CN105992594A

CN105992594A - 对会感染人类的肠病毒具有特异性的抗体

Info

Publication number: CN105992594A
Application number: CN201480068187.7A
Authority: CN
Inventors: 玛琍·J·卡杜莎
Original assignee: Mab Quest Pte Ltd
Current assignee: Mab Quest Pte Ltd
Priority date: 2013-12-16
Filing date: 2014-12-16
Publication date: 2016-10-05
Anticipated expiration: 2034-12-16
Also published as: SG11201604604SA; US20160333075A1; WO2015092668A1; US10822397B2; MY191739A; AU2014369191B2; CN111057146B; US10125187B2; TW201609802A; CN105992594B; EP3082862A4; US20190100574A1; EP3082862B1; AU2014369191A1; EP3082862A1; TWI700295B; CN111057146A

Abstract

本发明提供可特异性地结合至肠病毒71(EV71)的至少一种构象表位的抗体或其片段，其中该抗体个别地包含至少一种可变轻链与至少一种可变重链。还提供一种制造可特异性地结合至肠病毒71(EV71)的至少一种构象表位的抗体的方法。

Description

对会感染人类的肠病毒具有特异性的抗体

发明领域

本发明关于对会感染人类的肠病毒具有特异性的抗体、其制造方法、及其用于治疗人类肠病毒感染的用途、以及作为疫苗制程控制，以决定特异性与效力标准。

发明背景

小核糖核酸病毒(小核糖核酸病毒科)是一个多样的病毒科，会引起多种常见疾病。在小核糖核酸病毒科中，肠病毒属的病毒对数种疾病是重要的，每年会影响全世界数百万人。非特异性发热性疾病是肠病毒感染最常见的表现之一。由肠病毒感染引发的其他著名的疾病包括脊髓灰质炎、胸膜痛、心包炎、心肌炎、心律失常、心肌梗塞与急性出血性结膜炎。

肠病毒属的病毒通常在被感染者的呼吸道分泌物(如唾液，痰，或鼻粘液)和粪便中发现。从历史上看，脊髓灰质炎，由3种脊髓灰质炎病毒引起，是肠病毒引起的最重要疾病。然而，现在有将近一百种非脊髓灰质炎肠病毒可导致人类疾病；其中包括柯萨奇病毒A、柯萨奇病毒B、埃可病毒、和许多其他肠病毒。不包括鼻病毒，引起人类疾病的肠病毒最近被重新划分为4个不同种类。脊髓灰质炎病毒和肠病毒71(EV71)，像许多其他肠病毒，是经由粪-口途径传播。感染可导致多种症状，范围从温和的呼吸道疾病(一般感冒)、手足口病、急性出血性结膜炎、无菌性脑膜炎、心肌炎、严重新生儿败血症样疾病与急性弛缓性麻痹。

肠病毒感染是儿童无菌性脑膜炎的最常见原因。在美国，肠病毒引起30,000至50,000例脑膜炎。此外，2007年的一项研究提示，与肠病毒有关的急性呼吸道或胃肠道感染可能是慢性疲劳综合征的一个因素。

人类肠病毒71和柯萨奇病毒A16(CA16)，为肠病毒血清型种A，其因为是手足口病(HFMD)的主要病因而引起注意。该病毒会随着粪便被排出，且还见于咽分泌物和水泡。传播与儿童间的密切接触有关，并经由环境污染传播。本病特征为急发热，并且在手掌、脚掌、臀部和膝盖出现疹子，以及在颊膜出现水疱，其通常会在7-10天内结束。只有一小部分HFMD患病儿童发展为严重的疾病。

有些感染EV71的儿童会发展为脑炎，此为肠病毒感染的一种罕见表现。脑炎可导致永久性脑损伤，且可以致命。主要涉及神经系统和心血管系统表现为综合征的严重疾病，如脑膜炎、脑炎、脑干脑炎、急性弛缓性麻痹、肺水肿和心脏衰竭，一般仅发生于EV71感染。在亚太地区最具破坏性的神经系统综合征为脑干脑炎，其死亡率为40-80％。患有重症HFMD的儿童可能需要几个月的时间才能恢复，而且在某些情况下，神经损害可能是永久性的。目前尚无HFMD的特异性抗病毒治疗，且无疫苗可预防脊髓灰质炎以外的肠病毒感染。

EV71有时额外地与严重中枢神经系统疾病有关。其于1969年首度由在加州的神经系统疾病的案例分离出及被鉴定。至今，对于EV71感染的宿主反应的分子机制知之甚少，但已发现编码趋化因子、涉及蛋白质降解的蛋白质、补体蛋白、以及促凋亡蛋白的mRNA的水平会增加。

虽然之后该病毒已于全球检测到，但最近HFMD在亚洲的区域流行病中已升高警戒，EV71更具致病性的形式可能会出现于该地区。第一个造成大量死亡的HFMD爆发疫情是在1997年的马来西亚沙捞越出现。与该爆发疫情有关的病毒为EV71。台湾于1998年的流行期间，报导129,106件HFMD病例，其中405例为严重疾病，且78例死亡。新加坡在2000-2001年期间，报导9000件案例，其中有7例死亡，从那以后，每两到三年反复流行一次。在2008年的前8个月，新加坡报导19,530件病例，以及1人死于HFMD。之后，EV71疫情在新加坡、泰国、马来西亚、台湾、日本、韩国、越南、中国、澳大利亚和菲律宾定期有报导。

中国在2007年报导83,344件案例，其中有17例死亡，并在2008年的安徽省阜阳市经历了一次大爆发，且蔓延至中国许多地方。这些大爆发经由媒体广泛地报导，引发家长对于孩童健康的关注，且公共卫生部门试图通过关闭学校和日托中心打断传播链而引起了社会混乱。从那时起，中国每年都会有大爆发的报告。

针对来自EV71壳体蛋白的肽而产生的单克隆抗体通常没有或具有低中和活性。Zhang等人(2012)产生针对氨基酸残基94至97的单克隆抗体，其在Western印迹法、免疫荧光法与ELISA中具反应性，但无法中和EV71病毒。Kiener等人(2012)描述针对VP2壳体肽(氨基酸142-146)的单克隆抗体，其特异性地与EV71反应，但无法中和病毒。市售的单克隆抗体MAB979(Merck Millipore)，其对VP2肽(氨基酸141至150)具反应性(Liu等人，2011)，可在滴度为<1:14时中和原型EV71(BrCr)。位于VP1壳体内的肽SP55(氨基酸163-177)和也位于VP1内的肽SP70(氨基酸208-222)可产生单克隆抗体，其无法中和EV71，或仅在低滴度如1:4或最佳1:16时进行中和(Li等，2009)。Lim等人(2012)描述2种单克隆抗体，是针对位于SP70肽(Li等人，2009)内的一种肽产生的，其共享共同的表位KQEKD。其中一种单克隆抗体可中和EV71，而另一种则不能。作者提示中和作用取决于抗体的同种型，在这种情况下，具IgM同种型的抗体可以中和，而IgG抗体则无法。IgM具10个结合位点，而IgG只有2个，这提示该中和活性是取决于抗体的阻断作用。

由于上述抗体缺乏效力，因此需要提供更有效的具EV71特异性的单克隆抗体，以及制造可对抗EV71与其他小核糖核酸病毒的中和性抗体的方法。另外，EV71抗体为EV71疫苗发展中，制程控制与效力测定所需要的，且还可用于帮助定义EV71抗体效力标准。

发明概述

本发明寻求解决上述问题，并提供具肠病毒71(EV71)特异性的抗体。依照本发明的一个优选方面，提供至少一种经分离的抗体或其片段，其可特异性地结合至EV71的至少一种构象(非线性)表位。

在一个优选实施方案中，该抗体或其片段可包含至少一种可变轻链氨基酸序列，其包含SEQ ID NO:1、其变异体、突变体或片段，以及至少一种可变重链氨基酸序列，包含SEQ ID NO:2、其变异体、突变体或其片段。

在一个优选实施方案中，该抗体包含一种可变轻链，其包含具有与SEQ ID NO:1至少90％序列同一性的序列，以及一种可变重链，其包含具有与SEQ ID NO:2至少90％序列同一性的序列。

在一个优选实施方案中，该可变轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO:15、其变异体、突变体或片段。

依照另一个优选实施方案，该抗体包含至少一种可变轻链与至少一种可变重链，其中该可变轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO:3、其变异体、突变体或片段，以及该重链氨基酸序列包含SEQ ID NO:4与5的至少一者、其变异体、突变体或片段。

在一个优选实施方案中，该抗体包含一种可变轻链，其包含一种具有与SEQ IDNO:3至少90％序列同一性的序列，以及一种可变重链，其包含至少一种具有与SEQ ID NO:4或5至少90％序列同一性的序列。

在一个优选实施方案中，该可变轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO:16、17与18的至少一者、其变异体、突变体或片段，以及该重链氨基酸序列包含SEQ ID NO:19、20、21与22的至少一者、其变异体、突变体或片段。

依照又一个优选实施方案，该抗体包含至少一种可变轻链与至少一种可变重链，其中该可变轻链包含SEQ ID NO:6中所列氨基酸序列、其变异体、突变体或片段，以及该可变重链包含SEQ ID NO:7中所列氨基酸序列、其变异体、突变体或片段。

