CN105254756A - 一种针对丙型肝炎病毒包膜蛋白e2的单克隆抗体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丙型肝炎病毒（Hepatitis？C？Virus，HCV）包膜蛋白E2的单克隆抗体（简称单抗）制备及其应用。所述的单抗命名为1C1，由本发明制备的杂交瘤细胞株1C1（保藏编号：CCTCC？NO：C2015199）分泌并筛选得到。该单抗的表位为构象型表位，能够结合来自1a、1b、2a、3、4、5、6型别HCV的包膜蛋白E2。本发明得到的单抗1C1具有很好中和HCV，降低其感染细胞的能力，可作为丙型肝炎病毒感染后的治疗性抗体，在HCV感染的诊断与预防中具有巨大应用前景。

Description

一种针对丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的单克隆抗体及应用

技术领域

本发明涉及免疫化学、基因工程和细胞生物学领域。具体而言，本发明的目的在于制备一种与丙型肝炎(hepatitisCvirus，HCV)包膜蛋白E2相结合的单克隆抗体的杂交瘤；由该杂交瘤产生的抗HCV包膜蛋白E2单克隆抗体及其相应产品可应用于人感染HCV的诊断试剂或用于治疗或预防HCV感染的药物制备。

背景技术

HCV感染人体后，约80％HCV感染者常发展成为慢性肝炎，其中约有10％-20％患者发展肝硬化、肝癌(AscioneA,TartaglioneT,DiCostanzoGG.NaturalhistoryofchronichepatitisCvirusinfection.DigLiverDis.2007,39Suppl1:S4-7；JacobsonIM,DavisGL,El-SeragH,NegroF,TrepoC.PrevalenceandchallengesofliverdiseasesinpatientswithchronichepatitisCvirusinfection.ClinGastroenterolHepatol.2010,8:924-933；quize117)，严重影响人类健康，目前尚无有效的疫苗。目前，在HCV的治疗方法上取得了重大的进步，对一些型别的HCV能达到95％以上的治愈率，但仍然有一些抗药性毒株，且HCV具有高度变异性和异质性，在治疗过程中可能很快产生抗性突变毒株(RiceCM,SaeedM.HepatitisC:Treatmenttriumphs.Nature.2014,510:43-44)。因此，从多种途径上研制针对HCV的中和性抗体以及疫苗仍然非常迫切。

HCV是有包膜的单股正链RNA病毒，其基因组RNA全长约9.6kb，由5’UTR(～341bp)、3’UTR以及中间的一个长的开放阅读框组成(ChooQL,RichmanKH,HanJH,BergerK,LeeC,DongC,GallegosC,CoitD,Medina-SelbyR,BarrPJ,etal.GeneticorganizationanddiversityofthehepatitisCvirus.ProcNatlAcadSciUSA.1991,88:2451-2455)。HCV感染细胞后，其基因组能编码产生约3000个氨基酸的多聚蛋白，该多聚蛋白在共转运和翻译后转运过程中，经过病毒和宿主细胞内蛋白酶的剪切，最终形成10种蛋白：3种结构蛋白(核衣壳蛋白Core、包膜蛋白E1和E2)和7种非结构蛋白P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B(GrakouiA,WychowskiC,LinC,FeinstoneSM,RiceCM.ExpressionandidentificationofhepatitisCviruspolyproteincleavageproducts.JVirol.1993,67:1385-1395)。非结构蛋白不会被包装至病毒粒子中。整个病毒粒子是由RNA和core蛋白形成核衣壳，包膜糖蛋白E1和E2组成病毒外壳的主要成分。

在病毒感染的早期阶段，由E2与肝细胞表面CD81受体以及清道夫受体BI(SRB1)直接相互作用，介导病毒入侵肝细胞，同时，E2也是中和抗体结合的主要靶点。因而，开发针对E2的中和性抗体将能够在第一步抑制病毒入侵细胞。

