CN103992988B - 一种杂交瘤细胞株及其产生的抗犬瘟热病病毒n蛋白的单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杂交瘤细胞株及其产生的抗犬瘟热病病毒N蛋白的单克隆抗体CDV‑1N8，属于CDV的防治领域。本发明筛选得到一株稳定分泌抗CDV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是：CGMCC No.8793，实验证明，该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体CDV‑1N8与CDV的N蛋白能够发生特异性反应，而与Vero细胞蛋白不发生反应。本发明公开的单克隆抗体能特异的识别CDV‑N蛋白，且其识别的CDV‑N蛋白的B细胞表位精确定位为：QITFLHSERS。本发明的单克隆抗体CDV‑1N8以及该单克隆抗体所识别的CDV N蛋白病毒特异性保守B细胞表位多肽可制备成诊断CDV感染的试剂，为建立CDV的血清学鉴别诊断方法奠定了基础。

Description

一种杂交瘤细胞株及其产生的抗犬瘟热病病毒N蛋白的单克 隆抗体

技术领域

本发明属于微生物相关的基因工程领域，具体涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的抗犬瘟热病病毒N蛋白的单克隆抗体。

背景技术

犬瘟热(Canine distemper,CD)CD是由副黏病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus，CDV)引起的急性、热性、高度接触性传染病。CDV的自然感染宿主包括传统的犬科、鼬科和浣熊科，但目前已经扩展到了食肉目的所有8个科、偶蹄目猪科、灵长目的猕猴属及鳍足目海豹科等多种动物，其发病率高几乎可达100％，由于该病临床症状多样，易继发其他细菌、病毒的混合感染和二次感染，死亡率甚至可高达80％，有着“毁灭性传染病”之称，对养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业造成严重的经济损失。另外近期研究表明，CDV在体外能够感染人的前体破骨细胞，犬瘟热可能是犬传染给人的第二种病毒性传染病。

CD是于1809年由Jeneer首次报道，1905年Carre首次发现CDV，所以本病也曾称为Carre氏病。银黑狐CD是于1925年首先由Green在美国养狐场发现，1928年Rudolf同时发现了水貂、银黑狐和貉CD，C.E.苏列纳于1953年确诊了紫貂CD，1957年B.A.潘柯夫报道了北极狐CD，我国是从1972年起相继在水貂、狐、貉等毛皮动物中发生犬瘟热，特别是大熊猫等国宝动物的CDV感染，使得CDV的致病地位日益突出。CD感染的动物范围及分布范围还有着不断扩大的趋势。王贵升等(2013)年对山东地区40家养殖规模在3000只以上的养殖场的155份毛皮动物病例进行了RT-PCR法检测，结果表明送检病例中犬瘟热的检出率为63.87％。这表明CD对我国的毛皮动物养殖业具有相当大的威胁。

犬瘟热呈世界性分布，且在不同物种间存在交叉感染，犬瘟热不可能被完全消灭，目前尚无针对犬瘟热的特效治疗药物和方法，疫苗接种是一种有效的防制措施，但常规疫苗在不同程度上存在着弊端：犬瘟热病毒灭活苗抗原性差，现已很少使用；麻疹病毒异源苗免疫力持续时间短；弱毒疫苗对热不稳定且对某些免疫缺陷的幼犬和野生食肉动物存在不安全性及发生变态反应得危险。因此必须加强对CD的研究，为进一步研究安全性高、免疫力持久疫苗提供技术支持。

CDV属于副黏病毒科麻疹病毒属，与麻疹病毒亲缘关系最近。CDV为不分节片的单股负链RNA病毒，由15616个核苷酸组成，分子量为6×10⁶Da。CDV的基因组编码6种结构蛋白，分别为核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)、膜蛋白(M)、血凝素蛋白(H)、融合蛋白(F)。N蛋白是核衣壳主要组成成分，据Hamburger等报道，CDV的毒力与N蛋白密切相关，CDV的毒力在中枢神经系统的持续性感染中具有重要作用。N蛋白是保守性较强的免疫原性蛋白，除了含有B细胞表位外，也含有T细胞表位，在犬瘟热病毒感染的早期免疫应答中起着主要作用，能引起强烈的抗体反应。因此，N蛋白在犬瘟热的早期诊断及防治上有重要的作用。所以，筛选出一株可以分泌抗CDV-N蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株，并鉴定出其所分泌的单克隆抗体所识别的CDV-N蛋白特异性B细胞表位多肽对CDV的诊断及预防具有积极意义，并为CDV亚单位疫苗的研制奠定基础。

