CN103642792A - 一种抗丙肝病毒的中和性单克隆抗体的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗丙肝病毒的中和性单克隆抗体的制备及其应用。用pVAX-CpG-N2N8免疫小鼠后，再用E2蛋白加强免疫；将针对E2抗体效价最高的小鼠取脾作为抗原致敏的B细胞，与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，再将融合细胞在HAT培养基中筛选，获取融合细胞生长克隆得到产生本发明单抗的杂交瘤细胞株。本发明的抗丙肝病毒E2的中和性单克隆抗体由所述杂交瘤细胞株产生，该单克隆抗体结合的表位位于E2糖蛋白的F₅₅₀GCTWMNSTGFTKVCGAPPCVIG₅₇₂部位。本发明的抗丙肝病毒E2的中和性单克隆抗体具有很好的中和HCV感染能力，可作为丙型肝炎病毒治疗性抗体，在丙肝诊断与治疗中具有巨大应用前景。

Description

一种抗丙肝病毒的中和性单克隆抗体的制备及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学和感染免疫领域，具体涉及一种抗丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）的中和性单克隆抗体及产生该抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

我国是HCV（丙型肝炎病毒，丙肝病毒）高感染率国家之一，HCV感染是导致慢性肝炎、肝癌、肝硬化的主要因素之一，严重影响人类健康。目前尚无有效的治疗和预防性HCV疫苗,也无有效中和性治疗抗体。

HCV的最终控制将取决于疫苗预防。在抵挡病毒的入侵过程和免疫抵抗HCV攻击人体细胞中，特异性中和性抗体发挥重要作用。HCV包膜(envelope)糖蛋白（E1和E2）能够诱使机体产生中和抗体，阻断病毒的入侵。包膜E2蛋白是诱导中和抗体的主要靶抗原，虽然E2蛋白的变异性较高，但近年在E2中鉴定出了一系列保守的中和抗体表位，这给HCV疫苗的开发带来了新希望。DNA疫苗的发展为一些难以体外表达的抗原提供了新的途径。其基本原理是将编码抗原的基因片断直接通过肌肉注射或基因枪等方法直接导入宿主体内，DNA体内摄取后，抗原蛋白的转录后修饰及立体构象和自然感染时所产生的抗原蛋白完全一样，抗原性好，DNA编码的可溶性抗原蛋白释放到细胞外后，被专职抗原递呈细胞（APC）摄取，然后经MHCⅡ类途径呈递，活化CD4+T细胞，及其随后产生抗体的B细胞活化，从而产生针对特异性抗原的抗体。

HCV病毒体基因编码3011个氨基酸的长开放读码框。在病毒复制中，氨基端有三个蛋白(C、E1、E2/NS1)，羧基端有四个蛋白(NS2、NS3、NS4、NS5)（Pwalotsky JM，Gastroenterology，2002，122(6)：1554—1568）。HCV E区包膜糖蛋白是诱导中和抗体的主要抗原区，故HCV E区及其编码的抗原是HCV疫苗研究的重点（Fournillier,et al.J.Virol,2001;75:12088）。HCV的包膜蛋白El和E2在病毒识别、粘附、侵入宿主细胞过程中发挥关键作用。E2含有中和性抗体的表位，可以诱导中和性抗体的产生。

糖基化是蛋白翻译后的重要修饰加工环节，可以诱导蛋白空间构象正确折叠，增加蛋白的酶亲水性，稳定性，并且可以调节蛋白的抗原性。E1和E2上含有多个保守的糖基化位点，即在HCV的不同基因型中糖基化位点均是保守存在的。其中E1有5个N-糖基化位点，E2上有11个（Goffard,A et al.，J.Virol,2005，79:8400-8409；Slater-Handshy et al，Virology,2004,319(1):36-48）。

尽管E1E2的功能和作用已经比较清楚，然而E1E2的免疫保护性仍然较低。另外，HCV的基因编码的E1和E2蛋白的分子量大小分别是：31KD和70KD，其原核表达蛋白不能形成蛋白质的糖基化，且表达困难，而真核表达的产量较低且纯化困难。因而E1E2在实际免疫保护中的应用受到了限制，不利于推广。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗HCV E2糖蛋白的具有中和病毒感染作用的单克隆抗体。