在一个优选实施方案中，该抗体包含一种可变轻链，其包含具有与SEQ ID NO:6至少90％序列同一性的序列，以及一种可变重链，其包含具有与SEQ ID NO:7至少90％序列同一性的序列。

在一个优选实施方案中，本发明的抗体或片段是中和性抗体或其片段。

在一个优选实施方案中，本发明的抗体或其片段是单克隆小鼠、人类、人源化或嵌合抗体。

依照本发明的另一个优选方面，提供一种制造具小核糖核酸病毒特异性的抗体的方法，该方法包含：

对至少一个非人类哺乳动物免疫接种至少一个未成熟小核糖核酸病毒颗粒，以形成至少一个具小核糖核酸病毒特异性的B细胞；

选择出至少一个具小核糖核酸病毒特异性的B细胞；

融合该选择出的B细胞与至少一个永生化细胞，以产生至少一个杂交瘤，其中该杂交瘤可制造具小核糖核酸病毒特异性的至少一种抗体或其片段；以及

任选地自该杂交瘤中分离出该抗体，并对可变重链与轻链测序。

依照本发明的另一个优选方面，提供一种经分离的核酸分子，其编码

(a)前述定义的抗体或片段的至少一种可变轻链，其中该可变轻链包含至少一种氨基酸序列，其选自由SEQ ID NO:3与16-18、其变异体、突变体或片段组成的群组；及/或

(b)前述定义的抗体或片段的至少一种可变重链，其中该可变重链包含至少一种氨基酸序列，其选自由SEQ ID NO:4、5与19-22、其变异体、突变体或片段组成的群组。

在一个优选实施方案中，该(a)的至少一种核酸序列具有与SEQ ID NO:10及/或24及/或25及/或26至少90％的序列同一性；及/或该(b)的至少一种核酸序列具有与SEQ IDNO:11及/或12及/或27及/或28及/或29及/或30至少90％的序列同一性。

更优选地，依照上述的经分离核酸分子包含：

(a)至少一种核酸序列，其选自由SEQ ID NO:10与24-26、其突变体、变异体或片段组成的群组；及/或

(b)至少一种核酸序列，其选自由SEQ ID NO:11、12与27-30、其突变体、变异体或片段组成的群组。

依照本发明的另一个实施方案，提供一种经分离的核酸分子，其编码

(a)该抗体或其片段的至少一种可变轻链，其中该可变轻链包含至少一种氨基酸序列，其选自由SEQ ID NO:1与15、其变异体、突变体或片段组成的群组；及/或

(b)该抗体或其片段的至少一种可变重链，其中该可变重链包含至少一种氨基酸序列，其为SEQ ID NO:2、其变异体、突变体或片段。

在该经分离的核酸分子的一个实施方案中，该(a)的至少一种核酸序列具有与SEQID NO:8及/或23至少90％的序列同一性；及/或该(b)的至少一种核酸序列具有与SEQ IDNO:9至少90％的序列同一性。

更优选地，该经分离的核酸分子包含：

(a)至少一种核酸序列，其为SEQ ID NO:8及/或23、其突变体、变异体或片段；及/或

(b)至少一种核酸序列，其为SEQ ID NO:9、其突变体、变异体或片段。

(a)该抗体或其片段的至少一种可变轻链，其中该可变轻链包含至少一种氨基酸序列，其为SEQ ID NO:6、其变异体、突变体或片段；及/或

(b)该抗体或其片段的至少一种可变重链，其中该可变重链包含至少一种氨基酸序列，其为SEQ ID NO:7、其变异体、突变体或片段。

在该经分离的核酸分子的一个实施方案中，该(a)的至少一种核酸序列具有与SEQID NO:13至少90％的序列同一性；及/或该(b)的至少一种核酸序列具有与SEQ ID NO:14至少90％的序列同一性。

更优选地，该经分离的核酸分子包含：

(a)至少一种核酸序列，其为SEQ ID NO:13、其突变体、变异体或片段；及/或

(b)至少一种核酸序列，其为SEQ ID NO:14、其突变体、变异体或片段。

依照本发明的另一个优选方面，提供EV71的至少一种构象表位，其中该构象表位可经依照本发明任一方面的至少一种抗体识别。

依照其他优选方面，本发明提供一种用于表征潜在肠病毒疫苗候选物上的至少一种构象中和表位的方法，以及用于纯化含有至少一种构象表位的潜在肠病毒疫苗候选物的方法。

此外，本发明的一个优选实施方案提供一种定义EV71与EV71疫苗的中和性抗体效力的方法。本发明的抗体还可用于EV71疫苗制程控制。

依照其他优选方面，本发明提供一种治疗EV71及/或至少一种EV71相关疾病的方法；作为药物使用的本发明的抗体或其片段；本发明的抗体或其片段用于制备药物的用途；包含本发明的抗体或其片段的试剂盒，核酸及其用途；包含本发明的至少一种经分离的核酸的表达载体；一种包含本发明的表达载体的宿主细胞，以及可由依照本发明的任一方面的至少一种抗体识别的构象表位。

如根据下列描述会清楚可知的，本发明的优选实施方案可允许该经分离的抗体的最佳用途，利用其对于EV71的至少一种表位具准确性与特异性。技术人员会由下列描述清楚得知此与其他相关优点。

附图简述

图1显示24孔板的影像，显示抗体E18(A)、E19(B)与E20(C)的噬斑减少中和测试(PRNT)的结果。

图2A为显示EV71被E18中和的图像。

图2B为显示EV71被E19中和的图像。

图3A为Western印迹法影像，显示E18与E19并未结合以使EV71病毒蛋白变性。R525为针对VP1的家兔多克隆抗体；M＝模拟感染细胞裂解物；V＝经EV71感染细胞裂解物。

图3B为结合曲线，显示E18与E19结合至重组与热灭活的EV71壳体蛋白上。

图4A与B为显示EV71与热灭活(HI)-EV71与(A)E18及(B)E19的结合。

图5A为点状图，显示经病毒样颗粒(VLP)免疫的小鼠，其血清中的抗体结合至EV71。DPBS为Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水。

图5B为条状图，显示E18结合至EV71的抑制，在经VLP免疫的小鼠的血清存在下。

图6A为考马斯(Coomassie)染色(“C”)凝胶的图像，显示抗体E18可有效地用于表征潜在EV71疫苗候选物。图6A还以Western印迹法呈现，EV71病毒样颗粒可使用抗体E18亲和柱纯化。此外，以E18与E19制备的亲和柱还可纯化感染性病毒体(图6A)。

图6B为抗体E18亲和柱捕捉到的EV71病毒样颗粒的图像。

图7包括两幅图，显示EV71经重组嵌合E18、E19与E20抗体中和。

图8显示亲本小鼠E18与嵌合E18抗体在使用Vero细胞的细胞培养物中的EV71中和活性。Y轴＝噬斑减少百分比；X轴＝抗体浓度的log10标度。植物与非植物制造的嵌合E18抗体具相似活性。

图9包括三幅图，显示EV71经重组人源化E19衍生抗体中和。

发明详述

为了方便起见，本案说明书中提及的参考文献书目以参考文献列表形式列出，并附于实施例结尾。这些参考文献在此通过援引完整并入本案。

定义

为了方便起见，在本案说明书、实施例与后附的权利要求书中使用的某些术语收录于此。

如本文中使用的，术语“抗体”指任何可结合至特定表位的免疫球蛋白或完整分子及其片段。此类抗体包括但不局限于，完整抗体的多克隆、单克隆、嵌合、人源化、单链、单链可变片段(scFv)、Fab、Fab’、F(ab)’片段及/或F(v)部分。术语“单克隆抗体”可称为“单抗”。该抗体包括抗体E18、E19与E20，分别由杂交瘤细胞系EV18/4、EV19/5、以及EV20/5制造。抗体E18、E19与E20可以是单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、及其维持亲本抗体的抗原结合功能的片段。抗体E18、E19与E20可特异性地结合至EV71，包括但不局限于构象表位，其包含EV71的至少一种壳体蛋白，并包括单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、及其维持亲本抗体的抗原结合功能的片段。

术语“抗体片段”如本文中使用的指该抗体的完全序列的不完整或分离部分，其维持亲本抗体的抗原结合功能。抗体片段的例子包括scFv、Fab、Fab'、F(ab')2与Fv片段；双抗体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子；以及自抗体片段形成的多特异性抗体。E18、E19与E20抗体的片段可包含于本发明中，只要它们维持全长抗体的的期望亲和力。尤其是，其可短少至少一个氨基酸。例如，单链抗体可具有包含SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2且在该二者间具有接头的构造。另一组合可以是SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:2于单链构造中。

术语“抗原”如本文中使用的指可促进抗体产生，并可导致免疫反应的物质。于本发明中，其可与术语“免疫原”交换使用。在严格意义上，免疫原为可引发免疫系统产生反应的物质，而抗原定义为结合至特定抗体的物质。抗原或其片段可以是与特定抗体接触的分子(即表位)。当蛋白质或蛋白质的片段用于给宿主动物免疫接种时，该蛋白质的数个区域可诱发抗体产生(即引发免疫反应)，其可特异性地结合至抗原(在该蛋白质上的给定区域或三维结构)。抗原的非限制性例子为EV71的VP0蛋白，以及未成熟小核糖核酸病毒颗粒。该抗原可包括但不局限于EV71的壳体蛋白及/或非结构性蛋白。尤其是，术语“表位”可指形成抗体结合位点的约5个至约13个氨基酸的连续序列。结合至抗体或结合蛋白的形式的表位可以是变性蛋白，其实质上缺乏三级结构。该表位可以是构象表位，其包含来自非连续序列的非连续要件(element)。该表位还可以是四级(quaternary)表位，其包含来自超过一种蛋白质或多肽的非连续要件，其组装为颗粒如VLP、病毒体或一些其他种类的组装物。

