CN115584346A - 鼠抗人stc2单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备与应用，涉及生物医药。提供鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株A1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No.62532。提供由所述鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。提供含有所述鼠抗人STC2单克隆抗体的免疫印迹检测试剂、免疫组化及ELISA检测试剂。提供该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在制备免疫印迹检测试剂、免疫组化及ELISA检测试剂中的应用。提供一种免疫印迹检测试剂盒、免疫组化及ELISA检测试剂盒，鼠抗人STC2单克隆抗体应用于蛋白免疫印迹、免疫组化及ELISA检测实验技术。特异性强、灵敏度高。

Description

鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备 与应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别是涉及一种鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备与应用。

背景技术

原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，近年来随着各种肝癌治疗手段的广泛应用，肝癌患者的生存率有所提高，早发现、早诊断、早治疗对于改善肝癌患者的预后具有非常重要的意义。

STC2是在人体各个组织中广泛表达，并且结构高度保守，可通过自分泌或旁分泌的方式发挥作用，是一种分泌性的糖蛋白。研究发现，STC2与肿瘤的发生发展及不良预后密切相关，除乳腺癌外，STC2在大多数的肿瘤组织中起癌蛋白的作用，可帮助肿瘤细胞生长，增强其迁移与侵袭能力，其表达情况也与患者预后相关，高表达的STC2往往预示着较差的预后情况。

诊断肝癌的技术手段主要集中在影像学技术。超声检查是最早应用于肝癌诊断的技术，但是其优势主要是在肝癌中晚期，在早期诊断中的可靠性较差。斯钙素(stanniocalcin，STC)是一种糖蛋白激素,最早在硬骨鱼中发现,起着调节钙/磷平衡的作用。近年来发现STC2在肝癌、乳腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中具有重要意义。研究表明STC2在多种癌组织中相对于邻近正常组织过表达，其表达与组织学分级和肿瘤进展高度相关。STC2表达的调节改变细胞增殖和上皮间质转化(EMT)。有研究发现血清STC2水平高的HCC患者的总生存率(OS)显著低于STC2水平低的患者，这表明STC2是HCC诊断和预后的有潜力的标志物，在某些方面表现出优于AFP。STC2对原发性肝癌的临床诊断价值为：⑴是一种仅次于病理检查的诊断方法；⑵为目前最好的早期诊断方法之一；⑶及时反应病情变化和治疗效果的敏感指标；(4)帮助患者预测预后情况。

STC2的检测方法报道很多，比较成熟的是化学发光免疫，酶联免疫吸附(ELISA)、免疫组化等，而这些技术都依赖于优质的STC2抗体。对于STC2单克隆抗体的研制，国内外均有报道，但对其在检测中的特异性及灵敏度的提高尚需进一步研究。

发明内容

本发明的第一目的是克服现有技术的不足，提供特异性好，灵敏度高的一种鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株。

本发明的第二目的在于提供所述鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法。

本发明的第三目的在于提供所述鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株的应用。

本发明的第四个目的是对所述述鼠抗人STC2单克隆抗体进行初步的表位鉴定。

本发明提供一种鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株A1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No.62532，保藏日期：2022年06月13日。

本发明提供由所述鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

本发明提供一种提供含有所述鼠抗人STC2单克隆抗体的免疫印迹检测试剂。

本发明提供一种提供含有所述鼠抗人STC2单克隆抗体的免疫组化检测试剂。

本发明提供一种提供含有所述鼠抗人STC2单克隆抗体的ELISA检测试剂。

本发明提供所述鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在制备免疫印迹检测试剂中的应用。

一种免疫印迹检测、免疫组化及ELISA检测试剂盒，包含所述鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

所述鼠抗人STC2单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)单克隆抗体的腹水生产：

选用SPF级，7～9周龄小鼠，采用腹腔注射的方式，对每只小鼠注射500μL的高温灭菌的液体石蜡，一周后，将单克隆细胞株用PBS吹落离心，重悬后调整细胞密度，每只小鼠腹腔接种500μL，10⁶个杂交瘤细胞株，待7～14天左右观察小鼠腹部肿大情况，用注射器反复收集2～3次腹水，7000rpm,离心20min，吸取中部淡黄色液体备用；