本发明的另一目的在于提供产生上述抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的再一目的在于提供上述杂交瘤细胞株的制备方法。

本发明的目的还在于提供上述单克隆抗体或杂交瘤细胞株的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现

一种产生抗HCV E2糖蛋白的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括如下步骤：

（1）用重组质粒pVAX-CpG-N2N8（见本申请人在先中国专利申请“一种HCV的DNA疫苗及其制备方法”，申请号：201210258252.5，公开号：102746387A，公开日：2012-10-24）免疫Balb/c小鼠后，再用E2蛋白加强免疫；检测免疫小鼠血清针对E2蛋白的抗体效价。

（2）将针对E2蛋白抗体效价最高的小鼠无菌取脾作为抗原致敏的B细胞，并将其与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，再将融合细胞在HAT培养基中筛选，获取融合细胞生长克隆得到产生抗HCV E2糖蛋白的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

所述的产生抗HCV E2糖蛋白的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，还包括如下步骤：得到产生抗HCV E2糖蛋白的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株后，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫印记（western blotting）筛选和鉴定后，选出具有高效价抗体水平的杂交瘤细胞株。

一种产生抗HCV E2糖蛋白的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，通过上述制备方法制备得到。

优选的，所述的杂交瘤细胞株保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，命名为杂交瘤细胞株1C2，保藏编号为CCTCC NO：C2013172。

一种抗HCV E2糖蛋白的中和性单克隆抗体，命名为1C2，由上述杂交瘤细胞株产生。

所述的抗HCV E2糖蛋白的中和性单克隆抗体主要的抗体亚型为IgG2a。

所述的抗HCV E2糖蛋白的中和性单克隆抗体结合的表位位于E2糖蛋白的F₅₅₀GCTWMNSTGFTKVCGAPPCVIG₅₇₂部位。

上述杂交瘤细胞株或单克隆抗体在丙肝诊断与治疗等相关生物学指标中的应用；所述的抗HCV E2糖蛋白的中和性单克隆抗体中和HCVcc的半数抑制浓度为15μg/mL。

上述杂交瘤细胞株或单克隆抗体在制备中和HCV感染的药物或免疫制剂中的应用。

一种中和HCV感染的药物或免疫制剂，包含上述抗HCV E2糖蛋白的中和性单克隆抗体。

上述杂交瘤细胞株或单克隆抗体在制备丙肝诊断与治疗药物中的应用。

一种丙肝诊断与治疗药物，包含上述抗HCV E2糖蛋白的中和性单克隆抗体。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

（1）本发明以pVAX-1-CpG-N2N8作为免疫原，可以将HCV的包膜糖蛋白E1E2以天然构象呈现给抗原递呈细胞，并且两个糖基化位点的缺失可以进一步暴露E1E2中和性抗体的表位，进而更有效地激发机体的免疫反应，并且pVAX-1为美国FDA认可的DNA疫苗载体。

（2）本发明DNA疫苗（pVAX-1-CpG-N2N8）以真核表达质粒DNA为免疫原，直接和CpG佐剂联合免疫，克服了糖基化蛋白质在原核和真核表达上的困难，有效地中和病毒进一步感染。

（3）本发明的抗HCV E2糖蛋白的中和性单克隆抗体，能在体外有效地中和HCV的感染，因而可以有效地清除病毒；其可作为丙型肝炎病毒治疗性抗体，在丙肝诊断与治疗中具有巨大应用前景。

附图说明

图1是SDS-PAGE鉴定Protein A agarose纯化的单抗1C2；其中，1-3为从Protein A agarose上洗脱下来的单抗1C2，4为Protein A agarose+1C2，5为杂交瘤细胞的培养上清，6为杂交瘤的小鼠腹水。

图2是酶联免疫吸附实验（ELISA）检测单抗1C2的效价。

图3是酶联免疫吸附实验（ELISA）检测单抗1C2的抗体亚型。

图4是单抗1C2对E2蛋白的特异性识别结果。

图5是免疫印迹（Western Blot）分析单抗1C2对HCVcc和临床病人血清中HCV的中和作用；其中，A：仅病毒HCVcc对照，B：仅Huh7.5.1细胞对照，C：单抗1C2+HCVcc，D和E：1C2+病人血清中HCV，F：病人血清中HCV。