抗体的产生与抗原表位息息相关。成熟的E2蛋白(翻译后剪切掉N端20个氨基酸信号肽的)大致可分为两个区域：N端的胞外区(aa384-661，对应于HCV多聚蛋白上的位置)以及C端的疏水区(aa661-746)。一般抗原表位被认为存在于胞外亲水区。而E2的胞外结构域含有三个高度变异区：HVR1(384-410aa)、HVR2(474-482aa)、IgVR(431-466aa)(HelleF,DuverlieG,DubuissonJ.ThehepatitisCvirusglycanshieldandevasionofthehumoralimmuneresponse.Viruses.2.11,3:1909-1932；McCaffreyK,BooI,PoumbouriosP,DrummerHE.ExpressionandcharacterizationofaminimalhepatitisCvirusglycoproteinE2coredomainthatretainsCD81binding.JVirol.2007,81:9584-9590)。HCV包膜蛋白的高度变异性使得宿主难以形成有效的保护性免疫，这是HCV逃逸机体免疫清除的机制之一，同时也是HCV疫苗以及中和性抗体开发的主要难题之一。相对于高度变异的基因组以及E2上的高度变异区，E蛋白上的糖基化修饰位点相当保守。在HCV的7个基因型和多个亚型之间，E2上分布的11个糖基化位点中N5和N7(分别为75％和89％)以外的9个都是高度保守的(>％97)(GoffardA,DubuissonJ.GlycosylationofhepatitisCvirusenvelopeproteins.Biochimie.2003,85:295-301；HelleF,GoffardA,MorelV,DuverlieG,McKeatingJ,KeckZY,FoungS,PeninF,DubuissonJ,VoissetC.Theneutralizingactivityofanti-hepatitisCvirusantibodiesismodulatedbyspecificglycansontheE2envelopeprotein.JVirol.2007,81:8101-8111)，这显示了糖苷在HCV生活周期中的重要作用。对这些聚糖的功能分析表明，糖苷的功能是多样的，且不同位置的糖基化修饰功能是不完全相同的：(1)糖基化修饰影响蛋白质折叠，E2N8和E2N10缺失后直接抑制E1E2蛋白的异二聚体的形成，E1N1，E2N3，E2N7，E2N8和E2N10突变导致病毒组装缺陷影响病毒粒子的产量(GoffardA,CallensN,BartoschB,WychowskiC,CossetFL,MontpellierC,DubuissonJ.RoleofN-linkedglycansinthefunctionsofhepatitisCvirusenvelopeglycoproteins.JVirol.2005,79:8400-8409；HelleF,VieyresG,ElkriefL,PopescuCI,WychowskiC,DescampsV,CastelainS,RoingeardP,DuverlieG,DubuissonJ.RoleofN-linkedglycansinthefunctionsofhepatitisCvirusenvelopeproteinsincorporatedintoinfectiousvirions.JVirol,2010,84:11905-11915)；(2)糖苷介导病毒粘附入侵细胞；E2N2和E2N4位糖基化位点突变明显减少HCVpp对肝细胞的入侵感染；(3)糖苷保护病毒避免降解以及抗体的中和作用，在HCVpp中的研究表明E2N2和E2N4缺失后假病毒更易被中和，而E2N1，E2N6和E2N11缺失后导致HCVcc对中和性抗体更加敏感，因而这些位点糖苷的存在对于病毒抵抗中和抗体的中和作用至关重要。从蛋白作为抗原的角度出发，糖苷可以遮蔽关键的抗原表位，使病毒抗原表达时，机体不能有效识别病毒抗原，导致机体无法产生高效的抗病毒免疫保护反应。在E2上哪个N-糖基化修饰去除能在体内诱导产生中和性抗体尚不清楚。

尽管HCVE2上糖基化修饰位点是高度保守的，但在病毒感染后体内产生的抗体的压力下，也还是会发生“糖苷移位”等现象来逃逸抗体的中和作用(PantuaH,DiaoJ,UltschM,HazenM,MathieuM,McCutcheonK,TakedaK,DateS,CheungTK,PhungQ,HassP,ArnottD,HongoJA,MatthewsDJ,BrownA,PatelAH,KelleyRF,EigenbrotC,KapadiaSB.GlycanshiftingonhepatitisCvirus(HCV)E2glycoproteinisamechanismforescapefrombroadlyneutralizingantibodies.JMolBiol,2013,425:1899-1914)，这种糖苷移位也不是随机的，有一个常见的现象是N1(N417)处的N突变为S/T，导致在N415处形成新的糖基化修饰位点，说明病毒会利用糖苷来遮蔽这些表位从而避免抗体的中和(KeckZY,AngusAGN,WangWY,LauP,WangY,GathererD,PatelAH,FoungSKH.Non-randomEscapePathwaysfromaBroadlyNeutralizingHumanMonoclonalAntibodyMaptoaHighlyConservedRegionontheHepatitisCVirusE2GlycoproteinEncompassingAminoAcids412-423.PLoSPath,2014,10)。

由于原核表达的E2蛋白不能形成蛋白质的糖基化，得到的蛋白不能正确折叠，只能提供线性表位，无法提供构象性表位，而真核表达的产量较低且纯化困难。DNA疫苗的发展为一些难以体外表达的抗原提供了新的途径。DNAprime联合蛋白进行boost的方式被认为是非常有效的免疫方式(SongMK,LeeSW,SuhYS,LeeKJ,SungYC.EnhancementofimmunoglobulinG2aandcytotoxicT-lymphocyteresponsesbyaboosterimmunizationwithrecombinanthepatitisCvirusE2proteininE2DNA-primedmice.JVirol,2000,74:2920-2925)。目前，关于DNA疫苗的机理仍不是特别清楚，这种方便的免疫途径至少可以将表达质粒导入体内，在细胞中表达后提供胞内抗原，加工后被MHCI类分子递呈，如果是分泌型蛋白还可提供胞外抗原，被循环的或定居在组织中的抗原递呈细胞加工后由MHCII类分子递呈，此外局部注射和电击所造成的损伤、炎症反应以及细胞毒性T细胞对电转了外源DNA细胞的裂解作用也可将抗原释放至胞外从而产生外源性抗原(KutzlerMA,WeinerDB.DNAvaccines:readyforprimetime？NatureReviewsGenetics,2008,9:776-788；YokoyamaM,HassettDE,ZhangJ,WhittonJL.DNAimmunizationcanstimulatefloridlocalinflammation,andtheantiviralimmunityinducedvariesdependingoninjectionsite.Vaccine,1997,15:553-560)。单纯的DNA注射不能提供足够的抗原，但是利用基因导入仪电击的方式可使DNA疫苗在体内有效表达，已有研究报道利用基因导入仪将E2真核表达质粒导入人体肌肉中作为治疗性DNA疫苗(WeilandO,AhlenG,DiepolderH,JungMC,LevanderS,FonsM,MathiesenI,SardesaiNY,VahlneA,FrelinL,SallbergM.TherapeuticDNAVaccinationUsingInVivoElectroporationFollowedbyStandardofCareTherapyinPatientsWithGenotype1ChronicHepatitisC.MolTher,2013,21:1796-1805)，显示了潜在的前景。

