CN101550188A - H5亚型禽流感病毒h5n1血凝素单克隆抗体及其核苷酸序列和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种H5亚型禽流感病毒(H5N1)血凝素的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列，以及轻链可变区的氨基酸序列。本发明还公开了单克隆抗体的核苷酸序列，包括编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列。本发明还公开了一种制备这种单克隆抗体的方法：用H5亚型禽流感病毒血凝素免疫BALB/c小鼠，制备一组小鼠抗H5血凝素特异性单克隆抗体。通过体外中和活性实验，筛选出高滴度中和活性的杂交瘤细胞株3F16A4。对该单克隆抗体的轻、重链可变区基因进行测序。编码该可变区的基因序列在构建对高致病性H5亚型禽流感病毒H5N1有治疗作用的嵌合抗体和人源化抗体等方面有巨大的潜在价值。

Description

H5亚型禽流感病毒H5N1血凝素单克隆抗体及其核苷酸序列和制备方法

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体，具体涉及一种高度中和活性抗H5亚型禽流感病毒(H5N1)血凝素特异性单克隆抗体(3F16A4)。本发明还涉及一种上述抗体的可变区基因。本发明还涉及一种上述抗体的制备方法。

背景技术

高致病性禽流感对公共卫生造成了巨大威胁。自1997年在香港首次发现高致病性H5亚型禽流感病毒H5N1感染人类以后，2003年初香港又再次发生了H5亚型高致病性禽流感病毒感染人的疫情。自从2004年以后，多个国家不断发生的H5N1禽流感病毒感染人的事件和高致病性禽流感病毒禽类感染的疫情，这些迹象充分表明了H5N1禽流感病毒在不断变异，跨越种属屏障的能力在逐渐增强。因此，世界卫生组织认为人类目前正面临禽流感病毒大规模流行的重大威胁。

然而，疫苗接种和治疗性抗体的使用是预防和控制禽流感流行的重要手段。禽流感病毒表面的两个糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是致病的主要因素，特别是HA对病毒的致病性起关键作用，HA使病毒颗粒吸附在细胞表面受体上，并与病毒的血凝活性有关，HA具有诱导机体产生中和抗体的能力，在机体产生保护性免疫应答中起关键作用，是流感疫苗和抗体治疗研究的主要靶标。但流感病毒的HA抗原性在宿主免疫力的选择性压力下不断发生变异，HA诱导保护性免疫应答是型和亚型依赖性的，大部分是病毒株依赖性的，接种旧疫苗所诱导的中和抗体滴度对新的流行株不一定产生有效的保护性。研究显示，从1997至2003期间H5N1HA出现明显的抗原漂移，2004年从越南禽流感患者分离的H5N1抗原性与HK/213/03抗原性出现了完全不同，2005年后期病毒抗原性已经发生明显漂移。因此，禽流感病毒抗原性的变异给疫苗研制和治疗性抗体的研究带来了极大的挑战。我们携带禽流感病毒A/HK/482/97(H5N1)的血凝素全基因序列的质粒和禽流感病毒株A/Goose/GD/1/96(H5N1)血凝素为免疫原分别免疫小鼠，获得了18株具有A/Goose/GD/1/96(H5N1)血凝抑制活性的单抗。中和试验检测18株单抗对1997年至2006年从禽流感患者分离H5N1病毒的中和活性，显示18株单抗对2株人H5N1病毒(A/HK/483/97和A/HK/156/97)均有明著的中和滴度，对2003年人H5N1病毒(A/HK/213/03)，16株单抗保持中和活性，但部分单抗中和滴度下降，对2004年人H5N1病毒(A/Vietnam/1194/04)，仅有4株单抗保持中和活性(H5M3，H5M4，3F16A4和H5M11)，而对2006年人H5N1病毒A/Shenzhen/406H/06，仅3株单抗保持中和活性(H5M3，H5M4，和3F16A4)，而且除3F16A4单抗以外，其他2株单抗中和滴度明显下降，结果表明十年来H5N1病毒的中和位点不断发生变异。然而，有1株3F16A4单抗对1997年至2006年间从人分离高致病性H5亚型禽流感病毒H5N1始终保持高度中和滴度，表明尽管H5N1病毒的变异频率非常高，但在病毒多个中和性抗原位点中，仍然有相对保守的位点承受住了巨大的突变压力，该抗原位点可能为高度保守的中和位点，这是对病毒进行有效预防和控制的重要靶点。

