 블롯에 27C5.6 단일클론 항체 및 GFP 항체를 직접 탐침시켰다.
1차 RTS 산물에 GFP 항체 및 MCM2 단일클론 항체인 27C5.6을 프로브로 반응시켰다. 양성 밴드가 영역 [1-3]에서 검출되었다. 출발 서열로 영역 [1-3]이 포함된 단편을 이용하여 상기 과정을 반복하였다.
2차 RTS에서, 영역 MCM2-3Q3(CQSAGPFEVNMEETIYQNYQRIRIQESP(서열번호 7); 서열번호 1의 355 내지 382번의 아미노산 잔기에 해당됨.)에서 27C5.6 항체에 대한 양성 결과가 나타났다. 출발 서열로서 영어 MCM2-3Q3가 포함된 단편을 이용하여 상기 과정을 반복하였다.
3차 RTS에서, 영역 MCM2-3Q3.2(IYQNYQRIRIQESP(서열번호 3); 서열번호 1의 369 내지 382번의 아미노산 잔기에 해당됨.)에서 27C5.6 항체에 대한 양성 결과가 나타났다. 그러나, 영역 MCM2-3Q3.1(CQSAGPFEVNMEET (서열번호 8); 서열번호 1의 355 내지 368번의 아미노산 잔기에 해당됨.) 또는 MCM2-3Q3.2(EVNMEETIYQNYQR(서열번호 9); 서열번호 1의 362 내지 375번의 아미노산 잔기에 해당됨.)에서는 양성 결과가 나타나지 않았다.
결과
처음 결과에서는, MCM2 단일클론 항체인 27C5.6에 대한 에피토프가 MCM2 단백질의 N-말단 영역내에 위치되어 있음을 확인하였다. 연속적인 MCM2 단백질 절단으로, 27C5.6에 의해 인지되는 에피토프는, 구체적으로 서열번호 1의 369-382번 아미노산 잔기(IYQNYQRIRIQESP (서열번호 3))에 해당되는 14개의 아미노산 영역내에 위치되어 있음을 확인하였다. 추가적인 RTS로 에피토프 위치를 더욱 구체화할 수도 있다.
전술한 동일한 과정을 이용하여 MCM2 단일클론 항체인 26H6.19에 대한 에피토프를 동정하였다. 처음 결과는, 에피토프가 MCM2 단백질의 C-말단 영역내에 위치되어 있는 것으로 나타났다. 에피토프는 23개의 아미노산 영역, 구체적으로 서열번호 1의 688-710번의 아미노산(PSNKEEEGLANGSAAEPAMPNTY (서열번호 4))에 해당되는 영역으로 예비적으로 규정되었다. 추가적인 분석으로, MCM2 단일클론 항체 26H6.19의 에피토프를 서열번호 1의 683-692번의 아미노산(HVRHHPSNKE (서열번호 14))을 포함하는 10개의 아미노산 영역으로 구체화하였다.
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Gln Val Glu Arg Ala Thr Glu Asp 145 150 155 160 Gly Glu Glu Asp Glu Glu Met Ile Glu Ser Ile Glu Asn Leu Glu Asp 165 170 175 Leu Lys Gly His Ser Val Arg Glu Trp Val Ser Met Ala Gly Pro Arg 180 185 190 Leu Glu Ile His His Arg Phe Lys Asn Phe Leu Arg Thr His Val Asp 195 200 205 Ser His Gly His Asn Val Phe Lys Glu Arg Ile Ser Asp Met Cys Lys 210 215 220 Glu Asn Arg Glu Ser Leu Val Val Asn Tyr Glu Asp Leu Ala Ala Arg 225 230 235 240 Glu His Val Leu Ala Tyr Phe Leu Pro Glu Ala Pro Ala Glu Leu Leu 245 250 255 Gln Ile Phe Asp Glu Ala Ala Leu Glu Val Val Leu Ala Met Tyr Pro 260 265 270 Lys Tyr Asp Arg Ile Thr Asn His Ile His Val Arg Ile Ser His Leu 275 280 285 Pro Leu Val Glu Glu Leu Arg Ser Leu Arg Gln Leu His Leu Asn Gln 290 295 300 Leu Ile Arg Thr Ser Gly Val Val Thr Ser Cys Thr Gly Val Leu Pro 305 310 315 320 Gln Leu Ser Met Val Lys Tyr Asn Cys Asn Lys Cys Asn Phe Val Leu 325 330 335 Gly Pro Phe Cys Gln Ser Gln Asn Gln Glu Val Lys Pro Gly Ser Cys 340 345 350 Pro Glu Cys Gln Ser Ala Gly Pro Phe Glu Val Asn Met Glu Glu Thr 355 360 365 Ile Tyr Gln Asn Tyr Gln Arg Ile Arg Ile Gln Glu Ser Pro Gly Lys 370 375 380 Val Ala Ala Gly Arg Leu Pro Arg Ser Lys Asp Ala Ile Leu Leu Ala 385 390 395 400 Asp Leu Val Asp Ser Cys Lys Pro Gly Asp Glu Ile Glu Leu Thr Gly 405 410 415 Ile Tyr His Asn Asn Tyr Asp Gly Ser Leu Asn Thr Ala Asn Gly Phe 420 425 430 Pro Val Phe Ala Thr Val Ile Leu Ala Asn His Val Ala Lys Lys Asp 435 440 445 Asn Lys Val Ala Val Gly Glu Leu Thr Asp Glu Asp Val Lys Met Ile 450 455 460 Thr Ser Leu Ser Lys Asp Gln Gln Ile Gly Glu Lys Ile Phe Ala Ser 465 470 475 480 Ile Ala Pro Ser Ile Tyr Gly His Glu Asp Ile Lys Arg Gly Leu Ala 485 490 495 Leu Ala Leu Phe Gly Gly Glu Pro Lys Asn Pro Gly Gly Lys His Lys 500 505 510 Val Arg Gly Asp Ile Asn Val Leu Leu Cys Gly Asp Pro Gly Thr Ala 515 520 525 Lys Ser Gln Phe Leu Lys Tyr Ile Glu Lys Val Ser Ser Arg Ala Ile 530 535 540 Phe Thr Thr Gly Gln Gly Ala Ser Ala Val Gly Leu Thr Ala Tyr Val 545 550 555 560 Gln Arg His Pro Val Ser Arg Glu Trp Thr Leu Glu Ala Gly Ala Leu 565 570 575 Val Leu Ala Asp Arg Gly Val Cys Leu Ile Asp Glu Phe Asp Lys Met 580 585 590 Asn Asp Gln Asp Arg Thr Ser Ile His Glu Ala Met Glu Gln Gln Ser 595 600 605 Ile Ser Ile Ser Lys Ala Gly Ile Val Thr Ser Leu Gln Ala Arg Cys 610 615 620 Thr Val Ile Ala Ala Ala Asn Pro Ile Gly Gly Arg Tyr Asp Pro Ser 625 630 635 