发明内容

为了克服现有技术中的不足，如果能够筛选出多种抗体分别针对不同的表位，包括利用不同的糖基化缺失突变体诱导可识别被糖苷遮盖表位的抗体，那么病毒也许就无法利用糖苷移位来逃逸了，这也是非常有意义的。

因此，本发明的目的是提供一种抗HCV包膜蛋白E2的单克隆抗体1C1，所述抗体由保藏号为CCTCCNO：C2015199的小鼠杂交瘤细胞株1C1分泌产生，所述抗体的类型为IgG2a型。

本发明所述抗体1C1能够结合HCV蛋白的构象型表位。

本发明所述抗体1C1对HCVcc有中和作用。

本发明所述抗体1C1能够结合来自1a、1b、2a、3、4、5、6型HCV的包膜蛋白E2。

本发明的又一个目的是提供筛选能够表达单克隆抗体1C1的杂交瘤细胞株1C1的制备方法，包括以下步骤：

构建HCVsE2糖基化突变体的真核表达质粒：将HCV分泌型包膜糖蛋白sE2的融合蛋白克隆入真核表达载体pCDNA3.1，再利用PCR的方法将sE2的第2个糖基化位点的编码氨基酸由N(天冬酰胺)突变为D(天冬氨酸)，即sE2N2。具体所述突变是sE2蛋白的sE2-N423RT突变为sE2-D423RT。用糖基化缺失突变体的重组质粒免疫BALB/c小鼠3次，每次间隔3周，末次用原核表达获取的sE2-His蛋白颈背部皮下注射加强免疫一次，一个月后，再次用原核表达获取的sE2-His蛋白尾静脉注射入免疫后小鼠，刺激3天。

获取融合细胞生长克隆：从免疫合格小鼠无菌取脾脏，制备脾脏单个悬浮细胞作为抗原致敏的B细胞，利用聚乙二醇介导的细胞融合法将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，然后用HAT培养基进行筛选，进而获取融合细胞生长克隆。

应用ELISA和Westernblot筛选和鉴定出具有可高效结合并中和HCV的杂交瘤细胞分泌液(即单抗1C1)。最后，将筛选到的杂交瘤细胞株接种石蜡致敏后的小鼠腹腔，获得小鼠腹水并从中分离纯化所需单克隆抗体。

本发明的又一个目的是涉及单克隆抗体1C1在制备用于检测HCV的试剂盒中的应用，所述试剂盒利用单克隆抗体1C1通过ELISA或流式细胞仪(FlowCytometer,FCM)来检测HCV蛋白的表达。

一种检测HCV的试剂盒，所述试剂盒包含单克隆抗体1C1。

单克隆抗体1C1在制备治疗或预防HCV感染药物中的用途。

用于治疗或预防HCV感染的药物组合物，其包含药物有效量的单克隆抗体1C1。

本发明的组合物可被施用给被HCV感染的或有感染风险的受试者。可以应用任何合适的施用途径，包括胃肠外的、口服、眼、局部、局部区域、灌肠或气溶胶给药。胃肠外给药包括肌内注射、静脉注射、淋巴管内注射、皮下或皮内注射及输注。

本发明的组合物可被制备成适合所选择施用途径的任意药学形式，例如可注射溶液或悬浮液、输液、片剂、胶囊、霜剂、软膏、洗剂或栓剂形式。

本发明的组合物包含作为有效成分的单克隆抗体1C1，以及本领域技术人员知晓的合适的药物辅料、载体或稀释剂。

本发明的进一步目标是能够特异性结合上述抗体独特型的抗独特型抗体。本发明的抗独特型抗体可通过本领域技术人员本身已知的获得抗独特型抗体的传统方法获得。

本方案中所应用的是以sE2N2作为DNA疫苗免疫，联合运用原核表达的不具备糖基化修饰的sE2蛋白进行加强免疫。利用基因导入仪将sE2N2电转入小鼠体内后可进行具有天然构象的sE2抗原的表达以及分泌，既可以提供胞内抗原也可提供胞外抗原，分别以内源性抗原和外源性抗原的方式进行抗原递呈。并且N2糖基化位点的缺失可以进一步暴露sE2的表位，进而更有效地激发机体的免疫反应，诱导产生更多抗体。经验证，本发明制备HCVN-糖基化位点突变sE2N2的单克隆抗体，能有效地中和HCV的感染，清除病毒。