图6是荧光实时定量PCR（Real-Time PCR）检测单抗1C2对HCVcc的中和作用。

图7是免疫印迹（Western Blot）检测单抗1C2中和HCVcc感染Huh7.5.1的半数抑制浓度。

图8是合成的E2的19个多肽片段（p1-p19）的示意图。

图9是ELISA的方法检测单抗1C2的表位。

图10点杂交的方法检测单抗1C2的表位；其中，A1-A6分别为E2-p1—E2-p6，B1-B6分别为E2-p7—E2-p12，C1-C6分别为E2-p13—E2-p18，1C2与E2-p10片段结合。

图11是ELISA的方法检测单抗1C2的表位。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本申请人在先中国专利申请“一种HCV的DNA疫苗及其制备方法”（公开号：102746387A，公开日：2012-10-24）中已构建了含有E1E2野生型及突变体的真核重组质粒，这些突变体重组质粒分别命名为pVAX-CpG-N2N8、CpG-N8、CpG-N13、CpG-N2N4、CpG-N2N14。中和性抗体检测（抑制病毒感染后检测病毒RNA含量的变化）结果显示：pVAX-CpG-N2N8免疫小鼠的血清，其中和能力最强，即其抑制JFH(2a)HCVcc感染Huh7.5.1细胞的中和能力最强，与对照和CpG-E1E2WT组相比*p<0.05。

实施例1杂交瘤细胞株和单克隆抗体的制备

一、DNA疫苗免疫小鼠并检测抗血清抗体效价

采用OMEGA Biotek公司的提取质粒DNA试剂盒，提取pVAX-1-CpG-N2N8，纯化，去除内毒素后，以70μg的量和500U IL-2（免疫佐剂），通过基因导入仪将不同质粒分别导入Balb/c小鼠（雌性，6-8周）大腿肌肉内，分别在第1天、第10天和第25天免疫，共免疫三次，第32天时E2蛋白（Li P,et al.Vaccine,2007）加强免疫一次，60μg/只，最后一次加强免疫后10天时取小鼠血清，酶联免疫吸附法检测针对E2蛋白的抗体效价。选取抗体效价最高的小鼠，腹腔注射E2蛋白约300μg/只，连续注射3天，再间隔3天，进行细胞融合。

二、杂交瘤细胞融合

1.将生长状态良好的SP2/0细胞收集，用RPMI-1640培养液洗涤一次，再用该培养液重悬调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，于小鼠背部皮下注射0.5mL。待10天左右实体瘤形成后，取瘤组织，制备细胞悬液。具体方法如下：

（1）小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡10min。

（2）无菌状态下将小鼠背部肿瘤组织取出到无菌匀浆器中，加5mL RPMI-1640培养液研磨5-10次后，室温静置5min，使大组织块沉底部，取上清细胞悬液2mL出来，再补加2mLRPMI-1640培养液到匀浆器中，再次研磨，重复上述操作。吹打后静置5min，吸取上层细胞悬液于新的50mL无菌离心管中备用。将细胞悬液1200r/min离心8min后，弃上清，用6-8mLRPMI-1640培养液重悬。

（3）在新的15mL离心管中加入4mL淋巴细胞分离液，将细胞悬液缓慢加到淋巴细胞分离液面上，800g离心15min，用巴氏吸管吸取中间的白色云雾状细胞（SP2/0骨髓瘤细胞）层到新的离心管中，用15mL RPMI-1640洗涤细胞1次，再重悬计数。

2.免疫小鼠脾脏制备

（1）将效价最高的小鼠眼球放血并收集，留血清作为阳性血清。

（2）小鼠无菌剪开腹腔，取出脾脏，置于装有5mL RPMI1640培养液的匀浆器中充分研磨。

（3）静置5min，取匀浆液到新的15mL离心管中并补加RPMI1640培养液到15mL，1200rpm离心10min。

（4）弃上清，用10mL RPMI1640培养液将细胞洗涤一次后重悬计数。

3.细胞融合

（1）将SP2/0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按照1:5的比例（取到的所有脾细胞）加到50mL离心管吹打混匀，补加RPMI-1640培养液到40mL，1200rpm离心10min，尽量将上清弃干净。

