CN108659125B - 抗幽门螺旋杆菌蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种幽门螺旋杆菌抗体及其分泌细胞株、制备方法和用途。本发明以培养的幽门螺旋杆菌菌体蛋白的超声上清部分为免疫原免疫小鼠，经筛选后获得了可特异结合幽门螺旋杆菌蛋白的抗体15A5，该抗体为IgG2a亚型。该抗体可检测组织或血清中的感染的幽门螺旋杆菌。

Description

抗幽门螺旋杆菌蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及生物医学工程领域，特别涉及一种抗幽门螺旋杆菌蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用。

背景技术

幽门螺旋杆菌是一种革兰氏阴性杆菌，螺旋形、微需氧、Marshall等于1983年首次从胃粘膜组织中分离到幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，简称Hp)，并报道和B型胃炎及消化性溃疡密切相关。世界卫生组织1994年起就将感染幽门螺旋杆菌划定为第一类的致癌风险。世界有过半人口受到过幽门螺杆菌的感染，幽门螺杆菌寄生在胃黏膜组织中，感染首先引起慢性胃炎，并导致胃溃疡和胃萎缩，或可发展为胃癌，幽门螺杆菌感染与胃癌死亡率的高低呈现平行关系。此外，从病因学角度讲，它与胃溃疡、十二指肠溃疡、胃腺癌和原发B细胞淋巴瘤有关。

对于HP的检测，最常见的方法包括碳13尿素呼气试验、胃镜结合组织病理检查以及幽门螺旋杆菌抗体检查。PCR方法也是快速准确检测幽门螺旋杆菌DNA的有效方法，免疫学检测方法则包括测定血清中的抗体、补体结合试验、凝集试验、被动血凝测定、免疫印迹技术和酶联合吸附测定(ELISA)以及免疫组织化学法等。无论采用何种免疫学检测方法，对需要特异、敏感的检测抗体。针对不同的用途，抗体的制备策略也有不同，即便是对于免疫检测的用途，因检测样本类型不同、目标蛋白在检样的状态不同以及检样的基质不同而引起的干扰类型不同，在抗原设计和选择过程和抗体的筛选过程中都需要充分考虑。

常见的免疫原制备方法包括直接提取或纯化包含目的蛋白的生物样本(如组织裂解液、细胞裂解液、提取自天然组织活细胞的纯化蛋白)，重组表达的抗原蛋白或其片段、化学合成的抗原肽等。针对Hp的菌体抗原制备方法主要包括目前国内外报道不多。整菌抗原、超声粉碎抗原或酸提取抗原。免疫检测方法，以类似的方法，

利用全菌或简单分离的菌体蛋白制备幽门螺旋杆菌的抗体简单易行。李妍等用培养的幽门螺旋杆菌超声后用上清和沉淀分别免疫BALB/c小鼠，获得针对Lpp20、HspA、CagA、ureaseA、UreaseB及catalase的抗体共34株，利用这些抗体进行了ELISA检测，无免疫组化检测和抗体对比。(抗幽门螺杆菌单克隆抗体的制备与鉴定，李妍，宁云山，洪燕华，刘宜楚，罗军，龙敏，董文其，李明，南方医科大学学报，2006,26(4)：425-427)，马健也采用这类用全菌免疫，重组蛋白筛选的方法获得了抗尿素酶B和热休克蛋白Hsp60抗体，建立的夹心ELISA方法可以检出25ng/ml的菌体蛋白。将全菌免疫小鼠获得抗体直接标记HRP检测抗体(马健，幽门螺杆菌单克隆抗体的制备及其在免疫检测中的应用，华南理工大学硕士学位论文，2014；马健，倪超，王海鹰，宁正祥.幽门螺旋杆菌单克隆抗体制备及其检测应用.现代食品科技.2015,31(4):228-233.)其他利用全菌免疫的研究也有报道(刘志国等主编，中国幽门螺旋杆菌研究，科学技术文献出版社，1997年出版，临床篇1.2抗幽门螺杆菌单克隆抗体的制备和临床应用)。除兔多抗外，在兽药研究中，鸡IgY也是一类常用的抗体，聂作明等利用菌体蛋白和尿素酶B作为混合抗原免疫母鸡，获得了具有ELISA和免疫印迹检测能力的IgY抗体(聂作明，杨严俊，徐榕榕，盛剑俊.抗幽门螺杆菌卵黄抗体的制备及其效价的评定.食品科学,2005,26(4):232-237)，以开发治疗性Hp抗体为目标，祝捷等用全菌和部分重组蛋白免疫产蛋母鸡制得了具备抑菌效果的IgY抗体(祝捷，杨靖，周永君，潘兴，杨廷敏等，特异性抗幽门螺杆菌卵黄抗体的制备及其抗菌作用研究.中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛,2013)，该抗体为禽源性抗体，暂时只可用于体外细胞实验。

