TW201716442A

TW201716442A - 抗EphA4抗體

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Publication number: TW201716442A
Application number: TW105128767A
Authority: TW
Inventors: 田口良太; 今井俊夫; 井上英二; 山田章夫; 中谷亜季; 平山俊文; 尾野雄一; 伊藤俊介
Original assignee: 衛材Ｒ＆Ｄ企管股份有限公司
Priority date: 2015-09-08
Filing date: 2016-09-06
Publication date: 2017-05-16
Also published as: CN111320693B; AR105938A1; EP3381941A1; RU2719158C2; MX2018002164A; EP3381941B1; SG11201800127WA; ES2846175T3; CN107922499A; RU2019128192A; JP6738814B2; US20190077860A1; IL268889A; CN111320693A; US10428140B2; JP2020010691A; WO2017043466A1; RU2018106456A3; AU2016319433A8; JP6770153B2

Abstract

本發明提供一種能夠與EphA4結合，而抑制EphA4與其配位基的結合的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段及含有該等作為有效成分的醫藥組合物。取得對EphA4具有結合親和性的小鼠抗EphA4抗體，並特定出該小鼠抗EphA4抗體的互補決定區(CDR)的序列。由此，能夠製作在重鏈及輕鏈的可變區含有所述小鼠抗EphA4抗體的CDR序列的人源化抗體。

Description

抗EphA4抗體

本發明涉及一種與EphA4結合的抗體。

EphA4係受體型酪胺酸激酶家族之一。已知肝配蛋白(Ephrin)A型及B型係EphA4的配位基，EphA4與作為其配位基的肝配蛋白結合，會誘導產生脫黏附信號。EphA4係在運動神經元中表現，在神經回路形成期的脊髓中，藉由在運動神經元的非投射區表現肝配蛋白，而控制正確的軸突導向。

根據以往的研究，提示EphA4的功能抑制係針對肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis，以下也稱為“ALS”)或阿茲海默症等神經退行性疾病、脊髓損傷的有效治療手段。

報告了EphA4係調整ALS的表現型的基因(專利文獻1、非專利文獻1)。顯示出EphA4的遺傳缺陷或利用EphA4-Fc等所產生的拮抗作用會促進小鼠、大鼠的脊髓損傷時的軸突伸長或功能恢復(非專利文獻2及非專利文獻3)。

作為現有的EphA4抑制藥，已知有KYL肽及化合物1(專利文獻1、非專利文獻1及非專利文獻2)，關於具有中和活性的抗體尚無報告。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1] WO2012/156351A1

[非專利文獻]

[非專利文獻1] Van Hoecke et al., Nature Medicine，vol18：1418-1422，2012

[非專利文獻2] Goldshmit et al., PLoS one，vol6：e24636，2011

[非專利文獻3] Spanevello et al., Journal of Neurotrauma，vol30：1023-1034，2013

本發明的課題在於提供一種能夠與EphA4結合，而抑制EphA4與其配位基的結合的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段及含有彼等作為有效成分的醫藥組合物。

本發明者等人為了解決所述課題而反復進行了努力研究，結果藉由取得能夠與EphA4結合，而抑制EphA4與其配位基的結合的抗EphA4抗體，而完成了本發明。

即，本發明在一個實施方式中涉及以下的發明。

(1)一種抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其含有：(a)包含序列編號26或序列編號27所示的胺基酸序列的CDR-H1；(b)包含序列編號28或序列編號29所示的胺基酸序列的CDR-H2；(c)包含序列編號30所示的胺基酸序列的CDR-H3；(d)包含序列編號31所示的胺基酸序列的CDR-L1； (e)包含序列編號32所示的胺基酸序列的CDR-L2；及(f)包含序列編號33所示的胺基酸序列的CDR-L3。

(2)根據(1)所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其經人源化。

(3)根據(1)或(2)所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述抗體或其EphA4結合片段係與EphA4特異性地結合，而抑制EphA4與肝配蛋白的結合。

(4)根據(1)至(3)中任一項所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述抗體或其EphA4結合片段含有重鏈及輕鏈，所述重鏈的恒定區及所述輕鏈的恒定區含有源於人抗體的序列。

(5)根據(4)所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的恒定區為人IgG。

(6)根據(5)所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述人IgG為人IgG₁或人IgG₂。

(7)根據(4)至(6)中任一項所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述輕鏈的恒定區為人Igκ。

(8)根據(1)至(7)中任一項所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述EphA4結合片段係選自由Fab、Fab'、F(ab')₂、及Fv所組成的族群中。

(9)根據(8)所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述EphA4結合片段為F(ab')₂。

(10)一種醫藥組合物，其含有(1)至(9)中任一項所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段。

(11)根據(10)所記載的醫藥組合物，其還含有製藥學上容許的載體。

(12)根據(10)或(11)所記載的醫藥組合物，其係用於治療肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)。

另外，本發明在另一個實施方式中涉及以下的發明。

(1')一種抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，所述抗體或其EphA4結合片段含有重鏈及輕鏈，所述重鏈的可變區含有序列編號66、68、70、72、74或76所示的胺基酸序列或在該序列中有1個或多個胺基酸經置換、附加及/或缺失的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號78、80、82、或84所示的胺基酸序列或在該序列中有1個或多個胺基酸經置換、附加及/或缺失的胺基酸序列，所述抗體或其EphA4結合片段與EphA4特異性地結合，而抑制EphA4與肝配蛋白的結合。

(2')一種抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，所述抗體或其EphA4結合片段含有重鏈及輕鏈，所述重鏈的可變區含有序列編號66、68、70、72、74或76所示的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號78、80、82、或84所示的胺基酸序列。

(3')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號66的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號78的胺基酸序列。

(4')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號68的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號78的胺基酸序列。

(5')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號70的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號78的胺基酸序列。

(6')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號72的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號78的胺基酸序列。

(7')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號74的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號78的胺基酸序列。

(8')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號76的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號78的胺基酸序列。

(9')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號66的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號80的胺基酸序列。

(10')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號68的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號80的胺基酸序列。

(11')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號70的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號80的胺基酸序列。

(12')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號72的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號80的胺基酸序列。

(13')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號74的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號80的胺基酸序列。

(14')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段其中，所述重鏈的可變區含有序列編號76的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號80的胺基酸序列。

(15')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號66的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號82的胺基酸序列。

(16')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號68的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號82的胺基酸序列。

(17')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號70的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號82的胺基酸序列。

(18')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號72的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號82的胺基酸序列。

(19')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號74的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號82的胺基酸序列。

(20')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號76的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號82的胺基酸序列。