“构象表位”于此定义为抗原包含的，与抗体的可变轻链与重链直接接触的亚基的序列(通常为氨基酸)。当抗体与未经消化的抗原相互作用时，若该蛋白为展开的，则接触的表面氨基酸可以并非互相连续的。此在三维构象上聚在一起，并与该抗体的互补位相互作用的不连续氨基酸称为构象表位。相对的，若该抗原经消化，会形成称为肽的小区段，其与主要组织相容性复合体分子结合，之后经由连续排成一线的氨基酸与T细胞受体结合。这些已知为线性表位。

术语“包含”于此定义为各成分、组分、或步骤，可结合使用以实施本发明。因此，术语“包含”涵盖更具限制性的术语“基本上由……组成”以及“由……组成”。

术语“嵌合抗体”如本文中使用的，指至少一种抗体分子，其中恒定区中的氨基酸序列已被改变，使得抗体更接近人类抗体，并仍维持其原始结合能力。

术语“人源化抗体”如本文中使用的，指至少一种抗体分子，其中可变与恒定区内的氨基酸序列已被改变，使得抗体更接近人类抗体，并仍维持其原始结合能力。如本文中使用的，术语“杂交瘤”指已被改造以大量制造期望抗体的细胞。例如，欲制造至少一种杂交瘤，自经相关抗原刺激的动物的脾脏取出B细胞，与至少一种永生化细胞融合。此融合是以使细胞膜更具通透性而进行。该经融合的杂合细胞(称为杂交瘤)会快速且无限制地倍增，并可制造至少一种抗体。杂交瘤的例子为细胞系EV18/4、EV19/5与EV20/5。

“永生化细胞”如本文中使用的也称作转化细胞-即生长特性已被改变的细胞。此并不一定意味着“癌”或“肿瘤”细胞，即若引入至实验动物中，会形成肿瘤，尽管在某些情况下会。永生化细胞系包括但不局限于NS1、Jurkat、HeLa、HepG2、SP2/0、Hep-3b诸如此类。

术语抗体或相关结合蛋白的“免疫结合特性”，在其所有语法形式中，指抗体或结合蛋白对其抗原的特异性、亲和力与交叉反应性。

术语“经分离”于此定义为一种生物学成分(如核酸、肽或蛋白)，已实质上被分离、制造、或纯化离开该成分天然存在其中的生物体的细胞中的其他生物学成分，即其它染色体和染色体外DNA与RNA，与蛋白。已被分离的核酸、肽和蛋白因此包括经标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。此术语也包括通过在宿主细胞中重组表达所制备的核酸、肽和蛋白，以及化学合成的核酸。

术语“中和性抗体”于此定义为能够中和病原体启动及/或永久感染宿主的能力的抗体。本发明提供至少一种中和性人类单克隆抗体，其中该抗体可识别来自EV71的抗原。

术语“框架”于此定义为抗体中为功能提供结构支持，但不直接结合至表位的区域。

术语“突变体”于此定义为具有至少一个核苷酸序列与参考序列不同者，其系经由取代、删去或加入至少一个核酸而变化，但编码保留如同未突变序列所编码者识别与结合至EV71上同样的构象表位的能力的氨基酸序列。术语“突变体”也适用于与至少一种参考序列不同的氨基酸序列，其系经由取代、删去或加入至少一个氨基酸而变化，但保留如同未突变序列识别与结合至EV71上同样的构象表位的能力。尤其是，突变体可以是天然存在的，或可以经由重组或合成产生。更特别的是，突变体可具有与参考序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的序列同一性。例如，SEQ ID NO:15所示的E18可变轻链氨基酸序列短于SEQ ID NO:1所示的序列，并可视为SEQ ID NO:1的突变体，因为其保留识别与结合至EV71上同样的构象表位的能力。类似地，SEQ ID NO:16所示的人源化E19可变轻链氨基酸序列是通过用优选的人类框架取代SEQ ID NO:3所示的E19可变轻链氨基酸序列中的氨基酸而制备，并可视为SEQ ID NO:3的突变体。

术语“变异体”如本文中使用的，指一种氨基酸序列，其一或多个氨基酸经改变，但保留如同未变异的参考序列识别与结合至EV71上同样的构象表位的能力。该变异体可具有“保守性”改变，其中取代后的氨基酸具有相似的结构或化学特性(例如，亮氨酸用异亮氨酸置换)。更罕见的，变异体可以有“非保守性”改变(如甘氨酸用色氨酸置换)。类似次要变化还可包括氨基酸删去或插入，或两者皆有。决定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或删去，而不消除其生物学或免疫学活性的指引，可使用本领域中已知的计算机程序，如软件(DNASTAR,Inc.麦迪逊,威斯康辛,美国)找到。例如，SEQ ID NO:15所列的E18可变轻链氨基酸序列短于SEQ ID NO:1所列的序列，并可视为SEQ ID NO:1的变异体，因为其保留识别与结合至EV71上同样的构象表位的能力。类似地，SEQ ID NO:16所示的人源化E19可变轻链氨基酸序列通过用优选的人类框架取代SEQ ID NO:3所列的E19可变轻链氨基酸序列中的氨基酸而制备，并可视为SEQ ID NO:3的变异体。

术语“样品”如本文中使用的，以其最广义使用。怀疑含有编码至少一种EV71衍生肽或其片段的核酸，或EV71本身的生物样品可包含体液、来自细胞的萃取物、从细胞分离的染色体、细胞器或膜；细胞；基因组DNA、RNA或cDNA(在溶液中或结合于固体支持物上)、组织、组织印痕、诸如此类。

如本文中使用的，术语“特异性结合”或“特异性地结合”指一或多个蛋白或肽与激动剂、抗体、或者拮抗剂间的相互作用。尤其是，该结合介于抗原与抗体之间。该相互作用取决于一或多个蛋白中受到结合分子识别的特定结构(即抗原或表位)的存在。如前所述，抗原或表位可以由超过一种单一肽序列构成，它们来自相同蛋白或不同蛋白，在空间上聚到一起以形成构象抗原或表位。例如，若抗体具表位“A”特异性，则在含有游离经标记A与该抗体的反应中，含有表位A的多肽的存在或游离未经标记A的存在会降低结合至该抗体的经标记A的量。

术语“未成熟小核糖核酸病毒颗粒”指空的病毒颗粒，其缺乏基因组材料并包含壳体蛋白VP0、VP1与VP3。壳体蛋白V0为壳体蛋白V2与V4的前体。

术语“治疗”，如在本发明的上下文中使用的，指预防性、改善性、治疗性或治愈性治疗。

术语“受试者”于此定义为脊椎动物，特别是哺乳动物，更特别是人类。就研究目的而言，受试者可特别为至少一种动物模型，例如，小鼠、大鼠诸如此类。特别是，对于治疗EV-71感染及/或EV71相关疾病，受试者可以是受到EV71感染的人类。

本领域技术人员会理解到，本发明可在没有过度实验情况下，根据本文所给的方法来实施。方法、技术和化学品如给定参考文献中描述的或来自标准生物技术和分子生物学教科书中的流程。

依照一个优选方面，本发明提供经分离的单克隆抗体及相关的结合蛋白，其特异性地结合至EV71。依照本发明的任何方面的抗体可以是单克隆抗体(单抗)，其可以是自单一抗体制造细胞衍生的抗体的实质上同质群组。因此，该群组中的所有抗体可相同，而且可对给定表位具有相同的特异性。单抗反应的特异性为针对EV71感染及/或至少一种EV71相关疾病的有效治疗提供基础。单克隆抗体与自其衍生的结合蛋白还具有作为治疗试剂的效用。

依照本申请的任何方面的抗体提供至少一种抗EV71抗体，其可中和EV71感染，并抑制细胞对细胞传播。这些依照本申请的任何方面的抗体可作为用于治疗EV71与EV71相关疾病的预防剂及/或治疗剂使用。

依照本发明的一个优选实施方案，提供一种经分离的抗体或其片段，其可特异性地结合至肠病毒71(EV71)的至少一种构象表位。

尤其是，该经分离的抗体可选自由下列所组成的群组：

(a)由杂交瘤细胞系EV18/4制造的抗体；

(b)具有由杂交瘤细胞系EV18/4制造的抗体的结合特征的抗体；

(c)结合至可与由杂交瘤细胞系EV18/4制造的抗体结合的抗原的抗体；

(d)包含至少一种可变轻链与至少一种可变重链的抗体，其中该可变轻链包含SEQID NO:1、其变异体、突变体或片段，以及该可变重链包含SEQ ID NO:2、其变异体、突变体或片段。

该经分离的单克隆抗体或其片段可以是中和性单克隆抗体或其片段，其可特异性地结合至EV71的至少一种表位。该表位可以是线性表位或可以是构象表位。该构象表位可在完整的病毒壳体上。更特别的是，该表位可包含壳体蛋白VP1、VP2、VP3、VP4及/或VP0前体的一或多者。肠病毒属的所有成员，包括EV71、脊髓灰质炎病毒与柯萨奇病毒A16，皆具有单股正义RNA基因组，其具有单一可读框，编码一种多蛋白P1，其由壳体蛋白VP4、VP2、VP3与VP1与数种包括病毒蛋白酶3C与3CD的非结构性蛋白所组成，病毒蛋白酶3C与3CD负责切割该多蛋白P1成个别的壳体蛋白VP1、VP3与VP0。VP0为VP2与VP4的前体。壳体蛋白可组装成为病毒样颗粒(VLP)。