（2）然后在1min内慢慢滴入预温至37℃的50%PEG4000900μL（Sigma），边加边搅拌。加完后再搅拌30sec并静置1min。

（3）然后慢慢加入RPMI-1640培养液至50mL，终止反应。1200rpm离心5min，去上清于37℃放置5min，用含5%HAT（H：次黄嘌呤，A：氨基蝶呤，T：胸腺嘧啶脱氧核苷）的RPMI-1640培养液悬浮。

（4）准备5块96孔板，提前一天在5块96孔板中加小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，加入上述饲养细胞，10000个/100μL/孔，于37℃，5%CO₂培养箱中培养。

（5）融合后第二天开始观察细胞生长情况，培养期间需补加HAT培养基，第10天吸去100μL培养基换HT培养基100μL。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基变黄时，进行抗体检测。

4.杂交瘤细胞上清检测

间接ELISA（酶联免疫吸附实验）方法检测杂交瘤细胞上清：抗原（5μg/mL，100μL/孔）包被酶联板4℃过夜（E2蛋白包被酶标板，GST和BSA蛋白包被分别作为阴性对照），PBST洗涤三次，加封闭液，于37℃温育1h，洗涤三次，然后加入杂交瘤的培养上清，于37℃温育1h，PBST洗三次后，加入1:4000稀释的HRP-羊抗鼠IgG（Proteintech,SA00001-1），37℃反应1h，洗三次后，加入50μL/孔TMB底物液显色10min，用2M的浓硫酸终止反应之后，检测450nm的OD值。同时设免疫小鼠阳性血清为阳性对照，设SP2/0细胞的培养上清作为阴性对照，OD450大于阴性对照2倍的样品为阳性。选取与阴性相比阳性值高，生长旺盛的细胞待用，有限稀释法进行克隆。

5.杂交瘤的克隆化（有限稀释法）

（1）将杂交瘤细胞从培养孔内吹散吸出，细胞计数。

（2）将细胞用RPMI-1640培养液稀释到10个细胞/毫升。将细胞悬液分别加入到三块96孔细胞培养板，100μL/孔。

（3）特异性抗体的检测：在克隆后第10天，细胞克隆长满培养孔1/2时检测，对于抗体效价高，呈单克隆生长，形态良好的细胞孔，以相同方法继续再克隆，大量培养冻存。

将得到的克隆化的杂交瘤细胞于2013年11月7日保藏于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，命名为杂交瘤细胞株1C2，保藏编号为CCTCC NO：C2013172。

6.单克隆抗体的生产

克隆化的杂交瘤细胞可在小鼠体内诱生小鼠腹水生产单克隆抗体，取8-10周龄的小鼠，腹腔注射灭菌的液体石蜡0.5mL/只，10天后腹腔注射杂交瘤细胞株1C210⁶细胞/只，10天后抽取小鼠腹水。将抽取的腹水于细胞离心管中4℃1200r/m离心8min，取10mL上清，于4℃12000r/m离心30min，弃杂质，备-80℃保存备用。

7.单克隆抗体的纯化（Protein A-agarose）

（1）预处理：将100μL Protein A纯化柱用约10倍体积的PBS洗涤一至三次。

（2）上腹水：从小鼠身上采到的腹水5000g离心20min左右，离心完后，取中间层的腹水与等体积2×PBS缓冲液混合，即刻加到Protein A柱子里，然后封住柱子置于摇床上摇动，室温2h或4度过夜。也可以用0.45微米的膜将腹水过滤一次，再与Protein A的柱子孵育。

（3）洗涤：将离心管离心分出腹水并将腹水弃去，720g离心5min，用10倍柱体积的PBS洗柱3次。

（4）洗脱：最后用洗脱液将抗体洗脱下即可。加入1倍柱体积0.1M甘氨酸（Glycine,pH3.0），摇床上摇5分钟后，收集液体，重复三次。测定抗体浓度，同时用SDS-PAGE检测纯度。结果显示，我们用Protein A成功纯化了单克隆抗体（单抗）1C2（图1所示）。