(21')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號66的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號84的胺基酸序列。

(22')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號68的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號84的胺基酸序列。

(23')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號70的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號84的胺基酸序列。

(24')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號72的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號84的胺基酸序列。

(25')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號74的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號84的胺基酸序列。

(26')根據(1')或(2')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的可變區含有序列編號76的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號84的胺基酸序列。

(27')根據(1')至(26')中任一項所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述抗體或其EphA4結合片段係與EphA4特異性地結合，而抑制EphA4與肝配蛋白的結合。

(28')根據(1')至(27')中任一項所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的恒定區及所述輕鏈的恒定區含有源於人抗體的序列。

(29')根據(28')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述重鏈的恒定區為人IgG。

(30')根據(29')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述人IgG為人IgG₂、或包含人IgG₁與人IgG₂的組合的人IgG。

(31')根據(30')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述人IgG為人IgG₂。

(32')根據(31')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述人IgG₂具有Eu編號中的C131S、C219S、V234A及/或G237A變異，且在羧基末端不具有賴胺酸殘基。

(33')根據(32')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述人IgG₂含有序列編號62的胺基酸序列。

(34')根據(30')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述人IgG為包含人IgG₁與人IgG₂的組合的人IgG。

(35')根據(34')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述包含人IgG₁與人IgG₂的組合的人IgG中，CH1及鉸鏈部為人IgG₁，CH2及CH3為人IgG₂。

(36')根據(35')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述包含人IgG₁與人IgG₂的組合的人IgG具有Eu編號中的V234A及/或G237A變異，且在羧基末端不具有賴胺酸殘基。

(37')根據(36')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述包含人IgG₁與人IgG₂的組合的人IgG含有序列編號60的胺基酸序列。

(38')根據(28')至(37')中任一項所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述輕鏈的恒定區為人Igκ。

(39')根據(1')至(38')中任一項所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述EphA4結合片段係選自由Fab、Fab'、F(ab')₂、及Fv所組成的族群中。

(40')根據(39')所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中所述EphA4結合片段為F(ab')₂。

(41')一種醫藥組合物，其含有(1')至(40')中任一項所記載的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段。

(42')根據(41')所記載的醫藥組合物，其還含有製藥學上容許的載體。

(43')根據(41')或(42')所記載的醫藥組合物，其係用於治療肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)。

將以上所列舉的本發明的一個或多個形態任意地組合而成的發明也含有在本發明的範圍內。

根據本發明，提供一種能夠與EphA4結合，而抑制EphA4與其配位基的結合的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段及含有彼等作為有效成分的醫藥組合物。

圖1表示抗EphA4單株抗體(抗體A)針對人EphA4及小鼠EphA4的結合親和性。

圖2表示利用抗EphA4單株抗體(抗體A)、KYL肽及化合物1所產生的小鼠EphA4、與小鼠肝配蛋白A1及小鼠肝配蛋白B2的結合抑制。

圖3表示利用抗EphA4單株抗體(抗體A)、及KYL肽所產生的人EphA4、與人肝配蛋白A5及人肝配蛋白B3的結合抑制。

圖4A表示抗體A-IgG(抗體A)及抗體A-Fab針對小鼠EphA4的結合親和性。

圖4B表示抗體A-IgG(抗體A)及抗體A-F(ab')₂針對小鼠EphA4的結合親和性。

圖4C表示抗體A-IgG(抗體A)及抗體A-Fab針對人EphA4的結合親和性。

圖4D表示抗體A-IgG(抗體A)及抗體A-F(ab')₂針對人EphA4的結合親和性。

圖5表示利用抗體A-IgG(抗體A)、抗體A-F(ab')₂、抗體A-Fab、及KYL肽所產生的小鼠EphA4與小鼠肝配蛋白B2的結合抑制。

圖6表示抗體A針對人Eph受體(圖6A)及小鼠Eph受體(圖6B)的結合特異性。

圖7表示抗體A的與小鼠EphA4、大鼠EphA4、猴EphA4及人EphA4 的結合活性。

圖8表示抗體A在海馬神經元中濃度依賴性地抑制由肝配蛋白A1所誘發的EphA4自磷酸化(autophosphorylation)。圖8中的pY表示磷酸化EphA4。

圖9表示抗體A在海馬神經元中濃度依賴性地抑制由肝配蛋白A1所誘發的生長錐萎陷(growth cone collapse)。

圖10表示抗體A在新生小鼠腦中，抑制由肝配蛋白A1所誘發的EphA4自磷酸化。圖10中的pY表示磷酸化EphA4。

圖11表示實施方式13中所實施的評價系統之示意圖。

圖12表示抗體A在使用小鼠ES細胞的活體外ALS模型中保護運動神經元。

圖13表示實施方式14中所實施的評價系統之示意圖。

圖14表示抗體A在使用人iPS細胞的活體外ALS模型中保護運動神經元。

圖15中，橫軸表示EphA4-配位基結合區(EphA4-LBD)的胺基酸，縱軸表示Fab的結構區。黑色位元表示存在相互作用的組合的交點。另外，對於1個殘基的胺基酸而存在的多個位元對應於相互作用的種類(氫鍵、表面接觸等)。位元數量越多的胺基酸，表示以越多樣的相互作用而與Fab結合。

圖16表示EphA4-配位基結合區(EphA4-LBD)的表面結構。在圖16中，顏色深的區域屬於Fab結合區。另外，在圖中，將結合區所含的胺基酸名與殘基編號示於相應的位置，所結合的Fab的H鏈及L鏈的CDR以帶狀模型表示。

本發明涉及一種與EphA4結合的抗EphA4抗體。

本發明中所使用的抗EphA4抗體係能夠識別EphA4並與之結合的抗體，如下所述，該抗體可為完整的抗體，或者只要具有與EphA4的結合親和性，則也可為其抗原結合片段或合成抗體(例如重組抗體、嵌合抗體、人源化抗體等)。在本發明中，可理解為EphA4係指源於人、小鼠、大鼠及猴的EphA4。源於人、小鼠、大鼠及猴的EphA4除了可從美國國立生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)所提供的基因庫等登記有序列數據的公共資料庫取得以外，還可藉由基於具有親緣關係的動物種的EphA4的鹼基序列數據而設計引物，並由從所需的動物種所提取的RNA進行轉殖，而取得EphA4基因的序列數據。例如，人、小鼠、大鼠、猴的EphA4的鹼基序列數據分別以基因庫登記號NM_004438.4、NM_007936.3、NM_001162411.1、NM_001260870而登記在資料庫中。