中国发明专利说明书CN1814623A(公开日2006年8月9日)公开了一项发明名称为“一种H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，其制备方法及其用途”的专利申请，该申请公开了一种抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体2F2及其重链可变区和轻链可变区的序列，以及产生该抗体的杂交瘤细胞CCTCC-C200424，该申请发明人于2005年11月在《高致病性H5亚型禽流行性感冒病毒血凝素单克隆抗体的制备于初步应用》一文中的单抗2F2与1987年至2005年分离的H5亚型禽流感病毒株的血凝抑制实验显示对多株病毒的血抑效价均高于1∶6400，但对近两年分离得到病毒株Sck/ST/4610/03和Wdk/JK/1653/05的血抑效价较低，分别为1∶200和小于1∶100，可见该抗体所识别的抗原位点并非保守位点且已发生突变。且该单抗所识别的H5亚型病毒均是从禽类分离出来，而针对能感染人的H5N1病毒未知。

因此，本发明筛选获得的特异性及具有高度中和活性的单克隆抗体，从中克隆出轻、重链可变区基因，具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种所结合的抗原位点高度保守的单克隆抗体，本发明还要提供这种特异性单克隆抗体的可变区核苷酸序列，以及这种抗体的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明的禽流感病毒H5N1的单克隆抗体为保藏号CCTCC-C200738的杂交瘤细胞分泌产生的禽流感病毒H5N1的单克隆抗体。上述单克隆抗体的重链可变区具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明的单克隆抗体的核苷酸序列，包括SEQ ID NO.3所示的编码重链可变区的核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示的编码轻链可变区的核苷酸序列。

本发明的制备禽流感病毒H5N1的单克隆抗体的方法，包括如下步骤：

1、以禽流感病毒株A/Goose/GD/1/96(H5N1)血凝素为免疫原分别免疫小鼠；

2、取小鼠脾脏与生长期的小鼠骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞；

3、筛选分泌抗体的杂交瘤细胞，获得具有A/Goose/GD/1/96(H5N1)血凝抑制活性的单克隆抗体。

上述方法在步骤3以后如还包括下面步骤会取得更好效果：进行中和试验检测单克隆抗体对H5N1病毒的中和活性，筛选单克隆抗体。

本发明抗体能特异性结合禽流感病毒H5N1，对1997年至2006发现的人H5N1病毒均有较高的中和活性，可见本发明抗体与H5N1血凝素结合的中和位点相对保守，因此，本发明抗体可用于制备检测禽流感病毒H5N1的试剂或试剂盒，或者用于制备治疗人禽流感的药物。

具体实施方式

下面将通过具体的例子和实验报告进一步阐明本发明抗体：

1.H5亚型禽流感病毒(H5N1)血凝素单克隆抗体的制备

1.1免疫原的制备

以天然H5血凝素(H5N1 A/Goose/Guangdong/1/96)为免疫原，H5血凝素(A/Goose/Guangdong/1/96)来源于哈尔滨兽医研究所。血凝试验检测其滴度为1∶1024。(血凝实验和血凝抑制实验的具体方法参照WHO操作指南)

1.2免疫小鼠

试验用4-6周龄雌性BALB/c小鼠进行，用天然H5血凝素全程免疫，用50ug/ul的天然H5血凝素120ul，加入480ul注射用生理盐水及600ul弗氏不完全佐剂，混匀，灭菌注射器乳化至溶液呈油包水状，于背部、足垫处多点皮下注射，小鼠免疫4次后，于融合前3天静脉加强100μg/只抗原。

1.3杂交瘤细胞制备

选择免疫血清抗体ELISA检测效价达1×10⁵和血凝抑制实验检测效价达1∶320以上的小鼠，于融合前3天尾静脉注射100μg抗原。无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株NS-1按10∶1的比例混合，用45％聚乙二醇(PEG，MW1450，Sigma)作用下进行融合。按下述步骤将聚乙二醇溶液加入细胞。在37℃水浴中，在1-2min内缓慢加入1.0ml PEG，边加边轻轻摇匀，分别于1min、2min、3min、4min、5min内加1ml、2ml、3ml、4ml、5ml无血清RPMI-1640培养基终止融合，最后加入10ml含15％FBS的二合一培养基，室温1000rpm离心5min，弃上清，用36ml含15％胎牛血清的培养基轻轻悬起细胞。将此细胞悬液加入6块96孔培养板上，在二氧化碳培养箱中温度为37℃、5％CO2的培养箱中。一天以后，于每孔加入100μl含次黄嘌呤、氨基喋呤-胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT，Sigma)筛选培养基。以后每3天用此筛选培养基给培养物换液一次，直到克隆细胞形成。