发明内容

本发明目的之一是提供一株分泌CDV-N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

本发明目的之二是提供一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，该单克隆抗体可与CDV-N蛋白发生特异性反应；

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明采用TRIZOL法提取CDV病毒总RNA，反转录克隆N蛋白基因的cDNA，将该cDNA插入原核表达载体pEASY-E1，利用pEASY-E1原核表达载体对CDV-N基因进行原核表达，将所表达出的包涵体形式的CDV-N蛋白经HIS标签亲和纯化后作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。此外，本发明还利用大肠杆菌表达系统对CDV-N基因进行原核表达，对所表达的包涵体形式的CDV-N蛋白进行包涵体纯化后作为检测用抗原，建立间接ELISA检测方法对阳性杂交瘤细胞进行筛选，最终获得一株稳定分泌抗CDV-N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.8793，其分泌的抗体命名为CDV-1N8，分类命名是：分泌犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞；保藏时间：2014年3月3日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明还提供了一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，其命名为CDV-1N8，Western-blot检测结果表明单克隆抗体CDV-1N8可与CDV-N蛋白发生特异性反应，而与对照Vero细胞蛋白不发生反应；IFA检测结果表明单克隆抗体CDV-1N8与CDV发生特异性反应。

本发明利用噬菌体多肽库技术对CDV-1N8所识别的CDV-N蛋白的B细胞表位进行了鉴定，最终将表位精确定位为：QITFLHSERS。同时，序列比对结果显示这个表位多肽为CDV所特有并保守的B细胞表位多肽。

因此，本发明提出了所述的杂交瘤细胞株在制备诊断或预防犬瘟热病毒感染药物中的应用。及所述的单克隆抗体在制备诊断或预防犬瘟热病毒感染药物中的应用。及所述的CDV-N蛋白线性B细胞表位多肽在制备诊断犬瘟热病毒感染药物中的应用。

综上所述，本发明制备并鉴定出了一种特异性针对CDV-N蛋白的单克隆抗体，本发明的单克隆抗体以及该单克隆抗体所识别的CDV-N蛋白病毒特异性保守B细胞表位多肽可用于制备成诊断或预防CDV病毒感染的试剂。

附图说明

图1是重组pEASY-E1-N蛋白的SDS-PAGE分析结果(M：标准蛋白Marker；1：pEASY-E1-N诱导前产物；2：pEASY-E1-N诱导后产物；3：pEASY-E1-N纯化产物)。

图2是单克隆抗体CDV-1N8亚类鉴定。

图3是为应用Western blot试验检测单克隆抗体CDV1N8与CDV蛋白和Vero细胞的反应性结果WB分析(1：CDV1N8与CDV感染的细胞裂解沉淀的反应；2：CDV-1N8与Vero细胞裂解沉淀的反应；M：标准蛋白Marker)。

图4是为应用间接免疫荧光试验检测单克隆抗体CDV-1N8与CDV蛋白反应性结果分析。

图5是为应用间接免疫荧光试验检测单克隆抗体CDV-1N8与CDV蛋白反应性结果分析。

图6是合成短肽与CDV-1N8反应性的间接ELISA分析(其中短肽1序列(对照)：LLKIRQIRSITR，

短肽2序列：QITFLHSERS，短肽3序列(对照)：IKIRHNPTIQKR，短肽4序列(对照)：PSRNKPIIPLTM)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会在逐步描述中更为显现。

具体实施方式

主要实验材料和来源

1.蛋白、细胞、病毒

原核表达并纯化的CDV-N蛋白、SP2/0细胞、Vero细胞和CDV毒株均由本实验室保存。

2.主要试剂和药品

胎牛血清、DMEM培养基购自GIBCO公司；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG抗体、FITC标记羊抗鼠IgG抗体、胶回收试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；50％PEG、50×HAT、50×HT购自Sigma公司；邻苯二胺、预染蛋白Marker购自Fermentas公司；SBAClonotypingTM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒购于Southern Biotechnology公司；质粒提取试剂盒购自AXYGEN公司，T-E1、反转录酶、Ex TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶，HIS标签纯化试剂购自北京全式金公司。噬菌体随机12肽库(Ph.D.-12)和E.coli ER2738宿主菌购自New England Biolabs(NEB)公司

