CN107922499A

CN107922499A - 抗EphA4抗体

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Publication number: CN107922499A
Application number: CN201680048438.4A
Authority: CN
Inventors: 田口良太; 今井俊夫; 井上英二; 山田章夫; 中谷亚季; 平山俊文; 尾野雄; 尾野雄一; 伊藤俊介
Original assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 2015-09-08
Filing date: 2016-09-06
Publication date: 2018-04-17
Anticipated expiration: 2036-09-06
Also published as: EP3381941A4; AU2016319433A1; CN111320693A; CN111320693B; BR112018003494A2; ES2846175T3; RU2719158C2; IL256519A; KR20180041136A; RU2019128192A; CA2989993A1; JP6770153B2; PH12018500290A1; EP3381941B1; CO2018000652A2; WO2017043466A1; PE20181051A1; CN107922499B; US10428140B2; IL268889A

Abstract

本发明提供一种能够与EphA4结合并抑制EphA4与其配体之间的结合的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，及含有所述抗EphA4抗体或其EphA4结合片段作为有效成分的药物组合物。获得了对EphA4具有结合亲和性的小鼠抗EphA4抗体，并识别出了所述小鼠抗EphA4抗体的互补决定区(CDR)的序列。由此，能够制备在重链及轻链的可变区含有所述小鼠抗EphA4抗体的CDR序列的人源化抗体。

Description

抗EphA4抗体

技术领域

本发明涉及一种与EphA4结合的抗体。

背景技术

EphA4是受体型酪氨酸激酶家族中的一个成员。已知肝配蛋白(Ephrin)A型及B型是EphA4的配体。EphA4与作为其配体的肝配蛋白结合，会诱导产生脱黏附信号。EphA4是在运动神经元中表达，在神经回路形成期的脊髓中，借由在运动神经元的非投射区表达肝配蛋白，而控制正确的轴突导向。

根据以往的研究，提示EphA4的功能抑制是针对肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis，以下也称为“ALS”)或阿兹海默症等神经退行性疾病、脊髓损伤的有效治疗手段。

报告了EphA4是调整ALS的表型的基因(专利文献1、非专利文献1)。显示出EphA4的遗传缺陷或利用EphA4-Fc等所产生的拮抗作用会促进小鼠或大鼠的脊髓损伤时的轴突伸长或功能恢复(非专利文献2及非专利文献3)。

作为现有的EphA4信号传导抑制药，已知有KYL肽及化合物1(专利文献1、非专利文献1及非专利文献2)。然而，关于具有中和活性的抗体尚无报告。

现有技术

[专利文献1]WO2012/156351A1

[非专利文献1]Van Hoecke等人,Nature Medicine,vol.18:1418-1422,2012

[非专利文献2]Goldschmit等人,PLoS one,vol.6:e24636,2011

[非专利文献3]Spanevello等人,Journal of Neurotrauma,vol.30:1023-1034,2013

发明内容

本发明的主题在于提供一种能够与EphA4结合并抑制EphA4与其配体之间的结合的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段及含有所述抗EphA4抗体或其EphA4结合片段作为有效成分的药物组合物。

诸位发明人为了解决所述主题而反复进行了努力研究，结果借由取得能够与EphA4结合并抑制EphA4与其配体之间的结合的抗EphA4抗体，而完成了本发明。

具体而言，本发明在一个实施例中涉及以下的发明。

(1)一种抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其含有：

(a)包含SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的CDR-H1；

(b)包含SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的CDR-H2；

(c)包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的CDR-H3；

(d)包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的CDR-L1；

(e)包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的CDR-L2；及

(f)包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的CDR-L3。

(2)根据(1)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述抗体或其EphA4结合片段经人源化。

(3)根据(1)或(2)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述抗体或其EphA4结合片段是与EphA4特异性地结合并抑制EphA4与肝配蛋白之间的结合。

(4)根据(1)至(3)中任一项所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述抗体或其EphA4结合片段含有重链及轻链，

所述重链的恒定区及所述轻链的恒定区含有源于人抗体的序列。

(5)根据(4)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的恒定区源于人IgG。

(6)根据(5)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述人IgG为人IgG₁或人IgG₂。

(7)根据(4)至(6)中任一项所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述轻链的恒定区为人Igκ。

(8)根据(1)至(7)中任一项所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述EphA4结合片段是选自由Fab、Fab'、F(ab')₂、及Fv所组成的组。

(9)根据(8)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述EphA4结合片段为F(ab')₂。

(10)一种药物组合物，其含有(1)至(9)中任一项所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段。

(11)根据(10)所记载的药物组合物，其还含有药学上可接受的载体。

(12)根据(10)或(11)所记载的药物组合物，其中

所述药物组合物是用于治疗肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)。

另外，本发明在另一个实施例中涉及以下的发明。

(1’)一种抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其含有重链及轻链，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:66、68、70、72、74或76所示的氨基酸序列或在该序列中有一个或多个氨基酸经取代、添加和/或缺失的氨基酸序列，

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:78、80、82、或84所示的氨基酸序列或在该序列中有一个或多个氨基酸经取代、添加和/或缺失的氨基酸序列，并且

所述抗EphA4抗体或其EphA4结合片段与EphA4特异性地结合并抑制EphA4与肝配蛋白之间的结合。

(2’)一种抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其含有重链及轻链，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:66、68、70、72、74或76所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:78、80、82、或84所示的氨基酸序列。

(3’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列。

(4’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列。

(5’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列。

(6’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列。

(7’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列。

(8’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列。

(9’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列。

(10’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列。

(11’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列。

(12’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列。

(13’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列。

(14’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段其中，

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列。

(15’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列。

(16’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列。

(17’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列。

(18’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列。

(19’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列。

(20’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列。

(21’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列。

(22’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列。

(23’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列。

(24’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列。

(25’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列。

(26’)根据(1’)或(2’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列，并且

所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列。

(27’)根据(1’)至(26’)中任一项所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

(28’)根据(1’)至(27’)中任一项所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

(29’)根据(28’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的恒定区源于人IgG。

(30’)根据(29’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述人IgG为由人IgG₂、或人IgG₁与人IgG₂的组合组成的人IgG。

(31’)根据(30’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述人IgG为人IgG₂。

(32’)根据(31’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述人IgG₂具有Eu编号中的C131S、C219S、V234A和/或G237A突变，且在羧基末端不具有赖氨酸残基。

(33’)根据(32’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述人IgG₂含有SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列。

(34’)根据(30’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述人IgG为由人IgG₁与人IgG₂的组合组成的人IgG。

(35’)根据(34’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述由人IgG₁与人IgG₂的组合组成的人IgG中，CH1及铰链部为人IgG₁，并且CH2及CH3为人IgG₂。

(36’)根据(35’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述由人IgG₁与人IgG₂的组合组成的人IgG具有Eu编号中的V234A和/或G237A突变，且在羧基末端不具有赖氨酸残基。

(37’)根据(36’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述由人IgG₁与人IgG₂的组合组成的人IgG含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列。

(38’)根据(28’)至(37’)中任一项所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述轻链的恒定区源于人Igκ。

(39’)根据(1’)至(38’)中任一项所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

(40’)根据(39’)所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述EphA4结合片段为F(ab')₂。

(41’)一种药物组合物，其含有

(1’)至(40’)中任一项所记载的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段。

(42’)根据(41’)所记载的药物组合物，其还含有药学上可接受的载体。

(43’)根据(41’)或(42’)所记载的药物组合物，其中

将以上所列举的本发明的两个或更多个方面任意地组合而成的发明也包含在本发明的范围内。

本发明提供一种能够与EphA4结合并抑制EphA4与其配体之间的结合的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段及含有所述抗EphA4抗体或其EphA4结合片段作为有效成分的药物组合物。

附图说明

图1表示抗EphA4单克隆抗体(抗体A)针对人EphA4及小鼠EphA4的结合亲和性。

图2表示利用抗EphA4单克隆抗体(抗体A)、KYL肽及化合物1所产生的小鼠EphA4、与小鼠肝配蛋白A1及小鼠肝配蛋白B2的结合抑制。

图3表示利用抗EphA4单克隆抗体(抗体A)、及KYL肽所产生的人EphA4、与人肝配蛋白A5及人肝配蛋白B3的结合抑制。

图4A表示抗体A-IgG(抗体A)及抗体A-Fab针对小鼠EphA4的结合亲和性。

图4B表示抗体A-IgG(抗体A)及抗体A-F(ab')₂针对小鼠EphA4的结合亲和性。

图4C表示抗体A-IgG(抗体A)及抗体A-Fab针对人EphA4的结合亲和性。

图4D表示抗体A-IgG(抗体A)及抗体A-F(ab')₂针对人EphA4的结合亲和性。

图5表示利用抗体A-IgG(抗体A)、抗体A-F(ab')₂、抗体A-Fab、及KYL肽所产生的小鼠EphA4与小鼠肝配蛋白B2的结合抑制。

图6表示抗体A针对人Eph受体(图6A)及小鼠Eph受体(图6B)的结合特异性。

图7表示抗体A的与小鼠EphA4、大鼠EphA4、猴EphA4及人EphA4的结合活性。

图8表示抗体A在海马神经元中浓度依赖性地抑制由肝配蛋白A1所诱发的EphA4自磷酸化(autophosphorylation)。图8中的pY表示磷酸化EphA4。

图9表示抗体A在海马神经元中浓度依赖性地抑制由肝配蛋白A1所诱发的生长锥萎陷(growth cone collapse)。

图10表示抗体A在新生小鼠脑中，抑制由肝配蛋白A1所诱发的EphA4自磷酸化。图10中的pY表示磷酸化EphA4。

图11表示实例13中所实施的评价系统的示意图。

图12表示抗体A在使用小鼠ES细胞的活体外ALS模型中保护运动神经元。

图13表示实例14中所实施的评价系统的示意图。

图14表示抗体A在使用人iPS细胞的活体外ALS模型中保护运动神经元。

图15中，横轴表示EphA4-配体结合区(EphA4-LBD)的氨基酸，纵轴表示Fab的结构区。黑色位表示存在相互作用的组合的交点。另外，对于1个氨基酸而存在的多个位对应于相互作用的种类(氢键、表面接触等)。位数量越多的氨基酸，表示以越多样的相互作用而与Fab结合。

图16表示EphA4-配体结合区(EphA4-LBD)的表面结构。在图16中，颜色深的区域属于Fab结合区。另外，在图中，将结合区所含的氨基酸名与残基编号示于相应的位置，所结合的Fab的H链及L链的CDR以带状模型表示。

具体实施方式

本发明涉及一种与EphA4结合的抗EphA4抗体。

本发明中所使用的抗EphA4抗体是能够识别EphA4并与之结合的抗体，如下所述，该抗体可为完整的抗体，或者只要具有与EphA4的结合亲和性，则也可为其抗原结合片段或合成抗体(例如重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体等)。在本发明中，可理解为EphA4是指源于人、小鼠、大鼠及猴的EphA4。源于人、小鼠、大鼠及猴的EphA4除了可从美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)所提供的基因库等登记有序列数据的公共数据库取得以外，还可借由基于具有亲缘关系的动物种的EphA4的碱基序列数据而设计引物，并由从所需的动物种所提取的RNA进行克隆，而取得EphA4基因的序列数据。例如，人、小鼠、大鼠、猴的EphA4的碱基序列数据分别以基因库登记号NM_004438.4、NM_007936.3、NM_001162411.1、NM_001260870而登记在数据库中。

在本发明的一个实施例中，EphA4含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或在该氨基酸序列中有一个或多个氨基酸经取代、添加和/或缺失的氨基酸序列，或含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或在该氨基酸序列中有一个或多个氨基酸经取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。在本发明中，关于EphA4所使用的“多个”，只要保持与成为其基础的序列同等的功能特性，则没有限定，为2个至100个、例如2个至90个、2个至80个、2个至70个、2个至60个、2个至50个、2个至40个、2个至30个、2个至20个、2个至10个、或2个至5个，或为氨基酸中的氨基酸数的10％以内、例如9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、或5％以内。

在本发明的一个方面中，抗EphA4抗体或其EphA4结合片段是与EphA4特异性地结合的抗体。“特异性结合”的术语是本领域普通技术人员公知的术语，用以确定抗体或其抗原结合片段针对抗原或表位的特异性结合的方法也是众所周知的。在本发明的一个实施例中，“特异性结合”应理解为：抗EphA4抗体或其EphA4结合片段相比于与其他靶分子结合，能够以更大的结合亲和性、结合活性，更迅速和/或更长时间持续地借由免疫学反应与EphA4结合。就这一点而言，并不排除与某个靶特异性地结合的抗体或其抗原结合片段会与其他靶特异性地结合。在本发明的另一个实施例中，“特异性结合”能够利用对于EphA4具有至少约10^-7M、或至少约10^-8M、或至少约10^-9M、或至少约10^-10M、或至少约10^-11M、或至少约10^-12M、或其以上的KD的抗体而显示出。另外，在本发明的又一个实施例中，“特异性结合”应理解为：与EphA4借由免疫学反应进行结合，但实质上不与Eph受体的其他亚类及亚型结合。

在本发明的一个方面中，本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段是与EphA4的细胞外区域结合的抗体。例如，本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段可为含有SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列或在该氨基酸序列中有一个或多个氨基酸经取代、添加和/或缺失的氨基酸序列，或含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或在该氨基酸序列中有一个或多个氨基酸经取代、添加和/或缺失的氨基酸序列的与EphA4细胞外区域的任一个部位结合的抗体或抗原结合片段。在本发明中，关于EphA4的细胞外区域而使用的“多个”为2个至50个、例如2个至45个、2个至40个、2个至35个、2个至30个、2个至25个、2个至20个、2个至15个、2个至10个、或2个至5个，或为氨基酸中的氨基酸数的10％以内、例如9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、或5％以内，但并不限定于此。

在本发明的一个方面中，抗EphA4抗体或其EphA4结合片段能够与EphA4特异性地结合并抑制EphA4与肝配蛋白之间的结合。

在本发明的一个实施例中，抗EphA4抗体或其EphA4结合片段能够与人EphA4、小鼠EphA4、大鼠EphA4、及猴EphA4中的至少一个特异性地结合并抑制其与配体之间的结合。在本发明的优选的实施例中，抗EphA4抗体或其EphA4结合片段能够与人EphA4、小鼠EphA4、大鼠EphA4、及猴EphA4中的两个以上特异性地结合并抑制其与配体之间的结合。在本发明的另一个优选的实施例中，抗EphA4抗体或其EphA4结合片段能够与人EphA4、小鼠EphA4、大鼠EphA4、及猴EphA4的全部特异性地结合并抑制其与配体之间的结合。