利用全菌蛋白制备Hp抗体虽然操作简单，由于涉及免疫的抗原数量很多，所以特异性需要对大量无关菌进行筛选，保证获得特异抗体。利用重组蛋白免疫可以使抗体的识别特异性和生产稳定性得到基本保证。白艳艳等以重组尿素酶B为抗原制备了可以用于ELISA检测的单抗(白艳艳，王兆钺，白霞，缪竞诚，沈飞.幽门螺杆菌尿素酶B单克隆抗体的制备、鉴定及应用.中国病理生理杂志,2006,22(3)：622-624.)。陶好霞等也利用类似方法制备了8株不同亚型的抗尿素酶的单抗用于ELISA检测(陶好霞,刘向昕,张兆山.幽门螺杆菌尿素酶B单克隆抗体的制备与鉴定.生物技术通讯,2007,18(2):246-248)。朱虹等制备了针对CagL蛋白的一株IgG类单抗和两株IgM抗体(幽门螺杆菌CagL蛋白单克隆抗体的制备与鉴定，江苏大学学报(医学版)，2013,23(3)：238-242)。李丛胜等利用重组的幽门螺杆菌HP0762蛋白，制备了兔多抗克隆抗体，并进行了ELISA和免疫印迹检测，但无免疫组化检测用途的报道(李丛胜，邱炎，王艳春，韩秀萍，陶好霞.幽门螺杆菌HP0762蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体制备.生物技术通讯.2010,21(2):149-153)。用作免疫原的蛋白除脲酶外也包括一些菌体表面糖蛋白，虽然这类糖蛋白往往难以通过原核表达纯化获得与天然蛋白一致的修饰和免疫原性，但仍有研究尝试并获得识别重组抗原的抗体(赵英会，庄东明，杨庆玺，于广福，王玉，张丽青，赵大鹏，张红欣，于爱莲.幽门螺杆菌外膜蛋白Omp18表达载体构建及其多克隆抗体的制备.中国病原生物学杂志.2013,8(7):592-595)。为检测血液中的幽门螺旋菌感染，利用核酸检测和免疫检测的方法都是可行的，发明专利“检测血液中幽门螺杆菌抗原的方法”(公开号：CN1680605)公开了一种利用商业化抗体检测血样中幽门螺杆菌抗原蛋白的方法，发明专利“一种用于测定幽门螺杆菌抗体的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和应用的制作方法”(CN102662059A)则提供了一种利用抗原检测样本中抗幽门螺杆菌抗体的方法。