640 Leu Thr Phe Ser Glu Asn Val Asp Leu Thr Glu Pro Ile Ile Ser Arg 645 650 655 Phe Asp Ile Leu Cys Val Val Arg Asp Thr Val Asp Pro Val Gln Asp 660 665 670 Glu Met Leu Ala Arg Phe Val Val Gly Ser His Val Arg His His Pro 675 680 685 Ser Asn Lys Glu Glu Glu Gly Leu Ala Asn Gly Ser Ala Ala Glu Pro 690 695 700 Ala Met Pro Asn Thr Tyr Gly Val Glu Pro Leu Pro Gln Glu Val Leu 705 710 715 720 Lys Lys Tyr Ile Ile Tyr Ala Lys Glu Arg Val His Pro Lys Leu Asn 725 730 735 Gln Met Asp Gln Asp Lys Val Ala Lys Met Tyr Ser Asp Leu Arg Lys 740 745 750 Glu Ser Met Ala Thr Gly Ser Ile Pro Ile Thr Val Arg His Ile Glu 755 760 765 Ser Met Ile Arg Met Ala Glu Ala His Ala Arg Ile His Leu Arg Asp 770 775 780 Tyr Val Ile Glu Asp Asp Val Asn Met Ala Ile Arg Val Met Leu Glu 785 790 795 800 Ser Phe Ile Asp Thr Gln Lys Phe Ser Val Met Arg Ser Met Arg Lys 805 810 815 Thr Phe Ala Arg Tyr Leu Ser Phe Arg Arg Asp Asn Asn Glu Leu Leu 820 825 830 Leu Phe Ile Leu Lys Gln Leu Val Ala Glu Gln Val Thr Tyr Gln Arg 835 840 845 Asn Arg Phe Gly Ala Gln Gln Asp Thr Ile Glu Val Pro Glu Lys Asp 850 855 860 Leu Val Asp Lys Ala Arg Gln Ile Asn Ile His Asn Leu Ser Ala Phe 865 870 875 880 Tyr Asp Ser Glu Leu Phe Arg Met Asn Lys Phe Ser His Asp Leu Lys 885 890 895 Arg Lys Met Ile Leu Gln Gln Phe 900 <210> 2 <211> 3453 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (58)...(2772) <400> 2 acttttcgcg cgaaacctgg ttgttgctgt agtggcggag aggatcgtgg tactgct atg 60 Met 1 gcg gaa tca tcg gaa tcc ttc acc atg gca tcc agc ccg gcc cag cgt 108 Ala Glu Ser Ser Glu Ser Phe Thr Met Ala Ser Ser Pro Ala Gln Arg 5 10 15 cgg cga ggc aat gat cct ctc acc tcc agc cct ggc cga agc tcc cgg 156 Arg Arg Gly Asn Asp Pro Leu Thr Ser Ser Pro Gly Arg Ser Ser Arg 20 25 30 cgt act gat gcc ctc acc tcc agc cct ggc cgt gac ctt cca cca ttt 204 Arg Thr Asp Ala Leu Thr Ser Ser Pro Gly Arg Asp Leu Pro Pro Phe 35 40 45 gag gat gag tcc gag ggg ctc cta ggc aca gag ggg ccc ctg gag gaa 252 Glu Asp Glu Ser Glu Gly Leu Leu Gly Thr Glu Gly Pro Leu Glu Glu 50 55 60 65 gaa gag gat gga gag gag ctc att gga gat ggc atg gaa agg gac tac 300 Glu Glu Asp Gly Glu Glu Leu Ile Gly Asp Gly Met Glu Arg Asp Tyr 70 75 80 cgc gcc atc cca gag ctg gac gcc tat gag gcc gag gga ctg gct ctg 348 Arg Ala Ile Pro Glu Leu Asp Ala Tyr Glu Ala Glu Gly Leu Ala Leu 85 90 95 gat gat gag gac gta gag gag ctg acg gcc agt cag agg gag gca gca 396 Asp Asp Glu Asp Val Glu Glu Leu Thr Ala Ser Gln Arg Glu Ala Ala 100 105 110 gag cgg gcc atg cgg cag cgt gac cgg gag gct ggc cgg ggc ctg ggc 444 Glu Arg Ala Met Arg Gln Arg Asp Arg Glu Ala Gly Arg Gly Leu Gly 115 120 125 cgc atg cgc cgt ggg ctc ctg tat gac agc gat gag gag gac gag gag 492 Arg Met Arg Arg Gly Leu Leu Tyr Asp Ser Asp Glu Glu Asp Glu Glu 130 135 140 145 cgc cct gcc cgc aag cgc cgc cag gtg gag cgg gcc acg gag gac ggc 540 Arg Pro Ala Arg Lys Arg Arg Gln Val Glu Arg Ala Thr Glu Asp Gly 150 155 160 gag gag gac gag gag atg atc gag agc atc gag aac ctg gag gat ctc 588 Glu Glu Asp Glu Glu Met Ile Glu Ser Ile Glu Asn Leu Glu Asp Leu 165 170 175 aaa ggc cac tct gtg cgc gag tgg gtg agc atg gcg ggc ccc cgg ctg 636 Lys Gly His Ser Val Arg Glu Trp Val Ser Met Ala Gly Pro Arg Leu 180 185 190 gag atc cac cac cgc ttc aag aac ttc ctg cgc act cac gtc gac agc 684 Glu Ile His His Arg Phe Lys Asn Phe Leu Arg Thr His Val Asp Ser 195 200 205 cac ggc cac aac gtc ttc aag gag cgc atc agc gac atg tgc aaa gag 732 His Gly His Asn Val Phe Lys Glu Arg Ile Ser Asp Met Cys Lys Glu 210 215 220 225 aac cgt gag agc ctg gtg gtg aac tat gag gac ttg gca gcc agg gag 780 Asn Arg Glu Ser Leu Val Val Asn Tyr Glu Asp Leu Ala Ala Arg Glu 230 235 240 cac gtg ctg