测定抗体或其抗原结合片段的对抗原的结合特性(例如，结合亲和性及跨物种反应性)的方法可使用本领域普通技术人员公知的方法。例如，结合亲和性可使用Biacore(R)生物传感器、KinExA生物传感器、邻近闪烁分析(scintillation proximity assay)、ELISA、ORIGEN免疫测定法(IGEN公司)、流式细胞仪、荧光淬灭、荧光转移、酵母展示和/或免疫染色进行测定，但并不限定于此。抗体或其抗原结合片段针对EphA4与其配体之间的结合的中和活性可使用Biacore(R)生物传感器、ELISA和/或流式细胞仪进行测定，但并不限定于此。

本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段只要与EphA4结合、优选的是特异性地结合，则可为单克隆抗体、多克隆抗体、或其EphA4结合片段中的任一个。

在本发明中，本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段可为IgG、IgA或IgM(或其亚类)等任意类型，并不限定于特定类型。根据重链(有时称为H链)的恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白被分为不同类型。5个主要的免疫球蛋白的类型有：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其中的几个可进一步细分为例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁及IgA₂的亚类(同种型)。不同类型的免疫球蛋白的对应的重链的恒定区分别称为α、δ、ε、γ及μ。另外，抗体的轻链(有时称为L链)的种类有λ链及κ链。

本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段可为IgG抗体，也可为例如IgG₁抗体或IgG₂抗体等。另外，本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段根据情况也可为单体、二聚物或多聚物。

在本发明的一个方面中，本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段可为不同亚类的IgG抗体的组合，也可为例如由IgG₁抗体及IgG₂抗体的组合组成的IgG抗体等。

在本说明书中，抗体的抗原结合片段只要为该抗体的功能性、结构性的片段，保持针对该抗体能够结合的抗原的结合性，则没有特别限定。作为抗体的抗原结合片段的例子，可列举Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、单链Fv(ScFv)、这些的变体、含有抗体部分的融合蛋白质及含有抗原识别部位的免疫球蛋白分子的其他修饰结构体等，但并不限定于此。在一个方面中，本发明的抗体的结合片段为F(ab')₂。

抗体的抗原结合片段可经由利用例如木瓜酶、胃蛋白酶等蛋白酶所进行的完全的抗体蛋白质消化而获得，或者也可利用重组宿主细胞(例如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或者哺乳动物细胞等真核生物、或大肠杆菌等原核生物)而直接产生。例如，也可从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段，使之进行化学结合，而形成F(ab')₂片段。另外，F(ab')₂也可使用促进F(ab')₂分子组装的亮氨酸拉链GCN4而形成。另外，在利用化学合成技术来生产scFv的情况下，可使用自动合成机。在利用基因重组技术来生产scFv的情况下，可将含有编码scFv的多核苷酸的适当的质粒导入到适当的宿主细胞(例如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或者哺乳动物细胞等真核生物、或大肠杆菌等原核生物)中。编码目标scFv的多核苷酸也可借由多核苷酸的连接等众所周知的操作而制备。结果所产生的scFv也可使用本技术领域公知的标准蛋白质纯化技术而单独分离。

在本发明中，抗体的可变区意指抗体轻链的可变区和/或抗体重链的可变区，抗体的恒定区意指抗体轻链的恒定区和/或抗体重链的恒定区。重链及轻链的可变区分别包含利用作为高变区而已知的三个CDR连结而成的四个框架区(FR)。各链中的CDR利用FR而被保持在附近，与另一条链中的CDR一起有助于形成抗体的抗原结合部位。作为用以确定CDR的技术，例如可列举(1)基于跨物种序列可变性的方法(例如Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th ed.,1991,National Institutes ofHealth,Bethesda MD)；及(2)基于抗原-抗体复合体的晶体结构学研究的方法(Al-lazikani等人,1997J.Molec.Biol.273：927-948)，但并不限定于此。可使用这些方法，或者也可组合其他方法而使用。重链的恒定区是由三个区域CH1、CH2、CH3及铰链部所构成，以CH1、铰链部、CH2、CH3的顺序从氨基末端(N末端)向羧基末端(C末端)进行配置。轻链的恒定区是由一个区域CL所构成。

在本发明中，单克隆抗体意指由实质上均匀的抗体的群体所获得的抗体。即，该群体所含的各个抗体除了若干有可能存在的某天然的突变体以外，为一致。单克隆抗体是针对单一抗原部位的抗体，极具特异性。此外，与以不同的抗原或不同的表位作为靶的典型的多克隆抗体相比，各单克隆抗体是以抗原的单一表位作为靶的抗体。修饰语“单克隆”表示由实质上均匀的抗体群体所获得的抗体的特性，不应限定性地理解为必须借由特定方法来生产抗体。

本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段可为嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、非人哺乳动物(例如猴、小鼠、大鼠、兔、牛、马、山羊等)的抗体、或这些的EphA4结合片段。嵌合抗体例如为将非人(例如小鼠或大鼠)抗体的可变区导入到人抗体的恒定区而成的抗体，例如是指可变区源于非人抗体且恒定区源于人抗体的抗体。人源化抗体例如为将非人抗体的高变区(也称为互补决定区(complementarity-determining region：CDR))导入到人抗体中而成的抗体，例如是指CDR源于非人抗体且其以外的抗体区源于人抗体的抗体。其中，在本发明中，嵌合抗体与人源化抗体的边界并非必须明确，既可称为嵌合抗体也可称为人源化抗体的状态也是可以的。在本发明中，作为优选的人源化抗体的方面，为CDR源于啮齿类抗体且其以外的抗体区源于人抗体的抗体，特别优选的是CDR源于小鼠抗体且其以外的抗体区源于人抗体的抗体。人源化除了可使用CDR移植法(Kontermann and Dubel,AntibodyEngineering,Springer Lab Manual(2001)and Tsurushita等人,Methods 36:69-83(2005))而进行以外，也可使用本技术领域的公知方法(例如参照Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-327(1988)；及Verhoeyen等人,Science239:1534-1536(1988)，借由用CDR序列置换掉人抗体的对应序列而进行。人源化抗体典型而言是若干个CDR残基、及根据情况的若干个FR残基被置换为源于非人抗体的类似部位的残基的人抗体。

为了减少抗原性，重要的是在人源化抗体的制备中，对于轻链及重链两者，对人可变区的使用加以选择。根据“最佳适合”法，对于已知的人FR序列的全基因库，筛选啮齿类抗体的可变区的序列。其次，最接近啮齿类的序列的人序列是作为人源化抗体的人FR而收入。例如，请参照Sims等人,J.Immunol.151：2296-2308(1993)及Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)。在别的方法中，使用轻链或重链的特定亚群的源于全部的人抗体的共通序列的特定框架。针对若干个不同的人源化抗体，可使用相同的框架。例如，请参照Carter等人,Proc.Natl.Acad.Set USA 89:4285-4289(1992)and Presta等人,J.Immunol.151:2623-2632(1993)。

此外，人源化抗体通常理想为保持针对抗原的高结合亲和性及其他优选的生物学性质。为了实现该目标，根据一个方法，人源化抗体是借由使用亲代序列及人源化序列的三维模型的亲代序列及各种概念的人源化产物的分析步骤而制备。通常可利用三维的免疫球蛋白模型，这是本领域技术人员已知的。可利用将所选择的候补的免疫球蛋白序列的有希望的三维立体结构进行模式化而显示的计算机程序。借由对这些显示内容进行研究，而能够分析候补的免疫球蛋白序列功能中残基可能具有的某种作用、即分析候补的免疫球蛋白对与其抗原结合之能力产生影响的残基。可借由该方法，以实现针对单个或多个靶抗原(例如EphA4或其片段)的结合亲和性增大这样的期待的抗体特性的方式，从接受序列(recipient sequence)及导入序列(import sequence)中选择FR残基，并进行组合。

当然，将以上所例示的嵌合抗体或人源化抗体在保持该抗体的功能的情况下(或者为了附加、提高该抗体的功能)进行适当重构(例如，抗体的修饰、或抗体的氨基酸序列的一部分的取代、添加和/或缺失)的抗体也包含在本发明的抗体中。更具体而言，为了减少由抗体产生细胞所产生的抗体的不均匀性，而借由基因重构等人工方法使位于重链的羧基末端(C末端)的赖氨酸(Lys)缺失的抗体也包含在本发明的范围内。另外，为了修饰抗体的效应器功能，而对恒定区的氨基酸序列进行重构的抗体也包含在本发明的范围内，例如为了降低抗体依赖性细胞毒杀(ADCC)活性和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)活性，而将人IgG₂抗体的Eu编号中的234位的缬氨酸(Val)置换为丙氨酸(Ala)且将237位的甘氨酸(Gly)置换为丙氨酸(Ala)的抗体等也包含在本发明的范围内。此外，兼具具有本发明的抗体的CDR序列的抗体结合部位、和与不同抗原结合的抗原结合部位的双重特异性抗体(Kontermann(2012),mAbs 4,182-97)也包含在本发明的范围内。

本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段根据需要也可加以修饰。本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段的修饰可为使针对(a)例如片层或螺旋构象等的修饰区域的氨基酸序列的三维结构；(b)靶部位的分子的电荷或疏水性的状态；或(c)维持侧链体积的修饰效果发生变化的修饰，或者也可为不会明确地观察到这些变化的修饰。

本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段的修饰例如也可借由所构成的氨基酸残基的置换、缺失、添加等而实现。

在本说明书中，所谓氨基酸是使用其最广义的含义，不仅包括天然的氨基酸、例如丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬酰胺(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、脯氨酸(Pro)，还包括如氨基酸变体及衍生物的非天然氨基酸。本领域技术人员考虑到该广义定义，当然可理解，作为本说明书中的氨基酸，例如可列举：L-氨基酸；D-氨基酸；氨基酸变体、氨基酸衍生物等经化学修饰的氨基酸；正亮氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸等在生物体内不会成为蛋白质构成材料的氨基酸；及本领域技术人员公知的具有氨基酸特性的借由化学合成的化合物等。作为非天然氨基酸的例子，可列举：α-甲基氨基酸(α-甲基丙氨酸等)、D-氨基酸(D-天冬酰胺、D-谷氨酸等)、类组氨酸氨基酸(2-氨基组氨酸、β-羟基组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基组氨酸、α-甲基组氨酸等)、在侧链上具有多余的亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)及侧链中的羧酸官能团氨基酸被置换为磺酸基的氨基酸(半胱氨酸等)等。

天然存在的氨基酸残基例如可基于一般的侧链特性而分类为以下的组：

(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；

(5)对链取向产生影响的残基：Gly、Pro；及

(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。

构成抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列的非保存的置换也可借由将属于这些族群之一的氨基酸换为属于其他族群的氨基酸而进行。进一步的保存性置换也可借由将属于这些族群之一的氨基酸换为同一个组的其他氨基酸而进行。同样地，也可适当进行氨基酸序列的缺失或置换。

作为构成抗体或其抗原结合片段的氨基酸的修饰，例如可为利用糖所进行的糖基化、乙酰基化或磷酸化等翻译后修饰。抗体可在其恒定区的保守位置处进行糖基化。抗体的糖基化通常为N-结合型或O-结合型中的任一者。N-结合型是指针对天冬酰胺残基侧链的糖质部分的结合。作为三肽序列的天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸及天冬酰胺-X-半胱氨酸(式中，X为脯氨酸以外的任意的氨基酸)是用以利用酶附加针对天冬酰胺侧链的糖质部分的识别序列。借由使这些三肽序列中的任一个存在于抗体或其抗原结合片段中，而存在潜在性的糖基化部位。O-结合型糖基化可为N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、或木糖中的任一个对羟基氨基酸(例如丝氨酸或苏氨酸)的结合，根据情况也可为对5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸的结合。本领域技术人员可根据目的而适当选择糖基化的条件(在使用生物学方法进行糖基化的情况下，例如为宿主细胞或细胞培养基的种类、pH值等)。

对于本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，还可基于本领域技术人员公知的技术常识，借由其他修饰方法进行单独修饰或组合而进行修饰。

本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段也可借由本领域技术人员众所周知的方法而产生。例如，可使用产生本发明的EphA4抗体或其EphA4结合片段的融合瘤而使抗体产生，或者也可将编码本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段的基因组入到表达载体中，再将该表达载体导入到大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞等中而使抗体产生。编码本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段的基因优选的是具有编码信号序列的DNA，更优选的是在编码重链可变区的DNA及编码轻链可变区的DNA的5'末端具有编码信号序列的DNA。信号序列是在核糖体上合成了分泌蛋白质或内在膜蛋白质后，跨过脂质双层所必需的存在于蛋白质的N末端的氨基酸残基，在本发明中，只要为具有该功能的序列，则没有特别限定。作为本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段可含有的信号序列，可列举源于人、小鼠、大鼠、兔、驴、山羊、马、鸟、狗、猫、酵母等的信号序列。关于信号序列的一个具体方面，作为关于重链的信号序列，可列举含有SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:55所表示的氨基酸序列的肽，作为关于轻链的信号序列，可列举含有SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:58所表示的氨基酸序列的肽。另外，只要在功能上同等，则在SEQ ID NO:10所表示的氨基酸序列、SEQ ID NO:55所表示的氨基酸序列、SEQ ID NO:12所表示的氨基酸序列或SEQ ID NO:58所表示的氨基酸序列中也可具有一个或多个(例如2、3、4或5个)的氨基酸的取代、添加和/或缺失。

本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段也可依据本领域技术人员公知的方法进行单独分离或纯化。此处，“经单独分离的”或“经纯化的”是指人工地从自然状态进行单独分离、或进行纯化。在分子或组合物是自然产生的情况下，在为其发生变化或者从原本的环境中被去除、或这两种情况时，就是“经单独分离的”或“经纯化的”。作为单独分离或纯化的方法的例子，可列举：电泳、分子生物学、免疫学或色谱的方法等，具体可列举离子交换色谱法、疏水性色谱法、或反相HPLC色谱法、或者等电聚焦电泳等，但并不限定于此。

在本发明的另一个优选的实施例中，抗EphA4抗体或其EphA4结合片段具有以下的CDR：

(a)含有SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的CDR-H1；

(b)含有SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的CDR-H2；

(c)含有SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的CDR-H3；

(d)含有SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的CDR-L1；

(e)含有SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的CDR-L2；及

(f)含有SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的CDR-L3。

在本发明的一个实施例中，所述抗EphA4抗体或其EphA4结合片段为人源化抗体或嵌合抗体，优选的是人源化抗体。

(a)含有SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的CDR-H1；

(b)含有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的CDR-H2；

(c)含有SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的CDR-H3；

(d)含有SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的CDR-L1；

(e)含有SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的CDR-L2；及

(f)含有SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的CDR-L3。

(a)含有SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的CDR-H1；

(b)含有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的CDR-H2；

(c)含有SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的CDR-H3；

(d)含有SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的CDR-L1；

(e)含有SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的CDR-L2；及

(f)含有SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的CDR-L3。

在本发明的另一个优选的实施例中，抗EphA4抗体或其EphA4结合片段含有重链及轻链，所述重链的可变区含有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或在该序列中有一个或多个氨基酸经取代、添加和/或缺失的氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或在该序列中有一个或多个氨基酸经取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。