附图说明

图1显示的是1C1与HCVcc结合的亲和性；

以不同浓度的1C1作为一抗，以ELISA检测各浓度下1C1与GNA(Galanthusnivalisagglutinin，雪花莲凝集素)捕获的HCVcc(JFH1分离株，基因型为2a)的结合，将不同的浓度所对应的OD值用GraphPadPrism5软件进行拟合，计算出Kd值。

图2显示的是1C1对不同型别HCVE2的识别能力；

pCMV-tag2A-1a/1b/2a/3a/4a/5a/6aE2分别转染293T细胞后，收获细胞裂解液，被GNA捕获的E2蛋白作为抗原，以1C1作为一抗。

图3显示的是酶联免疫吸附实验(ELISA)检测单抗1C1的抗体亚型；

以GNA捕获的HCVcc作为抗原，1C1作为一抗，分别以HRP标记羊抗鼠IgG1，2a，2b作为二抗，检测针对哪种亚型的二抗能识别1C1。

图4显示的是ELISA的方法检测单抗1C1的表位；

以合成的E2的多肽库、原核表达GST-sE2蛋白或者GNA捕获的HCVcc分别作为抗原，检测单抗1C1与这些抗原的结合能力。

图5显示的是免疫印迹(WesternBlot)检测单抗1C1中和HCVccHuh7.5.1。

将候选杂交瘤细胞单克隆化后，分别接种小鼠腹腔制备腹水，用proteinA/G纯化抗体，取定量的抗体进行抗HCV中和实验。

保藏说明

分泌特异性抗丙型肝炎病毒HCV包膜蛋白E2的单克隆抗体1C1的小鼠杂交瘤细胞株1C1于2015年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072)，保藏编号为CCTCCNO：C2015199。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室指南》(NewYork:ColdSpringHarborlaboratoryPress,2001)中所述的条件进行。

【实施例1】小鼠单克隆抗体的制备和筛选

1、构建sE2N2突变体的真核重组质粒

pcDNA3.1-E1E2质粒载体(ChenF,etal.,AntimicrobialagentsandChemotherapy,2010,p3355-3364)含有完整1a型HCV的E1E2的全长基因序列(Genebank序列号为AY958062)，利用PCR扩增出可表达分泌型E2蛋白的E2的基因序列，进一步将该片段构建到pCDNA3.1(-)-myc-his载体(Invitrogen)上。再用定点突变PCR方法将sE2上第2个N-糖基化位点上的天冬酰胺突变为天冬氨酸，获得重组质粒命名为sE2N2。构建中所需引物如下：

sE2-F：5’-CGGGATCCATGGTAGGGAACTGGGCGAAGG-3’(SEQIDNO:1)

sE2-R：5’-GCAAGCTTCTCGGACCTGTCCCTGTCGTC-3’(SEQIDNO:2)

N2-Df:5’-TTGGCACATCGATCGCACGGCCTTGAAC-3’(SEQIDNO:3)

N2-Ur:5’-GTTCAAGGCCGTGCGATcGATGTGCCAA-3’(SEQIDNO:4)

其中，sE2-F和sE2-R用来扩增sE2片段，以sE2-F引物搭配点突变所在位置下游引物(N2-Ur)经PCR获得包含点突变序列的上游片段，以sE2-R引物搭配点突变所在位置上游引物(N2-Df)获得包含点突变序列的下游片段，最后通过上下游片段overlapPCR获得包含该点突变的全长基因。整个构建的具体实施步骤如下：

(1)PCR扩增反应体系：

反应条件为94℃2min；(94℃30s，60℃30s，68℃2min)×30cycles；68℃，7min。

(2)OverlapPCR获得含突变位点的完整基因片段

分别将包含点突变位置的上、下游基因片段按照AXYGEN的试剂盒步骤进行清洁回收，以回收的上下游PCR产物为模板，扩增全长的sE2-N2，反应体系如下：模板，上游产物2μL+下游产物2μL；10mmdNTP，1μL；sE2-F，1μL；sE2-R，1μL；10×KODbuffer，5μL；MgCl₂，3μL；KOD酶，1μL；ddH₂O，33μL。

反应条件是：94℃，5min；(94℃，30s；60℃，30s；68℃，30s)×30cycles；68℃，5min。

用PCR清洁回收试剂盒回收sE2N2的全长PCR产物。

(3)PCR产物和pCDNA3.1(-)-myc-his空载进行酶切、酶连

BamHI和HindIII进行双酶切，体系如下：

37℃，水浴3小时，再将酶切后的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后按目标分子量大小(894bp)进行切胶回收。

连接体系如下：sE2N2产物产物，6μL；pCDNA3.1(-)-myc-his，2μL；10×LigationBuffer，1μL；T4连接酶，1μL。反应条件为4℃，过夜。

(4)转化：

将连接产物用Biorad电转仪以电转的方式转化到大肠杆菌DH5α中，经过Amp抗性筛选，获取转化入质粒的克隆。

(5)克隆鉴定

质粒提取：挑取克隆接入Amp⁺LB培养基，摇菌过夜后用AXYGEN的试剂盒抽提质粒，并用HindIII和BamHI进行酶切鉴定。酶切体系同上。鉴定成功后送英俊公司测序。