为提高检测的敏感度，可以选择制备菌体多抗获得高亲合力抗体，但多抗的批次间差异较大，难以稳定应用，实践中往往采用多个单抗组合使用的鸡尾酒法，在抗体的技术层面，也可以通过制备双特异抗体达到上述目的，范贵荣等利用VacA和HpaA重组蛋白分别免疫，二次融合的方法获得了可识别两种蛋白的稳定细胞株，这种尝试拓展了抗体的识别能力，但其稳定性和实际应用效果尚待检验(范贵荣，抗幽门螺杆菌VacA和HpaA双特异性单克隆抗体的制备，重庆医科大学，硕士学位论文，2009)。除用于诊断外，制备Hp抗体还有望用于Hp相关肿瘤，叶翠莲等利用重组的HpaA蛋白制备的单克隆抗体进行的细胞抑制实验表明一株单抗可以部分抑制幽门螺旋杆菌对AGS细胞的粘附作用(叶翠莲姜和蔡家利邱容蓉邹姝妹王颖.幽门螺杆菌HpaA蛋白单克隆抗体的制备及其初步应.中国生物制品学杂志,2011.3:83-87)。

发明内容

为了克服以上技术问题，提供一种适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测的，具有特异性和敏感性的幽门螺旋杆菌单克隆抗体。所述细胞株已于2018年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，保藏号为：CGMCC NO 15485，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

发明人提供了一种抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体，由保藏号为CGMCC NO15485的杂交瘤细胞株产生。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别幽门螺旋杆菌蛋白。

进一步地，所述单克隆抗体的重链可变区的DNA序列为SEQ ID1所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列为SEQ ID2所示的核苷酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID3所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID4所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体为小鼠IgG2b亚型。

发明人还提供了一株分泌抗幽门螺旋杆菌蛋白分子的杂交瘤细胞株，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞株15A5，所述细胞株已于2018年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，保藏号为：CGMCC NO 15485，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

发明人还提供了上述单克隆抗体在幽门螺旋杆菌蛋白免疫检测中的用途。

进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。

区别于现有技术，本发明所产生的有益技术效果为：

(1)本发明获得的单克隆抗体由杂交瘤15A5分泌产生，能特异性识别人组织中感染的幽门螺旋杆菌及其蛋白，可以特异性检测与幽门螺旋杆菌感染有关的慢性胃炎、胃溃疡和胃癌组织样本中的菌体蛋白。

(2)本发明获得的杂交瘤15A5为一种IgG2b亚型抗体，与幽门螺旋杆菌具有特异结合能力，具有很高的敏感度。

(3)因本发明获得的单克隆抗体杂交瘤15A5由可溶的菌体蛋白制成，可以识别天然菌体蛋白及空间表位，更利于免疫组织化学(IHC)、免疫印记(Western blotting)中的蛋白检测。

附图说明

图1为15A5杂交瘤培养上清分泌抗体的免疫印迹检测结果，其中Marker为预染蛋白分子量标记，15A5为杂交瘤培养上清的检测结果；

图2为胃炎组织1的染色结果对比图；15A5的染色结果为++，兔多抗的染色结果为+；

图3为胃炎组织3的染色结果对比图；15A5的染色结果为++，兔多抗的染色结果为+。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

实施例1幽门螺旋杆菌培养和菌体蛋白制备

将获得的幽门螺旋杆菌(ATCC 700392，Strain Designations:26695)放入37℃恒温水浴锅，摇晃以迅速解冻，用接种环接种适量菌株于制备好的哥伦比亚培养基上(按1000ml：41g的比例分别加入纯水和哥伦比亚培养基(北京索莱宝科技有限公司)，加入8％的脱纤维绵羊血)，按原代培养的条件，将平皿放置于微需氧罐中培养2天，至平皿中长出乳白色粘稠菌苔，用PBS缓冲液pH7.4洗下菌苔，5000rpm离心5分钟，弃去上清，再加入500μl的PBS，超声破碎菌体，超声后14000rpm离心15分钟，将上清转移至新的离心管，沉淀以含8M尿素的PBS缓冲液重悬，上清和沉淀菌体蛋白-20℃保存备用。