gcc tac ttc ctg cct gag gca ccg gcg gag ctg ctg cag 828 His Val Leu Ala Tyr Phe Leu Pro Glu Ala Pro Ala Glu Leu Leu Gln 245 250 255 atc ttt gat gag gct gcc ctg gag gtg gta ctg gcc atg tac ccc aag 876 Ile Phe Asp Glu Ala Ala Leu Glu Val Val Leu Ala Met Tyr Pro Lys 260 265 270 tac gac cgc atc acc aac cac atc cat gtc cgc atc tcc cac ctg cct 924 Tyr Asp Arg Ile Thr Asn His Ile His Val Arg Ile Ser His Leu Pro 275 280 285 ctg gtg gag gag ctg cgc tcg ctg agg cag ctg cat ctg aac cag ctg 972 Leu Val Glu Glu Leu Arg Ser Leu Arg Gln Leu His Leu Asn Gln Leu 290 295 300 305 atc cgc acc agt ggg gtg gtg acc agc tgc act ggc gtc ctg ccc cag 1020 Ile Arg Thr Ser Gly Val Val Thr Ser Cys Thr Gly Val Leu Pro Gln 310 315 320 ctc agc atg gtc aag tac aac tgc aac aag tgc aat ttc gtc ctg ggt 1068 Leu Ser Met Val Lys Tyr Asn Cys Asn Lys Cys Asn Phe Val Leu Gly 325 330 335 cct ttc tgc cag tcc cag aac cag gag gtg aaa cca ggc tcc tgt cct 1116 Pro Phe Cys Gln Ser Gln Asn Gln Glu Val Lys Pro Gly Ser Cys Pro 340 345 350 gag tgc cag tcg gcc ggc ccc ttt gag gtc aac atg gag gag acc atc 1164 Glu Cys Gln Ser Ala Gly Pro Phe Glu Val Asn Met Glu Glu Thr Ile 355 360 365 tat cag aac tac cag cgt atc cga atc cag gag agt cca ggc aaa gtg 1212 Tyr Gln Asn Tyr Gln Arg Ile Arg Ile Gln Glu Ser Pro Gly Lys Val 370 375 380 385 gcg gct ggc cgg ctg ccc cgc tcc aag gac gcc att ctc ctc gca gat 1260 Ala Ala Gly Arg Leu Pro Arg Ser Lys Asp Ala Ile Leu Leu Ala Asp 390 395 400 ctg gtg gac agc tgc aag cca gga gac gag ata gag ctg act ggc atc 1308 Leu Val Asp Ser Cys Lys Pro Gly Asp Glu Ile Glu Leu Thr Gly Ile 405 410 415 tat cac aac aac tat gat ggc tcc ctc aac act gcc aat ggc ttc cct 1356 Tyr His Asn Asn Tyr Asp Gly Ser Leu Asn Thr Ala Asn Gly Phe Pro 420 425 430 gtc ttt gcc act gtc atc cta gcc aac cac gtg gcc aag aag gac aac 1404 Val Phe Ala Thr Val Ile Leu Ala Asn His Val Ala Lys Lys Asp Asn 435 440 445 aag gtt gct gta ggg gaa ctg acc gat gaa gat gtg aag atg atc act 1452 Lys Val Ala Val Gly Glu Leu Thr Asp Glu Asp Val Lys Met Ile Thr 450 455 460 465 agc ctc tcc aag gat cag cag atc gga gag aag atc ttt gcc agc att 1500 Ser Leu Ser Lys Asp Gln Gln Ile Gly Glu Lys Ile Phe Ala Ser Ile 470 475 480 gct cct tcc atc tat ggt cat gaa gac atc aag aga ggc ctg gct ctg 1548 Ala Pro Ser Ile Tyr Gly His Glu Asp Ile Lys Arg Gly Leu Ala Leu 485 490 495 gcc ctg ttc gga ggg gag ccc aaa aac cca ggt ggc aag cac aag gta 1596 Ala Leu Phe Gly Gly Glu Pro Lys Asn Pro Gly Gly Lys His Lys Val 500 505 510 cgt ggt gat atc aac gtg ctc ttg tgc gga gac cct ggc aca gcg aag 1644 Arg Gly Asp Ile Asn Val Leu Leu Cys Gly Asp Pro Gly Thr Ala Lys 515 520 525 tcg cag ttt ctc aag tat att gag aaa gtg tcc agc cga gcc atc ttc 1692 Ser Gln Phe Leu Lys Tyr Ile Glu Lys Val Ser Ser Arg Ala Ile Phe 530 535 540 545 acc act ggc cag ggg gcg tcg gct gtg ggc ctc acg gcg tat gtc cag 1740 Thr Thr Gly Gln Gly Ala Ser Ala Val Gly Leu Thr Ala Tyr Val Gln 550 555 560 cgg cac cct gtc agc agg gag tgg acc ttg gag gct ggg gcc ctg gtt 1788 Arg His Pro Val Ser Arg Glu Trp Thr Leu Glu Ala Gly Ala Leu Val 565 570 575 ctg gct gac cga gga gtg tgt ctc att gat gaa ttt gac aag atg aat 1836 Leu Ala Asp Arg Gly Val Cys Leu Ile Asp Glu Phe Asp Lys Met Asn 580 585 590 gac cag gac aga acc agc atc cat gag gcc atg gag caa cag agc atc 1884 Asp Gln Asp Arg Thr Ser Ile His Glu Ala Met Glu Gln Gln Ser Ile 595 600 605 tcc atc tcg aag gct ggc atc gtc acc tcc ctg cag gct cgc tgc acg 1932 Ser Ile Ser Lys Ala Gly Ile Val Thr Ser Leu Gln Ala Arg Cys Thr 610 615 620 625 gtc att gct gcc gcc aac ccc ata gga ggg cgc tac gac ccc tcg ctg 1980 Val Ile Ala Ala Ala Asn Pro Ile Gly Gly Arg Tyr Asp