（5）洗脱后的单抗1C2加入2/5体积的1M Tris（pH8.0）中和，再加入含有0.02%NaN3以及1mM EDTA的2×PBS和50%的甘油，分装，保存在-20℃。

实施例2单克隆抗体抗体效价及亚型的检测

测定纯化的单抗1C2的浓度为1.57mg/mL，调整对照抗体浓度与1C2相同，对照抗体为抗体筛选过程中，没有HCV中和作用的单抗。将两种抗体从1:200起始，倍比稀释（1:200，1:400，1:800，…1:25600），检测1C2的抗体效价，具体方法如下：

（1）10μg/mL E2蛋白包被ELISA板，100μL/孔，4℃过夜。

（2）1%的BSA封闭，37℃1小时。

（3）PBST洗涤三次，每次2分钟。再加入稀释好的1C2抗体和对照抗体（抗体筛选过程中，没有HCV中和作用的单抗），100μL/孔，37℃1小时。

（4）PBST洗涤三次，每次2分钟。再加入HRP-羊抗鼠IgG二抗（1:4000）或者HRP-羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM（1:1000，santa cruze），100μL/孔，37℃1小时。

（5）PBST洗涤三次，每次2分钟。加入TMB显色，50μL/孔，再加入2M浓硫酸终止反应，50μL/孔。

（6）上全波长酶标仪，检测OD450。

结果表明，与对照抗体相比，1C2可以与E2蛋白特异性结合，效价可以达到1:12800（图2所示），其主要的抗体亚型为IgG2a（图3所示）。

实施例3单克隆抗体抗体特异性的检测

为了检测单抗1C2是否能特异性结合E2蛋白，使用ELISA的方法进行实验，具体方法如下：

（1）10μg/mL E2蛋白包被ELISA板，100μL/孔，4℃过夜；同时，10μg/mL的BSA和GST蛋白分别作为对照蛋白，也包被ELISA板，100μL/孔。

（2）1%的BSA封闭，37℃1小时。

（3）PBST洗涤三次，每次2分钟。再加入将单抗1C2（1.57mg/mL）以1:800稀释，100μL/孔，37℃1小时。

（4）PBST洗涤三次，每次2分钟。再加入HRP-羊抗鼠IgG二抗（1:4000）100μL/孔，37℃1小时。

（5）PBST洗涤三次，每次2分钟。加入TMB显色，50μL/孔，再加入2M浓硫酸终止反应，50μL/孔。

（6）上全波长酶标仪，检测OD450。

结果表明，1C2可以与E2蛋白特异性结合而不与BSA和GST结合，图中对照为不加一抗即1C2只加二抗，以排除二抗的非特异吸附（图4所示）。

实施例4中和性抗体的检测（免疫印迹法即抑制病毒感染后检测病毒蛋白含量变化和荧光实时定量PCR检测HCV在细胞内RNA的表达）

1.免疫印迹（Western Blot）法检测单抗1C2能中和丙肝病毒（Cell culture HCV，HCVcc）的感染性

1×10⁵人肝癌细胞Huh7.5.1（Joachim L,et al.Nature Medicine.17:589–595）接种到24孔板中，培养24小时。第二天将单抗1C2（1.57mg/mL）按照1:800比例稀释后，与1×10⁷拷贝的HCVcc在500μL体系中，于37℃共孵育1小时后，感染Huh7.5.1细胞；同时设不与单抗孵育的HCVcc感染Huh7.5.1细胞作为对照组。作用6小时将Huh7.5.1细胞换为正常的完全培养基（DMEM培养基（含有10%胎牛血清，Gibco；1%青霉素和链霉素）），72小时后收获细胞提取细胞的总蛋白，测定总蛋白含量，进行SDS-PAGE和免疫印记（Western Blot）检测病毒蛋白NS3的表达情况（以肌动蛋白（actin）作为内参）。结果如图5所示，与对照组相比，1C2对HCVcc感染有明显的中和作用。