实施例2杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1中获得的上清和沉淀菌体蛋白分别用弗氏完全佐剂(Sigma公司)乳化，按照1:1的比例混合后，免疫4-6周龄雌性Balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(Sigma公司)乳化，剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCC)以5:1比例混合，离心1500rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500(Roche公司)，并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的IMDM(Sigma公司)，混匀，离心1000rpm，5min。弃上清后，加入10ml血清(PAA公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10xHAT(Sigma公司)的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1％硝基纤维素(Sigma公司)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。

三、挑克隆

融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。

四、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100μl上清蛋白分别ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入200μl含饲养细胞和1％HT(Sigma公司)的完全培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HT)的24孔板培养。五天后取100μl上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。

实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数约5×10⁵，1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃保存。

二、单克隆抗体的纯化

用HiTrap rProtein A FF(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。

实施例4单克隆抗体特性鉴定

一、亚类鉴定

用100mM PBS(pH7.4)稀释包被羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)至0.5μg/ml,每孔加100μl，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05％Tween的PBS(PBS-T)洗3次，每孔加入200μl封闭液(含2％BSA和3％蔗糖的PBS)，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清，37℃孵育1h。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液1：1000稀释HRP标记的羊抗鼠(κ,λ)抗体或1：2000稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA)抗体(Southern Biotech公司)0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μl含0.15％ABTS(Southern Biotech公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸缓冲液(PH4.0)进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。

结果显示，本发明单克隆抗体为IgG2b亚型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

取经超声的幽门螺旋杆菌的超声上清，包被浓度为2μg/ml,100μl/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl，浓度为2％脱脂奶粉作为封闭液，37℃封闭2h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：20000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl含0.1％TMB(Sigma公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μl0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找到最大结合OD值的一半时对应的稀释倍数A，利用下列公式计算出该抗体的亲和常数为1.32×10⁹。

三、单抗反应特异性和应用效果

免疫印迹实验过程如下，取实施例1中制得的幽门螺旋杆菌培养的超声上清，上样10μl(约50ng)，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，预染蛋白分子量标记PageRuler^TMPrestained Protein Ladder(Thermo Scientific，货号26616)。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上(Millipore公司)。将膜置于含5％脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜。加入由15A5杂交瘤细胞培养上清(1：4稀释)4℃孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入1：5000稀释的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液(北京普利莱基因技术有限公司)，以ChemiDocMP多色荧光成像系统(Bio-Rad)进行化学发光图像数据的采集。结果可见图1：15A5杂交瘤培养上清分泌抗体的免疫印迹检测结果，该株抗体可与幽门螺旋杆菌的蛋白提取物特异结合，条带单一，其位置在27kDa附近。

实施例5抗体的可变区序列测定

培养新鲜的杂交瘤细胞，取上清进行抗原结合特性验证后，离心收集10⁶以上杂交瘤细胞。Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA。取9μl总RNA，加入2.5μLoligo(dT)12–18primer(10mM)，及5μldNTPs，混合均匀，70℃保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。随后加入5μl的5×逆转录酶缓冲液，2.5μl DTT(0.1M)及1μl逆转录酶(北京华大蛋白质研发中心有限公司)，42℃反应1小时。70℃孵育15分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20℃。将获得的第一链cDNA进行PCR扩增，在50μl反应体系中加入引物各25pmol，重链可变区和轻链可变区扩增用引物的序列按照沈倍奋主编的《重组抗体》(科学出版社，2005年出版)一书中鼠单抗引物序列设计和合成(生工生物工程(上海)股份有限公司)。用于扩增重链可变区的引物如下，其中MHV.B1直至MHV.B12的11条引物为上游引物，可分别与重链下游引物MHC.F组合用于扩增重链可变区基因。

MHV.B1:5’-GATGTGAAGCTTCAGGAGTC-3’

MHV.B2:5’-CAGGTGCAGCTGAAGGAGTC-3’