在本發明的一個實施方式中，EphA4含有序列編號1所示的胺基酸序列或在該胺基酸序列中有1個或多個胺基酸經置換、附加及/或缺失的胺基酸序列，或含有序列編號3所示的胺基酸序列或在該胺基酸序列中有1個或多個胺基酸經置換、附加及/或缺失的胺基酸序列。在本發明中，關於EphA4所使用的“多個”，只要保持與成為其基礎的序列同等的功能特性，則沒有限定，為2個~100個、例如2個~90個、2個~80個、2個~70個、2個~60個、2個~50個、2個~40個、2個~30個、2個~20個、2個~10個、或2個~5個，或為胺基酸中的胺基酸數的10%以內、例如9%以內、8%以內、7%以內、6%以內、或5%以內。

在本發明的一個形態中，抗EphA4抗體或其EphA4結合片段係與EphA4特異性地結合的抗體。“特異性結合”的術語係熟習該項技術者公知的術語，用以確定抗體或其抗原結合片段針對抗原或表位的特異性結合的方法也是眾所周知的。在本發明的一個實施方式中，“特異性結合”係理解為：抗EphA4抗體或其EphA4結合片段相比於與其他靶分子結合，能夠以更大的結合親和性、結合活性，更迅速及/或更長時間持續地藉由免疫學反應與EphA4結合。就這一點而言，並不排除與某個靶特異性地結合的抗體或其抗原結合片段會與其他靶特異性地結合。在本發明的另一個實施方式中，“特異性結合”能夠利用對於EphA4具有至少約10^-7M、或至少約10^-8M、或至少約10^-9M、或至少約10^-10M、或至少約10^-11M、或至少約10^-12M、或其以上的KD的抗體而顯示出。另外，在本發明的又一個實施方式中，“特異性結合”係理解為：與EphA4藉由免疫學反應進行結合，但實質上不與Eph受體的其他亞類及亞型結合。

在本發明的一個形態中，本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段係與EphA4的細胞外區域結合的抗體。例如，本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段可為含有序列編號2所示的胺基酸序列或在該胺基酸序列中有1個或多個胺基酸經置換、附加及/或缺失的胺基酸序列，或含有序列編號4所示的胺基酸序列或在該胺基酸序列中有1個或多個胺基酸經置換、附加及/或缺失的胺基酸序列的與EphA4細胞外區域的任一個部位結合的抗體或抗原結合片段。在本發明中，關於EphA4的細胞外區域而使用的“多個”為2個~50個、例如2個~45個、2個~40個、2個~35個、2個~30個、2個~25個、2個~20個、2個~15個、2個~10個、或2個~5個，或為胺基酸中的胺基酸數的10%以內、例如9%以內、8%以內、7%以內、6%以內、或5%以內，但並不限定於此。

在本發明的一個形態中，抗EphA4抗體或其EphA4結合片段能夠與 EphA4特異性地結合，而抑制EphA4與肝配蛋白的結合。

在本發明的一個實施方式中，抗EphA4抗體或其EphA4結合片段能夠與人EphA4、小鼠EphA4、大鼠EphA4、及猴EphA4中的至少一個特異性地結合，而抑制與其配位基的結合。在本發明的較佳的實施方式中，抗EphA4抗體或其EphA4結合片段能夠與人EphA4、小鼠EphA4、大鼠EphA4、及猴EphA4中的兩個以上特異性地結合，而抑制與其配位基的結合。在本發明的另一個較佳的實施方式中，抗EphA4抗體或其EphA4結合片段能夠與人EphA4、小鼠EphA4、大鼠EphA4、及猴EphA4的全部特異性地結合，而抑制與其配位基的結合。

測定抗體或其抗原結合片段的對抗原的結合特性(例如，結合親和性及跨物種反應性)的方法可使用熟習該項技術者公知的方法。例如，結合親和性可使用Biacore(註冊商標)生物感測器、KinExA生物感測器、鄰近閃爍分析(scintillation proximity assay)、ELISA(enzyme linked immunosorbent assay，酶聯免疫吸附測定)、ORIGEN免疫測定法(IGEN公司)、流式細胞儀、螢光淬滅、螢光轉移、酵母展示及/或免疫染色進行測定，但並不限定於該等。抗體或其抗原結合片段針對EphA4與其配位基的結合的中和活性可使用Biacore(註冊商標)生物感測器、ELISA及/或流式細胞儀進行測定，但並不限定於該等。

本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段只要與EphA4結合、較佳的是特異性地結合，則可為單株抗體、多株抗體、或其EphA4結合片段中的任一個。

在本發明中，本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段可為IgG、IgA或IgM(或該等的亞類)等任意類型，並不限定於特定類型。根據重鏈(有時稱為H鏈)的恒定區的抗體胺基酸序列，免疫球蛋白被分為不同類型。5個主要的免疫球蛋白的類型有：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，該等中的幾個可進一步細分為例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁及IgA₂的亞類(同種型)。不同類型的免疫球蛋白的對應的重鏈的恒定區分別稱為α、δ、ε、γ及μ。另外，抗體的輕鏈(有時稱為L鏈)的種類有λ鏈及κ鏈。

本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段可為IgG抗體，也可為例如IgG₁抗體或IgG₂抗體等。另外，本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段根據情況也可為單體、二聚物或多聚物的形態。

在本發明的一個形態中，本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段可為不同亞類的IgG抗體的組合，也可為例如包含IgG₁抗體及IgG₂抗體的組合的IgG抗體等。

在本說明書中，抗體的抗原結合片段只要為該抗體的功能性、結構性的片段，保持針對該抗體能夠結合的抗原的結合性，則沒有特別限定。作為抗體的抗原結合片段的例子，可列舉Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、單鏈(ScFv)、這些的變異體、含有抗體部分的融合蛋白質及含有抗原識別部位的免疫球蛋白分子的其他修飾結構體等，但並不限定於此。在一個形態中，本發明的抗體的結合片段為F(ab')₂。

抗體的抗原結合片段可經由利用例如木瓜酶、胃蛋白酶等蛋白酶所進行的完全的抗體蛋白質消化而獲得，或者也可利用重組宿主細胞(例如酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞或者哺乳動物細胞等真核生物、或大腸桿菌等原核生物)而直接產生。例如，也可從大腸桿菌直接回收Fab'-SH片段，使之進行化學結合，而形成F(ab')₂片段。另外，F(ab')₂也可使用促進F(ab')₂分子組裝的亮胺酸拉鍊GCN4而形成。另外，在利用化學合成技術來生產 scFv的情況下，可使用自動合成機。在利用基因重組技術來生產scFv的情況下，可將含有編碼scFv的多核苷酸的適當的質粒導人到適當的宿主細胞(例如酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞或者哺乳動物細胞等真核生物、或大腸桿菌等原核生物)中。編碼目標scFv的多核苷酸也可藉由多核苷酸的連接等眾所周知的操作而製作。結果所產生的scFv也可使用本技術領域公知的標準蛋白質精製技術而單獨分離。

