CN111996173B - 杂交瘤细胞株及其制备方法和应用、单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种杂交瘤细胞株及其制备方法和应用、单克隆抗体及其应用。该杂交瘤细胞株的保藏号为GDMCC No：61044或者该杂交瘤细胞株的保藏号为GDMCC No：61043。上述杂交瘤细胞株能够分泌与胰岛素特异性结合的胰岛素抗体，该胰岛素抗体能够用于制备灵敏度高、特异性强、稳定性好的胰岛素检测试剂盒。用本研究提供的胰岛素抗体研制的检测试剂盒，可精确检测待测样品中胰岛素，与市售试剂盒检测结果高度相关，与临床诊断具有较高诊断一致性。

Description

杂交瘤细胞株及其制备方法和应用、单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种杂交瘤细胞株及其制备方法和应用、单克隆抗体及其应用。
背景技术
胰岛素（INS）是胰岛β细胞合成和分泌的一种多肽类激素，由21个氨基酸构成的A链和30个氨基酸构成的B链，以两个双硫链相连组成，相对分子质量为5734D，是机体内唯一的降糖激素，其与机体能量代谢密切相关，并参与机体细胞生长、发育、增殖、分化等调控。
INS基因存在于所有细胞，并在这些细胞具有相同的拷贝和同样的结构，但只在胰岛β细胞高度特异地表达。在胰岛β细胞的细胞核中，第11对染色体短臂上胰岛素基因区DNA向mRNA转录，mRNA从细胞核移向细胞浆的内质网，转译成由110个氨基酸残基构成的前胰岛素原。前胰岛素原经过蛋白水解作用除其前肽，生成86个氨基酸组成的长肽链-胰岛素原（Proinsulin）。胰岛素原随细胞浆中的微泡进入高尔基体，经蛋白水解酶的作用，切去31、32、60三个精氨酸连接的链，断链生成没有生理活性的C肽，同时生成胰岛素，分泌到B细胞外，进入血液循环中。未经过蛋白酶水解的胰岛素原，一小部分随着胰岛素进入血液循环，胰岛素原的生物活性仅有胰岛素的5%。
胰岛素的检测在临床中主要应用于糖尿病诊断、分型，可以判定糖尿病患者是I型患者还是II型患者。主要适合于没有使用胰岛素治疗的患者，可在空腹及餐后2小时抽血进行测定，正常情况下空腹胰岛素水平应该为5μIU/mL～30μIU/mL，而餐后水平应比空腹高出4倍～5倍。如果胰岛素水平明显降低，就称之为绝对缺乏，可见于I型糖尿病；如果并没有明显减少，而表现为血糖升高，就称为相对缺乏，是因为胰岛素发挥作用的环节出现故障，常见于存在胰岛素抵抗的II型糖尿病。
近几年，胰岛素含量检测多采用免疫测定法，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，包括酶联免疫吸附法、免疫层析法法、免疫透射比浊法、时间分辨荧光免疫分析法、化学发光免疫分析法等。所有这些免疫学方法，都需要以胰岛素单克隆抗体为前提条件，对制备的抗体的性能要求很高。然而，现有的胰岛素单克隆抗体的性能较差，导致胰岛素检测结果不够准确。
发明内容
基于此，本申请提供一种杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能够分泌胰岛素单克隆抗体，且采用分泌的胰岛素单克隆抗体对胰岛素进行检测的准确性较高。
此外，本申请还提供一种杂交瘤细胞株的制备方法和杂交瘤细胞株的应用、单克隆抗体及其应用。
一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏号为GDMCC No：61044或者所述杂交瘤细胞株的保藏号为GDMCC No：61043。
上述杂交瘤细胞株能够分泌亲和力较高的胰岛素单克隆抗体，有利于提高胰岛素检测的准确性，能够为胰岛素免疫检测提供关键原料，对于扩大其临床应用，降低成本，具有重要意义。经试验验证，将上述杂交瘤细胞株分泌的胰岛素单克隆抗体制备成胰岛素检测试剂盒，采用该胰岛素检测试剂盒对胰岛素进行检测的准确度在0.900~1.100范围内，具有较高的准确性。
一种单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株分泌。
在其中一个实施例中，所述单克隆抗体能够识别多肽片段，所述多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3或者SEQ ID NO：4所示。
一种杂交瘤细胞株的制备方法，包括如下步骤：
采用胰岛素原免疫小鼠，获得免疫后的小鼠；及
提取所述免疫后的小鼠的脾脏细胞，并与小鼠骨髓瘤细胞融合，筛选，得到杂交瘤细胞株。
在其中一个实施例中，所述筛选的步骤包括：采用多肽并按照ELISA方法对融合后的细胞进行筛选，得到所述杂交瘤细胞株，其中，所述多肽包括第一片段及第二片段中的至少一个，所述第一片段含有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述第二片段含有如SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列。
在其中一个实施例中，所述多肽还包括胰岛素，所述采用多肽并按照ELISA方法对融合后的细胞进行筛选的步骤包括：
采用所述胰岛素并按照ELISA方法对融合后的细胞进行筛选，得到阳性细胞；及
采用所述第一片段及所述第二片段中的一个并按照ELISA方法对所述阳性细胞进行筛选，得到所述杂交瘤细胞株。
在其中一个实施例中，所述胰岛素原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
上述杂交瘤细胞株、或者上述单克隆抗体、或者上述杂交瘤细胞株的制备方法制备得到的杂交瘤细胞株在制备胰岛素检测试剂、胰岛素检测试剂盒或者胰岛素检测装置中的应用。