MHV.B3:5’-CAGGTGCAGCTGAAGCAGTC-3’

MHV.B4:5’-AGGTTACTCTGAAAGAGTC-3’

MHV.B5:5’-GAGGTCCAGCTGCAACAATCT-3’

MHV.B6:5’-GAGGTCCAGCTGCAGCAGTC-3’

MHV.B7:5’-CAGGTCCAACTGCAGCAGCCT-3’

MHV.B8:5’-GAGGTGAAGCTGGTGGAGTC-3’

MHV.B9:5’-GAGGTGAAGCTGGTGGAATC-3’

MHV.B10:5’-GATGTGAACTTGGAAGTGTC-3’

MHV.B12:5’-GAGGTGCAGCTGGAGGAGTC-3’

MHC.F:5’-GGCCAGTGGATAGTCAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC-3’

用于扩增轻链可变区的引物如下，其中MKV.B1直至MKV.B10的10条引物为上游引物，可分别与轻链下游引物MKC.F组合用于扩增Kappa轻链的可变区基因。

MKV.B1:5’-GATGTTTTGATGACCCAAACT-3’

MKV.B2:5’-GATATTGTGATGACGCAGGCT-3’

MKV.B3:5’-GATATTGTGATAACCCAG-3’

MKV.B4:5’-GACATTGTGCTGACCCAATCT-3’

MKV.B5:5’-GACATTGTGATGACCCAGTCT-3’

MKV.B6:5’-GATATTGTGCTAACTCAGTCT-3’

MKV.B7:5’-GATATCCAGATGACACAGACT-3’

MKV.B8:5’-GACATCCAGCTGACTCAGTCT-3’

MKV.B9:5’-CAAATTGTTCTCACCCAGTCT-3’

MKV.B10:5’-GACATTCTGATGACCCAGTCT-3’

MKC.F:5’-GGATACAGTTGGTGCAGCATC-3’

其余dNTPs及缓冲液均按照常规加入，最后加入cDNA模板1μl和1U热启动Taq DNA聚合酶(TaKaRa)。设置PCR扩增程序为94℃40秒，52℃40秒，72℃40秒，进行20至25个循环，最后72℃延伸3分钟，产物可置于4℃备用或直接电泳。取20μl PCR产物进行电泳分析，在1.5％琼脂糖凝胶上分离切胶回收，克隆至T载体测序。

实施例6.组织芯片染色和鉴定

一.芯片制备过程

对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。使用3DHISTECH公司的全自动组织芯片仪制作组织芯片。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放入68℃烤箱内10分钟,使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30min，再放入-20℃冰箱冷冻6min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为3μm，将连续切片漂在40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到50℃的温水中展片30秒，用经多聚赖氨酸处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入68℃烤箱内烤片2小时，取出，室温冷却，放入-4℃冰箱保存。

二.IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3％H₂O₂孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育15-30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染25秒，PBS返蓝30秒。按照85％(3分钟)-95％(3分钟)-100％(3分钟)-100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。

免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：

1、样本为弱阳性；标记为“+”；

2、样本为中度阳性；标记为“++”；

3、样本为高度阳性；标记为“+++”。

4、样本为阴性，标记为“-”。

三.数据统计

1、胃炎、胃癌组织芯片检测结果：

将本抗体(15A5)和市售抗体(Thermo兔多抗)在组织芯片(包括60例胃炎、109例胃癌)上进行幽门螺旋杆菌的同步检测并比较检测结果。

HP的免疫组化试验过程采取双盲设计，试验结果如下表所示。

本抗体(15A5)和市售临床抗体(Thermo兔多抗)符合率达到100％。同时，本抗体在2例胃炎组织内的染色强度大于市售抗体，说明本抗体在胃炎、胃癌组织的特异性同市售抗体相当，敏感性和亲和力高于市售抗体。本抗体能够更好的呈现胃幽门螺杆菌形态，呈弧形弯曲状、S形或点状，菌体纤细，便于观察。而对照兔多抗呈现的菌体形态偏粗，未能呈现菌体真正形态，镜下观察的形态不够清晰。