Pro Ser Leu 630 635 640 act ttc tct gag aac gtg gac ctc aca gag ccc atc atc tca cgc ttt 2028 Thr Phe Ser Glu Asn Val Asp Leu Thr Glu Pro Ile Ile Ser Arg Phe 645 650 655 gac atc ctg tgt gtg gtg agg gac acc gtg gac cca gtc cag gac gag 2076 Asp Ile Leu Cys Val Val Arg Asp Thr Val Asp Pro Val Gln Asp Glu 660 665 670 atg ctg gcc cgc ttc gtg gtg ggc agc cac gtc aga cac cac ccc agc 2124 Met Leu Ala Arg Phe Val Val Gly Ser His Val Arg His His Pro 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Ile Arg Val Met Leu Glu Ser 790 795 800 ttc ata gac aca cag aag ttc agc gtc atg cgc agc atg cgc aag act 2508 Phe Ile Asp Thr Gln Lys Phe Ser Val Met Arg Ser Met Arg Lys Thr 805 810 815 ttt gcc cgc tac ctt tca ttc cgg cgt gac aac aat gag ctg ttg ctc 2556 Phe Ala Arg Tyr Leu Ser Phe Arg Arg Asp Asn Asn Glu Leu Leu Leu 820 825 830 ttc ata ctg aag cag tta gtg gca gag cag gtg aca tat cag cgc aac 2604 Phe Ile Leu Lys Gln Leu Val Ala Glu Gln Val Thr Tyr Gln Arg Asn 835 840 845 cgc ttt ggg gcc cag cag gac act att gag gtc cct gag aag gac ttg 2652 Arg Phe Gly Ala Gln Gln Asp Thr Ile Glu Val Pro Glu Lys Asp Leu 850 855 860 865 gtg gat aag gct cgt cag atc aac atc cac aac ctc tct gca ttt tat 2700 Val Asp Lys Ala Arg Gln Ile Asn Ile His Asn Leu Ser Ala Phe Tyr 870 875 880 gac agt gag ctc ttc agg atg aac aag ttc agc cac gac ctg aaa agg 2748 Asp Ser Glu Leu Phe Arg Met Asn Lys Phe Ser His Asp Leu Lys Arg 885 890 895 aaa atg atc ctg cag cag ttc tga ggccctatgc catccataag gattccttgg 2802 Lys Met Ile Leu 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<210> 4 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for the MCM2 epitope of monoclonal antibody 26H6.19 (preliminary) <400> 4 Pro Ser Asn Lys Glu Glu Glu Gly Leu Ala Asn Gly Ser Ala Ala Glu 1 5 10 15 Pro Ala Met Pro Asn Thr Tyr 20 <210> 5 <211> 2688 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for truncated MCM2 gene <221> CDS <222> (1)...(2688) <223> Truncated MCM2 gene lacking 27 bp at 5' end <400> 5 atg gca tcc agc ccg gcc cag cgt cgg cga ggc aat gat cct ctc acc 48 Met Ala Ser Ser Pro Ala Gln Arg Arg Arg Gly Asn Asp Pro Leu Thr 1 5 10 15 tcc agc cct ggc cga agc tcc cgg cgt act gat gcc ctc acc tcc agc 96 Ser Ser Pro Gly Arg Ser Ser Arg Arg Thr Asp Ala Leu Thr Ser Ser 20 25 30 cct ggc cgt gac ctt cca cca ttt gag gat gag tcc gag ggg ctc cta 144 Pro Gly Arg Asp Leu Pro Pro Phe Glu Asp Glu Ser Glu Gly Leu Leu 35 40 45 ggc aca gag ggg ccc ctg gag gaa gaa gag gat gga gag gag ctc att 192 Gly Thr Glu Gly Pro Leu Glu Glu Glu Glu Asp Gly 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His Ser Val Arg Glu Trp 165 170 175 gtg agc atg gcg ggc ccc cgg ctg gag atc cac cac cgc ttc aag aac 576 Val Ser Met Ala Gly Pro Arg Leu Glu Ile His His Arg Phe Lys Asn 180 185 190 ttc ctg cgc act cac gtc gac agc cac ggc cac aac gtc ttc aag gag 624 Phe Leu Arg Thr His Val Asp Ser His Gly His Asn Val Phe Lys Glu 195 200 205 cgc atc agc gac atg tgc aaa gag aac cgt gag agc ctg gtg gtg aac 672 Arg Ile Ser Asp Met Cys Lys Glu Asn Arg Glu Ser Leu Val Val Asn 210 215 220 tat gag gac ttg gca gcc agg gag cac gtg ctg gcc tac ttc ctg cct 720 Tyr Glu Asp Leu Ala Ala Arg Glu His Val Leu Ala Tyr Phe Leu Pro 225 230 235 240 gag gca ccg gcg gag ctg ctg cag atc ttt gat gag gct gcc ctg gag 768 Glu Ala Pro Ala Glu Leu Leu Gln Ile Phe Asp Glu Ala Ala Leu Glu 245 250 255 gtg gta ctg gcc atg tac ccc aag tac gac cgc atc acc aac cac atc 816 Val Val Leu Ala Met Tyr Pro Lys Tyr Asp Arg Ile Thr Asn His Ile 260 265 270 cat gtc cgc atc tcc cac ctg cct ctg gtg gag gag ctg cgc tcg ctg 864 His Val Arg Ile Ser His Leu Pro Leu Val Glu Glu Leu Arg Ser Leu 