在本發明中，抗體的可變區意指抗體輕鏈的可變區及/或抗體重鏈的可變區，抗體的恒定區意指抗體輕鏈的恒定區及/或抗體重鏈的恒定區。重鏈及輕鏈的可變區分別包含利用作為高變區而已知的三個CDR連結而成的四個框架區(FR)。各鏈中的CDR利用FR而被保持在附近，與另一條鏈中的CDR一同有助於形成抗體的抗原結合部位。作為用以確定CDR的技術，例如可列舉(1)基於跨物種序列可變性的方法(例如Kabat et al，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th ed.，1991，National Institutes of Health，Bethesda MD)；及(2)基於抗原-抗體複合體的晶體結構學研究的方法(Al-lazikani et al.，1997 J.Molec.Biol.273：927-948)，但並不限定於此。可使用該等方法，或者也可組合其他方法而使用。重鏈的恒定區係由三個區域CH1、CH2、CH3及鉸鏈部所構成，以CH1、鉸鏈部、CH2、CH3的順序從胺基末端(N末端)向羧基末端(C末端)進行配置。輕鏈的恒定區係由一個區域CL所構成。

在本發明中，單株抗體意指由實質上均勻的抗體的群體所獲得的抗體。即，該群體所含的各個抗體除了若干有可能存在的某天然的突變體以外，為一致。單株抗體係針對單一抗原部位的抗體，極具特異性。此外，與以不同的抗原或不同的表位作為靶的典型的多株抗體相比，各單株抗體係以抗原的單一表位作為靶的抗體。修飾語“單株”表示由實質上均勻的抗體群體所獲得的抗體的特性，不應限定性地理解為必須藉由特定方法來生產抗體。

本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段可為嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、非人哺乳動物(例如猴、小鼠、大鼠、兔、牛、馬、山羊等)的抗體、或這些的EphA4結合片段。嵌合抗體例如為將非人(例如小鼠或大鼠)抗體的可變區導入到人抗體的恒定區而成的抗體，例如係指可變區源於非人抗體且恒定區源於人抗體的抗體。人源化抗體例如為將非人抗體的高變區(也稱為互補決定區(complementarity-determining region：CDR))導入到人抗體中而成的抗體，例如係指CDR源於非人抗體且其以外的抗體區源於人抗體的抗體。其中，在本發明中，嵌合抗體與人源化抗體的邊界並非必須明確，既可稱為嵌合抗體也可稱為人源化抗體的狀態也是可以的。在本發明中，作為較佳的人源化抗體的形態，為CDR源於齧齒類抗體且其以外的抗體區源於人抗體的抗體，特別較佳的是CDR源於小鼠抗體且其以外的抗體區源於人抗體的抗體。人源化除了可使用CDR移植法(Kontermann and Dubel，Antibody Engineering，Springer Lab Manual(2001)and Tsurushita et al.，Methods 36：69-83(2005))而進行以外，也可使用本技術領域的公知方法(例如參照Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-327(1988)；及Verhoeyen et al.，Science 239：1534-1536(1988))，藉由用CDR序列置換掉人抗體的對應序列而進行。人源化抗體典型而言係若干個CDR殘基、及根據情況的若干個FR殘基被置換為源於非人抗體的類似部位的殘基的人抗體。

為了減少抗原性，重要的是在人源化抗體的製作中，對於輕鏈及重鏈兩者，對人可變區的使用加以選擇。根據“最佳適合”法，對於已知的人FR序列的全基因庫，篩選齧齒類抗體的可變區的序列。其次，最接近齧齒類的序列的人序列係作為人源化抗體的人FR而收入。例如，望參照Sims et al.，J.Immunol.151：2296-2308(1993)及Chothia et al.，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)。在別的方法中，使用輕鏈或重鏈的特定亞群的源於全部的人抗體的共通序列的特定框架。針對若干個不同的人源化抗體，可使用相同的框架。例如，望參照Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Set USA 89：4285-4289(1992)and Presta et al.，J.Immunol.151：2623-2632(1993)。

此外，人源化抗體通常理想為保持針對抗原的高結合親和性及其他較佳的生物學性質。為了實現該目標，根據一個方法，人源化抗體係藉由使用親代序列及人源化序列的三維模型的親代序列及各種概念的人源化產物的分析步驟而製備。通常可利用三維的免疫球蛋白模型，這係本領域技術人員已知的。可利用將所選擇的候補的免疫球蛋白序列的有希望的三維立體結構進行模式化而顯示的電腦程式。藉由對該等顯示內容進行研究，而能夠分析候補的免疫球蛋白序列功能中殘基可能具有的某種作用、即分析候補的免疫球蛋白對與其抗原結合之能力產生影響的殘基。可藉由該方法，以實現針對單個或多個靶抗原(例如EphA4或其片段)的結合親和性增大這樣的期待的抗體特性的方式，從接受序列(recipient sequence)及導人序列(import sequence)中選擇FR殘基，並進行組合。

當然，將以上所例示的嵌合抗體或人源化抗體在保持該抗體的功能的情況下(或者為了附加、提高該抗體的功能)進行適當重構(例如，抗體的修飾、或抗體的胺基酸序列的一部分的置換、附加及/或缺失)的抗體也包含在本發明的抗體中。更具體而言，為了減少由抗體產生細胞所產生的抗體的不均勻性，而藉由基因重構等人工方法使位於重鏈的羧基末端(C末端)的賴胺酸(Lys)缺失的抗體也包含在本發明的範圍內。另外，為了修飾抗體的效應器功能，而對恒定區的胺基酸序列進行重構的抗體也含有於本發明的範圍內，例如為了降低抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)活性及/或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)活性，而將人IgG₂抗體的Eu編號中的234位的纈胺酸(Val)置換為丙胺酸(Ala)且將237位的甘胺酸(Gly)置換為丙胺酸(Ala)的抗體等也含有於本發明的範圍內。此外，兼具具有本發明的抗體的CDR序列的抗體結合部位、和與不同抗原結合的抗原結合部位的雙重特異性抗體(Kontermann(2012)，mAbs 4,182-97)也含有於本發明的範圍內。