2、原核表达的sE2-His蛋白和GST-sE2蛋白的提取和纯化

为方便sE2蛋白的纯化，我们将sE2分别与GST以及His标签融合形成蛋白，其中His标签分子量极小，基本不影响sE2蛋白的免疫原性，sE2-His蛋白用于小鼠免疫；GST-sE2蛋白可溶性更好，利于大量制备，用于体外检测实验：(1)融合GST、12×His标签的sE2基因的构建

同上，利用pcDNA3.1-E1E2质粒载体为模版，以引物CGggatccATGAACACCTTCACCACTG(F)(SEQIDNO:5)和GCaagcttCTCGGACCTGTCCCTGTCGTC(R)(SEQIDNO:6)，将去跨膜区且删去信号肽的sE2扩增出来，分别连接至

pGEX-KG、pET28a载体上形成GST-sE2、sE2-His融合基因。

(2)重组质粒pGEX-KG-sE2、pET28a-sE2的原核表达

①诱导：将测序正确的pGEX-KG-sE2、pET28a-sE2克隆转化入大肠杆菌BL21中，对于经抗性筛选获得阳性菌落，摇菌1-3L，待OD₆₀₀值达到0.4-0.6时，加入终浓度为0.25mM的IPTG以诱导融合蛋白表达，150rpm25℃继续培养5h。②集菌：4℃8000rpm离心2min收集菌体，然后用冰预冷的PBS洗涤菌体3次。最后用100mL冰预冷的含有蛋白酶抑制剂PMSF(0.5mM)的缓冲液重悬菌体(对于GST标签蛋白用PBS重悬，对于His标签蛋白用Tris-HClbuffer重悬)，备用。

③碎菌：高压均质仪破碎细菌：4℃，950kpa的压力进行循环破菌。随后，向细菌裂解液中加入终浓度为1％的TritonX-100，冰上轻摇1h。离心收集上清液：10000rpm离心20min，重复2次，以充分去除菌渣。

④亲和层析纯化靶蛋白：对于GST标签蛋白，加入PBS预平衡的50％GlutathioneSepharose4B珠子到细菌裂解液上清中，冰上轻摇结合2h，500g离心1min收集GlutathioneSepharose4B珠子；对于His标签蛋白，加入预平衡的50％的Ni-NTAagrose，冰上轻摇结合2h，500g离心1min收集Ni-NTAagrose珠子。

⑤洗去非特异性吸附于磁珠上的蛋白：对于GST标签蛋白，用灭菌PBS洗涤8次GlutathioneSepharose4B珠子，每次1min；对于His标签蛋白，用含20mM-80mM咪唑的Tris-HClbuffer洗涤。

⑥蛋白洗脱：对于GST标签蛋白，加入Sepharose4B1/2体积的含10mMGlutathione的Tris-HClbuffer，室温下用加样枪反复吹打10min，洗脱蛋白，4℃，2000rpm，离心3min，吸取上清；对于His标签蛋白，用含200mM咪唑的Elutionbuffer洗涤。重复洗脱一次，以充分将蛋白洗脱。

⑦靶蛋白浓度以及纯度检测：运用Bradford法测定洗脱蛋白的浓度，利用SDSPAGE结合考马斯亮蓝染色鉴定所得蛋白纯度。

⑧将洗脱蛋白去内毒素：利用Sigma公司的endotoxinremovalsolution去除大肠杆菌来源蛋白中污染的内毒素。最后用0.22μm滤膜(Millipore)过滤，分装，冻存。

3、小鼠免疫

采用OMEGABiotek公司的提取质粒DNA试剂盒，将重组的sE2N2质粒提取，纯化，去除内毒素后，以20～100微克的量通过基因导入仪导入小鼠大腿肌肉内。此外，电击后在相同肌肉位置注射入500U的IL-2作为佐剂。每3周质粒免疫一次，免疫3次。3周后再用20～50微克sE2-His蛋白加强免疫一次，最后一次免疫后20天时取小鼠血清，酶联免疫吸附法检测针对E2蛋白的抗体效价。选取抗体效价最高的小鼠，尾静脉注射sE2-His抗原约20～50微克，再间隔3天，处死小鼠取脾脏细胞以进行细胞融合。

4、1C1单抗的制备

(1)骨髓瘤细胞与免疫后小鼠脾脏细胞融合

①骨髓瘤细胞体内活化：收集1×10⁶个体外培养的SP2/0细胞，用RPMI-1640洗涤一次后接种于小鼠背部皮下，待7天左右实体瘤形成后，处死小鼠，酒精消毒后无菌剥离瘤组织，研磨、过滤后制备成细胞悬液，并计数。