一种胰岛素检测试剂盒，包括：第一抗体和第二抗体，所述第一抗体含有由保藏号为GDMCC No：61044的杂交瘤细胞株及保藏号为GDMCC No：61043的杂交瘤细胞株中的一个分泌的单克隆抗体，所述第二抗体含有由保藏号为GDMCC No：61044的杂交瘤细胞株及保藏号为GDMCC No：61043的杂交瘤细胞株中的另一个分泌的单克隆抗体。
在其中一个实施例中，所述第一抗体及所述第二抗体中的一个为标记物标记的抗体，所述标记物包括发光标记物。
一种胰岛素检测装置，包括上述单克隆抗体或者上述胰岛素检测试剂盒。
附图说明
图1为纯化后胰岛素4B2-E2-E7-C3抗体和4A3-B1-E1抗体的SDS-PAGE电泳图谱；
图2为4B2-E2-E7-C3抗体、4A3-B1-E1抗体、市售胰岛素单克隆抗体A和市售胰岛素单克隆抗体B的抗体效价对比图；
图3为采用含有本研究的单克隆抗体的胰岛素检测试剂盒与Roche公司胰岛素电化学发光检测试剂盒的相关性关系图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的部分实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本研究一实施方式提供一种杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株的保藏号为GDMCCNo：61044。
具体地，上述杂交瘤细胞株于2020年6月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称GDMCC，地址为：广州市先烈中路100号，广东省微生物研究所，59号楼5楼，邮编：510070），保藏编号为GDMCC No：61044，分类学名称为Mus musculus hybridoma 4B2-E2-E7-C3。
上述杂交瘤细胞株能够分泌亲和力较高的胰岛素单克隆抗体，有利于提高胰岛素检测的准确性，能够用于制备胰岛素检测试剂、胰岛素检测试剂盒或者胰岛素检测装置。经试验验证，将上述杂交瘤细胞株分泌的胰岛素单克隆抗体制备成胰岛素检测试剂盒，采用该胰岛素检测试剂盒对胰岛素进行检测的准确度在0.900~1.100范围内，具有较高的准确性。
本研究一实施方式提供一种杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株的保藏号为GDMCCNo：61043。
具体地，上述杂交瘤细胞株于2020年6月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称GDMCC，地址为：广州市先烈中路100号，广东省微生物研究所，59号楼5楼，邮编：510070），保藏编号为GDMCC No：61043，分类学名称为Mus musculus hybridoma4A3-B1-E1。
上述杂交瘤细胞株能够分泌亲和力较高的胰岛素单克隆抗体，有利于提高胰岛素检测的准确性，能够用于制备胰岛素检测试剂、胰岛素检测试剂盒或者胰岛素检测装置。经试验验证，将上述杂交瘤细胞株分泌的胰岛素单克隆抗体制备成胰岛素检测试剂盒，采用该胰岛素检测试剂盒对胰岛素进行检测的准确度在0.900~1.100范围内，具有较高的准确性。
本研究一实施方式提供一种单克隆抗体，由上述保藏号为GDMCC No：61044或者保藏号为GDMCC No：61043的杂交瘤细胞株分泌。
上述单克隆抗体对胰岛素的亲和力较高，能够用于制备准确性高、灵敏度高、特异性强、稳定性好的胰岛素检测试剂盒。
在其中一个实施例中，单克隆抗体能够识别多肽片段，多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3或者SEQ ID NO：4所示。该多肽片段含有胰岛素抗原表位，能够与单克隆抗体进行特异性结合。
其中，如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列为：ffytpktGI。如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列为sicslyql。
杂交瘤细胞株4B2-E2-E7-C3分泌的单克隆抗体能够特异性识别氨基酸序列如SEQID NO：3所示的多肽片段。杂交瘤细胞株4A3-B1-E1分泌的单克隆抗体能够特异性识别氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的多肽片段。
本研究一实施方式提供一种杂交瘤细胞株的制备方法，包括如下步骤S110~S120：
S110、采用胰岛素原免疫小鼠，获得免疫后的小鼠。
研究发现，由于胰岛素分子量较小，将其作为免疫原，获得的血清抗体效价低，免疫成功率不高，且容易使动物因低血糖死亡。本研究以胰岛素原作为免疫抗原，具有较高的免疫成功率，能够获得高效价的抗体，且能够避免动物因低血糖而死亡。
其中，根据GenBank上的人胰岛素原氨基酸序列（NP_001172026）可知，胰岛素原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。具体地，如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列为：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN。
需要说明的是，胰岛素原可以为通过基因工程技术或者人工合成等方式制备，也可以为市售的胰岛素原。
具体地，S110的步骤包括如下步骤S111~S112：
S111、采用胰岛素原对小鼠初次免疫，得到初次免疫的小鼠。
具体地，将胰岛素原乳化后，以100μg/只~200μg/只的抗原剂量免疫BALB/c小鼠，饲养2周～3周，得到初次免疫的小鼠。