本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段根據需要也可加以修飾。本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段的修飾可為使針對(a)例如片層或螺旋構象等的修飾區域的胺基酸序列的三維結構；(b)靶部位的分子的電荷或疏水性的狀態；或(c)維持側鏈體積的修飾效果發生變化的修飾，或者也可為不會明確地觀察到該等變化的修飾。

本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段的修飾例如也可藉由所構成的胺基酸殘基的置換、缺失、附加等而實現。

在本說明書中，所謂胺基酸係使用其最廣義的含義，不僅包括天然的胺基酸、例如絲胺酸(Ser)、天冬醯胺(Asn)、纈胺酸(Val)、亮胺酸(Leu)、異亮胺酸(Ile)、丙胺酸(Ala)、酪胺酸(Tyr)、甘胺酸(Gly)、賴胺酸(Lys)、精胺酸(Arg)、組胺酸(His)、天冬醯胺酸(Asp)、穀胺酸(Glu)、穀醯胺(Gln)、蘇胺酸(Thr)、半胱胺酸(Cys)、甲硫胺酸(Met)、苯丙胺酸(Phe)、色胺酸 (Trp)、脯胺酸(Pro)，還包括胺基酸變異體及衍生物這樣的非天然胺基酸。本領域技術人員考慮到該廣義定義，當然可理解，作為本說明書中的胺基酸，例如可列舉：L-胺基酸；D-胺基酸；胺基酸變異體、胺基酸衍生物等經化學修飾的胺基酸；正亮胺酸、β-丙胺酸、鳥胺酸等在生物體內不會成為蛋白質構成材料的胺基酸；及本領域技術人員公知的具有胺基酸特性的藉由化學合成的化合物等。作為非天然胺基酸的例子，可列舉：α-甲基胺基酸(α-甲基丙胺酸等)、D-胺基酸(D-天冬醯胺酸、D-穀胺酸等)、類組胺酸胺基酸(2-胺基組胺酸、β-羥基組胺酸、高組胺酸、α-氟甲基組胺酸、α-甲基組胺酸等)、在側鏈上具有多餘的亞甲基的胺基酸(“高”胺基酸)及側鏈中的羧酸官能團胺基酸被置換為磺酸基的胺基酸(半胱胺酸等)等。

天然存在的胺基酸殘基例如可基於一般的側鏈特性而分類為以下的族群：(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；(5)對鏈取向產生影響的殘基：Gly、Pro；及(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。

構成抗體或其抗原結合片段的胺基酸序列的非保存的置換也可藉由將屬於該等族群之一的胺基酸換為屬於其他族群的胺基酸而進行。進一步的保存性置換也可藉由將屬於該等族群之一的胺基酸換為同一個族群中的其他胺基酸而進行。同樣地，也可適當進行胺基酸序列的缺失或置換。

作為構成抗體或其抗原結合片段的胺基酸的修飾，例如可為利用糖所進行的糖基化、乙醯基化或磷酸化等翻譯後修飾。抗體可在保存其恒定區的位置進行糖基化。抗體的糖基化通常為N-結合型或O-結合型中的任一者。N-結合型係指針對天冬醯胺殘基側鏈的糖質部分的結合。作為三肽序列的天冬醯胺-X-絲胺酸、天冬醯胺-X-蘇胺酸及天冬醯胺-X-半胱胺酸(式中，X為脯胺酸以外的任意的胺基酸)係用以利用酶附加針對天冬醯胺側鏈的糖質部分的識別序列。藉由使該等三肽序列中的任一個存在於抗體或其抗原結合片段中，而存在潛在性的糖基化部位。O-結合型糖基化可為N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖、或木糖中的任一個對羥基胺基酸(例如絲胺酸或蘇胺酸)的結合，根據情況也可為對5-羥基脯胺酸或5-羥基賴胺酸的結合。本領域技術人員可根據目的而適當選擇糖基化的條件(在使用生物學方法進行糖基化的情況下，例如為宿主細胞或細胞培養基的種類、pH值等)。

對於本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，還可基於本領域技術人員公知的技術常識，藉由其他修飾方法進行單獨修飾或組合而進行修飾。

本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段也可藉由本領域技術人員眾所周知的方法而產生。例如，可使用產生本發明的EphA4抗體或其EphA4結合片段的融合瘤而使抗體產生，或者也可將編碼本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段的基因組入到表現載體中，再將該表現載體導入到大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞等中而使抗體產生。編碼本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段的基因較佳的是具有編碼信號序列的DNA，更較佳的是在編碼重鏈可變區的DNA及編碼輕鏈可變區的DNA的5'末端具有編碼信號序列的DNA。信號序列係在核糖體上合成了分泌蛋白質或內在膜蛋白質後，跨過脂質雙層所必需的存在於蛋白質的N末端的胺基酸殘基，在本發明中，只要為具有該功能的序列，則沒有特別限定。作為本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段可含有的信號序列，可列舉源於人、小鼠、大鼠、兔、驢、山羊、馬、鳥、狗、貓、酵母等的信號序列。關於信號序列的一個具體形態，作為關於重鏈的信號序列，可列舉含有序列編號10或序列編號55所表示的胺基酸序列的肽，作為關於輕鏈的信號序列，可列舉含有序列編號12或序列編號58所表示的胺基酸序列的肽。另外，只要在功能上同等，則在序列編號10所表示的胺基酸序列、序列編號55所表示的胺基酸序列、序列編號12所表示的胺基酸序列或序列編號58所表示的胺基酸序列中也可具有1個或多個(例如2、3、4或5個)的胺基酸的置換、附加及/或缺失。

本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段也可依據本領域技術人員公知的方法進行單獨分離或精製。此處，“經單獨分離的”或“經精製的”係指人工地從自然狀態進行單獨分離、或進行精製。在分子或組合物係自然產生的情況下，在為其發生變化或者從原本的環境中被去除、或這兩種情況時，就係“經單獨分離的”或“經精製的”。作為單獨分離或精製的方法的例子，可列舉：電泳、分子生物學、免疫學或色譜的方法等，具體可列舉離子交換色譜法、疏水性色譜法、或反相HPLC色譜法、或者等電聚焦電泳等，但並不限定於該等。

在本發明的另一個較佳的實施方式中，抗EphA4抗體或其EphA4結合片段具有以下的CDR：(a)含有序列編號26或序列編號27所示的胺基酸序列的CDR-H1；(b)含有序列編號28或序列編號29所示的胺基酸序列的CDR-H2；(c)含有序列編號30所示的胺基酸序列的CDR-H3； (d)含有序列編號31所示的胺基酸序列的CDR-L1；(e)含有序列編號32所示的胺基酸序列的CDR-L2；及(f)含有序列編號33所示的胺基酸序列的CDR-L3。