本申请的发明人显示了可中和EV71的抗体可使用未成熟EV71病毒颗粒作为抗原而产生。尤其是，该未成熟EV71病毒颗粒可以是空病毒颗粒，其并未含有基因组材料。更特别的是，该未成熟EV71病毒颗粒可包含壳体蛋白VP0。

如同所有的肠病毒，四种不同的壳体多肽已被鉴定出，并命名为VP1、VP2、VP3与VP4，其联合以形成二十面体病毒壳体。典型地，疫苗接种脊髓灰质炎病毒的个别的多肽已显示出该经分离的多肽或肽无法在人类或动物中生成有力的中和性抗体。本发明的经分离的单克隆抗体或其片段不仅可中和，还可诱发早期基因组释放，其为一种抗体中和病毒的新机制。此外，本申请提出的方法可用于制备具有针对相关病毒，包括重要人类病原体的类似性质的抗体。

依照本发明的一个优选实施方案的抗体可由杂交瘤细胞系EV18/4或标准重组方法制造，并可包含至少一种可变轻链(VL)，其包含如表1所示的SEQ ID NO:1，或其变异体、突变体或片段，及/或至少一种可变重链(VH)，其包含表1所示的SEQ ID NO:2，或其变异体、突变体或片段。尤其是，该经分离的抗体可包含至少一种可变轻链，其包含一种序列，具有与SEQ ID NO:1至少80％、至少90％或至少95％的序列同一性，及/或至少一种可变重链，其包含至少一种序列，具有与SEQ ID NO:2至少80％、至少90％或至少95％的序列同一性。

表1：由杂交瘤细胞系EV18/4、E19/5或E20/5制造的抗体的多肽序列

依照本发明的另一个优选实施方案，提供一种经分离的抗体或其片段，其可特异性地结合至肠病毒71(EV71)的至少一种表位，其中该抗体选自由下列所组成的群组：

(a)由杂交瘤细胞系EV19/5制造的抗体；

(b)具有由杂交瘤细胞系EV19/5制造的抗体的结合特征的抗体；

(c)结合至可与由杂交瘤细胞系EV19/5制造的抗体结合的抗原的抗体；

(d)包含至少一种可变轻链与至少一种可变重链的抗体，其中该可变轻链包含表1所列的SEQ ID NO:3、其变异体、突变体或片段，以及该可变重链包含表1所列的SEQ ID NO:4与5的至少一者、其变异体、突变体或片段。

尤其是，该经分离的抗体可包含一种可变轻链，其包含一种具有与SEQ ID NO:3至少80％、至少90％或至少95％的序列同一性的序列，及/或至少一种可变重链，其包含至少一种具有与SEQ ID NO:4或5至少80％、至少90％或至少95％的序列同一性的序列。

依照本发明的另一个优选实施方案，提供一种经分离的抗体或其片段，其可特异性地结合至肠病毒71(EV71)的至少一种构象表位，其中该抗体选自由下列所组成的群组：

(a)由杂交瘤细胞系EV20/5制造的抗体；

(b)具有由杂交瘤细胞系EV20/5制造的抗体的结合特征的抗体；

(c)结合至可与由杂交瘤细胞系EV20/5制造的抗体结合的抗原的抗体；

(d)包含至少一种可变轻链与至少一种可变重链的抗体，其中该可变轻链包含SEQID NO:6、其变异体、突变体或片段，以及该可变重链包含SEQ ID NO:7、其变异体、突变体或片段。

尤其是，该经分离的抗体可包含一种可变轻链，其包含一种具有与SEQ ID NO:6至少80％、至少90％或至少95％的序列同一性的序列，及/或至少一种可变重链，其包含一种具有与SEQ ID NO:7至少80％、至少90％或至少95％的序列同一性的序列。

抗体E18、E19与E20可阻断病毒在宿主中传播的机制。它们可有效地中和无细胞的病毒颗粒，并抑制病毒的细胞对细胞直接传播。

依照本发明的任何实施方案的抗体结合至EV71的至少一种构象表位。这是有利的，因为表位通常自然存在于三维构象，因此该等抗体可更足够且更有效地检测EV71的存在，及/或随后中和EV71的作用。该构象表位可包含至少一种壳体蛋白及/或至少一种非结构性蛋白。该壳体蛋白可以是完整病毒壳体蛋白。该壳体蛋白可包含一或多种蛋白，其选自由VP1、VP2、VP3、VP4与VP0前体组成的群组。依照本发明的任何方面的抗体可识别EV71病毒的完整谱。这些抗体可具高度特异性与敏感性。依照本发明的抗体提供数种优点，包括可作为针对HFMD的药物或疫苗使用。

尤其是，依照本发明的任何方面的抗体可大量获得，在杂交瘤上清液、腹水或重组细菌或植物及/或动物细胞中制备。凭借依照本发明的任何方面的任一杂交瘤细胞系，可获得单克隆抗体的恒定且可再生来源。这些抗体还可经由亲和层析法轻易地进行纯化，使用本领域中已知的任何方法。由依照本发明的任何方面的抗体识别的经定义表位还使抗体的病毒中和能力的机制研究可容易进行。

在一个实施方案中，依照本发明的任何方面的中和性抗体可于体内有效保护对抗EV71感染。这些抗体的效力与特异性如实施例中所示。

尤其是，依照本发明的任何方面的抗体可包含单克隆抗体E18、E19或E20的免疫结合特征。E18的免疫结合特征由杂交瘤EV18/4产生。E19的免疫结合特征由杂交瘤EV19/5产生。E20的免疫结合特征由杂交瘤EV20/5产生。这些杂交瘤提供本发明的抗体与结合蛋白的连续来源。这些序列也提供一种重组再创造每一种抗体的方法。

依照本发明的另一个方面，提供一种制造具小核糖核酸病毒特异性的抗体的方法，该方法包含对至少一个非人类哺乳动物免疫接种至少一个未成熟小核糖核酸病毒颗粒，以形成至少一个具小核糖核酸病毒特异性的B细胞，并选择出至少一个具小核糖核酸病毒特异性的B细胞。尤其是，该非人类动物可以是小鼠。更特别的是，该非人类哺乳动物可以是Balb/c小鼠。

尤其是，未成熟小核糖核酸病毒颗粒可以是空的小核糖核酸病毒颗粒，其并未含有基因组材料。未成熟小核糖核酸病毒颗粒可含有壳体蛋白VP1、VP3、VP0、及/或VP2与VP4。更特别的是，未成熟小核糖核酸病毒颗粒可含有壳体蛋白VP2及/或VP4或VP0，它是壳体蛋白V2与V4的前体。空的颗粒推测为成熟感染性病毒体的前体。

抗体可通过融合来自非人类哺乳动物脾脏的免疫B细胞及永生化细胞系以产生杂交瘤细胞系而制备。该杂交瘤细胞系可分泌单一种类的单克隆抗体，其具有针对小核糖核酸病毒的准确特异性，且通常具有高亲和力。尤其是，该永生化细胞系可以是“癌”或“肿瘤”细胞。更特别的是，该永生化细胞系可包括但不局限于NS1、Jurkat、HeLa、HepG2、SP2/0、Hep-3b诸如此类。该抗体可分离自杂交瘤，且可对可变重链与轻链测序。

小核糖核酸病毒科包含下列各属：口蹄疫病毒(Aphthovirus)、水栖哺乳动物病毒(Aquamavirus)、禽肝炎病毒(Avihepatovirus)、心病毒(Cardiovirus)、寇沙病毒(Cosavirus)、地西皮病毒(Dicipivirus)、肠病毒(Enterovirus)、马鼻炎病毒(Erbovirus)、肝病毒(Hepatovirus)、嵴病毒(Kobuvirus)、美格瑞病毒(Megrivirus)、腹肠孤病毒(Parechovirus)、萨力病毒(Salivirus)、萨佩洛病毒(Sapelovirus)、塞尼卡病毒(Senecavirus)、铁士古病毒(Teschovirus)、以及震颤病毒(Tremovirus)。尤其是，该小核糖核酸病毒可来自肠病毒属。更特别的是，该小核糖核酸病毒可以是肠病毒71(EV71)。

肠病毒代表一个庞大与多样的小型RNA病毒属，其特征在于单股正基因组RNA。所有肠病毒包含一个大约7500个碱基的基因组，已知具有高突变率，原因在于低保真度复制和频繁重组。感染宿主细胞后，基因组会以不需加帽(cap)方式翻译为单一多蛋白，其随后由病毒编码的蛋白酶加工成结构性壳体蛋白与非结构性蛋白，其主要涉及病毒的复制。

血清学研究已区别出约一百种人类肠病毒血清型，以抗体中和测试与基因组信息为基础。另外的抗原变异体已于数种血清型中定义出，以各变异株之间的降低或不可逆交叉中和为基础。以其在人类和动物中的发病机制的基础上，肠病毒最初分为四个群，脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒A(CA)、柯萨奇病毒B(CB)，以及艾柯病毒(echovirus)。然而，很快了解到导致人类疾病的病毒在生物特性上有显著重迭，且它们现在已被重新分类为4个遗传簇，不包括鼻病毒。表2显示了由肠病毒属涵盖的种类和血清型。