其中，将胰岛素原按照所需量用0.01 M、pH7.4的PBS缓冲液稀释后，与弗氏完全佐剂按体积比1:1混合，得到乳化剂。然后将乳化剂以100μg/只～200μg/只的抗原剂量免疫BALB/c小鼠，饲养2周～3周，得到初次免疫的小鼠。
其中，免疫的方式为皮下注射。具体地，免疫方式为背部皮下注射5个~7个点。
S112、对初次免疫的小鼠进行加强免疫，获得免疫后的小鼠。
具体地，将胰岛素原与弗氏不完全佐剂按体积比1:1混合乳化后，以50μg/只的抗原剂量对初次免疫的小鼠进行加强免疫，饲养2周～3周后，得到免疫后的小鼠。
进一步地，加强免疫进行多次，相邻加强免疫的时间间隔为2周～3周。在一个具体示例中，加强免疫进行四次。
其中，免疫的方式为皮下注射。具体地，免疫方式为背部皮下注射5个~7个点。
S120、提取免疫后的小鼠的脾脏细胞，并与小鼠骨髓瘤细胞融合，筛选，得到杂交瘤细胞株。
在其中一个实施例中，提取免疫后的小鼠的脾细胞，并与小鼠骨髓瘤细胞融合的操作包括如下步骤S121～S122：
S121、分别吸取免疫后的小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞于离心管中，加入不完全培养液后混匀，离心弃上清，得沉淀液。其中，免疫后的小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞的个数比例为10～2：1。
进一步地，免疫后的小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞的个数比例为6：1。在一个具体示例中，小鼠骨髓瘤细胞的细胞数为3.5×107个，免疫后的小鼠的脾细胞的个数为2.1×108个。
其中，小鼠骨髓瘤细胞为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14。
其中，不完全培养液为不含血清的培养液。进一步地，不完全培养液为不含血清的DMEM培养液。在其他实施方式中，不完全培养液还可以是不含血清的RPMI-1640培养液或者不含血清的IMDM培养液。
其中，离心转速为1200rpm～1600rpm，离心时间为5min～10min。在一个具体实施例中，离心转速为1400rpm，离心时间为8min。
S122、在沉淀液中加入PEG融合剂溶液，静置后，加入不完全培养液终止融合，得到融合细胞。
其中，PEG融合剂为PEG1500融合剂。需要说明的是，PEG融合剂不限于为PEG1500融合剂，也可以为其他PEG融合剂，可以根据需要进行选择。
在其中一个实施例中，筛选的步骤包括：采用多肽并按照ELISA方法对融合后的细胞进行筛选，得到杂交瘤细胞株。其中，多肽包括第一片段及第二片段中的至少一个。第一片段含有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。第二片段含有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
研究发现，人胰岛素第24~32aa位氨基酸（如SEQ ID NO：3所示）和人胰岛素第39~46 aa位氨基酸（如SEQ ID NO：4所示）有较强的免疫原性、亲水性及表面可及性，因此，采用上述第一片段和第二片段进行筛选，有利于筛选对胰岛素亲和性较高的单克隆抗体。
具体地，多肽还包括胰岛素。采用多肽并按照ELISA方法对融合后的细胞进行筛选的步骤包括如下步骤S123~S124：
S123、采用胰岛素并按照ELISA方法对融合后的细胞进行筛选，得到阳性细胞。
采用胰岛素对融合后的细胞进行筛选，有利于筛选出针对胰岛素的阳性细胞。
其中，胰岛素的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
具体地，如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTGIVEQCCTSICSLYQLENYCN。
S124、采用第一片段及第二片段中的一个并按照ELISA方法对阳性细胞进行筛选，得到杂交瘤细胞株。
具体地，第一片段还含有第一载体蛋白。第一载体蛋白与如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列偶联。通过设置第一载体蛋白能够增加第一片段的反应性。进一步地，第一载体蛋白为BSA（牛血清白蛋白）。需要说明的是，第一载体蛋白不限于为BSA，也可以为其他载体蛋白，例如可以为KLH（钥孔血蓝蛋白）或者OVA（鸡卵白蛋白）。
第二片段还含有第二载体蛋白。第二载体蛋白与如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列偶联。通过设置第二载体蛋白能够增加第二片段的反应性。进一步地，第二载体蛋白为BSA（牛血清白蛋白）。需要说明的是，第二载体蛋白不限于为BSA，也可以为其他载体蛋白，例如可以为KLH（钥孔血蓝蛋白）或者OVA（鸡卵白蛋白）。
本实施例中，以第一片段为抗原筛选出的一株杂交瘤细胞株，即杂交瘤细胞株4B2-E2-E7-C3（于2020年6月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称GDMCC，地址为：广州市先烈中路100号，广东省微生物研究所，59号楼5楼，邮编：510070），保藏编号为GDMCCNo：61044，分类学名称为Mus musculus hybridoma 4B2-E2-E7-C3），其分泌的单克隆抗体能够特异性识别如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