2)抗体纯化：

将所得腹水用结合缓冲液稀释一倍后，与预处理过的proteinG在低温实验室过夜孵育，2500rpm,离心3min后弃去上清，洗杂两次后，用洗脱缓冲液洗脱，收集洗杂与洗脱组分，SDS-PAGE电泳后，用考马斯亮蓝染色，判断抗体纯度与浓度。

本发明的优点：

本发明公开一种肝癌诊断的生物标志物及其单克隆抗体制备的方法，该生物标志物为STC2蛋白，可用于肝癌的早期筛查，及预后情况预测。其主要内容包括制备STC2抗原；制备杂交瘤细胞株；制备STC2单克隆抗体；抗体性质验证。鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌抗体效价高，特异性强，灵敏度高，易于检测，可在肝癌的早期检测药物、试剂中应用，也可用于后续的双抗夹心ELISA试剂盒的研制。试验验证，本发明的杂交瘤细胞产生的鼠抗人STC2单克隆抗体可应用于蛋白免疫印迹实验、免疫组化和ELISA检测技术中。且特异性强、灵敏度高。

附图说明

图1为STC2重组蛋白小量表达考马斯亮蓝染色结果。将诱导前及诱导后的大肠杆菌裂解后，分别上样进行10％的SDS-PAGE电泳分离蛋白，后经考马斯亮蓝染色，可见35KD处诱导后有明显外源蛋白表达条带。

图2为his标签的STC2重组蛋白经变性后，使用Ni柱纯化后采用咪唑进行梯度洗脱的考马斯亮蓝染色结果。洗脱浓度分别为：0mM、50mM、100mM、250mM。

图3为变性重组蛋白，使用透析方式梯度去除尿素后，再经超滤浓缩后，采用BSA梯度浓度的方式测定蛋白浓度的考马斯亮蓝染色结果。

图4为his标签的重组蛋白，westernblot验证结果。

图5为细胞融合之后，经HAT选择性培养基筛选、ELISA初次筛选及三次亚克隆化过程中的ELISA筛选结果。结果显示，其阳性为100％，能够稳定分泌STC2抗体。

图6为小鼠体内制备抗体及其纯化结果图，从左到右依次为纯化前腹水、洗杂组分、洗脱组分、BSA梯度浓度。

图7为单克隆抗体亚型鉴定结果。按照抗体分型试剂盒操作方法，鉴定所得抗体亚型，最终确定此STC2单克隆抗体亚型为IgG1。

图8为western blot鉴定结果，结果显示抗体特异性较好，无明显杂带。

图9为识别表位鉴定结果，初步显示抗体可识别STC2后100个氨基酸中的特异性位点。

图10为免疫组化鉴定结果，结果显示抗体可以检测人肝癌组织中的STC2的表达。

图11为ELISA鉴定结果，结果显示本发明的杂交瘤细胞产生的鼠抗人STC2单克隆抗体可应用于ELISA检测技术中。

具体实施方式

下面通过具体实施例结合附图对本发明作进一步的说明。

一种分泌STC2单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No.62532，保藏日期：2022年06月13日，保藏中心地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例1

免疫原的制备

1.重组质粒的构建

将实验室保存的myc标签的STC2质粒作为模板，以pet-22b作为载体，根据STC2的序列设计引物，引入NdeI和XhoI两个酶切位点。

STC2-Sense:5'CCCATATGATGTGTGCCGAGCGG3'(SEQIDNo.3)

STC2-Antisense:5'CCCTCGAGCCTCCGGATATCAGAATACTCAG3'(SEQIDNo.4)

PCR条件为：95℃5min(预变性)；94℃30s，56℃30s，72℃30s(循环数为35)；72℃(终延伸)，PCR产物可通过核酸电泳方式进行验证。接着以NdeI和XhoI为位点，通过酶切酶连将PCR产物插入至pet-22b载体中，并对所构建质粒进行测序验证与酶切验证。

2.重组蛋白的表达

取分子克隆所得质粒，转化入BL21菌株中，涂布于已添加氨苄抗生素的固体LB培养基上，挑取单克隆菌落，接种于添加氨苄抗性的LB培养基中220rpm,37℃过夜震荡培养。