1.4筛选分泌H5血凝素抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞

血凝抑制法和间接ELISA法同时筛选细胞培养上清，选择仅与天然H5血凝素特异性反应，且经血凝抑制试验检测为阳性的杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2-3次，得到1株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。将克隆化后阳性率达100％的细胞扩增培养后液氮冻存。

小鼠体内接种阳性杂交瘤细胞，制备腹水，并采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水中的抗体。

2、本发明单克隆抗体的特异性鉴定

2.1单抗亚类检测：

采用间接ELISA，测定杂交瘤细胞株上清中免疫球蛋白的亚类：包被天然H5血凝素抗原，封闭后加入杂交瘤细胞培养上清孵育，再分别加入HRP标记的羊抗小鼠IgM、IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体反应，充分洗涤后TMB显色，终止反应后测定A450值。以大鼠抗鼠heavy chain κ型和λ型的单抗检测单抗的heavy chain的型别。结果显示，3F16A4为IgG1，λ型。

2.2单克隆抗体血凝抑制活性测定及交叉实验：

表1为H5单抗的特性，腹水单抗效价测定采用针对天然H5血凝素的血凝抑制法，以无关腹水单抗作为阴性对照，以呈现完全血凝抑制的单抗最高稀释度作为其血凝抑制效价。由于血凝素在流感病毒不同亚型之间有一定的同源性以及共同的抗原表位，用血凝抑制试验检测这些H5单抗与其他A型流感病毒的HA(H1、H3、H7、H9)是否有交叉反应，以流感病毒H1、H3、H7、H9亚型标准抗血清分别作为阳性对照，以无关单抗为阴性对照，当腹水单抗血抑效价与阴性对照血抑效价相差4倍以上判为有交叉反应，当腹水单抗血抑效价与阴性对照血抑效价相差四倍以下判为无交叉反应。结果显示H5单抗3F16A4与A型流感病毒的H1、H3、H7、H9亚型及B型流感病毒的HA均无交叉反应。

表1

3.本发明单克隆抗体的中和活性分析病毒株：五株不同年份(1997年至2006年)的人H5N1病毒株A/Goose/Guangdong/1/96(Go/GD/96)，A/HongKong/482/97(HK/482/97)，A/HongKong/483/97(HK/483/97)，A/HongKong/156/97(HK/156/97)，A/HongKong/213/03(HK/213/03)，A/Vietnam/1194/04(VN/1194/04)，andA/Shenzhen/406H/06(SZ/406H/06))来源于香港大学微生物系。

方法和结果：

单抗腹水采用无血清MEM培养基作1∶40系列倍比稀释，每个稀释孔加入等量的200倍半数致死率(TCID50)浓度的流感病毒，混匀，置37℃孵育1.5h。随后在铺有单层MDCK细胞的96孔细胞培养板中每孔对应加入各种抗体稀释液与病毒混合液100μl。细胞在37℃，5％CO2培养箱中孵育1h后换入新鲜无病毒含10％FBS的MEM培养基，在CO2浓度为5％的37℃培养箱中培养3-4d，观察空斑形成抑制情况。表2为单抗的中和活性分析，结果显示：3F16A4单抗对1997年至2006年间5株人H5N1病毒株中和活性一直保持高滴度＞1280，说明这株单抗针对保守的中和位点。

表2

4、3F16A4mAb轻、重链可变区基因的克隆

按下述方案，克隆编码轻、重链可变区基因。

4.13F16A4杂交瘤细胞的培养

按常规方法复苏3F16A4细胞，用含15％FBS的RPMI1640培养基于37℃，5％CO₂孵箱培养。

4.2总RNA的提取

用TRIZOL Reagent(购自德国Roche公司)，按说明书提取总RNA。

4.3PCR法扩增基因

引物(5’到3’方向)：简并引物。

重链上游引物序列：gctctagagccgccaccatggRatgSagctgKgtMatSctctt

重链下游引物序列：gctttgctggatgcttta

轻链上游引物序列：atggagacagacacactcctgctat

轻链下游引物序列：ctaacactcattcctgttgaag

反应条件、体积：

反应体系：

10×Ex buffer(25mM Mg2+plus)                   5μl

2.5mM Ex dNTP                                  4μl

10μM上游引物                               0.35μl

10μM下游引物                               0.35μl

5U Ex Taq                                   0.25μl

模板(cDNA)                                     2μl

补灭菌水                                    至50μl

反应条件：

	1	2	3
				重链	①95℃，5分钟	①95℃，30秒②50℃，30秒③72℃，1分30秒	①72℃，5分钟②4℃，保温
轻链	①95℃，5分钟	①95℃，30秒②50℃，30秒③72℃，45秒	①72℃，5分钟②4℃，保温