在本发明的另一个优选的实施例中，抗EphA4抗体或其EphA4结合片段含有重链及轻链，所述重链的可变区含有SEQ ID NO:66、68、70、72、74或76所示的氨基酸序列或在该序列中有一个或多个氨基酸经取代、添加和/或缺失的氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:78、80、82、或84所示的氨基酸序列或在该序列中有一个或多个氨基酸经取代、添加和/或缺失的氨基酸序列。

此处，关于本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段的重链可变区或轻链可变区而使用的“多个”只要保持对EphA4的结合亲和性，而抑制EphA4与肝配蛋白之间的结合，则没有限定，为2个至15个、更优选的是2个至10个、例如9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个，或为氨基酸序列中的氨基酸数的10％以内、例如9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内或1％以内。

在本发明的另一个优选的实施例中，抗EphA4抗体或其EphA4结合片段含有重链可变区及轻链可变区，所述重链可变区含有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述轻链可变区含有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。

在本发明的另一个优选的实施例中，抗EphA4抗体或其EphA4结合片段含有重链可变区及轻链可变区，所述重链的可变区含有SEQ ID NO:66、68、70、72、74或76所示的氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:78、80、82、或84所示的氨基酸序列。

在本发明的另一个优选的实施例中，抗EphA4抗体或其EphA4结合片段含有重链可变区及轻链可变区，

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:66所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:78所示的酸氨基酸序列、或

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:68所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:78所示的酸氨基酸序列、或

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:70所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:78所示的酸氨基酸序列、或

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:72所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:78所示的酸氨基酸序列、或

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:74所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:78所示的酸氨基酸序列、或

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:76所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:78所示的酸氨基酸序列。

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:66所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:80所示的酸氨基酸序列、或

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:68所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:80所示的酸氨基酸序列、或

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:70所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:80所示的酸氨基酸序列、或

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:72所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:80所示的酸氨基酸序列、或

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:74所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:80所示的酸氨基酸序列、或

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:76所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:80所示的酸氨基酸序列。

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:66所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:82所示的酸氨基酸序列、或

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:68所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:82所示的酸氨基酸序列、或

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:70所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:82所示的酸氨基酸序列、或

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:72所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:82所示的酸氨基酸序列、或

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:74所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:82所示的酸氨基酸序列、或

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:76所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:82所示的酸氨基酸序列。

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:66所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:84所示的酸氨基酸序列、或

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:68所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:84所示的酸氨基酸序列、或

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:70所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:84所示的酸氨基酸序列、或

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:72所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:84所示的酸氨基酸序列、或

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:74所示的酸氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:84所示的酸氨基酸序列、或

所述重链的可变区含有SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列，所述轻链的可变区含有SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列。

在本发明的特定的实施例中，抗EphA4抗体或其EphA4结合片段具有人IgG₂的恒定区。优选的是所述人IgG₂恒定区具有选自C131S、C219S、V234A及G237A(Eu编号)中的氨基酸变体的至少1个。在一个实施例中，所述人IgG2恒定区具有C131S及C219S的氨基酸变体的组合。在一个实施例中，所述人IgG₂恒定区具有V234A及G237A的氨基酸变体的组合。在另一个实施例中，所述人IgG₂恒定区具有C131S、C219S、V234A及G237A的全部氨基酸变体。在又一个替代性实施例中，所述人IgG₂恒定区不具有C末端赖氨酸残基。

在本发明的优选的实施例中，人IgG₂的恒定区含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列。

在本发明的特定的实施例中，抗EphA4抗体或其EphA4结合片段具有由人IgG₁与人IgG₂的组合组成的人IgG恒定区。优选的是所述人IgG恒定区中，CH1及铰链部为人IgG₁，且CH2及CH3为人IgG₂。在一个实施例中，所述人IgG恒定区具有V234A或G237A(Eu编号)的氨基酸变体。在另一个方面中，所述人IgG恒定区具有V234A及G237A的氨基酸变体。在又一个替代性实施例中，所述人IgG恒定区不具有C末端赖氨酸残基。

在本发明的优选的实施例中，由人IgG₁与人IgG₂的组合组成的人IgG恒定区含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列。

本发明在一个方面中涉及一种含有本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段的药物组合物。

含有本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段的药物组合物在水性或干燥制剂的方面下，还可含有药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂。所容许的载体、赋形剂和/或稳定剂例如包括：生理盐水；磷酸、柠檬酸或其他有机酸之类的缓冲液；含有抗坏血酸的抗氧化剂；低分子量多肽；蛋白质(例如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白)；聚乙烯基吡咯烷酮之类的亲水性聚合物；氨基酸；包括葡萄糖、甘露糖、或糊精类在内的单糖类、二糖类、及其他碳水化合物；EDTA之类的螯合剂；甘露糖醇或山梨糖醇之类的糖醇类；钠之类的形成盐的抗衡离子；或TWEEN(商标)、PLURONICS(商标)、或者PEG之类的非离子性表面活性剂。

含有本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段的药物组合物例如可封入到微胶囊内、胶体性药物传递系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米粒子、或纳米胶囊)内、或微乳内。在具有适合于需要投予抗体的任一种疾病的释放特性的制剂中，在希望缓释投予抗体的情况下，可有意地进行抗体的微胶囊化。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸类、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、非分解性的乙烯-乙酸乙烯酯、LUPRON DEPOT(商标)之类的分解性乳酸-羟乙酸共聚物(由乳酸-羟乙酸共聚物及醋酸亮丙瑞林所构成的注射用微球)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。

根据一个方面，由于本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段能够抑制EphA4与其配体之间的结合，所以含有本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段的药物组合物能够用于治疗ALS。即，本发明在另一个方面中包括一种ALS的治疗方法，其包括对受试者投予治疗上有效量的本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段的步骤。另外，本发明在另一个方面中包括一种本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段的用途，其是用于制造ALS的治疗药。本发明在另一个方面中包括一种抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其是用于在治疗ALS的方法中使用。

本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段在治疗方法中可单独使用、或者与其他药剂或组合物并用。例如本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段也可与别的药剂同时投予或不同时投予。这种并用疗法包括并用投予(相同或不同的制剂含有2种以上的药剂)及分离投予(例如同时或连续)。在分别投予2种以上药剂的情况下，本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段的投予可在附随的治疗方法之前进行，或在继其之后进行。

投予含有本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段的药物组合物的受试者没有限定，例如可对人或非人哺乳动物(猴、小鼠、大鼠、兔、牛、马、山羊等)使用本发明。

含有本发明的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段的药物组合物向受试者的投予方法(投予途径、投予量、1天的投予次数、投予的时机等)没有限定，可根据受试者的健康状态、疾病的程度、所并用的药剂的种类等，由本领域技术人员(例如医生)而适当决定。

本领域技术人员理解，只要在技术上不矛盾，则也可将本说明书中所记载的所有方面中的任意一个或多个适当组合而实施本发明。此外，本领域技术人员理解，只要在技术上不矛盾，则优选的是将本说明书中所记载的优选的或有利的所有方面适当组合而实施本发明。

本说明书中所引用的文献是借由参照，而将这些文献的全部揭露内容视为明确地援用到本说明书中，本领域技术人员依据本说明书的上下文，在不脱离本发明的精神及范围的情况下，可理解为将这些文献中的相关揭露内容援用作本说明书的一部分。

本说明书中所引用的文献仅仅是为了揭露本申请的申请日前的先前技术而提供，不应当解释为认可诸位发明人因现有发明或任意的其他原因而不具有优先于相关揭露内容的权利。这些文献的全部记述内容是基于本申请人能够取得的数据，不构成认可这些记述内容正确。

本说明书中所使用的术语是用以说明特定的实施例而使用，并非意在对发明加以限定。

本说明书中所使用的“含有(comprise)”的术语除了根据上下文明确应不同地理解的情况以外，意在表示存在所记载的事项(构件、步骤、要素或数字等)，不排除存在这以外的事项(构件、步骤、要素或数字等)。“包含(consist of)”的术语包括“包含(consistof)”和/或“实质上包含(consist essentially of)”的术语所记载的方面。

本说明书中所使用的“中和活性”的术语是指抑制EphA4与其配体之间的结合的活性和/或EphA4借由其与配体之间的结合而在人活体内所诱导的信号传递、或抑制细胞的分子表达应答或者功能性变化的活性。

只要没有不同的定义，则这里使用的所有术语(包括技术术语及科学术语)具有与本发明所属技术领域的技术人员的广义理解相同的含义。这里使用的术语只要没有明示不同的定义，则应解释为具有与本说明书及先前技术领域的含义进行整合的含义，不应当解释为理想化或过度形式化的含义。

第一、第二等术语是用以表述各种要素，理解为这些要素不应受这些术语本身所限定。这些术语仅仅是用来将一个要素与另一个要素区别开来，例如将第一要素记为第二要素，同样地将第二要素记为第一要素在不脱离本发明的范围的情况下是可以的。

在本说明书中，表示成分含量或数值范围等而使用的数值只要没有特别说明，则应理解为经术语“约”所修饰。例如，“4℃”只要没有特别说明，则理解为“约4℃”，对于这种情况，本领域技术人员基于技术常识与本说明书的文意当然能够合理地理解。

除了上下文明确地表示其他含义的情况以外，在本说明书及申请专利范围中使用的情况下，以单数形表示的各方面只要在技术上不矛盾，则理解为也可为复数形，反之亦然。

以下，参照实施例更详细地说明本发明。然而，本发明可借由各种方面而实现，不应当解释为限定于这里所记载的实施例。相关技术领域的技术人员在不改变本发明的精神或范围的情况下，可伴有各种重构、附加、缺失、置换等而事实本发明。

实例

实例1：抗小鼠EphA4单克隆抗体的制备

小鼠抗小鼠EphA4单克隆抗体的制备

为了制备与小鼠EphA4(基因库登记号NP_031962.2、SEQ ID NO:1)结合的单克隆抗体，借由以下的步骤而制备在小鼠EphA4的细胞外区域(20至547位)(SEQ ID NO:2)融合了分泌型碱性磷酸酶(SEAP)及组氨酸标签的蛋白质(以下，称为“小鼠EphA4细胞外区域-SEAP-His蛋白质”、SEQ ID NO:43)。

首先，使用源于小鼠脑的总RNA，借由RT-PCR将编码小鼠EphA4的信号序列(SEQ IDNO:42)与细胞外区域(SEQ ID NO:2)的DNA序列进行扩增，克隆到具有编码SEAP及组氨酸标签的DNA序列的pENTR1A载体(Invitrogen/Life Technologies)的SalI/NotI位点。其次，将编码小鼠EphA4的信号序列与细胞外区域、SEAP、及组氨酸标签的DNA序列借由GatewaySystem(Invitrogen/Life Technologies)的LR反应而转移到pcDNA3.1_rfcB载体上，从而构建pcDNA3.1-小鼠EphA4细胞外区域-SEAP-His表达载体。使用TransIT-LT1(塔卡拉(TAKARA))，将所构建的pcDNA3.1-小鼠EphA4细胞外区域-SEAP-His表达载体转染到HEK293EBNA细胞(Invitrogen/Life Technologies)中。在6天的培养(5％CO₂、37℃)后，回收培养上清液。使用Protino Column(MACHEREY-NAGEL)，由所回收的培养上清液而纯化小鼠EphA4细胞外区域-SEAP-His蛋白质(SEQ ID NO:43)。

将20μg小鼠EphA4细胞外区域-SEAP-His蛋白质与等量的TiterMax Gold佐剂(TiterMax USA)、或者GERBU佐剂(GERBU Biotechnik GmbH)混合，并皮下注射到Balb/c小鼠的足垫。其后，在第3天、第7天、及第10天，同样地投予小鼠EphA4细胞外区域-SEAP-His蛋白质。此时，TiterMax Gold佐剂(TiterMax USA)仅在第10天使用，GERBU佐剂(GERBUBiotechnik GmbH)在第3天、第7天、及第10天使用。在第13天将小鼠处死(sacrificed)，回收末梢淋巴节，而制备淋巴节细胞。在GenomeONE-CF(Ishihara Sangyo Kaisha，Ltd.)的存在下，将所制备的淋巴节细胞与P3U1骨髓瘤细胞(日本京都大学提供)以5:1的比例进行融合。所述融合细胞是在96孔塑料培养盘中进行培养。在7天的培养(5％CO₂、37℃)后，回收培养上清液。

使用所获得的培养上清液，选出具有针对小鼠、大鼠及人EphA4的反应性以及小鼠EphA4与小鼠肝配蛋白A1的结合抑制活性的孔。

关于针对小鼠、大鼠及人的EphA4的反应性，使用使人IgG₁的Fc区域与组氨酸标签融合而成的蛋白质(以下，分别称为“小鼠EphA4细胞外区域-Fc-His蛋白质”、“大鼠EphA4细胞外区域-Fc-His蛋白质”或“人EphA4细胞外区域-Fc-His蛋白质”)，借由ELISA对小鼠EphA4的细胞外区域、大鼠EphA4(基因库登记号NP_001155883.1)的细胞外区域(20至547位)或人EphA4(基因库登记号NP_004429.1、SEQ ID NO:3)的细胞外区域(20至547位)(SEQID NO:4)进行评价。

小鼠、大鼠或人EphA4细胞外区域-Fc-His蛋白质是借由以下的步骤而制备。最初，构建pcDNA3.1-小鼠、大鼠或人EphA4细胞外区域-Fc-His表达载体。首先，使用源于小鼠、大鼠或人的脑的总RNA，借由RT-PCR将编码小鼠、大鼠或人EphA4的信号序列与细胞外区域的DNA序列进行扩增，克隆在具有编码Fc及组氨酸标签的DNA序列的pENTR1A载体(Invitrogen/Life Technologies)的SalI/NotI位点。其次，将编码小鼠、大鼠或人的EphA4的信号序列与细胞外区域、Fc及组氨酸标签的DNA序列借由Gateway System(Invitrogen/Life Technologies)的LR反应转移到pcDNA3.1_rfcB载体上，而构建pcDNA3.1-小鼠、大鼠或人EphA4细胞外区域-Fc-His表达载体。使用TransIT-LT1(塔卡拉(TAKARA))，将所构建的这些表达载体转染到HEK293EBNA细胞(Invitrogen/Life Technologies)中。在6天的培养(5％CO₂、37℃)后，回收培养上清液。