表2：肠病毒的种类和血清型

本发明的抗体可通过培养连续细胞系生产抗体分子的任何技术来生产。此种方法包括，但不限于，最初由Kohler和Milstein于1975年开发的杂交瘤技术，以及三体瘤技术、人类B细胞杂交瘤技术、以及EBV-杂交瘤技术，以生产人类单克隆抗体(Cole等人，1985)。可以使用人类抗体，并且可以使用人类杂交瘤获得(Cote等人，1983)。此外，一旦抗体序列已知，便可使用此领域公知的标准重组技术实现生产。

依照本发明的一个方面，提供一种经分离的核酸分子，其编码依照本发明的任何方面的抗体的至少一种可变轻链、或其变异体、突变体或片段，及依照本发明的任何方面的抗体的至少一种可变重链、或其变异体、突变体或片段。尤其是，该经分离的核酸分子可编码SEQ ID NO:1、3与6的至少一者、其变异体、突变体或片段，以及SEQ ID NO:2、4、5与7的至少一者、其变异体、突变体或片段。更特别的是，该经分离的核酸分子可包含SEQ ID NO:8、10与13的至少一者、其变异体、突变体或片段，以及SEQ ID NO:9、11、12与14的至少一者、其变异体、突变体或片段，如表3所列。

表3：编码抗体EV18、19与20的可变轻链或可变重链的核酸序列

尤其是，该经分离的核酸分子可包含至少一种核酸序列，其具有与SEQ ID NO:8、10或13至少80％、至少90％或至少95％的序列同一性，及/或至少一种核酸序列，其具有与SEQ ID NO:9、11、12或14至少80％、至少90％或至少95％的序列同一性，如表3所列。

依照本发明的经分离的核酸分子可克隆至表达载体上，其继而可转化至宿主细胞中以制造依照本发明的任何方面的抗体。尤其是，该宿主细胞可以是293细胞、CHO细胞或重组植物细胞。

可使用发展用于制造“嵌合抗体”的技术(Morrison等人，1984，在此通过援引完整并入本案)，通过剪接来自具适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因，连同来自具适当生物活性的人类抗体分子的基因。例如，来自小鼠抗体分子如E18、E19与E20的基因连同来自具适当生物活性的人类抗体分子的基因可被剪接。嵌合抗体是一种分子，其中不同部分自不同动物物种衍生，如具自鼠类抗体衍生的可变区与人类免疫球蛋白的恒定区者。嵌合抗体还可以是含有人类Fc部分与鼠类(或其他非人类)Fv部分者。

已发展出制造人源化抗体的技术(如US 5,585,089及/或US 5,225,539，在此通过援引完整并入本案)。免疫球蛋白轻链或重链可变区域由“框架”区及其中介入的三个称为互补决定区(CDR)的高变区组成。简言之，人源化抗体是来自如下的非人类物种的抗体分子，其具一或多个来自非人类物种的CDR，以及来自人类免疫球蛋白分子的框架区。嵌合与人源化抗体二者皆可以是单克隆。此人类或人源化嵌合抗体优选可用于人类疾病或病症的体内诊断或治疗。

产生重组嵌合E18(VL+VH；SEQ ID NO:1与2)、重组嵌合E19(VL+VH&VL+VH2；SEQ IDNO:3、4与5)，与重组嵌合E20(VL+VH；SEQ ID NO:6与7)抗体。就E18而言，第二重组嵌合抗体通过改变表4所列的E18VL(SEQ ID NO:1)与新的VL序列(SEQ ID NO:15,VL2)而达成。此外，产生七种重组人源化E19VL与VH序列，自E19VL与VH2(SEQ ID NO:3与5)衍生。该七种新颖的重组人源化E19VL与VH氨基酸序列显示于表4中，为hVL或hVH链(分别为SEQ ID NO:16、17、18、19、20、21与22；hVL1、hVL2、hVL3、hVH1、hVH2、hVH3、hVH4)。

表4：编码另外的嵌合与人源化重组E18与E19抗体的可变轻链或可变重链的多肽序列

依照本发明的另一个优选方面，提供一种经分离的核酸分子，其编码依照本发明的任何方面的抗体的至少一种可变轻链、或其变异体、突变体或片段，以及依照本发明的任何方面的抗体的至少一种可变重链、或其变异体、突变体或片段。尤其是，该经分离的核酸分子可编码SEQ ID NO:15、16、17与18的至少一者、其变异体、突变体或片段，以及SEQ IDNO:19、20、21与22的至少一者、其变异体、突变体或片段。编码嵌合与人源化重组E18与E19抗体的各可变轻链或可变重链的核酸序列列于表5。

表5：编码嵌合与人源化重组E18与E19抗体的可变轻链或可变重链的核酸序列

尤其是，该经分离的核酸分子可包含至少一种序列，其具有与SEQ ID NO:23、24、25或26至少80％、至少90％或至少95％的序列同一性，以及至少一种序列，其具有与SEQ IDNO:27、28、29或30至少80％、至少90％或至少95％的序列同一性，如表5所列。

依照本发明的一个优选方面的经分离核酸分子可克隆至表达载体上，其继而可转化至宿主细胞中以制造依照本发明的任何方面的抗体。尤其是，该宿主细胞可以是293细胞、CHO细胞或重组植物细胞。该重组嵌合与人源化E18、E19与E20抗体提供本发明的抗体与结合蛋白的另外的极稳定的连续来源。

含有该抗体分子的独特型的抗体片段可通过已知技术产生。例如，其可由胃蛋白酶消化该抗体分子而制备；Fab片段可通过还原F(ab)2片段的双硫桥而产生，而Fab片段可通过以木瓜蛋白酶与还原剂处理该抗体分子而制备。此类抗体片段可由本发明的任何抗体而产生。

在制造抗体时，筛选期望的抗体可通过此领域已知的技术达成。例如，这些技术可包括但不局限于放射免疫测定法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、“三明治式”免疫测定法、免疫放射计量测定法、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、原位免疫测定法(使用胶体金、酶、放射性同位素标记物诸如此类)、Western印迹法、沉淀反应、凝集测定法(凝胶凝集测定法、血凝测定法诸如此类)、免疫荧光测定法、免疫电泳测定法、诸如此类。例如，抗体结合可通过检测一抗上的标记物来检测。又例如，一抗可通过检测二抗或其它试剂对一抗的结合来检测。二抗可经标记。

依照本发明的其他优选方面，提供一种用于表征潜在肠病毒疫苗候选物上的至少一种中和性构象表位的方法，以及纯化含有至少一种构象表位的潜在肠病毒疫苗候选物的方法。此外，本发明提供一种定义针对EV71的中和性抗体效力的方法。

依照本发明的一个方面，提供一种依照本发明的任何方面的经分离的抗体或其片段，其在医药中的用途。尤其是，该用途涉及治疗EV71感染及/或至少一种EV71相关疾病。

依照另一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含依照本发明的任何方面的经分离的抗体或其片段。

又依照本发明的另一个方面，提供至少一种治疗EV71感染及/或至少一种EV71相关疾病的方法，该方法包含对受试者施用依照本发明的任何方面的经分离的抗体。在一个优选实施方案中，本发明的抗体的组合或混合物可施用于受试者。例如，该组合或混合物可包含前述的人源化或嵌合E19，以及至少一种另外的选自前述的人源化或嵌合E18或人源化或嵌合E20的抗体。优选地，该组合或混合物包含前述的人源化E19与人源化或嵌合E18。尤其是，该EV71相关疾病可选自由无菌性脑膜炎、脑炎、颅神经麻痹、格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrom)、脑干脑炎、脊髓灰质炎样综合征、疱疹性咽峡炎、以及手足口病组成的群组。

又依照本发明的另一个方面，提供依照本发明的任何方面的至少一种抗体用于制造治疗EV71感染及/或至少一种EV71相关疾病的药物的用途。在一个优选实施方案中，该药物可包含前述的人源化或嵌合E19，以及至少一种另外的选自前述的人源化或嵌合E18或人源化或嵌合E20的抗体。优选地，该药物包含前述的人源化E19与人源化或嵌合E18。尤其是，该EV71相关疾病可选自由无菌性脑膜炎、脑炎、颅神经麻痹、格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrom)、脊髓灰质炎样综合征、脑干脑炎、疱疹性咽峡炎、以及手足口病组成的群组。

现在已经一般性地描述了本发明，可更容易地经由参考下列实施例而理解本发明，实施例仅用于示范，而非限制本发明。

本领域技术人员会理解到，本发明可在没有过度实验下，依照本文所提供的方法来实施。方法，技术和化学品如给定参考文献中所述，或来自标准生物技术和分子生物学教科书的流程。

实施例

本领域已知的且并未具体描述的标准分子生物学技术一般遵循Sambrook andRussel,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory,New York(2001)所述。

实施例1：制造针对EV71的杂交瘤细胞系

给10只8周大Balb/c小鼠免疫接种经SUMO融合蛋白切除的重组EV71-VP0蛋白。第一次免疫是以弗氏完全佐剂(圣克鲁斯，加州，美国)完成，并进行皮下注射(SC)。第二次、第三次及融合前加强剂量均使用弗氏不完全佐剂(圣克鲁斯，加州，美国)，并进行2-3周间隔的腹膜内注射(IP)。