3.实验动物

6周龄BALB/c小鼠由长春生物制品所提供。

实施例1 CDV-N蛋白的原核表达及纯化

1.引物设计

根据Genbank中已登录的CDV-N基因序列(登录号：EF375619)，设计PCR扩增引物，序列如下：上游引物5-GAAACTATGTATCCGGCT-3，下游引物5-TGACTCACTCCATTCGGA-3

2.CDV病毒RNA的提取及反转录

利用Trizol法从感染CDV的Vero细胞中提取病毒基因组RNA作为模板，用随机引物进行反转录合成病毒cDNA。

Trizol法提取RNA步骤：收获感染CDV的Vero细胞1-5×10⁷个，加入1mL Trizol混匀，室温静置5min，加入0.2mL氯仿，用力振摇15s，室温孵育2-3min，12000g，4℃离心15min，小心取出上层无色液体，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后室温孵育10min，12000g，4℃离心10min，弃上清，沉淀加入1mL75％的乙醇(DEPC水配制的)，轻振15s，7500g，4℃离心5min，小心弃尽上清，沉淀室温风干3-5min，加入20-30μL DEPC水溶解，-20℃保存。

用提取的病毒总RNA进行反转录合成cDNA，体系如下：

反应过程中，先将模板RNA溶液和随机引物于95℃孵育10min，冰浴冷却5min，然后将其余试剂加入，混匀，室温放置10min，42℃孵育60min，冰中冷却2min。

3.CDV-N基因扩增与纯化

以反转录获得的cDNA为模板，利用所设计的PCR扩增引物，扩增CDV-N基因(图1)。

PCR反应体系(50μL)如下：

反应条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，循环30个周期；72℃延伸10min。

对PCR产物胶回收，将全部PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并在紫外灯下切取含有目的基因的胶块，之后按照上康为世纪生物科技有限公司胶回收试剂盒说明书回收PCR扩增出的N基因。

4.CDV-N蛋白原核表达重组载体的构建

将胶回收得到的N基因以及原核表达载体pEASY-E1分别进行连接，连接体系为：

连接条件：16℃连接过夜。

5.转化与挑菌

将4中得到的连接产物全部转入Ecoli DH5α感受态细胞中，冰浴30min，之后42℃水浴热刺激90s，再迅速冰浴2min。向管中加入250μL LB液体培养基，37℃摇床中摇动培养1h，将100μL菌液涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上，37℃培养过夜。从平板上随机挑取单个菌落，分别接种到3mL LB(Amp⁺，100μg/mL)液体培养基中37℃振荡培养。

6.重组质粒的PCR鉴定与测序

1)利用AXYGEN公司的质粒小量抽提试剂盒，按照试剂盒说明书操作从5中培养的菌液中提取质粒，将所提取的质粒进行PCR鉴定并测序。

2)对疑似重组质粒进行PCR鉴定

PCR反应体系(50μL)如下：

反应条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，循环30个周期；72℃延伸10min。

将经过PCR结果阳性的质粒送交上海英俊生物技术有限公司进行序列测定，将通过序列测定鉴定正确的重组质粒命名为pEASY-E1-N。

7.CDV-N基因的原核表达与纯化

按照5所述转化方法将重组质粒pEASY-E1-N转化到原核表达用BL21感受态细胞，然后取出100μL菌液涂布于含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上，37℃培养过夜，挑取LB平板培养基上的白色菌落，接种于3mL含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中37℃培养过夜。表达诱导具体操作如下：取1mL重组菌菌液加入到100mL的LB培养基中37℃震荡培养至OD600nm约为0.5-1h，加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃诱导4h。将表达产物进行SDS-PAGE电泳，通过HIS标签的亲和层析方法进行纯化，表达和纯化结果见图1。亲和层析方法如下：

1、将经过IPTG诱导的菌液离心，7000rpm，10min。收集菌体细胞，用PBS漂洗两遍，将收集好的菌液超声破碎，直至澄清，13000rpm，离心10min，取沉淀。再用纯化所用的上样缓冲液漂洗一遍，最后用上样缓冲液重悬，13000rpm，离心10min，取上清，用0.45μm滤器过滤。

2、将填料混匀后加入层析柱，室温静置10分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。

3、将上清负载上柱，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液。使用15倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白。使用5ml Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。将纯化后产物进行SDS-PAGE电泳检测。