使用有小鼠、大鼠或人EphA4细胞外区域-Fc-His蛋白质的ELISA是依据以下的步骤而进行。将抗人IgG抗体(Jackson ImmunoResearch Loboratories)涂布在96孔培养盘(Nunc)的孔上。在4℃下培养过夜后，利用1×Block Ace(大日本制药)，将孔在室温下封闭1小时。利用0.02％Tween 20/PBS(Nacalai Tesque)清洗3次后，对各孔中添加包含小鼠、大鼠或人EphA4细胞外区域-Fc-His蛋白质的培养上清液(最终浓度1nM)，在室温下培养1小时。清洗3次后，对各孔中添加所述融合细胞的培养上清液。在室温下培养1小时并清洗3次后，添加辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体(Jackson ImmunoResearchLoboratories)，在室温下培养1小时。清洗3次后，对各孔中添加TMBZ(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))溶液，在室温下培养5至20分钟。对各孔中添加等量的反应停止溶液(2N H₂SO₄、和光纯药(Wako Pure Chemical Industries))。利用酶标仪(microplate reader)(PerkinElmer)读取450nm的吸光度。

小鼠EphA4与小鼠肝配蛋白A1的结合抑制活性的评价是借由以下的步骤而进行。将抗碱性磷酸酶抗体(Seradyn)涂布在96孔培养盘(Nunc)的孔上。在4℃下培养过夜后，利用1×Block Ace(大日本制药)，将孔在室温下封闭1小时。利用0.02％Tween 20/PBS(Nacalai Tesque)清洗3次后，对孔中添加小鼠EphA4细胞外区域-SEAP-His蛋白质(最终浓度10nM)，在室温下培养1小时。清洗3次后，对孔中添加肝配蛋白A1-Fc嵌合体(R&DSystems、最终浓度20nM)与所述融合细胞的培养上清液。在室温下培养1小时并清洗3次后，添加辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(Jackson ImmunoResearch Loboratories)，在室温下培养1小时。清洗3次后，对孔中添加TMBZ(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，西格玛奥德里奇)溶液，在室温下培养5至20分钟。对孔中添加等量的反应停止溶液(2N H₂SO₄、和光纯药)，利用酶标仪(PerkinElmer)读取450nm的吸光度。

借由有限稀释法，从经过所述步骤而选出的孔而克隆融合瘤，最终获得表达具有针对小鼠、大鼠及人的EphA4的反应活性且具有小鼠EphA4与小鼠肝配蛋白A1的结合抑制活性的小鼠抗EphA4抗体的融合瘤克隆体。

培养所获得的融合瘤克隆体，使用蛋白A(GE Healthcare)从培养上清液纯化抗EphA4抗体(抗体A)。抗体A的同种型是利用单克隆抗体同种型试剂盒(Serotec)而确定，对于重链而言为IgG₁，对于轻链而言为κ。

抗体A的序列分析

借由5'-RACE(5'-rapid amplification of cDNA ends，cDNA 5'末端快速扩增技术)法，将编码抗体A的重链及轻链的信号序列、及可变区的DNA序列进行扩增。使用TRIZOL(Invitrogen/Life Technologies)，由所述融合瘤而制备总RNA，并利用DNase(deoxyribonuclease，脱氧核糖核酸酶)(QIAGEN，RNase free DNase set(无RNase的DNase试剂盒))进行处理。使用cDNA合成试剂盒(塔卡拉(TAKARA))，由所述总RNA而制备双链cDNA。将借由寡聚DNA ad29S(ACATCACTCCGT)(SEQ ID NO:5)及寡聚DNA ad29AS(ACGGAGTGATGTCCGTCGACGTATCTCTGCGTTGATAC TTCAGCGTAGCT)(SEQ ID NO:6)的退火而获得的5'-连接物附加在所述cDNA上。将所获得的cDNA利用5'-正向引物(5'-PCR4引物，AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG)(SEQ ID NO:7)及3'-反向引物(小鼠IgG重链的扩增是使用GCCAGTGGATAGACTGATGG(SEQ ID NO:8)，小鼠Igκ轻链的扩增是使用GATGGATACAGTTGGTGCAGC(SEQ ID NO:9))进行扩增。将经扩增的cDNA插入到pCR2.1载体(Invitrogen/Life Technologies)中。使用ABI3130XL而分析抗体A的基因序列。作为由借由本分析所鉴定出的抗体A的基因序列所编码的氨基酸序列，重链信号序列为SEQ ID NO:10，重链可变区为SEQ ID NO:11，轻链信号序列为SEQ ID NO:12，轻链可变区为SEQ ID NO:13。作为编码抗体A的基因序列的核苷酸序列，重链信号序列为SEQ ID NO:14，重链可变区为SEQ ID NO:15，轻链信号序列为SEQ ID NO:16，轻链可变区为SEQ ID NO:17。

抗体A的重链及轻链的全长序列是借由以下的步骤而取得。使用TRIZOL(Invitrogen/Life Technologies)，由所述融合瘤而制备总RNA，并利用DNase(QIAGEN，RNase free DNase set)进行处理。使用cDNA合成试剂盒(kit)(塔卡拉(TAKARA))，由所述总RNA而制备cDNA。将所获得的cDNA用于模板，使用5'正向引物(重链的扩增是使用GCGAAGCTTGCCG CCACCATGGCTTGGGTGTGGACCTTGC(SEQ ID NO:18)，轻链的扩增是使用GCGAAGCTTGCCGCCACCATGAGTGTGCCCACTCAGGTCC(SEQ ID NO:19))与3'反向引物(重链的扩增是使用GCGGAATTCATCATTTACCA GGAGAGTGGGAGAGGC(SEQ ID NO:20)，轻链的扩增是使用CGCGAATT CACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGAC(SEQ ID NO:21))，将编码抗体A的重链及轻链的基因序列借由PCR进行扩增，分别克隆在pEE6.4及pEE12.4载体(Lonza)上。使用ABI3130XL对基因序列进行分析。作为由借由本分析所鉴定出的抗体A的基因序列所编码的氨基酸序列，重链恒定区为SEQ ID NO:22，轻链恒定区为SEQ ID NO:23。作为编码抗体A的基因序列的核苷酸序列，重链恒定区为SEQ ID NO:24，轻链恒定区为SEQ ID NO:25。

抗体A的CDR是借由如下方法而确定：依据Kabat的编号系统(Kabat numberingsystem)，使用Abysis软件(UCL)对抗体A的氨基酸序列进行编号，基于该编号，依据用以鉴定CDR的Kabat的定义(Kabat definition)或AbM的定义法(AbM definition method)而确定。将抗体A的CDR的氨基酸序列及核苷酸序列分别示于表1及表2。

[表1]

表1抗体A的CDR的氨基酸序列

[表2]

表2抗体A的CDR的核酸序列

实例2：抗EphA4单克隆抗体针对小鼠及人EphA4的结合亲和性

借由使用Biacore A100(GE Healthcare)的表面等离子共振(SPR法)而确定实例1中所获得的抗体A针对小鼠及人EphA4的结合亲和性。首先，将利用小鼠IgG₁抗体对大鼠免疫并借由常用方法所制备的大鼠抗小鼠IgG₁抗体固定在传感芯片CM5上。大鼠抗小鼠IgG₁抗体在传感芯片CM5上的固定是借由使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐(EDC)的胺偶合法而进行，封闭是使用乙醇胺(传感芯片及固定用试剂均由GE Healthcare公司制造)。使用固定用缓冲液(10mM乙酸钠，pH值4.5)，稀释至1至2μg/mL，依据Biacore A100所附带的操作说明，固定在传感芯片上。将抗体A使用运行缓冲液HBS-EP(GEHealthcare，BR-1001-88)加以稀释，向流动检测池上注射120秒钟而进行捕获(70至100RU程度的抗体捕获量)。继而，将使用HBS-EP在50、25、12.5、6.3、3.1、1.6、0.8、和0nM的范围内进行连续稀释的小鼠或者人EphA4细胞外区域-SEAP-His添加至传感芯片持续120秒钟，依序观测添加时(结合相，120秒钟)及添加结束后(解离相，900秒钟)的结合反应曲线。在各观测结束后，添加3M MgCl₂(30秒钟、和光纯药)而再生传感芯片。对于所获得的结合反应曲线，利用使用有系统附带软件BIA evaluation软件的1：1的结合模型而进行拟合分析，而算出针对小鼠及人的EphA4的结合亲和性(KD＝kd/ka)。

抗体A针对小鼠及人EphA4的结合亲和性(KD值)分别为7.29×10^-10M、6.61×10^-10M(图1)。针对小鼠及人EphA4的其他结合参数也为大致相同程度。因此，认为抗体A针对小鼠及人的EphA4具有相同程度的结合亲和性。

实例3：抗EphA4单克隆抗体的小鼠EphA4-小鼠配体结合抑制活性

关于实例1中所获得的抗体A，小鼠EphA4与小鼠配体的结合抑制活性的评价是依据以下的步骤而进行。将抗碱性磷酸酶抗体(Thermo Fisher Scientific)涂布在96孔培养盘(Nunc)的孔上。在4℃下培养过夜后，利用1％Block Ace(DS Pharma Biomedical)，将孔在室温下封闭1小时。利用0.05％Tween 20/PBS(Thermo Fisher Scientific)清洗3次后，对孔中添加实例1的方法中所获得的小鼠EphA4细胞外区域-SEAP-His蛋白质(最终浓度10nM)，在室温下培养1小时。清洗3次后，对孔中添加配体与经连续稀释的抗体A(0、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、和1000nM)、作为EphA4抑制药而已知的KYL肽(KYLPYWPVLSSL，0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100μM、委托北海道系统-科学进行合成)及化合物1(0、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、和1000μM、式1、MatrixScientific)。此外，配体是使用小鼠肝配蛋白A1-Fc嵌合体(R&D Systems、最终浓度20nM)及小鼠肝配蛋白B2-Fc嵌合体(R&D Systems、最终浓度0.6nM)。在室温下培养1小时并清洗3次后，添加辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(Jackson ImmunoResearchLoboratories)，在室温下培养1小时。清洗3次后，对孔中添加TMBZ(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，西格玛奥德里奇)溶液，在室温下培养2分钟。对孔中添加等量的反应停止溶液(1NH₂SO₄、和光纯药)，利用酶标仪(Molecular Devices)而读取450nm的吸光度。

式1

[化1]

抗体A浓度依赖性地抑制小鼠EphA4与小鼠配体的结合，针对小鼠肝配蛋白A1、肝配蛋白B2结合的IC₅₀值分别为约1.2、1.2nM。现有的EphA4抑制药KYL肽针对小鼠肝配蛋白A1、肝配蛋白B2结合的IC₅₀值分别为约1.3、1.3μM(图2)。化合物1的活性更弱，也未见浓度依赖性。因此显示，抗体A抑制小鼠EphA4与小鼠配体的结合，其活性与现有的EphA4抑制药KYL肽相比，活性强1,000倍以上。

实例4：抗EphA4单克隆抗体的人EphA4-人配体结合抑制活性

关于实例1中所获得的抗体A，人EphA4与人配体的结合抑制活性的评价是依据以下的步骤而进行。将抗碱性磷酸酶抗体(Thermo Fisher Scientific)涂布在96孔培养盘(Nunc)的孔上。在4℃下培养过夜后，利用1％Block Ace(DS Pharma Biomedical)，将孔在室温下封闭1小时。利用0.05％Tween 20/PBS(Thermo Fisher Scientific)清洗3次后，对孔中添加实例1的方法中所获得的人EphA4细胞外区域-SEAP-His蛋白质(最终浓度10nM)，在室温下培养1小时。清洗3次后，对孔中添加配体与经连续稀释的抗体A(0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、和3000nM)、EphA4抑制药KYL肽(KYLPYWPVLSSL，0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100300、1000、和3000μM，委托东丽分析研究中心进行合成)。此外，配体是使用生物素化人肝配蛋白A5-Fc嵌合体(R&DSystems、最终浓度0.7nM)及生物素化人肝配蛋白B3-Fc嵌合体(R&D Systems、最终浓度2.3nM)。在室温下培养1小时并清洗3次后，添加辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白(GE Healthcare)，在室温下培养1小时。清洗3次后，对孔中添加TMBZ(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，西格玛奥德里奇)溶液，在室温下培养2分钟。对孔中添加等量的反应停止溶液(1N H₂SO₄、和光纯药)，利用酶标仪(Molecular Devices或PerkinElmer)而读取450nm的吸光度。

抗体A浓度依赖性地抑制人EphA4与人配体的结合，针对人肝配蛋白A5、肝配蛋白B3结合的IC₅₀值分别为约2.7、1.9nM。EphA4抑制药KYL肽针对人肝配蛋白A5、肝配蛋白B3结合的IC₅₀值分别为约6.1、1.6μM(图3)。因此显示，抗体A也强力地抑制人EphA4与人配体的结合。

实例5：EphA4结合片段针对小鼠及人EphA4的结合亲和性

首先，制备抗体A的Fab片段与F(ab')₂片段(以下，分别记载为抗体A-Fab、抗体A-F(ab')₂)作为EphA4结合片段。

抗体A-Fab的制备是依据以下的步骤而进行。在1.5mL试管(艾本德(Eppendorf))中混合抗体A(4.36mg/mL，1mL)、10mM L-半胱氨酸(和光纯药)、1mM EDTA(Gibco)及2.18μg/mL木瓜酶(西格玛奥德里奇)，在37℃下培养12小时。对培养后的试管，以最终浓度成为50mM的方式添加碘乙酰胺(和光纯药)。反应停止后，对PBS(西格玛奥德里奇)进行透析，对抗体溶液等量添加0.1M Tris(西格玛奥德里奇)-HCl/5M NaCl(pH值8.0、和光纯药)后使用rProtein A FF树脂进行纯化。将rProtein A FF 800uL填充至2mL试管中，以3.5C.V.依序添加超纯水、结合缓冲液(0.1M Tris(西格玛奥德里奇)-HCl/3M NaCl(pH值8.0、和光纯药))，而使rProtein A FF平衡化。对抗体溶液等量添加0.1M Tris(西格玛奥德里奇)-HCl/5M NaCl(pH值8.0、和光纯药)，将所获得的溶液通入柱中，回收从柱中溶出的溶液(过柱液)再次添加至柱中，重复该操作3次后，最后回收过柱液。接着，添加结合缓冲液2.5mL，重复清洗2次。借由将过柱液及清洗组分对PBS进行透析，而获得抗体A-Fab。