4.4PCR扩增产物的克隆筛选

测定基因序列，测定结果参见附录的基因序列表。其中，重链可变区的氨基酸序列为SEQ NO.1，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ NO.2。重链可变区的核酸序列为SEQ NO.3；编码本发明所述抗体轻链可变区的核酸序列为SEQNO.4。

5、与相似H5单抗轻、重链可变区基因序列比较(同源性结果及说明)

结果：2种抗体的可变区同源性比较低.

1).轻链可变区比较：

同源性为56.3％

2).重链可变区比较：

同源性为41.3％

序列表

<110>南方医科大学、上海人类基因组研究中心

<120>H5亚型禽流感病毒H5N1血凝素单克隆抗体及其核苷酸序列和制备方法

<160>4

<210>1

<211>360

<212>DNA

<213>artificial

<400>1

gaggtccacc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg

60

tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatacacga tacactggat gaagcagagc

120

catggaaaga gccttgagtg gattggaggt atttttccta acaatggaga tactacctac

180

aaccagaaat tcaaggtcag ggccacattg actgtaggca ggtcctccag cacagcctac

240

atggacctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagtct attactgtgt aaggaactac

300

ggtagtagtt acgggtactt cgatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctcttca

360

<210>2

<211>120

<212>PRT

<213>artificial

<400>2

Glu Val His Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

          20                 25               30

Thr Ile His Trp Met Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Gly Ile Phe Pro Asn Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Val Arg Ala Thr Leu Thr Val Gly Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Val Arg Asn Tyr Gly Ser Ser Tyr Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala

            100                 105                 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>3

<211>333

<212>DNA

<213>artificial

<400>3

gacattgtgc tgacccaatc tccaggttct ttgactgtgt ctctagggca gagggccacc

60

atatcctgca gagccagtga aagtgttgac aattttggca aaagttttat gcactggtat

120

caacagaaac caggacagtc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa ccgagaattt

180

gggatccctg ccaggttcaa tggcagtggg tctgggacag acttcgccct caccattaat

240

cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat ttctgtcagc aaagtaatga ggatcctcgg

300

acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa

333

<210>4

<211>111

<212>PRT

<213>artificial

<400>4

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Phe

            20                  25                  30

Gly Lys Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

        35                  40                  45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Glu Phe Gly Ile Pro Ala

    50                  55                  60

Arg Phe Asn Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala Leu Thr Ile Asn

65                  70                  75                  80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn

                85                  90                  95

Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105                 110

Claims (9)

1、一种H5亚型禽流感病毒H5N1血凝素的单克隆抗体，其特征在于，由保藏号为CCTCC-C200738的杂交瘤细胞分泌产生。

2、如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，该抗体的重链可变区具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3、如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体包括其保守性变异体或活性片段，所述的保守性变异体或活性片段的氨基酸序列由所述的单克隆抗体经过一个或多个保守性氨基酸替换、添加或删除得到。

4、如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体为单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体或其他人源化形式的单克隆抗体或其片段。

5、如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，该抗体用于预防、治疗和诊断H5亚型禽流感。

6、一种核苷酸序列，其特征在于，用于编码权利要求1所述的单克隆抗体。

7、如权利要求6所述的核苷酸序列，其特征在于，为SEQ ID NO.3所示的编码重链可变区的核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示的编码轻链可变区的核苷酸序列，或其简并序列和保守性变体。

8、一种制备权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以H5N1型禽流感病毒株A/Goose/GD/1/96血凝素为免疫原分别免疫小鼠；

(2)取该抗原免疫小鼠脾脏与生长期的小鼠骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞；

(3)筛选分泌抗体的杂交瘤细胞，获得具有H5N1型禽流感病毒株A/Goose/GD/1/96血凝抑制活性的单克隆抗体。

9、如权利要求8所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(3)后还包括：进行中和试验检测单克隆抗体是针对H5N1病毒高度的保守中和活性位点。