实施例2 单克隆抗体的制备

1.小鼠免疫

以亲和纯化的原核表达的重组CDV-N蛋白免疫5只6周龄雌性BALB/c小鼠，共免疫3次，每次免疫间隔两周，免疫剂量为50μg/只，免疫途径为腹腔免疫。

分别在二免和三免后一周对小鼠进行断尾采血，分离血清(4℃，10000rpm，20min)，用间接ELISA检测抗体水平。在细胞融合前3天，对免疫效果好的BALB/c小鼠再进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射50μg免疫抗原。

2.细胞融合

融合前1天准备饲养层细胞，按照常规方法取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞铺96孔细胞培养板中待用。断颈处死待取脾的小鼠，无菌取脾并分离脾细胞，按脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞4：1的比例用PEG进行细胞融合，融合后的细胞铺于准备好的饲养细胞之上。

3.阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆

利用纯化后的原核表达CDV-N蛋白建立间接ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞株，对反应阳性的杂交瘤细胞扩大培养，同时用有限稀释法进行阳性杂交瘤细胞的亚克隆，至少亚克隆3次，将亚克隆好的阳性杂交瘤细胞及时冻存。最终获得一株可以稳定分泌抗CDV-N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是：CGMCC8793；并将其分泌的单克隆抗体命名为CDV-1N8，以下简称1N8。

4.单克隆抗体的大量制备

给10周龄左右的健康BALB/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂，0.5mL/只，1周后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞，7～10d后当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，隔2d抽一次，将抽取的腹水10000r/min离心10min，去除上层油脂和沉淀，上清分装保存于-20℃。

实施例3 单克隆抗体的鉴定

1.单克隆抗体的亚类鉴定

按照SBA ClonotypingTM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒操作说明书对实施例2所得到的单克隆抗体进行亚类鉴定。

结果显示本发明单克隆抗体1N8的重链为IgG1，轻链为Kappa链，鉴定结果见图2。

2.Western blot鉴定试验

将离心收获CDV病毒上清后的细胞沉淀和Vero细胞沉淀处理后进行SDS-PAGE电泳，然后经电转印将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，电转条件为18V电压30min，用5％脱脂奶粉封闭液将转印后的硝酸纤维素膜4℃封闭过夜；加入单克隆抗体上清室温孵育1h，用PBST(含0.5mL/L吐温-20的pH7.4的PBS缓冲液)洗涤三次，再与4000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG抗体室温孵育1h，PBST洗涤3次后，用DAB显色试剂盒显色，扫描记录。

试验结果证实，本发明所制备的单克隆抗体1N8能够与CDV-N蛋白发生特异性反应，而与对照Vero细胞不发生反应，结果见图3，同时根据本实验结果推测1N8所识别的CDV-N蛋白B细胞表位应该是一个线性表位。

3.IFA鉴定试验

将生长至70％～80％的Vero细胞接毒CDV。感染48小时后冷乙醇4℃固定30分钟，1：10倍稀释的1N8腹水37℃孵育1h，然后1:100倍稀释的FITC标记的羊抗鼠二抗37℃孵育1h。最后荧光显微镜观察拍照。

试验结果证实，本发明所制备的单克隆抗体1N8仅能够与CDV发生特异性反应(结果见图4),不与Vero细胞发生反应(结果见图5)。

1.单克隆抗体1N8的纯化

用硫酸铵沉淀法初步提纯IgG分子，将初提纯的IgG分子在磷酸盐缓冲液中透析去硫酸铵之后过蛋白A/G亲和层析柱，用0.2M的甘氨酸-HCl(pH2.3)洗脱与蛋白A/G结合的特异性抗体，并立即在洗脱之后的抗体中加入1M的Tris-HCl(pH9.0)调pH值到7.0左右。

2、针对N蛋白特异性抗体的噬菌体随机12肽库(Ph.D.-12)淘筛

噬菌体随机12肽库针对N蛋白特异性抗体的淘选过程参照NEB公司的说明书进行。淘选过程分为3轮，其中靶分子包被量、肽库与靶分子的孵育时间逐轮降低、洗涤液中吐温20的含量则逐轮增加。