抗体A-F(ab')₂的制备是依据以下的步骤而进行。将抗体A对0.2M乙酸缓冲液(pH值4.0、和光纯药)在4℃下透析过夜。回收经透析的溶液，进行0.22μm过滤(默克密理博(Merck默克密理博))，其后进行定量，以抗体浓度成为4.0mg/mL的方式进行制备。待胃蛋白酶(西格玛奥德里奇)恢复至室温，使用0.2M乙酸缓冲液(pH值4.0、和光纯药)而制备为2.0mg/mL。在1.5mL试管(艾本德(Eppendorf))中将抗体A(4.0mg/mL，800μL)、胃蛋白酶溶液(2.0mg/mL，16μL)及0.2M乙酸缓冲液(pH值4.0、和光纯药)以64μL/试管进行混合，在37℃下培养15小时。对培养后的试管，以112μL/试管添加2M Tris-base(西格玛奥德里奇)而停止反应后，利用SDS-PAGE而确认分子种类。反应停止后，对100mM Tris-HCl(pH值8.0)进行透析。继而，使用rProtein A FF(GE Healthcare，17-1279-02)而进行抗体A-F(ab')₂的纯化。将rProtein A树脂1mL填充至5mL试管中，以3.5C.V.依序添加超纯水、结合缓冲液，而使rProtein A FF平衡化。透析后，对经透析的溶液等量添加0.1M Tris(西格玛奥德里奇)-HCl/5M NaCl(pH值8.0、和光纯药)进行平衡化，将所获得的抗体溶液通入柱中，回收过柱液再次添加至柱中，重复该操作3次，最后回收过柱液。接着，添加结合缓冲液5mL，重复清洗2次。为了去除未反应的IgG等，而利用0.1M柠檬酸盐(pH值3.0、和光纯药)进行溶出后，利用SDS-PAGE而确认分子种类。借由将过柱液及清洗组分对PBS进行透析，而获得抗体A-F(ab')₂。

其次，借由使用Biacore T200(GE Healthcare)的表面等离子共振(SPR法)而确定抗体A-Fab及抗体A-F(ab')₂针对小鼠及人EphA4的结合亲和性。将实例1中所获得的抗体A设为各比较对照。首先，将抗His标签抗体(GE Healthcare)固定在传感芯片CM5上。抗His标签抗体在传感芯片CM5上的固定是借由使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐(EDC)的胺偶合法而进行，封闭是使用乙醇胺(传感芯片及固定用试剂均由GE Healthcare公司制造)。使用固定用缓冲液(10mM乙酸钠，pH值4.5)而稀释为3μg/mL，依据Biacore T200所附带的操作说明而固定在传感芯片上。

将小鼠或者人EphA4细胞外区域-SEAP-His蛋白质使用运行缓冲液HBS-EP(GEHealthcare，BR-1001-88)进行稀释，向流动检测池上注射120秒钟而进行捕获(此时为10至20RU左右的蛋白捕获量)。继而，将使用HBS-EP进行连续稀释的抗体A(50、16.7、5.6、1.9、0.6、0nM)、抗体A-Fab(500、166.7、55.6、18.5、6.2、0nM)及抗体A-F(ab')₂(50、16.7、5.6、1.9、0.6、和0nM)添加至传感芯片持续120秒钟，依序观测添加时(结合相，120秒钟)及添加结束后(解离相，900秒钟)的结合反应曲线。在各观测结束后，添加3M MgCl₂(30秒钟、和光纯药)而再生传感芯片。对于所获得的结合反应曲线，利用使用有系统附带软件BIAevaluation软件的1：1的结合模型进行拟合分析，而算出针对小鼠及人的EphA4的结合亲和性(KD＝kd/ka)。

抗体A-Fab针对小鼠及人EphA4的结合亲和性(KD值)分别为4.51×10^-8M、4.04×10^-8M(图4A，图4C)。另一方面，抗体A-F(ab')₂针对小鼠及人EphA4的结合亲和性(KD值)分别为2.29×10^-11M、5.30×10^-11M(图4B，图4D)。

实例6：EphA4结合片段的EphA4-配体结合抑制活性

关于实例5中所获得的抗体A-Fab及抗体A-F(ab')₂，EphA4与配体的结合抑制活性的评价是依据以下的步骤而进行。将抗碱性磷酸酶抗体(Thermo Fisher Scientific)涂布在96孔培养盘(Nunc)的孔上。在4℃下培养过夜后，利用1％Block Ace(DS PharmaBiomedical)，将孔在室温下封闭1小时。利用0.05％Tween 20/PBS(Thermo FisherScientific)清洗3次后，对孔中添加实例1的方法中所获得的小鼠EphA4细胞外区域-SEAP-His蛋白质(最终浓度10nM)，在室温下培养1小时。清洗3次后，对孔中添加配体与经连续稀释的抗体A(0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、和3000nM)、抗体A-Fab(0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、3000nM)、抗体A-F(ab')₂(0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、和3000nM)、及EphA4抑制药KYL肽(KYLPYWPVLSSL，0、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、和3000μM，委托东丽分析研究中心进行合成)。此外，配体是使用生物素化小鼠肝配蛋白B2-Fc嵌合体(R&D Systems、最终浓度2.5nM)。在室温下培养1小时并清洗3次后，添加辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白(GE Healthcare)，在室温下培养1小时。清洗3次后，对孔中添加TMBZ(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，西格玛奥德里奇)溶液，在室温下培养2分钟。对孔中添加等量的反应停止溶液(1N H₂SO₄、和光纯药)，利用酶标仪(Molecular Devices或PerkinElmer)而读取450nm的吸光度。

抗体A(抗体A-IgG)、抗体A-Fab、抗体A-F(ab')₂及KYL肽的IC₅₀值分别为2.6(或者3.6)、438.5、2.9nM、5.293μM(图5)。如果与KYL肽相比，则抗体A及抗体A-F(ab')₂具有1000倍以上的活性，对于抗体A-Fab而言，与KYL肽相比也具有10倍以上的活性。

实例7：抗EphA4单克隆抗体针对人Eph受体的选择性

依据实例1中所记载的方法，使用源于组织的总RNA，将编码人的各Eph受体(EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、和EphB6)的信号序列与细胞外区域的DNA序列借由RT-PCR进行扩增，克隆在具有编码人IgG₁的Fc区域及组氨酸标签的DNA序列的pENTR1A载体(Invitrogen/LifeTechnologies)上。其次，将编码人的各Eph受体的信号序列与细胞外区域、Fc及组氨酸标签的DNA序列借由Gateway System(Invitrogen/Life Technologies)的LR反应而转移至pcDNA3.1_rfcB载体上，而构建表达对人的各Eph受体的细胞外区域融合了人IgG₁的Fc区域与His标签的蛋白质(称为“Eph受体细胞外区域-Fc-His蛋白质”)的载体(称为“Eph受体细胞外区域-Fc-His蛋白质表达载体”)。

其次，向10cm培养皿(Falcon)中接种HEK293EBNA细胞(Life technologies)并在37℃下培养1天。使用TransIT-LT1(塔卡拉(TAKARA))，将以上所获得的人的各Eph受体细胞外区域-Fc-His蛋白质表达载体转染至HEK293EBNA细胞中。在4天的培养(5％CO₂、37℃)后，回收培养上清液，在室温下以1500rpm离心5分钟。将离心上清液利用0.22μm过滤器(默克密理博)进行过滤，将Hepes(东仁化学科技(Dojindo Laboratories))与叠氮化钠(和光纯药)以最终浓度分别成为20mM、0.02％的方式进行添加。

关于抗体A，人Eph受体的结合活性的评价是依据以下的步骤而进行。

将驴抗人IgG抗体(Jackson ImmunoResearch Loboratories)涂布在96孔培养盘(Nunc)的孔上。在4℃下培养过夜后，利用1％Block Ace(DS Pharma Biomedical)，将孔在室温下封闭1小时。利用0.05％Tween 20/PBS(Nacalai)清洗3次后，对各孔中接种人的各Eph受体细胞外区域‐Fc-His蛋白质(最终浓度1nM)，在室温下培养1小时。清洗3次后，对孔中添加人IgG溶液(100μg/mL、三菱制药(Mitsubishi Pharma))及抗体A(10μg/mL)，在室温下培养1小时。添加辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG抗体(Jackson ImmunoResearchLoboratories)，在室温下培养1小时。清洗3次后，对孔中添加TMBZ(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，西格玛奥德里奇)溶液，在确认到适度的显色后，对孔中添加等量的反应停止溶液(1NH₂SO₄、和光纯药)，利用酶标仪(PerkinElmer)而读取450nm的吸光度。

抗体A在人Eph受体家族间仅对人EphA4特异性地具有反应活性(图6A)。

实例8：抗EphA4单克隆抗体针对小鼠Eph受体的选择性

依据实例1中所记载的方法，使用源于组织的总RNA，将编码小鼠的各Eph受体(EphA1、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、和EphB6)的信号序列与细胞外区域的DNA序列借由RT-PCR进行扩增，克隆在具有编码人IgG₁的Fc区域及组氨酸标签的DNA序列的pENTR1A载体(Invitrogen/Life Technologies)上。其次，将编码小鼠的各Eph受体(EphA1、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、和EphB6)的信号序列与细胞外区域、Fc及组氨酸标签的DNA序列借由Gateway System(Invitrogen/Life Technologies)的LR反应而转移至pcDNA3.1_rfcB载体上，而构建小鼠的各Eph受体的细胞外区域-Fc-His蛋白质表达载体。在小鼠EphA2的细胞外区域-Fc-His蛋白质表达载体的构建中，使用源于组织的总RNA，将编码小鼠EphA2的信号序列与细胞外区域的DNA序列借由RT-PCR进行扩增，克隆在具有编码Fc及组氨酸标签的DNA序列的pcDNA3.1载体上，而构建小鼠EphA2细胞外区域-Fc-His蛋白质表达载体。

其次，向10cm培养皿(Falcon或BD Bioscience)中接种HEK293EBNA细胞(Lifetechnologies)，在37℃下培养1天。使用TransIT-LT1(塔卡拉(TAKARA))，将借由所述方式而获得的小鼠EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、或EphB6细胞外区域-Fc-His蛋白质表达载体转染至HEK293EBNA细胞中。在4天的培养(5％CO₂、37℃)后，回收培养上清液，在室温下以1500rpm离心5分钟。将离心上清液利用0.22μm过滤器(默克密理博)进行过滤，将Hepes(东仁化学科技(DojindoLaboratories))与叠氮化钠(和光纯药)以最终浓度分别成为20mM、0.02％的方式进行添加。

关于抗体A，小鼠Eph受体的结合活性的评价是依据以下的步骤而进行。

将驴抗人IgG抗体(Jackson ImmunoResearch Loboratories)涂布在96孔培养盘(Nunc)的孔上。在4℃下培养过夜后，利用1％Block Ace(DS Pharma Biomedical)，将孔在室温下封闭1小时。利用0.05％Tween 20/PBS(Thermo Fisher Scientific)清洗3次后，对各孔中接种小鼠的各Eph受体细胞外区域‐Fc-His蛋白质(最终浓度1nM)，在室温下培养1小时。清洗3次后，对孔中添加人IgG溶液(100μg/mL，西格玛奥德里奇)及抗体A(10μg/mL)，在室温下培养1小时。添加辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG抗体(JacksonImmunoResearch Loboratories)，在室温下培养1小时。清洗3次后，对孔中添加TMBZ(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，西格玛奥德里奇)溶液，在确认到适度的显色后，对孔中添加等量的反应停止溶液(1N H₂SO₄、和光纯药)，利用酶标仪(PerkinElmer)而读取450nm的吸光度。

抗体A在小鼠Eph受体家族间仅对小鼠EphA4特异性地具有反应活性(图6B)。

实例9：抗EphA4单克隆抗体针对小鼠、大鼠、猴及人EphA4的反应性

小鼠、大鼠、猴及人EphA4细胞外区域-Fc-His蛋白质的制备是依据以下的步骤而进行。首先，依据实例1中所记载的方法，而构建猴EphA4细胞外区域-Fc-His蛋白质表达载体。将在载体构建中所利用的猴EphA4的氨基酸序列示于SEQ ID NO:44，将其细胞外区域示于SEQ ID NO:45。其次，向10cm培养皿(Falcon)中接种HEK293EBNA细胞(Lifetechnologies)，在37℃下培养1天。使用TransIT-LT1(塔卡拉(TAKARA))，将猴EphA4细胞外区域-Fc-His蛋白质表达载体、及实例1中所记载的小鼠EphA4、大鼠EphA4及人EphA4细胞外区域-Fc-His蛋白质表达载体转染至HEK293EBNA细胞中。在4天的培养(5％CO₂、37℃)后，回收培养上清液，在室温下以1500rpm离心5分钟。将离心上清液利用0.22μm过滤器(默克密理博)进行过滤，将Hepes(东仁化学科技(Dojindo Laboratories))与叠氮化钠(和光纯药)以最终浓度分别成为20mM、0.02％的方式进行添加。

关于抗体A，各种Eph受体的结合活性的评价是依据以下的步骤而进行。

将驴抗人IgG抗体(Jackson ImmunoResearch Loboratories)涂布在96孔培养盘(Nunc)的孔上。在4℃下培养过夜后，利用1％Block Ace(大日本制药)，将孔在室温下封闭1小时。利用0.05％Tween 20/PBS(Nacalai Tesque)清洗3次后，对孔中接种小鼠、大鼠、猴及人EphA4细胞外区域-Fc-His蛋白质(最终浓度1nM)，在室温下培养1小时。清洗3次后，对孔中添加人IgG溶液(100μg/mL、三菱制药(Mitsubishi Pharma))及抗体A(0、0.00128、0.0064、0.032、0.16、0.8、4、和20μg/mL)，在室温下培养1小时。添加辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG抗体(Jackson ImmunoResearch Loboratories)，在室温下培养1小时。清洗3次后，对孔中添加TMBZ(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，西格玛奥德里奇)溶液，在确认到适度的显色后，对孔中添加等量的反应停止溶液(1N H₂SO₄、和光纯药)，利用酶标仪(PerkinElmer)而读取450nm的吸光度。

抗体A对于小鼠、大鼠、猴及人EphA4均具有同等的反应活性(图7)。

实例10：抗EphA4单克隆抗体在海马神经元中的配体诱发EphA4自磷酸化抑制效果

大鼠海马神经元的制备是依据以下的步骤而进行。从妊娠第18天的大鼠(日本Charles River)取出胚胎，切开头部取出脑。在立体显微镜下切出海马区域后，添加消化溶液(137mM NaCl(和光纯药)、5mM KCl(和光纯药)、7mM Na₂HPO₄(和光纯药)、25mM Hepes(东仁化学科技(Dojindo Laboratories))、0.5mg/ml DNase(西格玛奥德里奇)，0.25％胰蛋白酶(Life technologies))，在37℃下振摇10分钟。去除溶液，添加20％胎牛血清/Hanks缓冲液(西格玛奥德里奇)。去除液体，利用Hanks缓冲液清洗2次后，在Hanks缓冲液中对海马组织进行吸液而制备细胞悬浮液。向涂布了添加有培养液(神经基质培养基(Lifetechnologies)，1×B-27添加剂(Life technologies)、0.5mM L-谷氨酰胺(Lifetechnologies))的聚L-赖氨酸的6孔培养皿(Falcon)中接种细胞。