以第二片段为抗原筛选出的一株杂交瘤细胞株，即杂交瘤细胞株4A3-B1-E1（于2020年6月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称GDMCC，地址为：广州市先烈中路100号，广东省微生物研究所，59号楼5楼，邮编：510070），保藏编号为GDMCC No：61043，分类学名称为Mus musculus hybridoma4A3-B1-E1），其分泌的单克隆抗体特异性识别如SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列。
上述杂交瘤细胞株的制备方法制备得到的杂交瘤细胞株能够分泌亲和力较高的胰岛素单克隆抗体，有利于提高胰岛素检测的准确性，能够用于制备胰岛素检测试剂、胰岛素检测试剂盒或者胰岛素检测装置。
本研究一实施方式提供一种胰岛素检测试剂盒，能够较为准确地检测待测样本中的胰岛素，能够应用于胰岛素检测装置中。其中，待测样本例如可以为血清或者血浆。
具体地，该胰岛素检测试剂盒包括第一抗体和第二抗体。第一抗体含有由保藏号为GDMCC No：61044的杂交瘤细胞株及保藏号为GDMCC No：61043的杂交瘤细胞株中的一个分泌的单克隆抗体。第二抗体含有由保藏号为GDMCC No：61044的杂交瘤细胞株及保藏号为GDMCC No：61043的杂交瘤细胞株中的另一个分泌的单克隆抗体。
本研究将上述两个特异性强和灵敏度高的单克隆抗体进行配对，制备得到的胰岛素检测试剂盒，能快速准确定量检测待测样本中胰岛素含量。
在其中一个实施例中，第一抗体及第二抗体中的一个为标记物标记的抗体。标记物包括发光标记物。进一步地，该发光标记物为钌复合物。具体地，发光标记物为三联吡啶钌。需要说明的是，发光标记物不限于为三联吡啶钌，也可以为其他钌复合物。需要说明的是，发光标记物不限于为钌复合物，也可以为其他发光标记物，例如可以为吖啶类物质。
本研究将上述两个特异性强和灵敏度高的单克隆抗体进行配对，制备得到的胰岛素检测试剂盒，能够在电化学发光平台快速定量检测待测样本中胰岛素含量。需要说明的是，标记物不限于为发光标记物，也可以为其他标记物，例如可以为碱性磷酸酶或者过氧化酶等化学发光催化剂。
进一步地，第一抗体及第二抗体中的另一个为固相载体标记的抗体。固相载体例如可以为磁性颗粒。进一步地，固相载体与抗体的连接方式为间接连接。其中，间接连接的方式例如可以为通过生物素-链霉亲和素体系连接固相载体和抗体。需要说明的是，固相载体与抗体的连接方式不限于为间接连接，也可以为直接连接。
保藏号为GDMCC No：61044的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体编号为INS-12抗体。保藏号为GDMCC No：61043的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体编号为2INS-1抗体。具体地，第一抗体为发光物质标记的INS-12抗体。第二抗体为固相载体标记的2INS-1抗体。更具体地，胰岛素检测试剂盒包括发光物质标记的INS-12抗体、生物素标记的2INS-1抗体、链霉亲和素标记的固相载体。
需要说明的是，胰岛素检测试剂盒还包括缓冲液等其他常规的组分。此处不再赘述。
本研究一实施方式提供一种胰岛素检测装置，包括上述单克隆抗体或者上述胰岛素检测试剂盒。该胰岛素检测装置能够较为准确地检测胰岛素含量。
其中，胰岛素检测装置包括检测设备。检测设备例如可以为电化学发光检测仪。需要说明的是，检测设备不限于为电化学发光检测仪，可以根据标记物选择合适的检测设备。
具体实施例部分：
实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
本实施例中所述胰岛素单克隆抗体的制备方法是：采用制备的胰岛素原为免疫抗原，与弗氏佐剂等体积比例混合免疫BalB/c母鼠，期间进行四次免疫，取鼠尾血清效价大于1:105的小鼠脾细胞与SP 2/0-Ag14骨髓瘤细胞，用质量百分含量为50%的PEG 1500的溶液（Sigma）进行细胞融合；用含有质量百分含量为20%胎牛血清的HAT-DMEM完全培养基筛选融合细胞；用化学合成的胰岛素多肽片段包被ELISA板，进行阳性细胞筛选；经过3-4次有限稀释，最后获得两株稳定分泌胰岛素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。其中一株杂交瘤细胞株于2020年6月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称GDMCC，地址为：广州市先烈中路100号，广东省微生物研究所，59号楼5楼，邮编：510070），保藏编号为GDMCC No：61044，分类学名称为Mus musculus hybridoma 4B2-E2-E7-C3（以下简称：INS-12）。另一株杂交瘤细胞株于2020年6月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称GDMCC，地址为：广州市先烈中路100号，广东省微生物研究所，59号楼5楼，邮编：510070），保藏编号为GDMCC No：61043，分类学名称为Mus musculus hybridoma4A3-B1-E1（以下简称：2INS-1）。
将石蜡油注射入8周的BalB/c母鼠腹腔，以0.6×106/只的细胞量将2株杂交瘤细胞注射入石蜡鼠腹腔，制备腹水。采用亲和层析Protein A Sepharose Fast Flow纯化单克隆抗体，以SDS-PAGE鉴定抗体纯度，纯度可达90%以上。具体制备步骤如下：
1、胰岛素原制备