275 280 285 agg cag ctg cat ctg aac cag ctg atc cgc acc agt ggg gtg gtg acc 912 Arg Gln Leu His Leu Asn Gln Leu Ile Arg Thr Ser Gly Val Val Thr 290 295 300 agc tgc act ggc gtc ctg ccc cag ctc agc atg gtc aag tac aac tgc 960 Ser Cys Thr Gly Val Leu Pro Gln Leu Ser Met Val Lys Tyr Asn Cys 305 310 315 320 aac aag tgc aat ttc gtc ctg ggt cct ttc tgc cag tcc cag aac cag 1008 Asn Lys Cys Asn Phe Val Leu Gly Pro Phe Cys Gln Ser Gln Asn Gln 325 330 335 gag gtg aaa cca ggc tcc tgt cct gag tgc cag tcg gcc ggc ccc ttt 1056 Glu Val Lys Pro Gly Ser Cys Pro Glu Cys Gln Ser Ala Gly Pro Phe 340 345 350 gag gtc aac atg gag gag acc atc tat cag aac tac cag cgt atc cga 1104 Glu Val Asn Met Glu Glu Thr Ile Tyr Gln Asn Tyr Gln Arg Ile Arg 355 360 365 atc cag gag agt cca ggc aaa gtg gcg gct ggc cgg ctg ccc cgc tcc 1152 Ile Gln Glu Ser Pro Gly Lys Val Ala Ala Gly Arg Leu Pro Arg Ser 370 375 380 aag gac gcc att ctc ctc gca gat ctg gtg gac agc tgc aag cca gga 1200 Lys Asp Ala Ile Leu Leu Ala Asp Leu Val Asp Ser Cys Lys Pro Gly 385 390 395 400 gac gag ata gag ctg act ggc atc tat cac aac aac tat gat ggc tcc 1248 Asp Glu Ile Glu Leu Thr Gly Ile Tyr His Asn Asn Tyr Asp Gly Ser 405 410 415 ctc aac act gcc aat ggc ttc cct gtc ttt gcc act gtc atc cta gcc 1296 Leu Asn Thr Ala Asn Gly Phe Pro Val Phe Ala Thr Val Ile Leu Ala 420 425 430 aac cac gtg gcc aag aag gac aac aag gtt gct gta ggg gaa ctg acc 1344 Asn His Val Ala Lys Lys Asp Asn Lys Val Ala Val Gly Glu Leu Thr 435 440 445 gat gaa gat gtg aag atg atc act agc ctc tcc aag gat cag cag atc 1392 Asp Glu Asp Val Lys Met Ile Thr Ser Leu Ser Lys Asp Gln Gln Ile 450 455 460 gga gag aag atc ttt gcc agc att gct cct tcc atc tat ggt cat gaa 1440 Gly Glu Lys Ile Phe Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ile Tyr Gly His Glu 465 470 475 480 gac atc aag aga ggc ctg gct ctg gcc ctg ttc gga ggg gag ccc aaa 1488 Asp Ile Lys Arg Gly Leu Ala Leu Ala Leu Phe Gly Gly Glu Pro Lys 485 490 495 aac cca ggt ggc aag cac aag gta cgt ggt gat atc aac gtg ctc ttg 1536 Asn Pro Gly Gly Lys His Lys Val Arg Gly Asp Ile Asn Val Leu Leu 500 505 510 tgc gga gac cct ggc aca gcg aag tcg cag ttt ctc aag tat att gag 1584 Cys Gly Asp Pro Gly Thr Ala Lys Ser Gln Phe Leu Lys Tyr Ile Glu 515 520 525 aaa gtg tcc agc cga gcc atc ttc acc act ggc cag ggg gcg tcg gct 1632 Lys Val Ser Ser Arg Ala Ile Phe Thr Thr Gly Gln Gly Ala Ser Ala 530 535 540 gtg ggc ctc acg gcg tat gtc cag cgg cac cct gtc agc agg gag tgg 1680 Val Gly Leu Thr Ala Tyr Val Gln Arg His Pro Val Ser Arg Glu Trp 545 550 555 560 acc ttg gag gct ggg gcc ctg gtt ctg gct gac cga gga gtg tgt ctc 1728 Thr Leu Glu Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Asp Arg Gly Val Cys Leu 565 570 575 att gat gaa ttt gac aag atg aat gac cag gac aga acc agc atc cat 1776 Ile Asp Glu Phe Asp Lys Met Asn Asp Gln Asp Arg Thr Ser Ile His 580 585 590 gag gcc atg gag caa cag agc atc tcc atc tcg aag gct ggc atc gtc 1824 Glu Ala Met Glu Gln Gln Ser Ile Ser Ile Ser Lys Ala Gly Ile Val 595 600 605 acc tcc ctg cag gct cgc tgc acg gtc att gct gcc gcc aac ccc ata 1872 Thr Ser Leu Gln Ala Arg Cys Thr Val Ile Ala Ala Ala Asn Pro Ile 610 615 620 gga ggg cgc tac gac ccc tcg ctg act ttc tct gag aac gtg gac ctc 1920 Gly Gly Arg Tyr Asp Pro Ser Leu Thr Phe Ser Glu Asn Val Asp Leu 625 630 635 640 aca gag ccc atc atc tca cgc ttt gac atc ctg tgt gtg gtg agg gac 1968 Thr Glu Pro Ile Ile Ser Arg Phe Asp Ile Leu Cys Val Val Arg Asp 645 650 655 acc gtg gac cca gtc cag gac gag atg ctg gcc cgc ttc gtg gtg ggc 2016 Thr Val Asp Pro Val Gln Asp Glu Met Leu Ala Arg Phe Val Val Gly 660 665 670 agc cac gtc aga cac cac ccc agc aac aag