2.免疫印迹（Western Blot）法检测单抗1C2中和临床病人血清中HCV的感染性

HCV病人血清中病毒的制备：超速离心HCV病人血清（将病人血清加入到专用超速离心管中，严格配平后，以120000g4℃真空离心4小时），所得的沉淀用小体积PBS重悬后过滤分装，冻于-80℃备用。

测定HCV拷贝数：按照中山达安基因公司的丙型肝炎病毒（HCV）核酸扩增PCR荧光检测试剂盒检测离心纯化的HCV的绝对拷贝数。计算病人血清中HCV拷贝数为0.5×10⁵copies/mL。

1×10⁵Huh7.5.1细胞接种到24孔板中，培养24小时。第二天将单抗1C2按照1:800比例稀释后，与1×10⁴拷贝的HCVcc在500μL体系中，于37℃共孵育1小时后，感染Huh7.5.1细胞。作用6小时将Huh7.5.1细胞换为正常的完全培养基，72小时后收获细胞提取细胞的总蛋白，并定量后，进行SDS-PAGE和免疫印记（western blot）检测病毒蛋白NS3的表达情况（以肌动蛋白（actin）作为内参）。结果如图5所示，对照组相（HCVcc）比，1C2对临床病人血清中HCV病毒有显著的中和作用。

3.实时荧光定量PCR检测单抗1C2中和丙肝病毒（Cell culture HCV，HCVcc）的感染性

1×10⁵Huh7.5.1细胞接种到6孔板中，培养24小时。第二天将单抗1C2（1.57mg/mL）按照1:800比例稀释后，与1×10⁷拷贝的HCVcc在37℃共孵育1小时后，感染Huh7.5.1细胞；同时设不与单抗孵育的HCVcc感染Huh7.5.1细胞作为对照组。作用6小时将Huh7.5.1细胞换为正常的完全培养基，72小时后收获细胞提取细胞RNA，并定量后，以1μg的RNA为模板，随机引物（Random Primer）作为引物进行逆转录PCR，后以HCV特异性的引物进行荧光实时定量PCR检测HCV的RNA水平（日本东洋纺公司，逆转录试剂盒货号：FSQ-101S；Real-Time PCR试剂盒货号：QPK-212）。具体方法如下：

（1）Trizol法提取细胞总RNA

1）收集6孔板中HCVcc感染72小时的Huh7.5.1细胞，用PBS洗两次后，每孔再加500μLTrizol试剂。

2）待细胞充分裂解后，将细胞裂解液转入EP管中并每管中加300μL氯仿，充分颠倒混匀后室温下静置10min，4℃下12000r/min离心10min。

3）将上清转入新的EP管中，加入500μL异丙醇沉淀RNA，4℃下12000r/min离心10min。

4）沉淀用600μL75%酒精溶液（0.1%DEPC-H₂O配制）洗涤2次，离心去上清，所得RNA用20μL DEPC-H₂O溶解，测量RNA的浓度。

（2）逆转录PCR获得模板cDNA第一链

按照逆转录试剂盒（TOYOBO），具体步骤如下：

1）以1μg的总RNA为模板，Random Primer为随机引物，反应体系为：1_μg的总RNA（设体积为XμL）；1μL随机引物；（11-X）μL无RNAse的水，总体积为12μL。

2）65℃5min，立即取出置于冰上。

3）反应液配制：上述反应液12μL/管中加入以下反应液：5×RT Buffer（4μL）；dNTP Mix(各10mM，2μL)；RNase inhibitor（RNA酶抑制剂）(10U/mL，1μL)；ReverTra-Ace逆转录酶（1μL），总体积为共20μL。

4）按照以下温度条件进行实验：30℃，10min；42℃，30min；99℃，5min；4℃，5min。

（3）Real Time PCR

1）反应体系如下：模板cDNA（1μL）；2×SYBR master mix（SYBR Green，DNA聚合酶，dNTP的混合物：10μL）；P1引物（1μL）；P2引物（1μL）；ROX参比染料（0.4μL）；ddH₂O（6.6μL），总体积为20μL。