根据GenBank上的人胰岛素原氨基酸序列（NP_001172026）可知，胰岛素原共有86个氨基酸（SEQ ID NO：1），本发明中所使用的胰岛素原为自制抗原蛋白。于金开瑞生物公司购买含胰岛素原cDNA的重组质粒，继而转化至大肠杆菌，获得工程菌株，经发酵表达、纯化，得到胰岛素原前体蛋白，进一步通过酶切、纯化得到胰岛素原。其中，胰岛素原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN。
2、胰岛素多肽片段偶联
选择多肽序列ffy tpk tGI（命名为INS-1）和sic sly ql（命名为INS-2）为胰岛素多肽片段抗原表位进行胰岛素特异性抗体筛选。上述多肽均由金开瑞生物公司合成。将上述合成的多肽片段的C端通过NHS偶联牛血清白蛋白BSA，形成合成肽。其中，INS-1与BSA偶联形成的合成肽命名为INS-BSA-1。INS-2与BSA偶联形成的合成肽命名为INS-BSA-2，备用。
3、BalB/c小鼠免疫
采用0.01M、pH7.4的PBS缓冲液，将胰岛素原抗原稀释到2mg/mL，并与弗氏佐剂按照1：1体积比例混合制成乳状液，首次免疫使用弗氏完全佐剂，每只小鼠注射量为100μg，背部皮下注射6点，共免疫3只BalB/c母鼠。两周以后免疫使用弗氏不完全佐剂，每只小鼠注射量为50μg，每隔两周免疫一次，共免疫四次。免疫前采集阴性血做为阴性对照。
4、血清抗体效价检测
用间接ELISA检测抗体效价：采用0.05M、pH 9.6的碳酸缓冲液，将胰岛素原稀释成为1μg/mL的浓度，包被聚苯乙烯板，每孔100μL，4℃孵育过夜；用0.01M、pH7.4、含有体积百分含量为0.01%的Tween-20的PBST缓冲液（Sigma）洗板3次，将板拍干。用封闭液（封闭液为含5%BSA的PBS，即100mL PBS中含有5 g BSA，其浓度为0.01M、pH为7.4）进行封闭，每孔100μL，37℃孵育2h，用0.01M、pH7.4的PBST（含体积百分含量为0.01%的Tween-20）缓冲液洗板3次，将板拍干备用。加入鼠尾阳性血清，从1:100开始做5倍梯度稀释，每孔100μL，37℃孵育1h。洗板3次后，将板拍干，加入比例1:5000倍的HRP标记羊抗鼠IgG（购于南京金斯瑞生物科技有限公司），每孔100μL，37℃孵育30 min；洗板3次且板拍干后，加入TMB显色液显色（广州捷倍斯）每孔100μL，37℃避光孵育10 min；最后加入50μL/孔，2M H2SO4终止反应，在酶标仪上用波长450nm进行检测读数，以免疫前小鼠血清为阴性对照，以测定值与阴性对照比值≥2.0为阳性判断标准，计算免疫血清抗体效价。
5、饲养层细胞的制备
在细胞融合后选择培养的过程中，由于大量骨髓瘤细胞及脾细胞相继死亡，此时单个或少数杂交瘤细胞不易存活，通常预先在培养瓶或培养板底部加一些活的原代细胞或静息的肿瘤细胞以辅助细胞生长，该细胞就是饲养细胞。具体制备方法如下：在细胞融合及细胞亚克隆前1天或当天制备。预先在5mL注射器中吸取4 mL HAT-DMEM完全培养基（Thermo）。将12周龄BalB/c母鼠拉颈处死，放入体积分数为75%酒精中浸泡3 min，体表消毒后，放入无菌的盒子里固定。在无菌操作台打开腹部皮肤，左手用镊子将腹膜拉起，右手用注射器注入5 mL培养基至腹腔内，注意避免穿入肠管，将培养基打入小鼠腹部后反复抽吸3次，吸出腹部溶液置于离心管中。然后加入适量培养基稀释腹腔细胞，1只小鼠可抽取 mL的腹水细胞，可铺3块96孔培养板。将上述细胞悬液加入96孔板，每孔0.1 mL（约2滴），置于37℃，5%CO2培养箱过夜培养。
6、Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞的准备
在细胞融合前1周，复苏Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞至小瓶，并用DMEM完全培养基培养。待细胞长满后，扩大培养2瓶。细胞融合前1天，转移Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞至新鲜完全培养基中。在细胞融合前，用倒置显微镜确定Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞生长状况良好（折光力强，未污染，并且生长足量）。融合当天，用无菌滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50 mL离心管内。1400rpm，离心8min，弃上清。加入35mL的DMEM不完全培养基，吹匀Sp2/0-Ag14悬液，并进行细胞计数，约为107个细胞，1400rpm，离心8min，弃上清备用。
7、脾细胞的制备
先将步骤（3）的免疫的小鼠取出固定，用镊子夹住小鼠眼球并拉出，收集眼血至1.5mL EP管中，12000 rpm，离心5min，收集上清标记备用。然后拉颈处死小鼠，放入75%酒精中浸泡2-3min。将小鼠放入已灭菌的平皿上，无菌取出脾脏，用剪刀剔除脾脏上多余的组织，将脾脏移至预置了10 mL不完全培养基的培养皿中，进行清洗。将洗净的脾组织放入200目尼龙网过滤网上，使用弯剪将组织分成3块，并轻轻将脾脏磨碎，期间不断滴加不完全培养基，使磨碎的细胞通过200目尼龙网进一步分离，制成单细胞悬液。将脾细胞悬液移至50mL离心管中，并添加35 mL不完全培养基。2300rpm，室温离心10min，弃上清。加入35mL不完全培养基将脾细胞沉淀重悬，1400rpm，离心8min，弃上清。再次加入35mL不完全培养基将脾细胞沉淀重悬，并进行细胞计数，细胞数约为108个细胞为宜，再次1400rpm，离心8min，弃上清。共完成2次脾细胞洗涤后备用。
8、细胞融合