gag gag gag ggg ctg gcc 2064 Ser His Val Arg His His Pro Ser Asn Lys Glu Glu Glu Gly Leu Ala 675 680 685 aat ggc agc gct gct gag ccc gcc atg ccc aac acg tat ggc gtg gag 2112 Asn Gly Ser Ala Ala Glu Pro Ala Met Pro Asn Thr Tyr Gly Val Glu 690 695 700 ccc ctg ccc cag gag gtc ctg aag aag tac atc atc tac gcc aag gag 2160 Pro Leu Pro Gln Glu Val Leu Lys Lys Tyr Ile Ile Tyr Ala Lys Glu 705 710 715 720 agg gtc cac ccg aag ctc aac cag atg gac cag gac aag gtg gcc aag 2208 Arg Val His Pro Lys Leu Asn Gln Met Asp Gln Asp Lys Val Ala Lys 725 730 735 atg tac agt gac ctg agg aaa gaa tct atg gcg aca ggc agc atc ccc 2256 Met Tyr Ser Asp Leu Arg Lys Glu Ser Met Ala Thr Gly Ser Ile Pro 740 745 750 att acg gtg cgg cac atc gag tcc atg atc cgc atg gcg gag gcc cac 2304 Ile Thr Val Arg His Ile Glu Ser Met Ile Arg Met Ala Glu Ala His 755 760 765 gcg cgc atc cat ctg cgg gac tat gtg atc gaa gac gac gtc aac atg 2352 Ala Arg Ile His Leu Arg Asp Tyr Val Ile Glu Asp Asp Val Asn Met 770 775 780 gcc atc cgc gtg atg ctg gag agc ttc ata gac aca cag aag ttc agc 2400 Ala Ile Arg Val Met Leu Glu Ser Phe Ile Asp Thr Gln Lys Phe Ser 785 790 795 800 gtc atg cgc agc atg cgc aag act ttt gcc cgc tac ctt tca ttc cgg 2448 Val Met Arg Ser Met Arg Lys Thr Phe Ala Arg Tyr Leu Ser Phe Arg 805 810 815 cgt gac aac aat gag ctg ttg ctc ttc ata ctg aag cag tta gtg gca 2496 Arg Asp Asn Asn Glu Leu Leu Leu Phe Ile Leu Lys Gln Leu Val Ala 820 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Ile Ile Ser Arg Phe Asp Ile Leu Cys Val Val Arg Asp 645 650 655 Thr Val Asp Pro Val Gln Asp Glu Met Leu Ala Arg Phe Val Val Gly 660 665 670 Ser His Val Arg His His Pro Ser Asn Lys Glu Glu Glu Gly Leu Ala 675 680 685 Asn Gly Ser Ala Ala Glu Pro Ala Met Pro Asn Thr Tyr Gly Val Glu 690 695 700 Pro Leu Pro Gln Glu Val Leu Lys Lys Tyr Ile Ile Tyr Ala Lys Glu 705 710 715 720 Arg Val His Pro Lys Leu Asn Gln Met Asp Gln Asp Lys Val Ala Lys 725 730 735 Met Tyr Ser Asp Leu Arg Lys Glu Ser Met Ala Thr Gly Ser Ile Pro 740 745 750 Ile Thr Val Arg His Ile Glu Ser Met Ile Arg Met Ala Glu Ala His 755 760 765 Ala Arg Ile His Leu Arg Asp Tyr Val Ile Glu Asp Asp Val Asn Met 770 775 780 Ala Ile Arg Val Met Leu Glu Ser Phe Ile Asp Thr Gln Lys Phe Ser 785 790 795 800 Val Met Arg Ser Met Arg Lys Thr Phe Ala Arg Tyr Leu Ser Phe Arg 805 810 815 Arg Asp Asn Asn Glu Leu Leu Leu Phe Ile Leu Lys Gln Leu Val Ala 820 825 830 Glu Gln Val Thr Tyr Gln Arg Asn Arg Phe Gly Ala Gln Gln Asp Thr 835 840 845 Ile Glu Val Pro Glu Lys Asp Leu Val Asp Lys Ala Arg Gln Ile Asn 850 855 860 Ile His Asn Leu Ser Ala Phe Tyr Asp Ser Glu Leu Phe Arg Met Asn 865 870 875 880 Lys Phe Ser His Asp Leu Lys Arg Lys Met Ile Leu Gln Gln Phe Leu 885 890 895 Glu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 900 905 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for the MCM2 epitope of monoclonal antibody 26H6.19 (refined) <400> 14 His Val Arg His His Pro Ser Asn Lys Glu 1 5 10 <210> 15 <211> 895 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for truncated MCM2 protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO:5 <400> 1 Met Ala Ser Ser Pro Ala Gln Arg Arg Arg Gly Asn Asp Pro Leu Thr 1 5 10 15 Ser Ser Pro Gly Arg Ser Ser Arg Arg Thr Asp Ala Leu Thr Ser Ser 20 25 30 Pro Gly Arg Asp Leu Pro Pro Phe Glu Asp Glu Ser Glu Gly Leu Leu 35 40 45 Gly Thr Glu Gly Pro Leu Glu Glu Glu Glu Asp Gly Glu Glu Leu Ile 50 55 60 Gly Asp Gly Met Glu Arg Asp Tyr Arg Ala Ile Pro Glu Leu Asp Ala 65 70 75 80 Tyr Glu Ala Glu Gly Leu Ala Leu Asp Asp Glu Asp Val Glu Glu Leu 85 90 95 Thr Ala Ser Gln Arg Glu Ala Ala Glu Arg Ala Met Arg Gln Arg Asp 100 105 110 Arg Glu Ala