其中，HCV特异性引物为：

P1引物：5’-CGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCG-3’（130-152nt）；

P2引物：5’-CTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’（287-311nt）。

内参RPLP0（管家基因：酸性核糖体磷蛋白P0）特异性引物为：

P1引物：5’-GGCGACCTGGAAGTCCAACT-3’；

P2引物：5’-CCATCAGCACCACAGCCTTC-3’。

ROX参比染料：用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。

2）反应条件是：95℃，1min；（95℃，15s；55℃，20s；72℃，20s）×40个循环；72℃，2min，设置在72℃，20s处采集荧光信号。

结果如图6所示，与对照组相（HCVcc）比，1C2对HCVcc感染有中和作用。

4.免疫印迹（Western Blot）法检测单抗1C2中和HCVcc的半数抑制浓度（50%inhibitoryconcentration,IC50）。

5×10⁵人肝癌细胞Huh7.5.1接种到12孔板中，培养24小时。第二天将单抗1C2以75、56、35、30、25、20、15、8、4、0μg/mL的浓度与1×10⁶拷贝的HCVcc在37℃共孵育1小时后，感染Huh7.5.1细胞，作用6小时将Huh7.5.1细胞换为正常的完全培养基，72小时后收获细胞提取细胞的总蛋白，测定总蛋白含量，进行SDS-PAGE和免疫印记（Western Blot）检测病毒蛋白NS3的表达情况（以酸性核糖体磷蛋白P0（RPLP0）作为内参）。结果如图7所示，与没有与单抗孵育的HCVcc的相比，高浓度的1C2抗体能完全中和HCVcc感染Huh7.5.1细胞，其中和病毒的半数抑制浓度为15μg/mL。

实施例5单抗1C2表位的检测

一、ELISA检测单抗1C2表位

为了确定1C2抗体结合的表位，我们合成了E2的19个多肽片段（命名为从p1到p19）（辉源生物科技有限（上海）公司），其示意图如图8所示，序列如下：

E2-p1：E384THVTGGSAGRTTAGLVGLL403；

E2-p2：T404PGAKQNIQLIDTNGSWHINST425（N1，N2），表示该片段含有第1和第2个糖基化位点；

E2-p3：A426LNCNESLNTGW437（N3）；

E2-p4：L438AGLFYQHKFNSSGCPER455（N4）；

E2-p5：L456ASCRRLTNFAQGWGPISYA475；

E2-p6：N476GSGLDERPYCWH488（N5）；

E2-p7：Y489PPRPCGIVPAKSVCGPVYC508；

E2-p8：F509TPSPVVVRTTDRSGAPTYSW529；

E2-p9：G530ANDTDVFVLNNTRPPLGNW549（N6，N7）；

E2-p10：F550GCTWMNSTGFTKVCGAPPCVIG572（N8）；

E2-p11：G573VGNNTLLCPTDCFRKHPEA592（N9）；

E2-p12：T593YSRCGSGPWITPRCMV609；

E2-p13：D610YPYRLWHYPCTINYTIFKV629（N10）；

E2-p14：R630MYVGGVEHRLEA642；

E2-p15：A643CNWTRGERCDLEDRD658（N11）；

E2-p16：G504PVYCFTPSP513；

E2-p17：P525TYSWGANDT534；

E2-p18：P545LGNWFGCTW554；

E2-p19：C569VIGGVGNNT578；

以这19个多肽片段作为抗原，用ELISA的方法检测单抗1C2的表位，具体操作方法如下：

将p1-p19的多肽片段，以10μg/mL、100μL/孔包被ELISA板，4℃过夜。第二天用PBST洗涤ELISA板3次后加入1%BSA封闭，37℃1小时；后将封闭液弃掉，PBST洗涤3次，加入单抗1C2（1.57mg/mL）（1:800，作为一抗）孵育37℃1小时；将一抗弃掉，PBST洗涤3次，加入HRP-羊抗鼠的二抗（1:4000）孵育37℃1小时；弃二抗，PBST洗涤3次，加入TMB显色10min，2M浓硫酸终止，读OD450。结果表明（图9所示）单抗1C2与E2的p10片段结合。