按1︰100吸取培养菌液，接种于氨苄抗性LB培养基中以相同条件进行扩大培养3t左右，留取1ml菌液作为未诱导组进行对照按照1︰1000添加1mM的IPTG，25℃150rpm过夜诱导蛋白表达。

将诱导培养物4000rpm,10min离心后，用PBS按1︰10进行重悬后，1︰100添加100mM的PMSF，再通过超声对菌体进行破碎。破碎后的混悬液需在高速离心机中12000rpm,离心10min然后分别将诱导前菌液、诱导后菌液、破碎后上清液、破碎后的菌体分别进行制样，经SDS-PAGE电泳后，用考马斯亮蓝染色脱色检测其诱导效果。结果见图1。

3.重组蛋白的纯化

将表达在包涵体中的重组蛋白用8M的尿素溶解后，加入到活化的镍珠中，过夜孵育。洗杂后，用0mM、50mM、100mM、250mM的咪唑进行梯度洗脱，取洗脱液进行SDS-PAGE电泳后，使用考马斯亮蓝进行染色判断蛋白纯度，并将洗脱所得变性蛋白，用透析袋装袋检漏后，在ph＝8的tris-cl溶液中缓慢搅拌，按8M、6M、4M、2M、0M，每隔8h进行换液，梯度透析去除尿素，最后一次需过夜透析，才能完全去除尿素。透析完成后，用高速离心机12000rpm，离心10min，取上清液，用超滤管进行超滤浓缩，并配置BSA浓度梯度蛋白样品，SDS-PAGE电泳后，考马斯亮蓝染色检测复性蛋白浓度，及浓缩后蛋白浓度，调整蛋白浓度，并用his标签抗体进行westernblot检测后，即可作为抗原使用。图2为his标签的STC2重组蛋白经变性后，使用Ni柱纯化后采用咪唑进行梯度洗脱的考马斯亮蓝染色结果。洗脱浓度分别为：0mM、50mM、100mM、250mM。图3为变性重组蛋白，使用透析方式梯度去除尿素后，再经超滤浓缩后，采用BSA梯度浓度的方式测定蛋白浓度的考马斯亮蓝染色结果。图4为his标签的重组蛋白，westernblot验证结果。

实施例2杂交瘤细胞的建立

动物免疫模型的建立。

免疫佐剂采用经典弗氏佐剂。初次免疫使用弗氏完全佐剂，与50μg抗原进行等体积乳化，后续每隔两周进行一次加强免疫，使用弗氏不完全佐剂，每次免疫完成均需进行眼眶采血后间接ELISA测定血清滴度。一共免疫5只BALB/C雌性小鼠，年龄为6～7周，每次免疫都通过皮下多点注射及腹腔注射。当血清滴度符合要求后，选取免疫效果最好的小鼠，进行冲击免疫，腹腔注射25μg蛋白，三天后取脾细胞进行融合。

细胞融合：

准备融合前一周，复苏骨髓瘤细胞，调整细胞状态后，于融合前两天进行扩大培养，融合前一天不进行传代等操作。融合当天，用PBS洗涤两次骨髓瘤细胞后，将其吹落，1500rpm，离心5min后，弃上清，洗涤两次后，用无血清1640培养基重悬后调整细胞密度备用。

融合前一天晚上，需制备饲养层细胞，以支持杂交瘤细胞的生长，抵抗96孔板的杀伤作用。取7～9周龄的BALB/C小鼠，摘眼球放血后，颈椎脱臼法处死，在75％的酒精中浸泡消毒5min后，在超净台中固定与泡沫板上，用镊子剪刀剖开外层，使腹膜暴露在外，酒精消毒后，用镊子挑起腹膜，用5ml注射器将无血清的1640培养基打入小鼠腹腔，轻柔按摩5min后吸出腹液，冲洗几次后，将所得液体1500rpm,离心5min，弃去上清。用含20％FBS的1640培养基重悬细胞后铺至96孔板中，每孔150μL，每只小鼠可铺三块96孔板，放入培养箱中培养备用。