在本發明的一個實施態樣中，所述抗EphA4抗體或其EphA4結合片段為人源化抗體或嵌合抗體，較佳的是人源化抗體。

在本發明的另一個較佳的實施方式中，抗EphA4抗體或其EphA4結合片段具有以下的CDR：(a)含有序列編號26所示的胺基酸序列的CDR-H1；(b)含有序列編號28所示的胺基酸序列的CDR-H2；(c)含有序列編號30所示的胺基酸序列的CDR-H3；(d)含有序列編號31所示的胺基酸序列的CDR-L1；(e)含有序列編號32所示的胺基酸序列的CDR-L2；及(f)含有序列編號33所示的胺基酸序列的CDR-L3。

在本發明的另一個較佳的實施方式中，抗EphA4抗體或其EphA4結合片段具有以下的CDR：(a)含有序列編號27所示的胺基酸序列的CDR-H1；(b)含有序列編號29所示的胺基酸序列的CDR-H2；(c)含有序列編號30所示的胺基酸序列的CDR-H3；(d)含有序列編號31所示的胺基酸序列的CDR-L1；(e)含有序列編號32所示的胺基酸序列的CDR-L2；及(f)含有序列編號33所示的胺基酸序列的CDR-L3。

在本發明的另一個較佳的實施方式中，抗EphA4抗體或其EphA4結合片段含有重鏈及輕鏈，所述重鏈的可變區含有序列編號11所示的胺基酸序列或在該序列中有1個或多個胺基酸經置換、附加及/或缺失的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號13所示的胺基酸序列或在該序列中有1個或多個胺基酸經置換、附加及/或缺失的胺基酸序列。

在本發明的另一個較佳的實施方式中，抗EphA4抗體或其EphA4結合片段含有重鏈及輕鏈，所述重鏈的可變區含有序列編號66、68、70、72、74或76所示的胺基酸序列或在該序列中有1個或多個胺基酸經置換、附加及/或缺失的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號78、80、82、或84所示的胺基酸序列或在該序列中有1個或多個胺基酸經置換、附加及/或缺失的胺基酸序列。

此處，關於本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段的重鏈可變區或輕鏈可變區而使用的“多個”只要保持對EphA4的結合親和性，而抑制EphA4與肝配蛋白的結合，則沒有限定，為2個~15個、更較佳的是2個~10個、例如9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個或2個，或為胺基酸序列中的胺基酸數的10%以內、例如9%以內、8%以內、7%以內、6%以內、5%以內、4%以內、3%以內、2%以內或1%以內。

在本發明的另一個較佳的實施方式中，抗EphA4抗體或其EphA4結合片段含有重鏈可變區及輕鏈可變區，所述重鏈可變區含有序列編號11所示的胺基酸序列，所述輕鏈可變區含有序列編號13所示的胺基酸序列。

在本發明的另一個較佳的實施方式中，抗EphA4抗體或其EphA4結合片段含有重鏈可變區及輕鏈可變區，所述重鏈的可變區含有序列編號66、68、70、72、74或76所示的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號78、80、82、或84所示的胺基酸序列。

在本發明的另一個較佳的實施方式中，抗EphA4抗體或其EphA4結合片段含有重鏈可變區及輕鏈可變區，所述重鏈的可變區含有序列編號66的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號78的胺基酸序列、或所述重鏈的可變區含有序列編號68的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號78的胺基酸序列、或所述重鏈的可變區含有序列編號70的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號78的胺基酸序列、或所述重鏈的可變區含有序列編號72的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號78的胺基酸序列、或所述重鏈的可變區含有序列編號74的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號78的胺基酸序列、或所述重鏈的可變區含有序列編號76的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號78的胺基酸序列。

在本發明的另一個較佳的實施方式中，抗EphA4抗體或其EphA4結合片段含有重鏈可變區及輕鏈可變區，所述重鏈的可變區含有序列編號66的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號80的胺基酸序列、或所述重鏈的可變區含有序列編號68的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號80的胺基酸序列、或所述重鏈的可變區含有序列編號70的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號80的胺基酸序列、或所述重鏈的可變區含有序列編號72的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號80的胺基酸序列、或所述重鏈的可變區含有序列編號74的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號80的胺基酸序列、或所述重鏈的可變區含有序列編號76的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號80的胺基酸序列。

在本發明的另一個較佳的實施方式中，抗EphA4抗體或其EphA4結合片段含有重鏈可變區及輕鏈可變區，所述重鏈的可變區含有序列編號66的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號82的胺基酸序列、或所述重鏈的可變區含有序列編號68的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號82的胺基酸序列、或所述重鏈的可變區含有序列編號70的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號82的胺基酸序列、或所述重鏈的可變區含有序列編號72的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號82的胺基酸序列、或所述重鏈的可變區含有序列編號74的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號82的胺基酸序列、或所述重鏈的可變區含有序列編號76的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號82的胺基酸序列。

在本發明的另一個較佳的實施方式中，抗EphA4抗體或其EphA4結合片段含有重鏈可變區及輕鏈可變區，所述重鏈的可變區含有序列編號66的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號84的胺基酸序列、或所述重鏈的可變區含有序列編號68的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號84的胺基酸序列、或所述重鏈的可變區含有序列編號70的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號84的胺基酸序列、或所述重鏈的可變區含有序列編號72的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號84的胺基酸序列、或所述重鏈的可變區含有序列編號74的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號84的胺基酸序列、或所述重鏈的可變區含有序列編號76的胺基酸序列，所述輕鏈的可變區含有序列編號84的胺基酸序列。

在本發明的特定的實施方式中，抗EphA4抗體或其EphA4結合片段具有人IgG₂的恒定區。較佳的是所述人IgG₂恒定區具有選自C131S、C219S、V234A及G237A(Eu編號)中的胺基酸變異的至少1個。在一個實施方式中，所述人IgG2恒定區具有C131S及C219S的胺基酸變異的組合。在一個實施方式中，所述人IgG₂恒定區具有V234A及G237A的胺基酸變異的組合。在另一個實施方式中，所述人IgG₂恒定區具有C131S、C219S、V234A及G237A的全部胺基酸變異。在又一個態樣中，所述人IgG₂恒定區不具有C末端賴胺酸殘基。