二、免疫斑点检测单抗1C2的表位

用免疫斑点实验进一步验证1C2与E2的多肽片段的结合情况，以确定该抗体是否为线性表位，具体方法如下：1）将PVDF膜在甲醇中浸泡完全；2）将其放在转膜液打湿的滤纸上，并保持湿润；3）将20μg的多肽片段（p1-p19）以及细胞裂解液点到膜上，待其吸收，37℃30min；4）5%牛奶封闭，37℃30min；5）TBST洗涤3次，加单抗1C2（1.57mg/mL）（1:500，作为一抗）37℃30min；6）TBST洗涤3次，加二抗HRP-羊抗鼠（1:2000），37℃30min；7）TBST洗涤3次，DAB显色15min，室温晾干。结果表明1C2可以与E2的p10片段结合（图10所示）。

三、ELISA检测1C2与糖基化突变的E1E2的结合

为了进一步验证1C2是否与糖基化突变的E1E2有结合，将E1E2的融合基因构建到真核表达载体pVAX-1得到pVAX-1-E1E2，并将构建好的不同的糖基化突变株pVAX-1-N2、N8、N13、N2N8、N2N4、N2N14、N2N4N14、N13（构建引物和方法见本申请人在先申请“一种HCV的DNA疫苗及其制备方法”），并转染CHO细胞，48小时后收获转染的CHO细胞并用细胞裂解液裂解，测定细胞总蛋白浓度。将ELISA板用5μg/mL的雪花莲凝集素（GNA，（Leopold Kong,et al.2012,PANS））预包被，然后加入转染的CHO细胞裂解液（1μg/μL的总蛋白浓度，100μL/孔），37℃1小时；1%BSA封闭后将封闭液弃掉，PBST洗涤3次，每次2min，加入单抗1C2或对照抗体（即对HCV没有中和作用的单抗）（1.57mg/mL）（1:800，作为一抗）孵育37℃1小时；将一抗弃掉，PBST洗涤3次，每次2min，加入HRP-羊抗鼠的二抗（1:4000）孵育37℃1小时；弃二抗，PBST洗涤3次，每次2min，加入TMB显色10min，2M浓硫酸终止，读OD450。结果表明该单抗可以与N13（即E2上的第8个糖基化位点突变点，不发生糖基化）结合（图11所示），N13也是p10所在区域，与上述结果一致。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种产生抗HCV E2糖蛋白的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）用重组质粒pVAX-1-CpG-N2N8免疫Balb/c小鼠后，再用E2蛋白加强免疫；检测免疫小鼠血清针对E2蛋白的抗体效价；

（2）将针对E2蛋白抗体效价最高的小鼠无菌取脾作为抗原致敏的B细胞，并将其与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，再将融合细胞在HAT培养基中筛选，获取融合细胞生长克隆得到产生抗HCV E2糖蛋白的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于还包括以下步骤：得到产生抗HCV E2糖蛋白的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株后，通过酶联免疫吸附试验和免疫印记筛选和鉴定后，选出具有高效价抗体水平的杂交瘤细胞株。

3.一种产生抗HCV E2糖蛋白的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：通过权利要求1或2所述的制备方法制备得到。

4.根据权利要求3所述的抗HCV E2糖蛋白的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述的杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2013172。

5.一种抗HCV E2糖蛋白的中和性单克隆抗体，其特征在于：由权利要求3或4所述的杂交瘤细胞株产生。

6.根据权利要求5所述的单克隆抗体，其特征在于：其结合的表位位于E2糖蛋白的F₅₅₀GCTWMNSTGFTKVCGAPPCVIG₅₇₂部位。

7.权利要求3或4所述的杂交瘤细胞株或权利要求5或6所述的单克隆抗体在制备中和HCV感染的药物或免疫制剂中的应用。

8.一种中和HCV感染的药物或免疫制剂，其特征在于：包含权利要求5或6所述的单克隆抗体。

9.权利要求3或4所述的杂交瘤细胞株或权利要求5或6所述的单克隆抗体在制备丙肝诊断与治疗药物中的应用。

10.一种丙肝诊断与治疗药物，其特征在于：包含权利要求5或6所述的单克隆抗体。

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