Gly Arg Gly Leu Gly Arg Met Arg Arg Gly Leu Leu Tyr 115 120 125 Asp Ser Asp Glu Glu Asp Glu Glu Arg Pro Ala Arg Lys Arg Arg Gln 130 135 140 Val Glu Arg Ala Thr Glu Asp Gly Glu Glu Asp Glu Glu Met Ile Glu 145 150 155 160 Ser Ile Glu Asn Leu Glu Asp Leu Lys Gly His Ser Val Arg Glu Trp 165 170 175 Val Ser Met Ala Gly Pro Arg Leu Glu Ile His His Arg Phe Lys Asn 180 185 190 Phe Leu Arg Thr His Val Asp Ser His Gly His Asn Val Phe Lys Glu 195 200 205 Arg Ile Ser Asp Met Cys Lys Glu Asn Arg Glu Ser Leu Val Val Asn 210 215 220 Tyr Glu Asp Leu Ala Ala Arg Glu His Val Leu Ala Tyr Phe Leu Pro 225 230 235 240 Glu Ala Pro Ala Glu Leu Leu Gln Ile Phe Asp Glu Ala Ala Leu Glu 245 250 255 Val Val Leu Ala Met Tyr Pro Lys Tyr Asp Arg Ile Thr Asn His Ile 260 265 270 His Val Arg Ile Ser His Leu Pro Leu Val Glu Glu Leu Arg Ser Leu 275 280 285 Arg Gln Leu His Leu Asn Gln Leu Ile Arg Thr Ser Gly Val Val Thr 290 295 300 Ser Cys Thr Gly Val Leu Pro Gln Leu Ser Met Val Lys Tyr Asn Cys 305 310 315 320 Asn Lys Cys Asn Phe Val Leu Gly Pro Phe Cys Gln Ser Gln Asn Gln 325 330 335 Glu Val Lys Pro Gly Ser Cys Pro Glu Cys Gln Ser Ala Gly Pro Phe 340 345 350 Glu Val Asn Met Glu Glu Thr Ile Tyr Gln Asn Tyr Gln Arg Ile Arg 355 360 365 Ile Gln Glu Ser Pro Gly Lys Val Ala Ala Gly Arg Leu Pro Arg Ser 370 375 380 Lys Asp Ala Ile Leu Leu Ala Asp Leu Val Asp Ser Cys Lys Pro Gly 385 390 395 400 Asp Glu Ile Glu Leu Thr Gly Ile Tyr His Asn Asn Tyr Asp Gly Ser 405 410 415 Leu Asn Thr Ala Asn Gly Phe Pro Val Phe Ala Thr Val Ile Leu Ala 420 425 430 Asn His Val Ala Lys Lys Asp Asn Lys Val Ala Val Gly Glu Leu Thr 435 440 445 Asp Glu Asp Val Lys Met Ile Thr Ser Leu Ser Lys Asp Gln Gln Ile 450 455 460 Gly Glu Lys Ile Phe Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ile Tyr Gly His Glu 465 470 475 480 Asp Ile Lys Arg Gly Leu Ala Leu Ala Leu Phe Gly Gly Glu Pro Lys 485 490 495 Asn Pro Gly Gly Lys His Lys Val Arg Gly Asp Ile Asn Val Leu Leu 500 505 510 Cys Gly Asp Pro Gly Thr Ala Lys Ser Gln Phe Leu Lys Tyr Ile Glu 515 520 525 Lys Val Ser Ser Arg Ala Ile Phe Thr Thr Gly Gln Gly Ala Ser Ala 530 535 540 Val Gly Leu Thr Ala Tyr Val Gln Arg His Pro Val Ser Arg Glu Trp 545 550 555 560 Thr Leu Glu Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Asp Arg Gly Val Cys Leu 565 570 575 Ile Asp Glu Phe Asp Lys Met Asn Asp Gln Asp Arg Thr Ser Ile His 580 585 590 Glu Ala Met Glu Gln Gln Ser Ile Ser Ile Ser Lys Ala Gly Ile Val 595 600 605 Thr Ser Leu Gln Ala Arg Cys Thr Val Ile Ala Ala Ala Asn Pro Ile 610 615 620 Gly Gly Arg Tyr Asp Pro Ser Leu Thr Phe Ser Glu Asn Val Asp Leu 625 630 635 640 Thr Glu Pro Ile Ile Ser Arg Phe Asp Ile Leu Cys Val Val Arg Asp 645 650 655 Thr Val Asp Pro Val Gln Asp Glu Met Leu Ala Arg Phe Val Val Gly 660 665 670 Ser His Val Arg His His Pro Ser Asn Lys Glu Glu Glu Gly Leu Ala 675 680 685 Asn Gly Ser Ala Ala Glu Pro Ala Met Pro Asn Thr Tyr Gly Val Glu 690 695 700 Pro Leu Pro Gln Glu Val Leu Lys Lys Tyr Ile Ile Tyr Ala Lys Glu 705 710 715 720 Arg Val His Pro Lys Leu Asn Gln Met Asp Gln Asp Lys Val Ala Lys 725 730 735 Met Tyr Ser Asp Leu Arg Lys Glu Ser Met Ala Thr Gly Ser Ile Pro 740 745 750 Ile Thr Val Arg His Ile Glu Ser Met Ile Arg Met Ala Glu Ala His 755 760 765 Ala Arg Ile His Leu Arg Asp Tyr Val Ile Glu Asp Asp Val Asn Met 770 775 780 Ala Ile Arg Val Met Leu Glu Ser Phe Ile Asp Thr Gln Lys Phe Ser 785 790 795 800 Val Met Arg Ser Met Arg Lys Thr Phe Ala Arg Tyr Leu Ser Phe Arg 805 810 815 Arg Asp Asn Asn Glu Leu Leu Leu Phe Ile Leu Lys Gln Leu Val Ala 820 825 830 Glu Gln Val Thr Tyr Gln Arg Asn Arg Phe Gly Ala Gln Gln Asp Thr 835 840 845 Ile Glu Val Pro Glu Lys Asp Leu Val Asp Lys Ala Arg Gln Ile Asn 850 855 860 Ile His Asn Leu Ser Ala Phe Tyr Asp Ser Glu Leu Phe Arg Met Asn 865 870 875 880 Lys Phe Ser His Asp Leu Lys Arg Lys Met Ile Leu Gln Gln Phe 885 890 895