图2为胃炎组织1的染色结果对比图；15A5的染色结果为++，兔多抗的染色结果为+；

图3为胃炎组织3的染色结果对比图；15A5的染色结果为++，兔多抗的染色结果为+。

2、正常组织芯片检测结果：

正常组织芯片包括30种正常组织样本，正常组织样本主要选自新鲜、及时固定的手术标本；每种组织包括3个不同病例样本。30种正常组织包括：大脑、心脏、小脑、食管、肾上腺、胃、卵巢、小肠、胰腺、结直肠、甲状旁腺、肝脏、垂体、唾液腺、睾丸、肾、甲状腺、前列腺、乳腺、子宫、脾、膀胱、扁桃体、骨骼肌、胸腺(幼儿)、皮肤、骨髓、外周神经、肺、间皮细胞。

将本抗体(15A5)和市售抗体(Thermo兔多抗)在正常组织芯片上进行同步检测，样本阳性和阴性结果一致，说明本抗体在正常组织的特异性同市售抗体相当。

本发明对人工培养的幽门螺旋杆菌进行离心和超声处理后，分别取其菌体蛋白的可溶性部分和不可溶的沉淀以尿素溶解后分别用于小鼠免疫，经细胞融合后获得了多株识别抗原的单克隆抗体细胞株，利用免疫原和包含多种病理组织的组织芯片分别筛选获得的抗体上清进行多轮筛选后获得了染色特异、敏感度高的单克隆抗体15A5。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgG2b亚型单克隆抗体，并通过对杂交瘤细胞的mRNA逆转录后扩增出编码其重链和轻链可变区的基因序列。对于最终获得的单克隆抗体以多种组织样本和多种抗体进行IHC方法检测，确定用途。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

序列表

<110> 福州迈新生物技术开发有限公司

<120> 抗幽门螺旋杆菌蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

<130> 20

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

gaggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc ttagtgccgc ctggagggtc ccggaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacttccact agttttggaa tgcactgggt tcgtcaggct 120

ccagagaagg gactggagtg ggtcgcattc attagtagtg ccagtagtac catctactat 180

gcagacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atcccaagaa caccctgttc 240

ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aaaagctttc 300

tatgctctgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctcagc caaaacgaca 360

cagcttgtct atccactggc ccct 384

<210> 2

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

ggtgatatcg ttctcactca atctccagca atcatgtctg cttctccagg ggagaaggtc 60

accataacct gcagtgccag ctcaagtgtg agttacacgc actggttcca gcagaagtca 120

ggcacttctc ccaaactctg gatttatagc atatccaacc tggcttctgg agtccctact 180

cgcttcagtg gcagtggatc tgggacctct tactctctca caatcagccg aatggaggct 240

gaagatgttg ccacttatta ctgccagcta aggaatagtt acccgcccac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa a 321

<210> 3

<211> 128

<212> PRT

<213> 小鼠(mus musculus)

<400> 3

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Pro Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Thr Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Ser Ser Ala Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ala Phe Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Gln Leu Val Tyr Pro Leu Ala Pro

115 120 125

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(mus musculus)

<400> 4

Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro

1 5 10 15

Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr

20 25 30

Thr His Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile

35 40 45

Tyr Ser Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Arg Asn Ser Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

Claims (6)

1.一种抗幽门螺旋杆菌蛋白单克隆抗体，由保藏号为CGMCC NO 15485的杂交瘤细胞株产生。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别幽门螺旋杆菌蛋白。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区编码的DNA序列为SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区编码的DNA序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.3 所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为小鼠IgG2b亚型。

6.一株分泌抗幽门螺旋杆菌蛋白分子的杂交瘤细胞株，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞株15A5，所述细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO 15485。

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