②免疫后脾脏细胞的制备：免疫后脾脏经过研磨、去除红细胞、过滤后形成单细胞悬液，重悬于RPMI-1640中，计数。

③聚乙二醇介导的细胞融合：超净台中事先准备37℃水浴，并将50％PEG以及RPMI-1640基础培养基于水浴中预热；将SP2/0与免疫细胞按照1∶5的比例于50mL离心管内混匀，300g离心5min，充分倒空上清液后轻轻敲击以使细胞沉淀松动；将离心管放于37℃水浴中，在1min内慢慢滴入0.8mL预热好的50％PEG，边滴边用巴氏管尖轻轻搅拌，继续搅拌30sec后静置1min；慢慢滴入预热好的RPMI-1640基础培养基，第1min加1mL，第二分钟加1mL，第3-4分钟加3mL，第5min加5mL，每次都是逐滴滴入并轻轻搅拌，最后慢慢加入30mL；250g离心5min去掉液体后继续将细胞于37℃放置5min；最后，用HAT培养基重悬细胞。

(2)饲养细胞的制备：取未经过免疫的健康小鼠，处死，收集血清(作为阴性血清备用)，无菌取腹腔巨噬细胞以作为饲养细胞，细胞重悬于HAT培养基后计数。

(3)杂交瘤细胞培养：将融合后的细胞与饲养细胞混合，分种于96孔细胞培养板，每孔250μL，约含10⁴个SP2/0细胞，共接种了4块96孔板；融合后隔天观察细胞状态以及有无污染，于第4天补充1滴HAT培养基，第10天吸走100μL培养基更换为100μL新鲜的HT培养基；待培养基变黄，细胞集落铺满约1/4培养孔时即可进行抗体检测。

(4)间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清

①5μg/mLGNA包被ELISA板用以捕获HCV，37^℃1小时。

②加入10⁶copiesHCVcc，4℃过夜。

③2％BSA封闭ELISA板，37℃，1小时。

④加入杂交瘤的培养上清，100μL/孔，4℃过夜。同时设置SP2/0细胞的培养上清作为阴性对照

⑤PBST洗板三次，HRP-羊抗鼠IgG(1:5000)加到ELISA板中孵育，100μL/孔，37℃，1小时。

⑥PBST洗板三次，加TMB显色，50μL/孔，5min后加2MH2SO4终止反应，50μL/孔。

⑦读板，记录450nm处吸光值。将OD₄₅₀nm大于阴性对照2倍的样品视为阳性。选取与阴性相比阳性值高，生长旺盛的细胞待用，有限稀释法进行克隆。(5)杂交瘤细胞的单克隆化：对于阳性值高的样品，利用有限稀释法对细胞进行单克隆化。具体为将阳性孔中的细胞集落吹散吸出后计数，HT培养基重悬后调整浓度至10个/mL，每孔添加50μL，尽量使每孔所含细胞数为0-1个，同时准备饲养细胞5×10⁴个/mL，每孔添加200μL；待单个细胞克隆长大后再次进行ELISA筛选出可分泌高滴度抗体的杂交瘤细胞株，并进行扩大培养以及细胞株冻存。筛选到的杂交瘤细胞株于2015年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072)，保藏编号为CCTCCNO：C2015199。

(6)单抗大量制备：取8周龄雌性BALB/C小鼠，每只腹腔注射0.5mL无菌液体石蜡以致敏，10天后，腹腔注射10⁶个杂交瘤细胞，约10天后，小鼠腹部明显膨胀时用5mL注射器采集小鼠腹水。将所得腹水于4℃，12000g离心30min以去杂质沉淀以及上层油脂，收集中间层的腹水。

(7)单抗纯化：采用ProteinA/G纯化，先将腹水加入等体积2×PBS进行稀释，再加入PBS预洗后的ProteinA/G珠子，室温震荡结合2h后收集珠子，用10倍柱体积的PBS洗涤3次后收集珠子，加入1倍柱体积0.1M甘氨酸(Glycine,pH3.0)进行洗脱，震荡10min后，收集洗脱下的抗体，重复三次。测定抗体浓度。最后，在抗体中加入2/5体积的1MTris(pH8.0)进行中和，再加入0.02％NaN3以及1mMEDTA和50％的甘油，于-20℃保存。

【实施例2】抗体特异性的检测

1、单抗与病毒亲和性的检测：

ELISA法。抗原为GNA捕获的HCVcc(JFH1分离株，2a型)，一抗为不同稀释度的1C1单抗，二抗为HRP-羊抗鼠IgG(1:5000)，TMB显色后测450nm的吸光值，根据不同单抗稀释度下所得OD₄₅₀nm值，利用Graphpad软件拟合出单抗与HCVcc的亲和性。结果表明，1C1与HCVcc结合的Kd值为29.36nM(图1所示)。

2、单抗与不同型别HCV的E2蛋白结合能力的检测：

将可表达不同型别HCVE2蛋白的真核表达质粒(pCMVtag2A-1a/1b/2a/3/4/5/6)分别转染293T细胞，3天后收获细胞裂解液，加入到预先包被有GNA的板子中4度赋予过夜，即GNA捕获的E2抗原。同时设置正常293T细胞裂解液作为阴性对照。一抗为5μg/mL1C1，二抗为HRP-羊抗鼠IgG(1:5000)，TMB显色后测450nm的吸光值。结果表明，1C1可以与2a以及1a、1b型别HCV的E2蛋白结合能力最好，与3、4、5、6型HCV的E2也具有一定的结合能力(图2所示)。