使用海马神经元的EphA4自磷酸化抑制活性评价是依据以下的步骤而进行。对接种至6孔培养皿(Falcon)中的大鼠海马神经元，利用小鼠肝配蛋白A1-Fc嵌合体(R&DSystems、最终浓度10nM)、抗体A(0、1、10、100、和1000nM)或者EphA4抑制药KYL肽(KYLPYWPVLSSL，0、0.01、0.1、1、10、和100μM、委托北海道系统-科学进行合成)进行处置，45分钟后利用cold-PBS(和光纯药)进行清洗，添加裂解缓冲液(20mM Tris、150mM NaCl、1mMEDTA、1％Triton X-100(以上为和光纯药)，1×蛋白酶抑制剂(Nacalai Tesque)、1×磷酸酶抑制剂(Nacalai Tesque))，并回收细胞。在4℃下混合15分钟后，进行15000rpm、4℃、15分钟的冷却离心，回收上清液。向上清液中添加兔抗EphA4多克隆抗体(医学生物学研究所股份有限公司)反应90分钟后，添加蛋白G珠(GE Healthcare)进一步反应30分钟。进行3000rpm、4℃、1分钟的冷却离心并去除上清液，添加1mL的裂解缓冲液。进行该操作3次后，添加2×SDS样品缓冲液，煮沸10分钟。使用该样品进行SDS-PAGE，进行使用抗磷酸化酪氨酸抗体(Santa Cruz biotechnology)的蛋白质印迹法。此外，也进行使用抗EphA4单克隆抗体(Abnova)的蛋白质印迹法，将带强度定量化，算出磷酸化EphA4/总EphA4的值。此外，抗EphA4单克隆抗体(Abnova)被认为是以针对人EphA4的C末端侧区域的合成肽作为免疫原，对于N末端侧具有细胞外区域的人EphA4不具有中和活性的抗体。

抗体A及EphA4抑制药KYL肽在海马神经元中浓度依赖性地抑制小鼠由肝配蛋白A1所诱发的EphA4自磷酸化，其IC₅₀值分别为24.2nM、9.91μM(图8)。本结果显示，抗体A在细胞系中也与KYL肽同样地拮抗EphA4/肝配蛋白信号传送。

实例11：抗EphA4单克隆抗体在海马神经元中针对配体诱发成长锥萎陷(growth cone collapse)的抑制效果

大鼠海马神经元的制备是如所述实例10中记载的方式进行，细胞是接种至涂布了添加有培养液的聚L-赖氨酸的96孔培养盘(greiner)中。

使用海马神经元的生长锥萎陷分析是依据以下的步骤而进行。对接种至96孔培养皿(greiner)中的培养第二天的大鼠海马神经元，利用PBS(和光纯药)、抗体A(0.1、0.3、和1μM)或者EphA4抑制药KYL肽(KYLPYWPVLSSL，10、30、和100μM，委托东丽分析研究中心进行合成)处置15分钟后，利用与山羊抗人Fcγ片段IgG₁抗体(Jackson Immuno Research)以1:5的比例进行聚类化的小鼠肝配蛋白A1-Fc嵌合体(R&D Systems、最终浓度1μg/mL)处置30分钟。其后，去除培养液，添加2％PFA(和光纯药)/4％蔗糖(和光纯药)/PBS并静置20分钟，而将细胞进行固定。去除液体，将细胞利用PBS清洗3次后，添加0.25％Triton X-100(和光纯药)/PBS，进行细胞透过处理15分钟。去除液体，添加2％BSA(西格玛奥德里奇)/0.25％Triton X-100/Opti-MEM(Life technologies)，实施1小时封闭后，使之与抗τ-1抗体(默克密理博)、抗MAP-2抗体(默克密理博)反应2小时。去除1次抗体液，利用PBS清洗3次后，使之与2次抗体、Alexa Fluor 546鬼笔环肽(Molecular probes)反应1小时。去除2次抗体液，利用PBS清洗3次后，添加封入SlowFadeGold抗淬灭剂(Molecular probes)，利用BIOREVO(KEYENCE)进行观察。对于各样品，从30个视野计数形成生长锥的神经元，而算出引起了生长锥萎陷的神经元数的比例。

抗体A及EphA4抑制药KYL肽在海马神经元中浓度依赖性地抑制小鼠由肝配蛋白A1所诱发的生长锥萎陷(图9)。因此显示，抗体A在细胞系中与KYL肽同样地功能性地抑制EphA4。

实例12：抗EphA4单克隆抗体在体内的配体拮抗作用

使用新生小鼠进行的体内竞争分析是依据以下的步骤而进行。向8天龄的小鼠(日本Charles River)分别以300mg/kg的用量进行皮下投予(30mL/kg)PBS(和光纯药)、抗体A或者借由常用方法用二硝基苯酚免疫大鼠所生产的对照抗体(小鼠抗二硝基苯酚抗体)。在24小时后，在4％异氟醚(Intervet)麻醉下切开头皮，对侧脑室内投予小鼠肝配蛋白A1-Fc嵌合体(300pmol/头、R&D Systems)或者PBS(和光纯药)，1小时后借由断头而使小鼠安乐死后，摘取大脑半球。将所采集的大脑半球添加至BioMasher(R)Ⅰ(Nippi)的回收用试管上所设置的过滤器试管中，插入破碎棒后，进行15000rpm、4℃、2分钟的冷却离心而进行破碎。使破碎物悬浮在TNE缓冲液(20mM Tris、150mM NaCl、1mM EDTA、1×蛋白酶抑制剂(NacalaiTesque)、1×磷酸酶抑制剂(Nacalai Tesque))中。对匀浆的一部分添加3×SDS样品缓冲液，煮沸10分钟，并进行蛋白质的定量。使用该样品进行SDS-PAGE，进行使用驴抗人IgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoResearch)、抗EphA4单克隆抗体(Abnova)、抗肌动蛋白抗体(SIGMA)的蛋白质印迹法。剩余的匀浆在进行了蛋白质的定量后，以相对于蛋白质3mg的量进行分散，并向其中添加1％Triton X-100(和光纯药)和0.1％SDS(Nacalai Tesque)。在4℃下混合15分钟后，进行15000rpm、4℃、15分钟的冷却离心，回收上清液。对上清液的一部分添加3×SDS样品缓冲液，煮沸10分钟，制备输入(Input)样品。使用该样品进行SDS-PAGE，进行使用抗EphA4单克隆抗体(Abnova)、抗肌动蛋白抗体(SIGMA)的蛋白质印迹法。向剩余的上清液中添加兔抗EphA4多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)，使之反应60分钟后，添加蛋白G珠(GE Healthcare)进一步反应30分钟。进行3000rpm、4℃、2分钟的冷却离心而去除上清液，并添加0.5mL的裂解缓冲液(20mM Tris、150mM NaCl、1mM EDTA、1％Triton X-100(和光纯药)、0.1％SDS(Nacalai Tesque)、1×蛋白酶抑制剂(Nacalai Tesque)、1×磷酸酶抑制剂(Nacalai Tesque))。进行该操作3次后，对珠添加1×SDS样品缓冲液，煮沸10分钟，制备珠样品。使用该样品进行SDS-PAGE，使用抗磷酸化酪氨酸抗体(Santa Cruzbiotechnology)进行蛋白质印迹法。此外，也使用抗EphA4单克隆抗体(Abnova)进行蛋白质印迹法，将带强度定量化，而算出磷酸化EphA4/总EphA4的值。此外，抗EphA4单克隆抗体(Abnova)被认为是以针对人EphA4的C末端侧区域的合成肽作为免疫原，对于N末端侧具有细胞外区域的人EphA4不具有中和活性的抗体。

对新生小鼠侧脑室内投予小鼠肝配蛋白A1在大脑半球中引起EphA4的自磷酸化。抗体A将小鼠由肝配蛋白A1所诱发的EphA4自磷酸化抑制了66％(图10)。因此显示，抗体A在体内也抑制EphA4与其配体之间的结合。

实例13：抗EphA4单克隆抗体的活体外ALS模型的源于小鼠ES细胞的运动神经元保护效果

小鼠ES细胞的维持培养是依据以下的步骤而进行。使在-80℃下冷冻保存的小鼠ES细胞(129×1/SvJ)在恒温浴内融化后，利用加温至37℃的小鼠ES细胞培养基(含有10％胎牛血清(FBS，Gibco)、0.1mMβ-巯基乙醇(Gibco)、1mM丙酮酸钠(Invitrogen)、2mM L‐谷氨酰胺(Invitrogen)、1％非必需氨基酸(Invitrogen)、100单位/mL青霉素-100μg/mL链霉素(Invitrogen)及1000单位/mL ESGRO(R)白血病抑制因子(默克密理博)的KnockOut^TM DMEM(Gibco))进行稀释。将各细胞悬浮液进行离心后(1500rpm、3分钟、室温)，去除上清液，悬浮在新的培养基中之后，转移至预先接种了饲养细胞的培养皿中，在CO₂培养箱内(5％CO₂、37℃)进行维持培养。

来自新生小鼠的星形胶质细胞的建立及维持培养是依据以下的步骤而进行。将出生后2天龄的野生型新生小鼠(C57BL/6J Jms Slc(日本SLC))、及野生型小鼠与变体人SOD1(G93A)Tg-(B6.Cg-Tg(SOD1_G93A)1Gur/J(Jackson Laboratories))小鼠的交杂新生小鼠利用异氟醚(Intervet)进行吸入麻醉或借由断头而安乐死后，单独分离大脑皮质，利用0.25％胰蛋白酶‐EDTA(Invitrogen)借由37℃、15分钟处理而进行分散。在酶处理后，利用含有10％FBS(Gibco)及1％青霉素-链霉素(Invitrogen)的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(Gibco)(10％FBS-DMEM)4mL进行稀释，而停止酶消化。其后，利用细胞滤网(BD Bioscience)，对单一细胞以外的杂质进行过滤，并以1500rpm离心5分钟。吸取上清液，稀释至新的10％FBS-DMEM 4mL中，对于每个个体，接种至60mm培养皿中，在37℃下进行培养。接种2天后，吸取培养基，添加新的10％FBS-DMEM 4mL而进行培养基更换。在达到融合后，回收包含非黏附细胞的培养上清液，进行变体人SOD1(G93A)的基因型分型。重新添加PBS(和光纯药)2mL，再次进行吸取。添加0.25％胰蛋白酶‐EDTA 1mL，在37℃下培养3分钟。利用10％FBS-DMEM 3mL而停止酶处理，并以1500rpm离心3分钟。离心后，吸取培养基，添加新的10％FBS-DMEM 6mL，接种至100mm培养皿中，由此进行传代培养(传代数2)。在达到融合后，吸取培养基，其后添加PBS(和光纯药)3mL，再次进行吸取。添加0.25％胰蛋白酶‐EDTA 2mL，并在37℃下培养3分钟。利用10％FBS-DMEM 4mL而停止酶处理，并以1500rpm离心3分钟。离心后，吸取培养基，添加新的10％FBS-DMEM 12mL，以每孔6mL接种至100mm培养皿中进行传代培养(传代数3)。吸取第3次传代的星形胶质细胞的培养基，添加PBS(和光纯药)2mL，再次进行吸取。添加0.25％胰蛋白酶‐EDTA 2mL，在37℃下培养3分钟，添加4mL的10％FBS-DMEM，而停止酶处理。回收悬浮液，以1500rpm离心3分钟，稀释至Cellbanker(日本全药工业)中，在用于试验前在-80℃下冷冻保存。在进行试验时，将冷冻保存的细胞悬浮液分别在恒温浴内融化后，利用加温至37℃的10％FBS-DMEM进行稀释。将各细胞悬浮液离心后(1500rpm、3分钟、室温)，去除上清液，悬浮于新的培养基中之后，接种至8孔培养玻片(ibidi)，在CO₂培养箱内(5％CO₂、37℃)进行维持培养。

变体人SOD1(G93A)的基因型分型是使用REDExtract-N-Amp^TM组织PCR试剂盒(西格玛奥德里奇)而进行。在小鼠ES细胞的维持培养的步骤中，将在传代培养时所回收的包含变体人SOD1(G93A)表达星形胶质细胞的非黏附细胞的培养上清液回收至1.5mL试管中，以1500rpm离心3分钟。离心后，吸取上清液，添加PBS1mL进行清洗，再次离心后，将其吸取。将提取溶液50μL、及组织制备溶液12.5μL混合，添加至每个样品中。混合后，转移至聚合酶链反应(PCR)试管中，利用GeneAmp(R)PCR系统9700(Applied biosystems(R))以55℃、10分钟→95℃、3分钟→4℃∞的循环进行基因组提取。其后，添加中和溶液B 50μL而进行中和化。

使用所提取的基因组，以表3所示的组成进行基因组PCR。PCR中所使用的引物序列如表4所示。利用1％琼脂糖凝胶/100V/20分钟对所得的每个PCR产物进行电泳。将检测到内标324bp及变体人SOD1(G93A)236bp的两个条带的细胞鉴定为变体人SOD1(G93A)表达星形胶质细胞。

[表3]

表3基因组PCR混合物

试剂名	液量
		模板：	1μL
Redmix：	5μL
		引物1(100μmol/L)：	0.05μL
引物2(100μmol/L)：	0.05μL
		引物3(100μmol/L)：	0.05μL
引物4(100μmol/L)：	0.05μL
		蒸馏水：	3.8μL
总量：	10μL

Red mix＝REDExtract-N-Amp PCR反应混合物.