按照Sp2/0-Ag14：脾细胞为1:6的比例，即将3.5×107个Sp2/0-Ag14和2.1×108个脾细胞进行细胞融合，将脾细胞转入Sp2/0-Ag14中，加入35 mL DMEM不完全培养基，1400rpm，离心8min。将离心后混合细胞内的培养基用吸管吸出，减少离心管中的培养基量，以免稀释PEG，并将管底细胞用手轻轻弹散。将装有混合细胞的离心管放入37℃水的烧杯中水浴。使用1 mL移液管向混合细胞沉淀中加入0.8mL、37℃预热的质量百分含量为50%的PEG溶液（Sigma），在1min内匀速、逐滴加入，边加边用移液管轻轻混匀细胞。滴加完成后再用移液管轻轻混匀90s。使用干净移液管向混合细胞液中逐滴加入预热的DMEM不完全培养基，同时轻轻混匀。4min内匀速滴加4mL不完全培养基；然后1min内匀速滴加10mL不完全培养基。共用时间7.5min。37℃放置5min，1400rpm，离心7min，弃上清。之后，加入HAT-DMEM完全培养基（含质量百分含量为20%的胎牛血清，Gibco）混匀融合细胞，平均加入到预先铺好腹腔细胞的96孔板中。标记融合时间，并置于37℃，5%CO2培养箱培养。培养3天后，在倒置显微镜下可观察到细胞团；若细胞团长势良好，培养6天后，将所有细胞板半换液成新鲜的HAT-DMEM完全培养基（含质量百分含量为20%的胎牛血清，Gibco）进行培养。
9、筛选分泌胰岛素抗体的杂交瘤细胞株
分别将胰岛素、合成肽INS-BSA-1和INS-BSA-2用0.05M、pH9.6的碳酸缓冲液稀释至1μg/mL进行包被，以100μL/孔加入酶标板孔中，置4℃过夜。第2天置于37℃平衡30min，然后洗板2次，拍干。加入100 μL/孔0.01M、pH 7.4的PBS（含有质量百分含量为5%的BSA）的封闭液进行封闭，置于37℃封闭2 h。倒掉液体，拍干后，洗板3次，置于4℃备用。
细胞融合第7天，取100 μL/孔细胞上清液置于胰岛素包被板孔中，并加入小鼠阳性血清1:500稀释作为阳性对照。37℃孵育1 h，倒掉液体，洗板3次后，拍干。加入100 μL/孔的酶标二抗（羊抗鼠IgG-HRP，比例1:5000，南京金斯瑞），放置37℃，孵育30 min。倒掉液体，洗板3次，拍干后，依次加入TMB显色液，每孔100 μL，37℃放置。反应10 min后，加入2 MH2SO4终止液（每孔50 μL）终止反应，置于酶标仪上，450 nm检测其OD值。将胰岛素检测结果进行判定，测定值与阴性对照比值大于2.0的细胞孔，判为阳性孔。挑出细胞阳性孔，并做标记后，将其细胞液换成HT-DMEM完全培养基（含质量百分含量为20%的胎牛血清）进行培养，第二天进行复测。复测时，分别采用胰岛素包被板、合成肽INS-BSA-1和INS-BSA-2包被板进行ELISA检测，挑出胰岛素测定值、合成肽INS-BSA-1测定值与阴性对照比值均大于2.0的阳性孔，将胰岛素、INS-BSA-2测定值与阴性对照比值均大于2.0的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，并用有限稀释法连续克隆化3次，直至获得100%阳性率为止，最终获得两株稳定分泌胰岛素抗体的细胞株。一株杂交瘤细胞株于2020年6月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称GDMCC，地址为：广州市先烈中路100号，广东省微生物研究所，59号楼5楼，邮编：510070），保藏编号为GDMCC No：61044，分类学名称为Mus musculus hybridoma 4B2-E2-E7-C3；其分泌的单克隆抗体编号为INS-12。另一株杂交瘤细胞株于2020年6月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称GDMCC，地址为：广州市先烈中路100号，广东省微生物研究所，59号楼5楼，邮编：510070），保藏编号为GDMCC No：61043，分类学名称为Mus musculus hybridoma4A3-B1-E1；其分泌的单克隆抗体编号为2INS-1。其中，INS-12抗体可识别合成肽INS-BSA-1片段，2INS-1抗体可识别合成肽INS-BSA-2片段。将获得的阳性细胞株扩增培养后冻存于液氮中。
10、杂交瘤细胞培养上清效价检测
采用ELISA方法检测细胞上清液，第1孔为上清原液，从第2孔开始，用0.01M、pH7.4的PBS 5倍逐级稀释至第11孔，以融合时小鼠血清500倍稀释为阳性对照，以DMEM不完全培养基为阴性对照。细胞培养上清效价判定标准：以最低阳性测定值与阴性对照比值大于2.0的孔对应的稀释比例，即为杂交瘤细胞培养上清效价。细胞上清液效价测定结果见表1。从表1可以看出，杂交瘤细胞4B2-E2-E7-C3的细胞上清效价为1：3.125×103，和4A3-B1-E1细胞上清效价为1：3.125×103。
表1、细胞上清效价检测
Figure 305554DEST_PATH_IMAGE001
11、腹水制备及采集
在接种细胞前一周，用5 mL注射器往小鼠腹腔内注射0.5 mL石蜡油。ELISA检测杂交瘤细胞上清液为阳性后，用滴管将细胞从细胞培养瓶壁轻轻吹下，将阳性细胞计数，1400rpm，离心6 min，弃上清。用生理盐水洗涤细胞1次，按照每只小鼠60万/0.5 mL的量，计算4只石蜡鼠所需细胞用量，对小鼠进行腹腔注射。6天后观察小鼠状态，如小鼠腹部明显变大，肤色明显变黑，即判断腹水产生，可进行腹水采集。每隔1天，抽取腹水1次，每只小鼠至少生产5 mL腹水，直至小鼠死亡或不再有腹水生成。腹水收集后，5000 rpm，离心5 min，取上清。在所有腹水收集完之前，先将离心得到的腹水保存于4℃（不超过一周），并加入体积百分含量为0.1%的Proclin 300溶液，用于防腐。
12、腹水效价检测