Claims (21)

  1. 하기 (a) 내지 (h)로 이루어진 군으로부터 선택되며, MCM2, 그의 변이체 또는 그의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체:
    (a) ATCC에 기탁번호 PTA-6668로 기탁된 하이브리도마 세포주 27C5.6에서 생산되는 단일클론 항체;
    (b) ATCC에 기탁번호 PTA-6667로 기탁된 하이브리도마 세포주 26H6.19에서 생산되는 단일클론 항체;
    (c) 하이브리도마 세포주 27C5.6 또는 26H6.19에서 생산되는 단일클론 항체의 결합 특징을 가지고 있는 단일클론 항체;
    (d) 하이브리도마 세포주 27C5.6 또는 26H6.19에서 생산되는 단일클론 항체에 결합할 수 있는 에피토피에 결합하는 단일클론 항체;
    (e) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합하는 단일클론 항체;
    (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합하는 단일클론 항체;
    (g) 경쟁적인 결합 분석에서 하이브리도마 세포주 27C5.6 또는 26H6.19에서 생산되는 단일클론 항체와 경쟁하는 단일클론 항체;
    (h) MCM2, 그의 변이체 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하고 있으며, 상기 (a) - (g)의 단일클론 항체의 항원 결합성 단편인 단일클론 항 체.
  2. ATCC에 기탁번호 PTA-6668로 기탁된 하이브리도마 세포주 27C5.6.
  3. ATCC에 기탁번호 PTA-6667로 기탁된 하이브리도마 세포주 26H6.19.
  4. 제 1항의 단일클론 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주.
  5. 제 1항에 따른 단일클론 항체 하나 이상을 포함하는 고등급 자궁경부 질환을 진단하기 위한 키트.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 ATCC에 기탁번호 PTA-6668로 기탁된 하이브리도마 세포주 27C5.6 또는 ATCC에 기탁번호 PTA-6667로 기탁된 하이브리도마 세포주 26H6.19에서 생산되는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 키트.
  7. 제 5항에 있어서, 2종 이상의 항체를 포함하며, 제1 항체는 ATCC에 기탁번호 PTA-6668로 기탁된 하이브리도마 세포주 27C5.6에서 생산되는 단일클론 항체이며, 제2 항체는 ATCC에 기탁번호 PTA-6667로 기탁된 하이브리도마 세포주 26H6.19에서 생산되는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 키트.
  8. 제 7항에 있어서, Topo2A에 특이적으로 결합하는 항체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  9. 제 7항에 있어서, 각 항체는 개별 항체 시약으로 제공되는 것을 특징으로 하는 키트.
  10. 제 7항에 있어서, 모든 항체는 항체 칵테일로 제공되는 것을 특징으로 하는 키트.
  11. 제 5항에 있어서, 상기 키트는 페록시다제 차단제, 단백질 차단제, 항체의 바이오마커 단백질 결합을 검출하기 위한 화합물, 대조염색, 청색화제 및 사용 설명서를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  12. 제 5항에 있어서, Pap 염색용 시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 Pap 염색용 시약은 EA50 및 오렌지 G를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  14. a) 환자에게서 자궁경부 샘플을 채취하는 단계;
    b) 상기 샘플을 MCM2에 특이적으로 결합하는 제 1항에 따른 하나 이상의 단 일클론 항체와 접촉시키는 단계; 및
    c) 상기 항체의 MCM2와의 결합을 검출하는 단계;
    를 포함하는 환자에게서 고등급 자궁경부 질환을 진단하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 ATCC에 기탁번호 PTA-6668로 기탁된 하이브리도마 세포주 27C5.6에서 생산되는 단일클론 항체 또는 ATCC에 기탁번호 PTA-6667로 기탁된 하이브리도마 세포주 26H6.19에서 생산되는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 샘플을 MCM2에 특이적으로 결합하는 2종 이상의 단일클론 항체와 접촉시키는 단계를 포함하며, 제1 항체는 ATCC에 기탁번호 PTA-6668로 기탁된 하이브리도마 세포주 27C5.6에서 생산되는 단일클론 항체이며, 제2 항체는 ATCC에 기탁번호 PTA-6667로 기탁된 하이브리도마 세포주 26H6.19에서 생산되는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 샘플을 Topo2A에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16항에 있어서, 상기 항체는 개별 항체 시약으로 순차적으로 또는 항체 칵테일로 동시에 상기 샘플과 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. MCM2 단일클론 항체에 결합하는 에피토프를 포함하는 분리된 폴리펩티드로서,
    상기 폴리펩티드는
    (a) 서열번호 3 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및
    (b) 서열번호 3 또는 14와 90% 이상의 서열 상동성을 가지며 항원성 활성이 있는 폴리펩티드;
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  20. 동물을 제 19항에 따른 폴리펩티드로 면역화하는 단계를 포함하는 MCM2 항체 제조 방법.
  21. MCM2 단일클론 항체를 제조하는 방법으로서,
    (a) 면역반응을 유도하는 조건하에서 동물을 제 19항에 따른 폴리펩티드로 면역화하는 단계;
    (b) 상기 동물에서 항체 생산 세포를 분리하는 단계;
    (c) 상기 항체 생산 세포를 배양한 불멸화 세포와 융합시켜, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 제조하는 단계;
    (d) 상기 하이브리도마 세포를 배양하는 단계; 및
    (e) 배양물로부터 단일클론 항체를 분리하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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