在本發明的較佳的實施方式中，人IgG₂的恒定區含有序列編號62的胺基酸序列。

在本發明的特定的實施方式中，抗EphA4抗體或其EphA4結合片段具有包含人IgG₁與人IgG₂的組合的人IgG恒定區。較佳的是所述人IgG恒定區中，CH1及鉸鏈部為人IgG₁，CH2及CH3為人IgG₂。在一個實施方式中，所述人IgG恒定區具有V234A或G237A(Eu編號)的胺基酸變異。在另一個態樣中，所述人IgG恒定區具有V234A及G237A的胺基酸變異。在又一個態樣中，所述人IgG恒定區不具有C末端賴胺酸殘基。

在本發明的較佳的實施方式中，包含人IgG₁與人IgG₂的組合的人IgG恒定區含有序列編號60的胺基酸序列。

本發明在一個態樣中涉及一種含有本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段的醫藥組合物。

含有本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段的醫藥組合物在水性或乾燥製劑的形態下，還可含有製藥學上容許的載體、賦形劑及/或穩定劑。所容許的載體、賦形劑及/或穩定劑例如包括：生理鹽水；磷酸、檸檬酸或其他有機酸之類的緩衝液；含有抗壞血酸的抗氧化劑；低分子量多肽；蛋白質(例如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白)；聚乙烯基吡咯啶酮之類的親水性聚合物；胺基酸；包括葡萄糖、甘露糖、或糊精類在內的單糖類、二糖類、及其他碳水化合物；EDTA之類的螯合劑；甘露糖醇或山梨糖醇之類的糖醇類；鈉之類的形成鹽的抗衡離子；或TWEEN(商標)、PLURONICS(商標)、或者PEG之類的非離子性表面活性劑。

含有本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段的醫藥組合物例如可封入到微膠囊內、膠體性藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球、微乳、奈米粒子、或奈米膠囊)內、或微乳內。在具有適合於需要投予抗體的任一種疾病的釋放特性的製劑中，在希望緩釋投予抗體的情況下，可有意地進行抗體的微膠囊化。緩釋基質的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸類、L-穀胺酸與γ-乙基-L-穀胺酸鹽的共聚物、非分解性的乙烯-乙酸乙烯酯、LUPRON DEPOT(商標)之類的分解性乳酸-羥乙酸共聚物(由乳酸-羥乙酸共聚物及醋酸亮丙瑞林所構成的注射用微球)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。

根據一個態樣，由於本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段能夠抑制EphA4與其配位基的結合，所以含有本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段的醫藥組合物能夠用於治療ALS。即，本發明在另一個態樣中包括一種ALS的治療方法，其包括對物件投予治療上有效量的本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段的步驟。另外，本發明在另一個態樣中包括一種本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段的用途，其係用於製造ALS的治療藥。本發明在另一個態樣中包括一種抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其係用於在治療ALS的方法中使用。

本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段在治療方法中可單獨使用、或者與其他藥劑或組合物並用。例如本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段也可與別的藥劑同時投予或不同時投予。這種並用療法包括並用投予(相同或不同的製劑含有2種以上的藥劑)及分離投予(例如同時或連續)。在分別投予2種以上藥劑的情況下，本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段的投予可在附隨的治療方法之前進行，或在繼其之後進行。

投予含有本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段的醫藥組合物的物件沒有限定，例如可對人或非人哺乳動物(猴、小鼠、大鼠、兔、牛、馬、山羊等)使用本發明。

含有本發明的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段的醫藥組合物向物件的投予方法(投予途徑、投予量、1天的投予次數、投予的時機等)沒有限定，可根據物件的健康狀態、疾病的程度、所並用的藥劑的種類等，由本領域技術人員(例如醫生)而適當決定。

本領域技術人員理解，只要在技術上不矛盾，則也可將本說明書中所記載的所有態樣中的任意一個或多個適當組合而實施本發明。此外，本領域技術人員理解，只要在技術上不矛盾，則較佳的是將本說明書中所記載的較佳的或有利的所有態樣適當組合而實施本發明。

本說明書中所引用的文獻係藉由參照，而將這些文獻的全部揭露內容視為明確地援用到本說明書中，本領域技術人員依據本說明書的上下文，在不脫離本發明的精神及範圍的情況下，可理解為將這些文獻中的相關揭露內容援用作本說明書的一部分。

本說明書中所引用的文獻僅僅是為了揭露本申請的申請日前的先前技術而提供，不應當解釋為認可本發明者等人因現有發明或任意的其他原因而不具有優先於相關揭露內容的權利。該等文獻的全部記述內容係基於本申請人能夠取得的數據，不構成認可該等記述內容正確。

本說明書中所使用的術語係用以說明特定的實施態樣而使用，並非意在對發明加以限定。

本說明書中所使用的“含有(comprise)”的術語除了根據上下文明確應不同地理解的情況以外，意在表示存在所記載的事項(構件、步驟、要素或數字等)，不排除存在這以外的事項(構件、步驟、要素或數字等)。“包含(consist of)”的術語包括“包含(consist of)”及/或“實質上包含(consist essentially of)”的術語所記載的形態。

本說明書中所使用的“中和活性”的術語係指抑制EphA4與其配位基的結合的活性及/或EphA4藉由與其配位基的結合而在人活體內所誘導的信號傳遞、或抑制細胞的分子表現應答或者功能性變化的活性。

只要沒有不同的定義，則這裡使用的所有術語(包括技術術語及科學術語)具有與本發明所屬技術領域的技術人員的廣義理解相同的含義。這裡使用的術語只要沒有明示不同的定義，則應解釋為具有與本說明書及先前技術領域的含義進行整合的含義，不應當解釋為理想化或過度形式化之含義。

第1、第2等術語係用以表述各種要素，理解為該等要素不應受該等術語本身所限定。該等術語僅僅是用來將一個要素與另一個要素區別開來，例如將第1要素記為第2要素，同樣地將第2要素記為第1要素在不脫離本發明的範圍的情況下係可以的。

在本說明書中，表示成分含量或數值範圍等而使用的數值只要沒有特別說明，則應理解為經術語“約”所修飾。例如，“4℃”只要沒有特別說明，則理解為“約4℃”，對於這種情況，本領域技術人員基於技術常識與本說明書的文意當然能夠合理地理解。

除了上下文明確地表示其他含義的情況以外，在本說明書及申請專利範圍中使用的情況下，以單數形表示的各形態只要在技術上不矛盾，則理解為也可為複數形，反之亦然。

以下，參照實施方式更詳細地說明本發明。然而，本發明可藉由各種形態而實現，不應當解釋為限定於這裡所記載的實施方式。相關技術領域的技術人員在不改變本發明的精神或範圍的情況下，可伴有各種重構、附加、缺失、置換等而事實本發明。