采用ELISA检测腹水效价，具体：第1孔为100倍稀释腹水，从第2孔开始，用0.01M、pH 7.4的PBS 5倍逐级稀释至第11孔，以融合时小鼠血清500倍稀释为阳性对照，以PBS为阴性对照。腹水效价判定标准：以最低阳性测定值与阴性对照比值大于2.0的孔对应的稀释比例，即为腹水效价。腹水效价测定结果见表2。从表2可以看出，杂交瘤细胞4B2-E2-E7-C3所制备的腹水效价:1：1.56×106，杂交瘤细胞4A3-B1-E1所制备的腹水效价为1：7.81×106。
表2、腹水效价检测
Figure 749305DEST_PATH_IMAGE002
13、抗体纯化及纯度鉴定
采用亲和层析法Protein A Sepharose Fast Flow纯化收集的腹水，以SDS-PAGE检测单克隆抗体纯度，纯度可达到90%以上。如图1所示。图1为纯化后胰岛素单抗的SDS-PAGE电泳图谱，第一泳道为Marker，第二泳道中条带1为杂交瘤细胞株4B2-E2-E7-C3分泌的INS-12抗体，第三泳道中条带2为杂交瘤细胞株4A3-B1-E1分泌的2INS-1抗体。
14、抗体效价检测
通过ELISA方法检测纯化得到的INS-1抗体、纯化得到的2INS-1抗体、市售胰岛素单克隆抗体A和市售胰岛素单克隆抗体B的抗体效价。具体如下：先将上述各抗体用0.01M、pH 7.4的PBS缓冲液均稀释为1 mg/mL。从第2孔至第12孔，用0.01M、pH 7.4的PBS进行5倍逐级稀释，以融合时小鼠血清500倍稀释为阳性对照，以PBS为阴性对照。抗体效价判定标准：以LoG（稀释度）为横坐标，以抗体OD值为纵坐标作曲线，曲线方程：y = min + (max-min)/(1 + 10^((LoGEC50-x)×Hillslope))，通过sigmaplot数据处理软件拟合曲线，并获得中值效价。抗体效价测定结果见图2及表3。图2为4B2-E2-E7-C3抗体、4A3-B1-E1抗体、市售胰岛素单克隆抗体A和市售胰岛素单克隆抗体B的抗体效价对比图。图2中，INS-12表示杂交瘤细胞株4B2-E2-E7-C3分泌的单克隆抗体，2INS-1表示杂交瘤细胞株4A3-B1-E1分泌的单克隆抗体，A表示市售胰岛素单克隆抗体A，B表示市售胰岛素单克隆抗体B。
从图2和表3可以看出，INS-12抗体的中值效价为14543.2，高于市售胰岛素单克隆抗体B的抗体中值效价（即为5061.9）；2INS-1抗体的中值效价为69763.8，高于市售胰岛素单克隆抗体A的抗体中值效价（即为60411.9）。由此可知，INS-12抗体、2INS-1抗体均具有较高的抗体效果。
表3、各抗体效价检测
Figure 434364DEST_PATH_IMAGE003
15、胰岛素检测试剂盒制备及其性能评价
应用于人血清或血浆中胰岛素含量检测。原理：采用双抗体夹心电化学发光法，总检测时间18分钟。第1步：标本、生物素化的INS-12单克隆抗体和钌（Ru）复合物（即三联吡啶钌）标记的2INS-1单克隆抗体一起孵育，形成抗原抗体夹心复合物。第2步：加入链霉亲和素包被的磁微粒进行孵育，让上述形成的复合物通过生物素与链霉亲和素间的反应结合到磁微粒上。第3步：反应混和液被吸到测量池中，磁微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定，检测结果由仪器自动从标准曲线上查出（此曲线由仪器对扫描得到的原标准曲线通过两点定标校准获得）。
（1）分析灵敏度
重复检测不含被测物的零值校准品20次，得出20次测量结果的相对光强（RLU）平均值（M）及标准差（SD），得出M+2SD所对应的RLU值，根据所采用试剂体系条件下的主曲线方程将M+2SD所对应的相对光强代入上述方程中，求出对应的浓度值，即为分析灵敏度。测定结果详见表4。从表4可以看出，利用上述INS-12单克隆抗体和2INS-1单克隆抗体制备成胰岛素检测试剂盒的灵敏度≤0.2 µIU/mL。
表4、分析灵敏度检测结果
Figure 487508DEST_PATH_IMAGE004
Figure 777675DEST_PATH_IMAGE005
（2）准确度检测
在试剂盒规定测量范围内，选择适当缓冲体系，将国家标准品配制成2个浓度点：25µIU/mL和500µIU/mL，每点平行测定3次，取其平均值M，计算实测浓度与标示浓度之比。测定结果详见表5。从表5可以看出，利用上述INS-12单克隆抗体和2INS-1单克隆抗体制备成胰岛素检测试剂盒的准确度在0.900~1.100范围内。
表5、准确度检测结果
Figure 985803DEST_PATH_IMAGE006
（2）精密度检测
准备两个浓度水平（低浓度12µIU/mL、高浓度600µIU/mL）样本，同一批次试剂对每个样本重复测定10次，计算批内变异CV≤8%；3个批次试剂对每个样本重复测定10次，批间变异CV≤10%。具体详见表6。
表6、试剂盒精密度检测结果
Figure 627000DEST_PATH_IMAGE007
（4）线性检测
线性范围：0.2 μIU/mL~1000 μIU/mL。取接近于检测范围上限的高值样本H，及接近于分析灵敏度的低值样本L，将高值样本和低值样本按100%H、80%H、60%H、50%H、30%H、20%H、10%H、0%H混合，配制线性样本，每个样本检测3次，将实测浓度与理论浓度进行线性拟合，相关系数r≥0.9900。具体详见表7。
表7、线性检测结果
Figure 313196DEST_PATH_IMAGE008
Figure 254607DEST_PATH_IMAGE009
（2）特异性检测