融合前致敏(priming)注射后三天，小鼠脾脏准备用于细胞融合(附录B：脾-骨髓瘤细胞融合的流程)。在细胞融合前，配偶SP2/0骨髓瘤细胞系扩展至每个脾脏一个T75烧瓶。在细胞融合当天，将小鼠由心脏放血以收集血清，脾脏以无菌方式收集。脾细胞和SP2/0细胞二者经清洗，并以一个小鼠脾脏对一个T75烧瓶的SP2/0细胞的比例混合。依照免疫原将小鼠脾脏分为四个细胞融合组，并加入适当数目的SP2/0细胞。细胞融合经由缓慢加入聚乙二醇(PEG1500)(Sigma公司，密苏里州，美国)至细胞混合物中而进行，将所得细胞团粒进行清洗，然后分配入四个24孔组织培养板每个脾脏(主板)。培养过夜后，10％RPMI 2XHAT培养基(次黄嘌呤、氨基喋呤与胸腺嘧啶)加入至孔中，板温育数天，之后进行10％RPMI 1XHAT的后续补料。

融合后1周至10天，由主板中挑出可见的杂交瘤克隆，放入24孔挑克隆板。当这些挑出的克隆为40-70％汇合度时，细胞上清液以酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行筛选，以包被有EV71VLP裂解液(抗原)与Sf9裂解液(对照)的板筛选。第二次筛选是以包被有重组EV71病毒蛋白(rVP0、rVP1、rVP2、rVP3、rVP4)综合液的板进行ELISA。任何给出阳性读数(SN07>0.1OD，SF9<0.1)的样品于T25烧瓶中倍增并冷冻保存。任何潜在阳性克隆之后进行小鼠免疫球蛋白捕获ELISA(MICE)，以确保该克隆有分泌抗体。自样品中收集抗体产生细胞上清液，并用于测试对EV71病毒的中和作用。

之后选择出最强阳性的杂交瘤，以有限稀释法再克隆，以获得单克隆在96孔板的孔中(附录E：再克隆单克隆抗体细胞系的流程)。再克隆是必需的，因为原始培养物可能起源于超过一个杂交瘤细胞。经由再克隆，来自此抗体阳性培养物的单细胞现在可被分离出并传代培养。该再克隆细胞首先进行MICE筛选，以筛选出分泌高滴度抗体的细胞(以OD测量确定)。具有高OD读数的4-8个单克隆扩展到24孔板的孔中，并经由间接ELISA测试特异性反应性，使用包被有EV71VLP裂解物/滞留物的板。具有强特异性反应性的克隆扩展到T25烧瓶中，并冷冻保存。选出一个良好克隆进行另一轮的再克隆。经过两轮再克隆，最终克隆经扩充，以收集细胞上清液，直接使用作为试剂或用于纯化单克隆抗体。最终克隆还经由预包被有不同的抗小鼠Ig类型(抗IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM、κ和λ轻链)的ELISA板进行同种型测定(附录C-III：Pierce快速ELISA小鼠单克隆同种型测定试剂盒的流程)。此外，RNA自每一个杂交瘤分离出，并用于产生cDNA，以进行每一种可变轻链与可变重链测序。

制备单克隆抗体的Fab片段

抗体的Fab片段是使用Pierce Fab制备试剂盒，依照制造商的说明书(http://www.piercenet.com/product/fab-preparation-kits)而制备。动物护理与使用是依照2006年动物法中马来西亚的国家动物福利标准和指南而进行。

免疫印迹分析

等体积的模拟和EV71感染的细胞裂解物于12％SDS-PAGE上分离，转移至硝酸纤维素膜，并使用R525(针对EV71VP1的多克隆抗体)、E18或E19探查。以缀合有辣根过氧化物酶的二抗(Dako，丹麦)，随后以TMB膜过氧化物酶底物(KPL，马里兰州，美国)检测结合抗体。

ELISA分析

间接ELISA于包被有重组病毒蛋白或热灭活EV71感染RD细胞裂解物作为阳性对照的Nunc免疫板进行。非特异性结合使用5％脱脂乳阻断，抗体以各种浓度双份加入，结合的抗体使用缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的抗小鼠IgG(Dako)检测。加入SureBlue ReserveTMB微孔过氧化物酶底物(KPL)5分钟，加入0.5M HCl以停止酶反应，且各孔于450nm读取。

进行三明治式ELISA，其中各孔包被有针对VP1的R525抗体，以及允许PEG沉淀的未处理或在56℃进行热灭活30分钟的EV71结合至VP1抗体。结合的颗粒以单克隆抗体E18或E19检测，之后以上述HRP IgG(Dako)检测。

进行竞争性ELISA，以检查小鼠血清中是否存在含E18表位的抗体。汇集由4只经高PRNT50滴度的VLP免疫接种的小鼠采集的血清，以及汇集由4只经PBS免疫接种的小鼠采集的血清，以进行竞争性ELISA测定法。各孔以R525包被，之后以相等蛋白质浓度的模拟与EV71感染的RD细胞裂解物包被。加入由小鼠汇集的血清(在1/250稀释度)至各孔中，之后随即加入HRP缀合的E18。加入Reserve TMB微孔过氧化物酶底物(KPL)5分钟，加入0.5M HCl以停止酶反应，且各孔于450nm读取。调整后的OD值由OD(EV71感染RD细胞)减去OD(模拟RD细胞裂解物)获得。E18结合的相对百分比是以样品调整后的OD除以仅含HRP-E18的孔调整后的OD，再乘以100而得。

噬斑减少中和试验

不同浓度的抗体、Fab片段或热灭活小鼠血清与EV71感染株MY104(300PFU/毫升)以1:1体积比在37℃温育1小时。该病毒-抗体(或Fab)混合物双份地接种于24孔板(Nunc，热费舍尔，美国)中的Vero细胞单层上。单层以每孔0.5毫升Vero细胞在补充有5％FBS和抗生素的DMEM(均来自Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)中3×105每毫升制备，且在接种前附着过夜。在以200μl抗体(或Fab)-病毒混合物接种之前吸出培养液，并于CO₂培养箱中，于37℃温育2小时，之后加入1毫升含有DMEM的覆盖液，DMEM补充有2％FBS，抗生素和1.5％羧甲基纤维素(CMC)。板于37℃以5％CO₂温育4天，并以萘黑色染色。噬斑以人工计数。抑制百分比以相对于对照的各孔中的噬斑平均数目而决定，其中对照的病毒仅与培养基共同温育。

病毒制造与纯化

EV71病毒体如前述(4)所制造与纯化。

VLP制造与纯化

简言之，EV71空的未成熟壳体使用杆状病毒表达系统制造，其中EV71的完整P1编码序列与蛋白酶3CD重组插入多角体蛋白启动子下游，且该重组杆状病毒用于以moi为0.1感染Sf9细胞。于第4天收获的上清液经澄清，并使用切向流过滤浓缩(GE HealthcareLifesciences)，滞留物通过将E18偶联至HiTrap NHS活化的HP柱(GE HealthcareLifesciences)制备的亲和柱。结合的颗粒使用甘氨酸缓冲液在pH 3.0洗脱出，并立即以1MTris-HCl中和至pH 7.2。颗粒转移到Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)缓冲液(Invitrogen)中。

以下拉(pull-down)测定法表征EV71VLP

20ml得自以表达EV71VLP的重组杆状病毒感染的细胞的上清液与10ml中和性单克隆抗体E18混合，并置于室温1小时。该混合物缓慢地加载通过MabSelect SuRe^TM(GEHealthcare)重组蛋白A的1ml柱，琼脂糖小珠尺寸85um，其用PBS预平衡，之后以20ml PBS清洗，之后以0.5ml的0.1M且pH为3.0的甘氨酸-HCl洗脱。级分以30μl的pH为8.8的Tris-HCl中和。洗脱出的级分于SDS-PAGE上运行，之后以考马斯蓝(Coomassie blue)染色与脱色。

经亲和柱(AFC)纯化的EV71VLP的分析

亲和柱(AFC)以中和性单克隆抗体E18制备。洗脱出的级分经Western印迹法分析。洗脱出的级分使用抗VP1抗体、抗VP2抗体或抗VP0单克隆抗体探查。经E18纯化的VLP使用电子显微术(EM)分析。

小鼠免疫接种

对小鼠(n＝每组10只)以两剂DPBS或10μg的VLP，在Inject Alum(ThermoScientific)存在下隔3周进行免疫接种。血清通过在56℃温育30分钟而失活，并储存于-20℃，以进行进一步分析。

于植物细胞中表达重组嵌合E18与人源化E19单克隆抗体

VL与VH DNA序列(SEQ ID NO:23、9、25与30)经密码子优化，以于本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中表达，并基因融合至人类IgG骨架上，其也经密码子优化，以于本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中表达。嵌合E18与完全人源化E19抗体构建物之后转移至农杆菌中，并用于渗入野生型本氏烟草以产生重组植物。重组嵌合E18或完全人源化E19抗体由植物材料中收获，并使用基于蛋白的柱层析法纯化。本文中使用的所有方法皆与先前用于人类治疗性抗体的方法相同(Qiu et al.,2014)。