[表4]

表4引物的核苷酸序列

活体外ALS模型的运动神经元保护效果的评价是依据以下的步骤而进行。利用0.25％胰蛋白酶/0.05％EDTA溶液(Gibco)对经培养维持的小鼠ES细胞进行处理，将细胞从培养皿剥离。进行离心而回收细胞后，制备悬浮液，以1.2×10⁵细胞/mL接种至低吸附性12孔培养盘(Nunc)中(第0天)。在DFK培养基(含有5％KnockOut血清替代品(Invitrogen)、2mML-谷氨酰胺、100单位/mL青霉素-100μg/mL链霉素及0.1mMβ-巯基乙醇的高级DMEM/F-12(Invitrogen)：神经元培养基(Invitrogen)[1:1]培养基)内进行2天悬浮凝聚块培养。第二天将DFK培养基换为含有1μM视黄酸(西格玛奥德里奇)及2μM purmorphamine(Stemgent)的DFK培养基。其后，以2天1次的频率更换培养基，培养5天(第3天至第7天)，而分化诱导为运动神经元。

将第7天所分化的运动神经元的细胞块利用细胞分散液Accumax(MStechnologies)进行分散，而制备为细胞密度5.5×10⁵细胞/mL的悬浮液。将该悬浮液以200μL/孔孔接种至预先培养维持了源于小鼠的野生型星形胶质细胞或变体人SOD1(G93A)表达星形胶质细胞的8孔培养玻片中，作为星形胶质细胞与运动神经元的共培养细胞而用于了评价。

将在野生型星形胶质细胞与运动神经元的共培养中所观察到的运动神经元数设为对照。在药物处置组中，进行变体人SOD1(G93A)表达星形胶质细胞与运动神经元的共培养，将条件设为添加溶剂(IgG及0.1％超纯水)、抗体A(10、30、100nM)、EphA4-Fc(R&DSystems，3、10、30nM)、KYL肽(东丽分析研究中心，1、3、10μM)。在各条件下以37℃、5％CO₂培养2天后，使用抗兔ISL1抗体(Abcam)及Hoechst 33342(Molecular probe)而将运动神经元进行免疫细胞化学染色。将每单位面积的ISL1/Hoechst 33342共阳性细胞计数为存活运动神经元，运动神经元存活率是作为相对于对照的百分率(％)而算出。此外，图11表示揭露评价系统的步骤的简单示意图。

在源于变体人SOD1(G93A)表达星形胶质细胞/小鼠ES细胞的运动神经元共培养中，运动神经元存活率显著降低(40至50％)。抗体A浓度依赖性地抑制由变体人SOD1(G93A)表达星形胶质细胞所诱发的源于小鼠ES细胞的运动神经元的死亡(图12)。另外，与抗体A同样地也利用KYL肽及EphA4-Fc处置，在本实验是中可见运动神经元保护效果，因此显示抗体A在该体内ALS模型中借由抑制EphA4/肝配蛋白信号传送而促进源于小鼠ES细胞的运动神经元的存活。

实例14：抗EphA4单克隆抗体的活体外ALS模型的源于人iPS细胞的运动神经元保护效果

人iPS细胞的维持培养是依据以下的步骤而进行。将在液氮中以干细胞冻存液(Takara)冷冻保存的人iPS细胞(201B7)从液氮层中取出，迅速悬浮于预先加温至37℃的人iPS细胞培养基(Essential 8,Thermo Fisher scientific)5mL中进行融化。将细胞悬浮液回收至15mL圆锥管(Falcon)中，离心后(1000rpm、5分钟、室温)，去除上清液，并悬浮于新的培养基后，接种至预先涂布了0.5μg/cm²人重组玻连蛋白(Invitrogen)的细胞培养皿(Falcon BD)中，添加10μM Y-27632(和光纯药)，在CO₂培养箱内(5％CO₂、37℃)进行维持培养。每天更换培养基，在达到融合的时刻用于实验。

活体外ALS模型的运动神经元保护效果的评价是依据以下的步骤而进行。吸取所维持培养的人iPS细胞的培养基，利用2mL PBS(和光纯药)进行清洗。吸取PBS后，添加0.5mMEDTA 500μL，在CO₂培养箱内(5％CO₂、37℃)培养2至3分钟(每30秒利用显微镜进行确认，在细胞彼此的结合减弱的时刻中止培养)。借由悬浮于5mL的人iPS细胞培养基中，而停止EDTA反应，并回收至15mL圆锥管中。以1000rpm、5分钟、室温的条件进行离心，并吸取上清液。将人iPS细胞块以约1/10量的细胞悬浮液接种至低黏附性6孔细胞培养盘(Nunclone sphere,Nunc)的1个孔中，向DFK培养基(含有2％B27添加剂、5％KnockOut血清替代品(Invitrogen)、2mmol/L L-谷氨酰胺、100单位/mL青霉素-100ug/mL链霉素、及0.1mmol/Lβ-巯基乙醇的高级DMEM/F-12(Invitrogen)：神经元培养基(Invitrogen)[1:1]培养基)中添加2μM SB431542(西格玛奥德里奇)、300nM LDN193189(西格玛奥德里奇)、3μM CHIR99021(西格玛奥德里奇)，在CO₂培养箱内(5％CO₂、37℃)进行培养。借由以下的方法，每2天更换培养基。首先，将人iPS细胞分化细胞块(SFEBs)连同培养基一起回收至15mL圆锥管中，并在常温下静置5分钟，由此使细胞块沉淀。吸取其上清液，添加新的DFK培养基、及2μM SB431542(西格玛奥德里奇)、300nMLDN193189(西格玛奥德里奇、3μM CHIR99021(西格玛奥德里奇)，并送回至原来的孔中，由此更换培养基。在培养第8天，将SFEB连同培养基一起回收至15mL圆锥管中，在常温下静置5分钟，由此使SFEB沉淀。吸取其上清液，添加新的DFK培养基，并添加0.1μM视黄酸(西格玛奥德里奇)、0.5μM Purmorphamine(Miltenyi Biotec)，并送回至原来的孔中，在CO₂培养箱内(5％CO₂、37℃)中进行培养。每2天更换培养基。在培养第12天，将SFEB连同培养基一起回收至15mL圆锥管中，在常温下静置5分钟，由此使SFEB沉淀。吸取上清液，添加500μL的Accumax(MS TechnoSystems)并吸液数次后，在CO₂培养箱内(37℃、5％CO₂)中培养5分钟。从培养箱中取出细胞，悬浮于5mL的DFK培养基中，并吸液数次，由此使细胞块分散。将细胞悬浮液利用细胞滤网(Falcon)进行过滤而将其解离为单一细胞后，利用计数室而计数细胞数。将细胞悬浮液回收至新的15mL圆锥管中，以1000rpm、5分钟、室温进行离心。利用运动神经培养基(含有2％B27添加剂、1％马血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、100单位/mL青霉素-100ug/mL链霉素、及0.1mmol/Lβ-巯基乙醇的高级DMEM/F-12(Invitrogen)：神经元培养基(Invitrogen)[1:1]培养基))而制备为细胞密度5.5×10⁵细胞/mL的悬浮液，以200μL/孔接种至预先以8×10⁴细胞/孔接种了源于小鼠的野生型星形胶质细胞或变体人SOD1(G93A)表达星形胶质细胞的8孔培养玻片中，作为星形胶质细胞与运动神经元的共培养细胞而用于评价(此外，野生型及人变体SOD1(G93A)表达星形胶质细胞的建立、冷冻、融化、接种、维持培养是借由与实例13相同的方法而进行)。将在野生型星形胶质细胞与运动神经元的共培养中所观察到的运动神经元数设为对照。在药物处置组中，进行变体人SOD1(G93A)表达星形胶质细胞与运动神经元的共培养，将条件设为添加溶剂(IgG、及0.1％超纯水)、抗体A(10、30、100nM)、EphA4抑制药KYL肽(KYLPYWPVLSSL，1、3、10μM，委托东丽分析研究中心进行合成)、EphA4-Fc(3、10、30nM，R&Dsystems)。在各条件下以5％CO₂、37℃培养2天后，使用抗ISL1抗体(从Developmental Studies Hybridoma Bank取得)及Hoechst 33342(Molecular probe)而对运动神经元进行免疫细胞化学染色。将每1个孔的ISL1/Hoechst33342共阳性细胞作为存活运动神经元而计数，运动神经元存活率是作为相对于对照的％而算出。图13表示揭露评价系统的步骤的简单示意图。

在源于变体人SOD1(G93A)表达星形胶质细胞/人iPS细胞的运动神经元共培养中，与使用小鼠ES细胞的分析是同样地运动神经元存活率显著降低(约50％)。抗体A浓度依赖性地抑制由变体人SOD1(G93A)表达星形胶质细胞所诱发的源于人iPS细胞的运动神经元的死亡(图14)。另外，与抗体A同样地也利用KYL肽及EphA4-Fc处置，在本实验是中可见源于人iPS细胞的运动神经元保护效果。因此显示，抗体A在人细胞内也借由抑制EphA4与其配体之间的结合而促进运动神经元的存活。

实例15：借由X射线晶体结构分析而进行的EphA4-配体结合区(EphA4-LBD)的表位作图

为了制备实例5中所制备的抗体A-Fab与作为抗原的EphA4-LBD的复合体，而制备EphA4-LBD(Qin H.等人,J.Biol.Chem.,283：29473-29484(2008))。以EphA4-LBD相对于抗体A-Fab成为约1.5倍的摩尔比的方式，将1.33··mol(950·M,1.4ml)的EphA4-LBD与0.9··mol(150··M,6ml)的抗体A-Fab混合，在冰上培养30分钟。其次，将混合液用于HILOAD 26/60Superdex 75制备级柱(prep grade)(GE Healthcare)，在色谱用缓冲液(25mM Tris/HCl(pH值7.5)、100mM NaCl)中进行溶出。将包含复合体的组分利用SDS PAGE加以分析，收集高纯度的组分，浓缩至34mg/ml，将其用于晶体化。

复合体的晶体化是借由使用自动晶体化装置Hydra II Plus One系统(MatrixTechnologies Corp.,Ltd.)的沉滴汽相扩散法而进行。培养盘是使用MRC-2(MolecularDimensions)。储备溶液(reservoir solution)的组成为100mM Tris/HCl(pH值7.5至8.5)、30％聚乙二醇400，以该储备溶液与所述复合体溶液的体积比成为1:1的方式进行混合，而制备晶体化微滴。所制备的晶体化培养盘是在20℃下进行静置。

在所述条件进行晶体化，结果获得空间群P212121、晶格常数和的晶体。对所获得的晶体入射放射光X射线取得的衍射资料。利用HKL2000(HKL Research Inc.)对衍射数据进行处理，借由分子置换法而确定位相。分子置换法是使用CCP4软件套件(Collaborative computational projectnumber 4,[CCP4]version 6.5.0,Acta Cryst.D 67：235-242(2011))所含的程序PHASER(version 2.5.0,J.等人,J.Appl.Cryst.40：658-674(2007))。作为分子置换法的搜索模型，是使用EphA4-LBD的晶体结构(PDBID：3CKH)与诸位发明人过去所确定的别的抗体的Fab的晶体结构。以与由所确定的位相而获得的电子密度一致的方式，使用程序COOT(Emsley P.等人,Acta Cryst.D 60：2126-2132n(2004))而构建分子模型，并使用程序REFMAC(Murshudov G.N.,Acta Cryst.D 53：240-255(1997))而进行结构精密化。

借由以上的结构计算，而获得分辨力为的复合体晶体结构(R＝0.234,Rfree＝0.288)。

使用计算化学系统MOE 2011.10(Chemical Computing Group Inc.)所安装的相互作用检测工具，对所获得的Fab/EphA4-LBD复合体的晶体结构进行分析，而鉴定直接与Fab相互作用的EphA4-LBD上的氨基酸残基(图15)。检测条件是使用MOE的标准设置。鉴定出的氨基酸残基为Ser58、Met60、Gln71、Val72、Cys73、Thr104、Arg106、Gln156、Asp161、Arg162、Ile163、Cys191、Ile192。图16表示Maestro(10.6版,Schrodinger，LLC)所制备的EphA4-LBD的表面结构。结果诸位发明人得出结论：这些氨基酸残基所存在的区域是EphA4-LBD的Fab结合区。

实例16：抗体A的人源化抗体的制备

人源化抗人EphA4抗体的制备

设计出人源化抗体的可变区。基于相对于抗体A的框架区(FR)的高同源性，选择人抗体的FR：轻链为IGKV1-NL1*01(SEQ ID NO:50)或IGKV3D-15*01(SEQ ID NO:51)及JK1(SEQ ID NO:52)，重链为IGHV7-4-1*02(SEQ ID NO:53)及JH6(SEQ ID NO:54)作为人源化抗体的FR。其后，使用小鼠抗体A的3D结构预测模型，预测会与CDR的氨基酸相互作用的FR中的氨基酸，与CDR(SEQ ID NO:26-30及31-33)一起进行移植。就EphA4的磷酸化增强及ADCC活性的观点而言，作为重链恒定区，使用具有C131S、C219S、V234A及G237A变体且不具有C末端赖氨酸残基的人IgG₂的恒定区(SEQ ID NO:62)、或者CH1及铰链部为人IgG₁且CH2及CH3为具有V234A及G237A变体的人IgG₂且不具有C末端赖氨酸残基的恒定区(SEQ ID NO:60)。作为轻链恒定区，是使用人Igκ(SEQ ID NO:64)。HK1(SEQ ID NO:72)、HK2(SEQ ID NO:74)、及HK4(SEQ ID NO:76)是设计为移植了借由Kabat的定义方法所确定的CDR(SEQ ID NO:26、28、30)的人源化抗体的重链可变区，HA1(SEQ ID NO:66)、HA2(SEQ ID NO:68)、及HA4(SEQID NO:70)是设计为移植了借由AbM的定义方法所确定的CDR(SEQ ID NO:27、29、30)的人源化抗体的重链可变区，L1-4(SEQ ID NO:78)、L1-5(SEQ ID NO:80)、及L1-6(SEQ ID NO:82)是设计为使用IGKV1-NL1*01及JK1的人源化抗体的轻链可变区，L2-4(SEQ ID NO:84)是设计为使用IGKV3D-15*01及JK1的人源化抗体的轻链可变区。此外，在重链恒定区的设计中，EphA4的磷酸化是使用与实例10中所记载的方法相同的方法而确认。

编码HK1、HK2、HK4的氨基酸序列的基因序列是借由如下方式制备：对IGHV7-4-1*02(SEQ ID NO:53)及JH6(SEQ ID NO:54)移植抗体A的重链CDR(SEQ ID NO:26、28、30)，将在N末端附加了信号序列(SEQ ID NO:55)的氨基酸序列借由GenScript USA Inc.转化为基因序列而进行合成，并借由PCR导入变体(HK1：SEQ ID NO:73、HK2：SEQ ID NO:75、HK4：SEQID NO:77、信号序列：SEQ ID NO:57)。编码HA1、HA2、HA4的氨基酸序列的基因序列是借由如下方式制备：对IGHV7-4-1*02(SEQ ID NO:53)及JH6(SEQ ID NO:54)移植抗体A的重链CDR(SEQ ID NO:27、29、30)，将在N末端附加了信号序列(SEQ ID NO:55)的氨基酸序列借由GenScript USA Inc.转化为基因序列而进行合成，并借由PCR导入变体(HA1：SEQ ID NO:67、HA2：SEQ ID NO:69、HA4：SEQ ID NO:71、信号序列：SEQ ID NO:56)。这些编码人源化重链可变区与信号序列的基因是插入至包含编码具有C131S、C219S、V234A及G237A变体且不具有C末端赖氨酸残基的人IgG₂的恒定区(SEQ ID NO:62)的基因序列(SEQ ID NO:63)的表达载体(pcDNA3.4)及包含编码CH1及铰链部为人IgG₁且CH2及CH3具有V234A及G237A的人IgG₂并且不具有C末端赖氨酸残基的恒定区(SEQ ID NO:60)的基因序列(SEQ ID NO:61)的表达载体(pcDNA3.4)中。编码L1-4、L1-5、L1-6的氨基酸序列的基因序列是借由如下方式制备：对IGKV1-NL1*01(SEQ ID NO:50)及JK1(SEQ ID NO:52)移植抗体A的轻链CDR(SEQ IDNO:31-33)，将N末端附加了信号序列(SEQ ID NO:58)的氨基酸序列借由GenScript USAInc.转化为基因序列而进行合成，并借由PCR导入变体(L1-4：SEQ ID NO:79、L1-5：SEQ IDNO:81、L1-6：SEQ ID NO:83、信号序列：SEQ ID NO:59)。编码L2-4的氨基酸序列的基因序列是借由如下方式制备：对IGKV3D-15*01(SEQ ID NO:51)及JK1(SEQ ID NO:52)移植抗体A的轻链CDR(SEQ ID NO:31-33)，将N末端附加了信号序列(SEQ ID NO:58)的氨基酸序列借由GenScript USA Inc.转化为基因序列而进行合成，并借由PCR导入变体(L2-4：SEQ ID NO:85、信号序列：SEQ ID NO:59)。这些编码人源化轻链可变区与信号序列的基因是插入至包含编码人Igκ的恒定区(SEQ ID NO:64)的基因序列(SEQ ID NO:65)的表达载体(pcDNA3.4)中。此处，“C131S”表示Eu编号中的131位的半胱氨酸被置换为丝氨酸的变体，“C219S”表示219位的半胱氨酸被置换为丝氨酸的变体，“V234A”表示234位的缬氨酸被置换为丙氨酸的变体，“G237A”表示237位的甘氨酸被置换为丙氨酸的变体。另外，此处CH1表示人IgG恒定区中Eu编号的118位至215位，铰链部表示人IgG恒定区中216位至230位，CH2表示人IgG恒定区中231位至340位，CH3表示341位至446位。为了产生这些人源化抗体，使用Expi293表达系统(Gibco/Thermo Fisher)，将所述表达载体以表5的组合转染至Expi293F细胞(Gibco/Thermo Fisher)中。回收上清液，使用蛋白A(GE Healthcare)进行纯化。