准备零值样本，向空白样本中加入该试剂盒分析物的类似物，各类似物及其浓度如下：人胰岛素原：10ng/mL，C-肽：20ng/mL，猪胰岛素：48ng/mL，牛胰岛素：100ng/mL，胰岛素样生长因子：50ng/mL，生长抑素：100pg/mL，胰高血糖素：1000pg/mL，制得类似物样本。每个样本检测两次，计算其交叉反应率，结果详见表8。表8中，n.d.表示未检测到。从表8可以看出，本研究的胰岛素检测试剂盒对人前胰岛素、C肽、胰高血糖素、生长抑素、胰岛素样生长因子等物质均具有相对较低的交叉反应率，说明本研究的胰岛素检测试剂盒具有较高的特异性。
表8、特异性检测结果
Figure 571319DEST_PATH_IMAGE010
（6）相关性检测
利用上述INS-12单克隆抗体和2INS-1单克隆抗体制备成胰岛素检测试剂盒，对胰岛素临床血清样本进行检测，并用Roche公司胰岛素电化学发光检测试剂盒做对照产品进行比对验证。检测结果详见图3。图3为采用含有本研究的单克隆抗体的胰岛素检测试剂盒与Roche公司胰岛素电化学发光检测试剂盒的相关性图。图3中，横坐标为Roche的胰岛素电化学发光检测试剂盒的检测浓度，纵坐标为含有本研究的单克隆抗体的胰岛素检测试剂盒的检测浓度。
从图3可以看出，两者的相关系数R2≧0.9961，说明本研究的胰岛素检测试剂盒与Roche公司胰岛素电化学发光检测试剂盒的检测结果有较好的相关性，说明采用本研究的胰岛素单克隆抗体对胰岛素检测具有较高的准确性。
综上所述，本申请的杂交瘤细胞能够分泌与胰岛素高特异性结合的单克隆抗体，能够用于制备准确性高、灵敏度高、特异性强、稳定性好的胰岛素检测试剂盒。并且采用本申请的胰岛素检测试剂盒能够较为准确的检测胰岛素，与市售检测试剂盒的检测结果高度相关，与临床诊断具有较高诊断一致性，可用于临床上对糖尿病、低血糖综合征的辅助诊断。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳普门科技股份有限公司
<120> 杂交瘤细胞株及其制备方法和应用、单克隆抗体及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 2
<211> 51
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Gly Ile
20 25 30
Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn
35 40 45
Tyr Cys Asn
50
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Gly Ile
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5

Claims (10)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的保藏号为GDMCC No：61044或者所述杂交瘤细胞株的保藏号为GDMCC No：61043。
2.一种单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为GDMCCNo：61044的所述杂交瘤细胞株分泌，所述单克隆抗体能够识别氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的多肽片段。
4.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为GDMCCNo：61043的所述杂交瘤细胞株分泌，所述单克隆抗体能够识别氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的多肽片段。
5.一种杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用胰岛素原免疫小鼠，获得免疫后的小鼠；及
提取所述免疫后的小鼠的脾细胞，并与小鼠骨髓瘤细胞融合，筛选，得到杂交瘤细胞株；
所述筛选的步骤包括：采用多肽并按照ELISA方法对融合后的细胞进行筛选，得到所述杂交瘤细胞株，其中，所述多肽包括第一片段及第二片段中的至少一个，所述第一片段如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述第二片段如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，所述采用多肽并按照ELISA方法对融合后的细胞进行筛选的步骤包括：
采用胰岛素并按照ELISA方法对融合后的细胞进行筛选，得到阳性细胞；及
采用所述第一片段及所述第二片段中的一个并按照ELISA方法对所述阳性细胞进行筛选，得到所述杂交瘤细胞株。
7.权利要求1所述的杂交瘤细胞株、或者权利要求2～4任一项所述的单克隆抗体、或者权利要求5～6任一项所述的杂交瘤细胞株的制备方法制备得到的杂交瘤细胞株在制备胰岛素检测试剂、胰岛素检测试剂盒或者胰岛素检测装置中的应用。
8.一种胰岛素检测试剂盒，其特征在于，包括：第一抗体和第二抗体，所述第一抗体含有由保藏号为GDMCC No：61044的杂交瘤细胞株及保藏号为GDMCC No：61043的杂交瘤细胞株中的一个分泌的单克隆抗体，所述第二抗体含有由保藏号为GDMCC No：61044的杂交瘤细胞株及保藏号为GDMCC No：61043的杂交瘤细胞株中的另一个分泌的单克隆抗体。
9.根据权利要求8所述的胰岛素检测试剂盒，其特征在于，所述第一抗体及所述第二抗体中的一个为标记物标记的抗体，所述标记物包括发光标记物。
10.一种胰岛素检测装置，其特征在于，包括权利要求2～4任一项所述的单克隆抗体或者权利要求8～9任一项所述的胰岛素检测试剂盒。
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