将N蛋白特异性抗体用包被液(0.1M NaHCO₃,pH8.3)稀释，100μl/孔加入到96孔酶标板中，4℃包被过夜；用含5mg/ml BSA的包被液封闭；将噬菌体肽库稀释到2×10¹¹pfu/ml，每孔加入100μl，37℃孵育；用含吐温20的Tris-HCl缓冲液洗涤10次；结合之后的噬菌体用0.2M的甘氨酸-HCL(pH2.3)洗脱，并立即加入1M的Tris-HCl(pH9.0)调pH值到7.0左右。每轮淘选的噬菌体接种含E.coli ER2738宿主菌的培养基扩大培养，取培养物离心之后的上清用20％的PEG8000/0.5M NaCl溶液沉淀，沉淀所得的噬菌体用于下一轮淘选。

3、阳性噬菌体的序列分析

按照Ph.D.-12随机肽库操作说明书抽提阳性单克隆噬菌体的ssDNA，使用试剂盒提供的引物5-CCCTCATAGTAGCGTAACG-3，由上海英俊公司进行测序。采用DNAstar软件进行序列分析。随机挑选8个噬菌体克隆，其测序结果经比对分析为QITFLHSERS。

4、抗原表位的初步鉴定

将噬菌体肽库筛选的抗原经多肽合成后分别以100ng/孔包被ELISA反应板，以单克隆抗体1N8细胞培养上清为一抗37℃孵育1h，然后HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗37℃孵育1h进行间接ELISA实验。结果显示1N8与短肽QITFLHSERS发生特异性反应，与其他对照短肽均不反应。进而将1N8所识别的CDV-N蛋白B细胞表位初步定位于QITFLHSERS所示的氨基酸序列上，鉴定结果见图6。

实施例4 利用犬瘟热病毒单克隆抗体1N8建立检测犬瘟热抗体的阻断ELISA方法

1、抗原包被浓度和阻断抗体稀释度的确定

犬瘟热病毒以38.4mg/L包被，犬瘟热病毒单克隆抗体1N8做1:1000、1：2000、1：4000、1：8000稀释，进行间接ELISA，结果表明，确定的抗原工作浓度为9.6mg/L，阻断抗体的稀释度为1：4000(见表1)。

表1 抗原包被浓度和阻断抗体稀释度

2、待检血清稀释度的确定

将血清分别做1：2.5；1：5；1：10；1：20；1：40；1：80倍比稀释，按照优化好的条件进行间接阻断ELISA，结果显示：当血清1：20稀释时，免疫血清的抑制率在50％以上，而未免疫血清的抑制率在25％以下。因此，血清稀释度规定为1：20(见表2)。

表2 待测血清稀释度

3、判断结果确定

抑制率(％)＝(阻断抗体D450nm-样本D450nm)/阻断抗体D450nm*100％

用间接阻断ELISA反应条件，对10份CDV未免疫血清样本进行检测。根据公式计算临界值,临界值＝阴性样品平均抑制率+2倍标准偏差。对未免疫血清样本的检测结果显示，CDV的平均抑制率为29％；大于29％则为阳性血清，小于29％则为阴性血清。

4、基于犬瘟热病毒单克隆抗体1N8的阻断ELISA方法检测8份犬瘟热病毒血清效价主要操作方法如下：

将犬瘟热病毒以碳酸盐缓冲液(pH9.6，0.05mol/L)稀释后加入96孔酶标板中，100μL/孔，37℃包被3h后，用PBST洗板机洗涤3次；用2％BSA封闭，200μL/孔，37℃封闭2h，再用PBST洗板机洗涤3次；将待检水貂血清用PBST稀释后加入酶标板中，50μL/孔，37℃孵育30min后，加入等量按工作浓度(1：4000)稀释的单克隆抗体1N8孵育1h后，用PBST洗板机洗涤3次；将羊抗鼠酶标抗体经PBST稀释后，100μL/孔，37℃孵育1h，用PBST洗板机洗涤3次；最后加TMB显色液，100μL/孔，室温作用10min；每孔加入50μL浓度为2mol/L的浓硫酸终止显色后，测定D450nm值，计算抑制率。每次均设CDV阳性血清对照(未阻断)。实验结果见表3。

表3 待测血清抑制率结果

结果显示，4份CDV阳性血清抑制率均在29％以上，而阴性血清抑制率在29％以下。与预期结果一致。所以，基于犬瘟热病毒单克隆抗体1N8的阻断ELISA方法，有效并实用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的规定范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一株杂交瘤细胞株，能稳定的分泌抗CDV-N蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述杂交瘤细胞株命名为CDV-1N8，微生物保藏号为：CGMCC No.8793。

2.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述杂交瘤细胞株产生。