[表5]

实例17：抗EphA4单克隆人源化抗体针对人EphA4的亲和性

借由使用Biacore T200(GE Healthcare)的表面等离子共振(SPR法)，而确定实例16中所获得的抗EphA4单克隆人源化抗体针对人EphA4的结合亲和性。首先，对于抗体A的测定，将利用小鼠IgG₁抗体对大鼠进行免疫并借由常用方法所制备的大鼠抗小鼠IgG₁抗体固定在传感芯片CM5上。大鼠抗小鼠IgG₁抗体在传感芯片CM5上的固定是借由使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐(EDC)的胺偶合法而进行，封闭是使用乙醇胺(传感芯片或固定用试剂均由GE HEALTHCARE公司制造)。使用固定用缓冲液(10mM乙酸钠，pH值4.5)进行稀释，依据Biacore T200所附带的操作说明，并固定在传感芯片上。人源化单克隆抗体的测定是使用蛋白A芯片(GE Healthcare，29-1383-03)。使用运行缓冲液HBS-EP(GE Healthcare)对抗体A及人源化单克隆抗体进行稀释，仅对流动检测池2送液120秒钟而进行捕获(30-60RU左右的捕获量)。继而，将使用HBS-EP在50、16.7、5.6、1.9、和0.6nM的范围内进行连续稀释的人EphA4细胞外区域-SEAP-His蛋白质不进行再生操作而连续添加至低浓度侧，依序观测添加时(结合相，120秒钟)及添加结束后(解离相，900秒钟)的结合反应曲线。各观测结束后，添加3M MgCl₂(60秒钟)或10mM甘氨酸-HCl pH值1.5(30秒钟)而再生传感芯片。对于所获得的结合反应曲线，借由使用系统附带软件BIAevaluation软件的1:1的结合模型进行拟合分析，而算出针对人EphA4的亲和性(KD＝kd/ka)(表6)。

得知表5的全部人源化抗体均显示出与亲本抗体A大致同等的亲和性(表6)。

[表6]

实例18：抗EphA4单克隆人源化抗体的人EphA4-人配体结合抑制活性

关于实例16中所获得的抗EphA4单克隆人源化抗体，人EphA4与人配体的结合抑制活性的评价是依据以下的步骤而进行。将抗碱性磷酸酶抗体(Thermo Fisher Scientific)涂布在96孔培养盘(Nunc)的孔上。在4℃下培养过夜后，利用1％BlockAce(DS PharmaBiomedical股份有限公司)，将孔在室温下封闭1小时。利用0.05％Tween 20/PBS(ThermoFisher Scientific)清洗3次后，对孔中接种实例2的方法中所获得的人EphA4细胞外区域-SEAP-His蛋白质(最终浓度10nM)，在室温下培养1小时。清洗3次后，对孔中添加配体与经连续稀释的抗体A人源化抗体(0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、和3000nM)。此外，配体是使用生物素化人肝配蛋白A5-Fc嵌合体(R&D Systems、最终浓度0.7nM)。在室温下培养1小时并清洗3次后，添加辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白(GE Healthcare)，在室温下培养1小时。清洗3次后，对孔中添加TMBZ(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，西格玛奥德里奇)溶液，在室温下培养2分钟。对孔中添加等量的反应停止溶液(1NH₂SO₄、和光纯药)，利用酶标仪(PerkinElmer)而读取450nm的吸光度。

可知表5的所有人源化抗体均显示出与亲本抗体A大致同等的抑制活性(表7)。

[表7]

实例19：抗EphA4单克隆人源化抗体针对人Eph受体的选择性

与实例7中所记载的方法同样地，使用源于组织的总RNA，将编码人的各Eph受体(EphA1，EphA2，EphA3，EphA4，EphA5，EphA6，EphA7，EphA8，EphA10，EphB1，EphB2，EphB3，EphB4，和EphB6)的信号序列与细胞外区域的DNA序列借由RT-PCR进行扩增，克隆在具有编码SEAP蛋白质及组氨酸标签的DNA序列的pENTR1A载体(Invitrogen/Life Technologies)上。其次，借由Gateway System(Invitrogen/Life Technologies)的LR反应，将编码人的各Eph受体的信号序列与细胞外区域、SEAP蛋白质及组氨酸标签的DNA序列转移至pcDNA3.1_rfcB载体上，而构建表达对人的各Eph受体的细胞外区域融合SEAP蛋白质与His标签的蛋白质(称为“Eph受体细胞外区域-SEAP-His蛋白质”)的载体(称为“Eph受体细胞外区域-SEAP-His蛋白质表达载体”)。

其次，使用Expi293表达系统(Gibco/Thermo Fisher)，将人的各Eph受体细胞外区域-SEAP-His蛋白质表达载体导入至Expi293F细胞(Gibco/Thermo Fisher)中。在5天的培养(5％CO₂、37℃)后，回收培养上清液，在室温下以1500rpm离心5分钟。将离心上清液利用0.45μm过滤器(默克密理博)进行过滤。

关于实例16中所获得的抗EphA4单克隆人源化抗体，人Eph受体的结合活性的评价是依据以下的步骤而进行。

将兔抗6-His抗体(Bethyl Loboratories)涂布在96孔培养盘(Nunc)的孔上。将孔在室温下封闭1小时后，利用1％Block Ace(DS Pharma Biomedical)，在4℃下培养过夜。利用0.05％Tween 20/PBS(Nacalai Tesque)清洗3次后，对孔中添加人EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、或EphB6的SEAP-His蛋白质(最终浓度1nM)，在室温下培养1小时。清洗3次后，对孔中添加人源化抗体，在室温下培养1小时。清洗3次后，添加辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG抗体(JacksonImmunoResearch Loboratories)，在室温下培养1小时。清洗3次后，对孔中添加TMB微孔过氧化物酶底物系统(KPL)，在确认到适度的显色后，对孔中添加等量的反应停止溶液(1NH₂SO₄、和光纯药)，利用酶标仪(Thermo Fisher Scientific)而读取450nm的吸光度。

在表8中汇总将人EphA4(hEphA4-SEAP-His)的450nm的吸光度设为100％时的比例，结果可知表5的所有人源化抗体均与亲本抗体A同样地对人EphA4特异性地结合(表8)。

[表8]

实例20：抗EphA4单克隆人源化抗体的体内ALS模型的源于人iPS细胞的运动神经元保护效果

人iPS细胞的维持培养是依据以下的步骤而进行。将在液氮中以干细胞冻存液(Takara)进行冷冻保存的人iPS细胞(201B7)从液氮层中取出，迅速悬浮于预先加温至37℃的人iPS细胞培养基(Essential 8,Thermo Fisher scientific)5mL中进行融化。将细胞悬浮液回收至15mL圆锥管(Falcon)中，离心后(1000rpm、5分钟、室温)，去除上清液，并悬浮于新的培养基后，接种至预先利用0.5μg/cm²人重组玻连蛋白(Invitrogen)进行涂布的细胞培养皿(Falcon BD)中，添加10μM Y-27632(和光纯药)，在CO₂培养箱内(5％CO₂、37℃)中进行维持培养。每天更换培养基，在达到融合的时刻用于实验。

实例16中所获得的抗EphA4单克隆人源化抗体的活体外ALS模型的运动神经元保护效果的评价是借由以下的步骤而进行。吸取所维持培养的人iPS细胞的培养基，利用2mLPBS(和光纯药)进行清洗。吸取PBS后，添加0.5mM EDTA 500μL，在CO₂培养箱内(5％CO₂、37℃)培养2至3分钟(每30秒钟利用显微镜进行确认，在细胞彼此的结合减弱的时刻中止培养)。借由悬浮于5mL的人iPS细胞培养基中，而停止EDTA反应，并回收至15mL圆锥管中。以1000rpm在室温下离心5分钟，并吸取上清液。将人iPS细胞块以约1/10量的细胞悬浮液接种至低黏附性6孔细胞培养盘(Nunclone sphere,Nunc)的1个孔中，向含有DFK培养基(2％B27添加剂，5％KnockOut血清替代品(Invitrogen)、2mmol/L L-谷氨酰胺、100单位/mL青霉素-100ug/mL链霉素、及0.1mmol/Lβ-巯基乙醇的高级DMEM/F-12(Invitrogen)：神经元培养基(Invitrogen)[1:1]培养基)中添加2μM SB431542(西格玛奥德里奇)、300nM LDN193189(西格玛奥德里奇)、3μM CHIR99021(西格玛奥德里奇)，在CO₂培养箱内(5％CO₂、37℃)进行培养。借由以下的方法，每2天更换培养基。首先，将人iPS细胞分化细胞块(SFEBs)连同培养基一起回收至15mL圆锥管中，在常温下静置5分钟，由此使细胞块沉淀。吸取其上清液，添加新的DFK培养基、及2μM SB431542(西格玛奥德里奇)、300nM LDN193189(西格玛奥德里奇)、3μM CHIR99021(西格玛奥德里奇)，并送回原来的孔中，由此更换培养基。在培养第8天，将SFEB连同培养基一起回收至15mL圆锥管中，在常温下静置5分钟，由此使SFEB沉淀。吸取其上清液，添加新的DFK培养基，添加0.1μM视黄酸(西格玛奥德里奇)、0.5μM Purmorphamine(Miltenyi Biotec)，并送回至原来的孔中，在CO₂培养箱内(5％CO₂、37℃)进行培养。每2天更换培养基。在培养第12天，将SFEB连同培养基一起回收至15mL圆锥管中，在常温下静置5分钟，由此使SFEB沉淀。吸取上清液，添加500μL的Accumax(MS TechnoSystems)并吸液数次后，在CO₂培养箱内(5％CO₂、37℃)培养5分钟。从培养箱中取出细胞，悬浮于5mL的DFK培养基中，并吸液数次，由此使细胞块分散。将细胞悬浮液利用细胞滤网(Falcon)进行过滤，而解离为单一细胞后，利用计数室而计数细胞数。将细胞悬浮液回收至新的15mL圆锥管中，以1000rpm在室温下离心5分钟。利用运动神经培养基(含有2％B27添加剂、1％马血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、100单位/mL青霉素-100ug/mL链霉素、及0.1mmol/Lβ-巯基乙醇的高级DMEM/F-12(Invitrogen)：神经元培养基(Invitrogen)[1:1]培养基))而制备细胞密度为5.5×10⁵细胞/mL的悬浮液，以200μL/孔接种至预先以8×10⁴细胞/孔接种了源于小鼠的野生型星形胶质细胞或变体人SOD1(G93A)表达星形胶质细胞的8孔培养玻片上，作为星形胶质细胞与运动神经元的共培养细胞而用于评价(此外，野生型、及人变体SOD1(G93A)表达星形胶质细胞的建立、冷冻、融化、接种、维持培养是借由与实例13相同的方法而进行)。将在野生型星形胶质细胞与运动神经元的共培养中所观察到的运动神经元数设为对照。在药物处置组中，进行变体人SOD1(G93A)表达星形胶质细胞与运动神经元的共培养，将条件设为添加溶剂(IgG、及0.1％超纯水)、添加人源化抗体。在各条件下在5％CO₂、37℃的条件下培养2天后，使用抗ISL1抗体(从Developmental Studies Hybridoma Bank取得)及Hoechst 33342(Molecular probe)对运动神经元进行免疫细胞化学染色。将每1个孔的ISL1/Hoechst33342共阳性细胞作为存活运动神经元而进行计数，运动神经元存活率是作为相对于对照的％而算出。

在源于变体人SOD1(G93A)表达星形胶质细胞/人iPS细胞的运动神经元共培养中，运动神经元存活率显著降低。表5中所记载的人源化抗体浓度依赖性地抑制由变体人SOD1(G93A)表达星形胶质细胞所诱发的源于人iPS细胞的运动神经元的死亡。由此显示，抗EphA4单克隆人源化抗体在人细胞内促进运动神经元的存活。

工业实用性

本发明提供能够与EphA4结合并抑制EphA4与其配体之间的结合的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段及含有所述抗EphA4抗体或其EphA4结合片段作为有效成分的药物组合物。本发明的抗体或药物组合物可用于治疗由EphA4与其配体之间的结合所引起的疾病、例如ALS。

Claims

1.一种抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其含有：

(a)包含SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的CDR-H1；

(b)包含SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的CDR-H2；

(c)包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的CDR-H3；

(d)包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的CDR-L1；

(e)包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的CDR-L2；及

(f)包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的CDR-L3。

2.如权利要求1所述的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述抗体或其EphA4结合片段经人源化。

3.如权利要求1或2所述的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

4.如权利要求1至3中任一项所述的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述抗体或其EphA4结合片段含有重链及轻链，并且

所述重链的恒定区及所述轻链的恒定区各自含有源于人抗体的序列。

5.如权利要求4所述的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述重链的恒定区源于人IgG。

6.如权利要求5所述的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述人IgG为人IgG₁或人IgG₂。

7.如权利要求4至6中任一项所述的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述轻链的恒定区源于人Igκ。

8.如权利要求1至7中任一项所述的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述EphA4结合片段选自由Fab、Fab'、F(ab')₂、及Fv组成的组。

9.如权利要求8所述的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段，其中

所述EphA4结合片段为F(ab')₂。

10.一种药物组合物，其含有

如权利要求1至9中任一项所述的抗EphA4抗体或其EphA4结合片段。

11.如权利要求10所述的药物组合物，其进一步含有

药学上可接受的载体。

12.如权利要求10或11所述的药物组合物，其中