将冲击免疫后的小鼠，摘眼球放血后，离心吸取血清，作为阳性对照备用。将小鼠放入75％酒精中浸泡杀菌后，用灭菌的镊子剪刀剖开小鼠，取出脾脏，放于无血清1640培养基中，剔除内脏组织，在无菌铜网，用注射器推头轻轻研磨，并用培养基反复冲洗后转入15ml离心管中，1500rpm,离心5min，弃去上清后，用无血清1640培养基重悬洗涤离心后，调整细胞数量至1×10⁸个/ml备用。

提前将50％的PEG与灭菌后的dd水放在37℃水浴中预热，备用。按脾细胞与骨髓瘤细胞10︰1的比例，将细胞混合在50ml离心管中吹打混匀，1500rpm,离心5min，将上清全部弃去后，手心旋转融合管5min左右，至细胞呈糊状，使得两种细胞充分接触，混合均匀。

将预热好的灭菌蒸馏水倒入超净台的烧杯中，将离心管放在水浴上，在1Min内按照先慢后快的原则滴加提前预热好的50％的PEG，边加边搅动。继续旋转离心管，使得PEG作用1min左右后，2min内滴入无血清的1640培养基25ml，并置于37℃水浴中静置20min。待细胞恢复至正常生理状态后，1500rpm离心5min后，将上清全部弃去，并用含HAT的20％FBS的1640培养基进行重悬，铺至预先铺有饲养层细胞的96孔板中，每孔100μL，放入培养箱中培养。四天后进行半换液，一周后换成含HT的20％FBS的1640培养基中，待细胞密度约为孔面积1/10时取上清检测。

阳性细胞株的筛选及其亚克隆：

使用HAT选择性培养基筛选后的细胞中仅一部分具备分泌抗体的能力，因此需要对细胞培养上清进行检测，采用事先建立好的间接ELISA条件进行检测，以2＜P/N＜10作为弱阳性，P/N＞10作为强阳性，筛选结果见图。选取部分强阳性，采用有限稀释法进行亚克隆，直至阳性率达100％，并进行扩大培养，及时冻存，筛选结果见图。

图5为细胞融合之后，经HAT选择性培养基筛选、ELISA初次筛选及三次亚克隆化过程中的ELISA筛选结果。结果显示，其阳性为100％，能够稳定分泌STC2抗体。

实施例3

鼠抗人STC2单克隆抗体的制备

单克隆抗体的腹水生产。

为避免病毒干扰，选用SPF级，7～9周龄小鼠，采用腹腔注射的方式，对每只小鼠注射500μL的高温灭菌的液体石蜡，一周后，将单克隆细胞株用PBS吹落离心，并重悬后调整细胞密度，每只小鼠腹腔接种500μL，10⁶个杂交瘤细胞，并轻轻按揉腹部，待7～14天左右观察小鼠腹部肿大情况，用注射器反复收集2～3次腹水，7000rpm,离心20min，吸取中部淡黄色液体备用。

抗体纯化

将所得腹水用结合缓冲液稀释一倍后，与预处理过的proteinG在低温实验室过夜孵育，2500rpm,离心3min后弃去上清，洗杂两次后，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗杂与洗脱组分，SDS-PAGE电泳后，用考马斯亮蓝染色，判断抗体纯度与浓度。图6为小鼠体内制备抗体及其纯化结果图，从左到右依次为纯化前腹水、洗杂组分、洗脱组分、BSA梯度浓度。

抗体性质鉴定

采用间接ELISA的方式，对细胞培养与小鼠腹水制备的STC2抗体进行滴度测定，细胞上清以1︰10开始倍比稀释，腹水纯化抗体以1︰400开始倍比稀释，以P/N大于2作为临界值，测定抗体滴度，结果显示腹水制备抗体效价可达1.28×10⁵,。通过抗体分型试剂盒，确定所得抗体的亚型为IGg1，结果如图。