结果

抗体E18、E19与E20通过对小鼠免疫接种含VP0的空的未成熟EV71颗粒而制备。来自噬斑减少中和测试的结果指示所有三种抗体，E18、E19与E20，皆可中和EV71(图1A-C)。表6中提供每一种抗体的PRNT₅₀值，其指示相较于无杂交瘤的病毒，减少50％噬斑数目所需的杂交瘤培养液的浓度。

表6：E18、E19与E20的PRNT50值

此外，E18与E19二者皆可以作为完整抗体或Fab片段中和病毒(图2)。在图2中，单克隆抗体E18(小图a)与E19(小图a)的完整IgG与Fab片段于不同浓度(X轴)使用噬斑减少中和测试用于抑制EV71。圆形代表完整抗体，方块代表Fab片段。对病毒的抑制以相对于对照孔噬斑的噬斑百分比表示。

来自间接ELISA的结果还指示E18与E19单抗二者可识别热灭活EV71颗粒表面上的构象表位(图3)。在图3A中，模拟(M)与EV71感染(V)细胞裂解物经SDS-PAGE分离并转移至膜上。膜以R525、E18或E19探查。E18与E19并未结合至变性的病毒蛋白。参照图3B，间接ELISA于包被有重组病毒蛋白或热灭活EV71感染细胞裂解物的各孔进行。各浓度的单抗以双份加入。单抗以辣根过氧化物酶(HRP)测定法检测。结合的单抗量以平均OD450±标准偏差表示。ELISA测试进一步显示E18与热灭活EV71A颗粒的结合比成熟病毒体要好(图4)。

于此显示可中和EV71的抗体可通过以含VP0的未成熟小核糖核酸病毒颗粒免疫接种而产生。此策略的一个例子，空的未成熟病毒样颗粒(VLP)于E18亲和柱纯化，并用于对小鼠免疫接种。分析所得血清以测定中和性抗体滴度(图5)。相较于对照小鼠(几何平均滴度＝55)，以VLP免疫接种的小鼠展现较高的针对EV71的中和性抗体滴度(几何平均滴度＝153)。由VLP免疫接种小鼠汇集的血清可抑制60％的E18结合，指示来自这些小鼠的血清含有可识别E18表位的抗体(图5)。因此，选择出的具有E18表位的VLP可诱发小鼠中的中和性抗体。因此，其他小核糖核酸病毒也可使用此述的方法获得治疗性抗体。

此外，由于E18可纯化维持构象表位的免疫原性EV71VLP，因此具有作为EV71疫苗发展制程控制试剂的效应。此制程的一个例子示于图6。于此，EV71VLP可结合至E18。如图6A所示，当以SDS PAGE分析，并以考马斯蓝染色(标记为C)时，沉淀的VLP含有所有VLP各成分(VP0、VP1与VP3)。之后EV71VLP的纯化使用E18亲和柱进行，洗脱出的级分使用Western印迹法分析。如图6A所示，经纯化的VLP中明显存在VP1与VP0(接下来的2条道，标记为EV71VLP)。重要的是，以E18与E19二者制备的亲和柱用于纯化来自原始EV71感染培养物的感染性病毒体，我们可显示VP1与VP0的存在，如图6A所示(最后4条道，标记为EV71病毒)。最后，经E18、E19与E20纯化的VLP使用电子显微术(EM)分析。在一个代表例中，与EV71病毒体大小大致相同的VLP示于图6B。此说明抗体E18、E19与E20可识别高度原始组装的EV71VLP，以及原始感染性EV71病毒体。任何EV71疫苗候选物可以类似表征，以决定是否所有成分皆存在、高度原始构象表位存在、及/或类似EV71病毒体的结构是否是明显的。此外，由于E18、E19与E20为高度中和性抗体(图2，表6)，因此这三种抗体可使用作为标准品，以决定各接受候选EV71疫苗的个体中的相对中和滴度，提供评估EV71疫苗诱发抗体反应的一致标准。

重要的是，E18、E19与E20的高中和活性还表明这些抗体可发展为有效的治疗性抗体以治疗人类疾病。如上所述，这两种抗体原先由小鼠杂交瘤中纯化。作为E18、E19与E20发展为用于人类治疗剂的第一步，生产重组嵌合E18、E19与E20抗体。具体而言，将E18、E19与E20的可变重链与轻链(SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6与7)克隆至人类IgG骨架上，以产生重组小鼠-人类嵌合单克隆抗体。测试嵌合抗体的体外中和EV71的能力，如图7所示，四种重组嵌合抗体中的三种可中和病毒。包含E19VL+VH(SEQ ID NO：3和4)的E19嵌合抗体不具活性。值得注意的是，嵌合E20也显示弱中和，仅在一种细胞系(ATCC)中具有限的活性。嵌合E18显示明显的中和活性；然而，在两种细胞系(NIBSC和ATCC)中，嵌合E18活性略小于亲本小鼠抗体(EV18/4/D6-1)。对于含有VL+VH2(SEQ ID NO：3和5)的嵌合E19，在两种细胞系中，其中和活性大于或等于亲本小鼠抗体(EV19/5/C1-6)。为每一抗体推算抑制50％EV71生长需要的重组嵌合抗体浓度，抑制浓度50(IC50)，结果显示于表7。

表7：重组嵌合E18、E19与E20抗体中和概况

含有E19VL+VH(SEQ ID NO:4)的嵌合E19抗体于任何测试的浓度皆无法中和EV71，且嵌合E20具最少的中和活性，如最高的IC50证明的。重组嵌合E18于NIBSC细胞中比亲本小鼠抗体具明显较高的IC50(约5倍差异)，并于ATCC细胞中有明显降低的中和作用，其中嵌合E18的IC50高出亲本抗体约2倍。含有VL+VH2(SEQ ID NO:3与5)的重组嵌合E19具有最佳活性，反映于在两种细胞系中皆具有低IC50。

由于嵌合E18的中和活性低于亲本小鼠抗体，因此通过缩短VL序列生成第二种重组嵌合E18。新的E18衍生VL序列，即VL2，提供于表4(SEQ ID NO:15)。新的重组嵌合E18抗体的表达于植物细胞中完成。亲本小鼠E18与两种嵌合E18抗体于细胞培养物中使用Vero细胞测试它们中和EV71的能力(图8)。抗体(Ab)经稀释，并测试多种浓度，如x轴所示。测定每一种抗体浓度的病毒噬斑减少百分比(y轴)。亲本小鼠E18展现于最低浓度有最佳的中和活性。两种嵌合E18抗体以类似的程度中和EV71，如几乎重迭的曲线所示。

由于重组嵌合E19是最有希望的重组中和性抗体，因此于VL与VH2(SEQ ID NO:3与5)的可变框架区内进行进一步的基因操作，以产生重组完全人源化E19单克隆抗体。VL的三种版本与VH2的三种版本一开始由模拟人类抗体框架，并引入特定氨基酸取代至小鼠E19VL与VH2框架区而创造出。六种新的完全人源化E19VL与VH2衍生序列提供于表4中(SEQ IDNO:16、17、18、19、20与21)，并标记为hVL1、hVL2、hVL3、hVH1、hVH2与hVH3，以区分它们与亲本小鼠VL与VH2序列(SEQ ID NO:3与5)。E19衍生的hVL与hVH的九种不同组合表达为完整人类IgG抗体，且测试每一种的EV71中和活性。如图9所示，所有九种重组完全人源化E19单克隆抗体皆可中和EV71。

表8：重组人源化E19抗体中和概况

此外，当推算每一种抗体的IC50时，具最佳中和概况的三种重组完全人类抗体为hVL2+hVH2、hVL3+hVH3与hVL3+hVH2(SEQ ID NO:17、18、20与21)。重要的是，三种最佳的重组完全人类E19抗体的IC50类似于所观察到的嵌合E19VL+VH2抗体的IC50(表7与8)，并优于亲本小鼠E19抗体(表7)。由于hVL2+hVH2一贯呈现最低的IC50，因此其代表治疗性抗体的最佳候选物，因其为完全人源化并高度中和。有趣的是，进一步检验hVH2序列发现框架3区缺乏存在于许多人类VH框架3区中的一个精氨酸残基。为了进一步优化hVL2+hVH2E19抗体的治疗潜力，产生自hVH2衍生但包括额外的于正确位置上的精氨酸残基的第七种序列。此新的序列提供于表4(SEQ ID NO:22)，并标记为hVH4。已完成新的hVL2+hVH4E19抗体的表达，且正在评估抗体的功能。

为了降低治疗性抗体的制造成本，重组抗体的表达于本氏烟草(Nicotianabenthamiana)植物细胞中进行中试(pilot)。具体地，嵌合VL2+VH E18抗体(SEQ ID NO:15与2)与重组完全人源化hVL2+hVH4E19抗体(SEQ ID NO:17与22)被选择用于中试植物细胞表达。植物的转化与表达如方法中所述进行，且目前每一种重组抗体已纯化出超过300毫克。已完成第二种E18嵌合(图8)的评估中和活性的功能测定法，且正在进行人源化E19的评估。基于第二种嵌合E18的结果，植物细胞代表本申请中为重组抗体提供的可行制造平台。

参考文献

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11.Zhang,J.,M.Dong,et al.,(2012)."Antigenic characteristics of thecomplete and truncated capsid protein VP1 of enterovirus 71."Virusresearch167(2):337-342.