【实施例3】单抗的亚型检测

ELISA法。抗原为GNA捕获的HCVcc(JFH1分离株，2a型)，一抗为5μg/mL1C1，二抗为HRP-羊抗鼠IgG1、IgG2a或者IgG2b(1:5000)，TMB显色后测450nm的吸光值。结果表明(图3所示)，1C1单抗为IgG2a型。

【实施例4】单抗表位检测。

采用间接ELISA法检测。所使用抗原抗体分别如下。

1、抗原：检测线性表位时用到的抗原为原核表达GST-sE2蛋白以及人工合成的覆盖E2的19个多肽片段(命名为从p1到p19)，使用浓度为5μg/mL，100μL/孔。检测构象性表位时用到的抗原为GNA捕获的含有1×10⁵copies的HCVcc。

以下为我们合成的E2的多肽片段：

E2-p1：E₃₈₄THVTGGSAGRTTAGLVGLL₄₀₃(SEQIDNO:5)

E2-p2：T₄₀₄PGAKQNIQLIDTNGSWHINST₄₂₅(N1,N2)(SEQIDNO:6)

E2-p3：A₄₂₆LNCNESLNTGW₄₃₇(N3)(SEQIDNO:7)

E2-p4：L₄₃₈AGLFYQHKFNSSGCPER₄₅₅(N4)(SEQIDNO:8)

E2-p5：L₄₅₆ASCRRLTNFAQGWGPISYA₄₇₅(SEQIDNO:9)

E2-p6：N₄₇₆GSGLDERPYCWH₄₈₈(N5)(SEQIDNO:10)

E2-p7：Y₄₈₉PPRPCGIVPAKSVCGPVYC₅₀₈(SEQIDNO:11)

E2-p8：F₅₀₉TPSPVVVRTTDRSGAPTYSW₅₂₉(SEQIDNO:12)

E2-p9：G₅₃₀ANDTDVFVLNNTRPPLGNW₅₄₉(N6,N7)(SEQIDNO:13)

E2-p10：F₅₅₀GCTWMNSTGFTKVCGAPPCVIG₅₇₂(N8)(SEQIDNO:14)

E2-p11：G₅₇₃VGNNTLLCPTDCFRKHPEA₅₉₂(N9)(SEQIDNO:15)

E2-p12：T₅₉₃YSRCGSGPWITPRCMV₆₀₉(SEQIDNO:16)

E2-p13：D₆₁₀YPYRLWHYPCTINYTIFKV₆₂₉(N10)(SEQIDNO:17)

E2-p14：R₆₃₀MYVGGVEHRLEA₆₄₂(SEQIDNO:18)

E2-p15：A₆₄₃CNWTRGERCDLEDRD₆₅₈(N11)(SEQIDNO:19)

E2-p16：G₅₀₄PVYCFTPSP₅₁₃(SEQIDNO:20)

E2-p17：P₅₂₅TYSWGANDT₅₃₄(SEQIDNO:21)

E2-p18：P₅₄₅LGNWFGCTW₅₅₄(SEQIDNO:22)

E2-p19：C₅₆₉VIGGVGNNT₅₇₈(SEQIDNO:23)

2、一抗：单抗1C1作为一抗，使用浓度为5μg/mL，孵育条件为4℃过夜。

3、二抗：HRP-羊抗鼠的二抗(1:5000)孵育条件为37℃，1小时。

具体操作方法如下：

将抗原包被ELISA板，4℃过夜。第二天用PBST洗涤ELISA板3次后加入2％BSA封闭，37℃，1小时；后将封闭液弃掉，PBST洗涤3次，加入单抗1C1(5μg/mL，作为一抗)4℃孵育过夜；将一抗弃掉，PBST洗涤3次，加入HRP-羊抗鼠的二抗(1:4000)37℃孵育，1小时；弃二抗，PBST洗涤3次，加入TMB显色10min，2M浓硫酸终止，读OD₄₅₀。结果表明(图4所示)，1C1均不能与人工合成的肽段结合，也不能和原核表达E2蛋白结合，但可以与HCV病毒粒子结合，说明1C1可能不与线性表位结合，而与病毒蛋白上构象型表位结合。

【实施例5】单抗对HCVcc的体外中和实验

Huh7.5.1细胞接种到24孔板中，2×10⁵细胞/孔，培养过夜。HCVcc(3MOI)与纯化后的不同浓度的单抗孵育，37℃1小时。将上述混合物加到Huh7.5.1细胞中，继续培养6小时。PBS洗去未结合细胞，将细胞培养基换为新鲜的含双抗的DMEM培养液，继续培养细胞3天，收获细胞。