图7为单克隆抗体亚型鉴定结果。按照抗体分型试剂盒操作方法，鉴定所得抗体亚型，最终确定此STC2单克隆抗体亚型为IgG1。

Western blot实验步骤：先将样品通过SDS-PAGE电泳分离，用活化过的PVDF膜，湿法转模的方式，260mA，转膜80min左右。拆开转模夹，用5％的脱脂奶粉室温封闭2h左右。转入STC2单克隆抗体中，4℃过夜孵育。用TBST洗膜三次后，二抗孵育2h，洗膜三次后，加入显影液，进行显影。图8为western blot鉴定结果，结果显示抗体特异性较好，无明显杂带。

免疫组化实验步骤：石蜡切片置于60℃烘箱提前1-2h烘片溶解，随后将切片放入二甲苯中脱蜡，梯度乙醇复水。完成后将切片转移至柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲体系中进行抗原修复。修复完成后，采用3％的H₂O₂溶液阻断内源性过氧化物酶。BSA封闭后，STC2抗体4℃孵育过夜。PBS洗涤3次后，加入二抗孵育2h，随后DAB染色，苏木素复染，稀氨水中返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯中透明，最后向上述透明组织滴加适量的中性树脂，覆上盖玻片以完成封片操作，供后续观察拍照。图10为免疫组化鉴定结果，结果显示抗体可以检测人肝癌组织中的STC2的表达。

ELISA实验步骤：

抗原包被：将样品用包被缓冲液稀释后，加入96孔板中，每孔100μl。贴膜封闭后，37℃作用1小时，再转入低温实验室中过夜包被。

封闭：倾倒包被液，PBST清洗三次，每次6分钟。拍干孔板后，每孔加入封闭液150μl，37℃烘箱中封闭2h。

加待测样品(一抗)：弃去封闭液，PBST清洗三次，每次6分钟。向每孔中加入100μl的一抗溶液，37℃孵育1h。

二抗孵育：弃去一抗溶液后，PBST清洗三次，每次6分钟。向每孔中加入100μl的二抗溶液，37℃孵育1h。

显色：弃去二抗溶液后，PBST清洗四次，每次6分钟。拍干孔板后，避光环境中，每孔加入150μl显色液，置于烘箱中，显色10分钟。显色完成后，加入2M H₂SO₄,终止反应，放入酶标仪中测定OD450值。

二、实验结果：

实验结果显示，本发明的鼠抗人STC2单克隆抗体能够特异性检测到STC2蛋白的表达，具有很好的免疫印迹应用前景，且对其进行初步表位鉴定，发现识别位点位于碳末端100个氨基酸，图9为识别表位鉴定结果，初步显示抗体可识别STC2后100个氨基酸中的特异性位点。图10与图11为免疫组化和ELISA鉴定结果，显示本发明的杂交瘤细胞产生的鼠抗人STC2单克隆抗体可应用于免疫组化与ELISA检测技术中。

Claims (7)

1.一种鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株A1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No.62532，保藏日期：2022年06月13日。

2.如权利要求1所述鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

3.如权利要求1所述鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在制备免疫印迹检测试剂中的应用。

4.一种免疫印迹检测试剂盒，其特征在于包含如权利要求2所述鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

5.一种免疫组化检测试剂盒，其特征在于包含如权利要求2所述鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

6.一种ELISA检测试剂盒，其特征在于包含如权利要求2所述鼠抗人STC2单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

7.如权利要求2所述鼠抗人STC2单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)单克隆抗体的腹水生产：

选用SPF级，7～9周龄小鼠，采用腹腔注射的方式，对每只小鼠注射500μL的高温灭菌的液体石蜡，一周后，将单克隆细胞株用PBS吹落离心，重悬后调整细胞密度，每只小鼠腹腔接种500μL，10⁶个杂交瘤细胞株，待7～14天左右观察小鼠腹部肿大情况，用注射器反复收集2～3次腹水，7000rpm,离心20min，吸取中部淡黄色液体备用；

2)抗体纯化：

将所得腹水用结合缓冲液稀释一倍后，与预处理过的proteinG在低温实验室过夜孵育，2500rpm,离心3min后弃去上清，洗杂两次后，用洗脱缓冲液洗脱，收集洗杂与洗脱组分，SDS-PAGE电泳后，用考马斯亮蓝染色，判断抗体纯度与浓度。

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