Claims

1.一种经分离的抗体或其片段，可特异性地结合至肠病毒71(EV71)的至少一种构象(非线性)表位，其中该抗体包含至少一种可变轻链与至少一种可变重链，其中该可变轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO:3、其变异体、突变体或片段，以及该可变重链氨基酸序列包含SEQ ID NO:4与5的至少一者、其变异体、突变体或片段。

2.依照权利要求1的经分离的抗体或其片段，其中该抗体包含一种可变轻链，其包含一种具有与SEQ ID NO:3至少90％序列同一性的序列，以及一种可变重链，其包含至少一种具有与SEQ ID NO:4或5至少90％序列同一性的序列。

3.依照权利要求1或2的经分离的抗体或其片段，其中该可变轻链包含SEQ ID NO:16、17与18的至少一者、其变异体、突变体或片段，以及该可变重链包含SEQ ID NO:19、20、21、与22的至少一者、其变异体、突变体或片段。

4.一种经分离的抗体或其片段，其可特异性地结合至肠病毒71(EV71)的至少一种构象(非线性)表位，其中该抗体包含至少一种可变轻链与至少一种可变重链，其中该可变轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO:1或15、其变异体、突变体或片段，以及该可变重链氨基酸序列包含SEQ ID NO:2、其变异体、突变体或片段。

5.依照权利要求4的经分离的抗体或其片段，其中该抗体包含一种可变轻链，其包含具有与SEQ ID NO:1或15至少90％序列同一性的序列，以及一种可变重链，其包含具有与SEQID NO:2至少90％序列同一性的序列。

6.一种经分离的抗体或其片段，其可特异性地结合至EV71的至少一种构象(非线性)表位，其中该抗体包含至少一种可变轻链与至少一种可变重链，其中该可变轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO:6、其变异体、突变体或片段，以及该可变重链氨基酸序列包含SEQ ID NO:7、其变异体、突变体或片段。

7.依照权利要求6的经分离的抗体或其片段，其中该抗体包含一种可变轻链，其包含具有与SEQ ID NO:6至少90％序列同一性的序列，以及一种可变重链，其包含具有与SEQ IDNO:7至少90％序列同一性的序列。

8.依照前述权利要求任一项的经分离的抗体或其片段，其中该抗体为中和性抗体或其片段。

9.依照前述权利要求任一项的经分离的抗体或其片段，其中该抗体为单克隆小鼠、人类、人源化或嵌合抗体。

10.依照权利要求1至9任一项的经分离的抗体或其片段，其用于EV71疫苗制程控制、候选EV71疫苗纯化、或决定EV71抗体效力标准。

11.一种医药组成物，其包含权利要求1至9任一项中定义的至少一种抗体或其片段。

12.依照权利要求1至9任一项的经分离的抗体或其片段，其用于EV71感染及/或至少一种EV71相关疾病的治疗。

13.依照权利要求12的经分离的抗体或其片段，其中该EV71相关疾病选自由无菌性脑膜炎、脑炎、颅神经麻痹、格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrom)、脊髓灰质炎样综合征、脑干脑炎、疱疹性咽峡炎、以及手足口病组成的群组。

14.权利要求1至9任一项中定义的至少一种抗体或其片段用以制备用于治疗EV71感染及/或至少一种EV71相关疾病的药物的用途。

15.依照权利要求14的用途，其中该药物包含权利要求6中定义的人源化抗体，以及一或多种前述定义的其他抗体。

16.依照权利要求14或15的用途，其中该EV71相关疾病选自由无菌性脑膜炎、脑炎、颅神经麻痹、格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrom)、脊髓灰质炎样综合征、脑干脑炎、疱疹性咽峡炎、以及手足口病组成的群组。

17.一种治疗EV71感染及/或至少一种EV相关疾病的方法，该方法包含对受试者施用权利要求1至9任一项中定义的抗体或其片段。

18.依照权利要求17的方法，其中该EV71相关疾病选自由无菌性脑膜炎、脑炎、颅神经麻痹、格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrom)、脊髓灰质炎样综合征、脑干脑炎、疱疹性咽峡炎、以及手足口病组成的群组。

19.一种制造具小核糖核酸病毒特异性的抗体的方法，该方法包含：对至少一个非人类哺乳动物免疫接种至少一个未成熟小核糖核酸病毒颗粒，以形成至少一个具小核糖核酸病毒特异性的B细胞；

选择出至少一个具小核糖核酸病毒特异性的B细胞；

融合选择出的B细胞与至少一个永生化细胞，以产生至少一个杂交瘤，其中该杂交瘤可制造具小核糖核酸病毒特异性的至少一种抗体或其片段；以及任选地自该杂交瘤中分离出该抗体，并对可变重链与轻链测序。

20.依照权利要求19的方法，其中该未成熟小核糖核酸病毒颗粒包含空的小核糖核酸病毒颗粒。

21.依照权利要求19或20的方法，其中该未成熟小核糖核酸病毒颗粒包含该小核糖核酸病毒的至少一种病毒蛋白的前体。

22.依照权利要求19至21任一项的方法，其中该小核糖核酸病毒可选自由口蹄疫病毒(Aphthovirus)、水栖哺乳动物病毒(Aquamavirus)、禽肝炎病毒(Avihepatovirus)、心病毒(Cardiovirus)、寇沙病毒(Cosavirus)、地西皮病毒(Dicipivirus)、肠病毒(Enterovirus)、马鼻炎病毒(Erbovirus)、肝病毒(Hepatovirus)、嵴病毒(Kobuvirus)、美格瑞病毒(Megrivirus)、腹肠孤病毒(Parechovirus)、萨力病毒(Salivirus)、萨佩洛病毒(Sapelovirus)、塞尼卡病毒(Senecavirus)、铁士古病毒(Teschovirus)、以及震颤病毒(Tremovirus)组成的群组。

23.依照权利要求19至22任一项的方法，其中该小核糖核酸病毒选自由肠病毒A、肠病毒B、肠病毒C、肠病毒D、肠病毒E、肠病毒F、肠病毒G、肠病毒H、肠病毒J、鼻病毒A、鼻病毒B、以及鼻病毒C组成的群组。

24.依照权利要求19至23任一项的方法，其中该小核糖核酸病毒为EV71。

25.依照权利要求24的方法，其中该病毒蛋白选自由VP0、VP1、VP2、VP3、及/或VP4组成的群组。

26.依照权利要求24或25的方法，其中该病毒蛋白为VP2及/或VP4。

27.依照权利要求24至26任一项的方法，其中该前体为VP0。

28.一种经分离的核酸分子，其编码

(a)权利要求1-3、8与9任一项中定义的抗体或其片段的至少一种可变轻链，其中该可变轻链包含至少一种氨基酸序列，其选自由SEQ ID NO:3与16-18、其变异体、突变体或片段组成的群组；及/或

(b)权利要求1-3、8与9任一项中定义的抗体或其片段的至少一种可变重链，其中该可变重链包含至少一种氨基酸序列，其选自由SEQ ID NO:4、5与19-22、其变异体、突变体或片段组成的群组。

29.依照权利要求28的经分离的核酸分子，其中(a)的至少一种核酸序列具有与SEQ IDNO:10及/或24及/或25及/或26至少90％的序列同一性；及/或(b)的至少一种核酸序列具有与SEQ ID NO:11及/或12及/或27及/或28及/或29及/或30至少90％的序列同一性。

30.依照权利要求29的经分离的核酸分子，其包含：

(a)至少一种核酸序列，其来自由SEQ ID NO:10与24-26、其突变体、变异体或片段组成的群组；及/或

(b)至少一种核酸序列，其来自由SEQ ID NO:11、12与27-30、其突变体、变异体或片段组成的群组。

31.一种经分离的核酸分子，其编码

(a)权利要求4、5、8与9任一项中定义的抗体或其片段的至少一种可变轻链，其中该可变轻链包含至少一种氨基酸序列，其选自由SEQ ID NO:1与15、其变异体、突变体或片段组成的群组；及/或

(b)权利要求4、5、8与9任一项中定义的抗体或其片段的至少一种可变重链，其中该可变重链包含至少一种氨基酸序列，其为SEQ ID NO:2、其变异体、突变体或片段。

32.依照权利要求31的经分离的核酸分子，其中(a)的至少一种核酸序列具有与SEQ IDNO:8及/或23至少90％的序列同一性；及/或(b)的至少一种核酸序列具有与SEQ ID NO:9至少90％的序列同一性。

33.依照权利要求32的经分离的核酸分子，其包含：

(b)至少一种核酸序列，其为SEQ ID NO:9，其突变体、变异体或片段。

34.一种经分离的核酸分子，其编码

(a)权利要求6-9任一项中定义的抗体或其片段的至少一种可变轻链，其中该可变轻链包含至少一种氨基酸序列，其为SEQ ID NO:6、其变异体、突变体或片段；及/或

(b)权利要求6-9任一项中定义的抗体或其片段的至少一种可变重链，其中该可变重链包含至少一种氨基酸序列，其为SEQ ID NO:7、其变异体、突变体或片段。

35.依照权利要求34的经分离的核酸分子，其中(a)的至少一种核酸序列具有与SEQ IDNO:13至少90％的序列同一性；及/或(b)的至少一种核酸序列具有与SEQ ID NO:14至少90％的序列同一性。

36.依照权利要求35的经分离的核酸分子，其包含：

37.一种表达载体，其包含权利要求28至36任一项中定义的至少一种经分离的核酸分子。

38.一种宿主细胞，其包含权利要求37中定义的表达载体。

39.一种试剂盒，其包含权利要求1-9任一项中定义的至少一种抗体或其片段。