抑制病毒感染后应用免疫印迹法(WB)检测各个处理组病毒蛋白NS3的表达情况：

①RIPA冰上裂解细胞，与5×SDS上样缓冲液混匀后，100℃煮沸变性5min。

②SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，封闭。

③一抗孵育：小鼠抗NS3单抗，用PBST进行1:2000稀释，4℃孵育过夜。内参抗体未鼠抗β-actin单抗(1:2000稀释)。

④二抗：HRP-羊抗鼠IgG1:5000稀释，加到转印好的PVDF膜，37℃孵育1小时。

⑤ECL显色。

结果如图5所示，用不同浓度(10或者25ug/mL)的单抗1C1以及所筛候选单抗(1C6、1D4、1D5)分别对HCV进行中和后，检测病毒对肝细胞的感染能力。同时设置阳性对照组(以sE2N2免疫小鼠后获得的抗血清进行中和试验)和阴性对照(以无中和能力的培养基进行中和试验)。NS3是HCV的非结构蛋白，通过检测该蛋白的表达水平可反映HCV的感染情况。Actin为细胞的肌动蛋白，表达量较为恒定，在此作为内参使用。由图可知，筛候选单抗1C6、1D4、1D5在高浓度时有一定的中和病毒感染的能力，而1C1在10μg/mL时仍显示了较好的中和HCVcc感染的作用。

SEQUENCELISTING

<110>武汉大学

<120>一种针对丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的单克隆抗体及应用

<130>

<160>6

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>扩增SE2片段的上游引物sE2-F

<400>1

cgggatccatggtagggaactgggcgaagg30

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>扩增SE2片段的下游引物sE2-R

<400>2

gcaagcttctcggacctgtccctgtcgtc29

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>sE2点突变所在位置上游引物N2-Df

<400>3

ttggcacatcgatcgcacggccttgaac28

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>sE2点突变所在位置下游引物N2-Ur

<400>4

gttcaaggccgtgcgatcgatgtgccaa28

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>扩增原核表达的sE2片段的上游引物

<400>5

cgggatccatgaacaccttcaccactg27

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>扩增原核表达的sE2片段的下游引物

<400>6

gcaagcttctcggacctgtccctgtcgtc29

Claims (13)

1.一种抗丙型肝炎病毒HCV包膜蛋白E2的单克隆抗体1C1，其特征在于：所述抗体由保藏号为CCTCCNO：C2015199的小鼠杂交瘤细胞株1C1分泌产生，所述抗体的类型为IgG2a型。

2.根据权利要求1所述的抗丙型肝炎病毒HCV包膜蛋白E2的单克隆抗体1C1，其特征在于：所述抗体1C1能够结合HCV蛋白的构象型表位。

3.根据权利要求2所述的抗丙型肝炎病毒HCV包膜蛋白E2的单克隆抗体1C1，其特征在于：所述抗体1C1对HCV有中和作用。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的抗丙型肝炎病毒HCV包膜蛋白E2的单克隆抗体1C1，其特征在于：所述抗体1C1能够结合来自1a、1b、2a、3、4、5、6型HCV的包膜蛋白E2。

5.产生权利要求1所述单克隆抗体1C1的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCCNO：C2015199。

6.制备权利要求1所述的单克隆抗体1C1的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）构建HCVsE2糖基化突变体的真核表达质粒：将HCV分泌型包膜糖蛋白sE2的融合蛋白克隆入真核表达载体pCDNA3.1，再利用PCR的方法将sE2的第2个糖基化位点的编码氨基酸由天冬酰胺N突变为天冬氨酸D，即sE2N2；具体所述突变是sE2蛋白的sE2-N423RT突变为sE2-D423RT；用糖基化缺失突变体的重组质粒免疫BALB/c小鼠3次，每次间隔3周，末次用原核表达获取的sE2-His蛋白颈背部皮下注射加强免疫一次，一个月后，再次用原核表达获取的sE2-His蛋白尾静脉注射入免疫后小鼠，刺激3天；

（2）获取融合细胞生长克隆：从免疫合格小鼠无菌取脾脏，制备脾脏单个悬浮细胞作为抗原致敏的B细胞，利用聚乙二醇介导的细胞融合法将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，然后用HAT培养基进行筛选，进而获取融合细胞生长克隆；

（3）应用ELISA和Westernblot筛选和鉴定出具有可高效结合并中和HCV的杂交瘤细胞分泌液；

（4）将筛选到的杂交瘤细胞株接种石蜡致敏后的小鼠腹腔，获得小鼠腹水并从中分离纯化所需单克隆抗体。

7.权利要求1的单克隆抗体1C1在制备用于检测HCV的试剂盒中的应用，其特征在于：所述试剂盒利用单克隆抗体1C1通过ELISA或FlowCytometry来检测HCV蛋白的表达。

8.一种检测HCV的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1的单克隆抗体1C1。

9.权利要求1的单克隆抗体1C1在制备治疗或预防HCV感染药物中的用途。

10.用于治疗或预防HCV感染的药物组合物，其特征在于：包含药物有效量的权利要求1的单克隆抗体1C1。

11.权利要求10的药物组合物，其是适于胃肠外的、口服、眼、局部、局部区域、灌肠或气溶胶施用的药物剂型。

12.权利要求10或11的药物组合物，其是可注射溶液或悬浮液、输液、片剂、胶囊、霜剂、软膏、洗剂或栓剂形式。

13.能够特异性结合权利要求1-3任一项的单克隆抗体1C1的独特型的抗独特型抗体。