實施方式1：抗小鼠EphA4單株抗體的製作

小鼠抗小鼠EphA4單株抗體的製作

為了製作與小鼠EphA4(基因庫登記號NP_031962.2、序列編號1)結合的單株抗體，藉由以下的步驟而製備在小鼠EphA4的細胞外區域(20~547 位)(序列編號2)融合了分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)及組胺酸標籤的蛋白質(以下，稱為“小鼠EphA4細胞外區域-SEAP-His蛋白質”、序列編號43)。

首先，使用源於小鼠腦的總RNA，藉由RT-PCR將編碼小鼠EphA4的信號序列(序列編號42)與細胞外區域(序列編號2)的DNA序列進行擴增，轉殖到具有編碼SEAP及組胺酸標籤的DNA序列的pENTR1A載體(Invitrogen/LifeTechnologies)的SalI/NotI位點。其次，將編碼小鼠EphA4的信號序列與細胞外區域、SEAP、及組胺酸標籤的DNA序列藉由Gateway System(Invitrogen/LifeTechnologies)的LR反應而轉移到pcDNA3.1_rfcB載體上，從而構建pcDNA3.1-小鼠EphA4細胞外區域-SEAP-His表現載體。使用TransIT-LT1(塔卡拉(TAKARA))，將所構建的pcDNA3.1-小鼠EphA4細胞外區域-SEAP-His表現載體轉導到HEK293EBNA細胞(Invitrogen/LifeTechnologies)中。在6天的培養(5% CO₂、37℃)後，回收培養上清液。使用Protino Column(MACHEREY-NAGEL)，由所回收的培養上清液而精製小鼠EphA4細胞外區域-SEAP-His蛋白質(序列編號43)。

將20μg小鼠EphA4細胞外區域-SEAP-His蛋白質與等量的TiterMax Gold佐劑(TiterMax USA)、或者GERBU佐劑(GERBU Biotechnik GmbH)混合，並皮下注射到Balb/c小鼠的足蹠。其後，在第3天、第7天、及第10天，同樣地投予小鼠EphA4細胞外區域-SEAP-His蛋白質。此時，TiterMax Gold佐劑(TiterMax USA)僅在第10天使用，GERBU佐劑(GERBU Biotechnik GmbH)在第3天、第7天、及第10天使用。在第13天將小鼠處死(sacrificed)，回收末梢淋巴節，而製備淋巴節細胞。在GenomeONE-CF(Ishihara Sangyo Kaisha，Ltd.)的存在下，將所製備的淋巴節細胞與P3U1骨髓瘤細胞(日本京都大學提供)以5：1的比例進行融合。所述融合細胞係在96孔塑膠培養盤中進行培養。在7天的培養(5% CO₂、37℃)後，回收培養上清液。

使用所獲得的培養上清液，選出具有針對小鼠、大鼠及人EphA4的反應性以及小鼠EphA4與小鼠肝配蛋白A1的結合抑制活性的孔。

關於針對小鼠、大鼠及人的EphA4的反應性，係使用使人IgG₁的Fc區域與組胺酸標籤融合而成的蛋白質(以下，分別稱為“小鼠EphA4細胞外區域-Fc-His蛋白質”、“大鼠EphA4細胞外區域-Fc-His蛋白質”或“人EphA4細胞外區域-Fc-His蛋白質”)，藉由ELISA對小鼠EphA4的細胞外區域、大鼠EphA4(基因庫登記號NP_001155883.1)的細胞外區域(20~547位)或人EphA4(基因庫登記號NP_004429.1、序列編號3)的細胞外區域(20~547位)(序列編號4)進行評價。

小鼠、大鼠或人EphA4細胞外區域-Fc-His蛋白質係藉由以下的步驟而製備。最初，構建pcDNA3.1-小鼠、大鼠或人EphA4細胞外區域-Fc-His表現載體。首先，使用源於小鼠、大鼠或人的腦的總RNA，藉由RT-PCR將編碼小鼠、大鼠或人EphA4的信號序列與細胞外區域的DNA序列進行擴增，轉殖在具有編碼Fc及組胺酸標籤的DNA序列的pENTR1A載體(Invitrogen/LifeTechnologies)的SalI/NotI位點。其次，將編碼小鼠、大鼠或人的EphA4的信號序列與細胞外區域、Fc及組胺酸標籤的DNA序列藉由Gateway System(Invitrogen/LifeTechnologies)的LR反應轉移到pcDNA3.1_rfcB載體上，而構建pcDNA3.1-小鼠、大鼠或人EphA4細胞外區域-Fc-His表現載體。使用TransIT-LT1(塔卡拉(TAKARA))，將所構建的該等表現載體轉導到HEK293EBNA細胞(Invitrogen/LifeTechnologies)中。在6天的培養(5%CO₂、37℃)後，回收培養上清液。

使用有小鼠、大鼠或人EphA4細胞外區域-Fc-His蛋白質的ELISA係依據以下的步驟而進行。將抗人IgG抗體(Jackson ImmunoResearch Loboratories)塗布在96孔培養盤(Nunc)的孔上。在4℃下培養一晚後，利用1×Block Ace(大日本製藥)，將孔在室溫下封閉1小時。利用0.02% Tween20/PBS(Nacalai Tesque)清洗3次後，對各孔中添加包含小鼠、大鼠或人EphA4細胞外區域-Fc-His蛋白質的培養上清液(最終濃度1nM)，在室溫下培養1小時。清洗3次後，對各孔中添加所述融合細胞的培養上清液。在室溫下培養1小時並清洗3次後，添加辣根過氧化物酶標記抗小鼠IgG抗體(Jackson ImmunoResearch Loboratories)，在室溫下培養1小時。清洗3次後，對各孔中添加TMBZ(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺、西格瑪(Sigma))溶液，在室溫下培養5~20分鐘。對各孔中添加等量的反應停止溶液(2N H₂SO₄、和光純藥)，利用酶標儀(microplate reader)(PerkinElmer)讀取450nm的吸光度。

小鼠EphA4與小鼠肝配蛋白A1的結合抑制活性的評價係藉由以下的步驟而進行。將抗鹼性磷酸酶抗體(Seradyn)塗布在96孔培養盤(Nunc)的孔上。在4℃下培養一晚後，利用1×Block Ace(大日本製藥)，將孔在室溫下封閉1小時。利用0.02% Tween20/PBS(Nacalai Tesque)清洗3次後，對孔中添加小鼠EphA4細胞外區域-SEAP-His蛋白質(最終濃度10nM)，在室溫下培養1小時。清洗3次後，對孔中添加肝配蛋白A1-Fc嵌合體(R & D Systems、最終濃度20nM)與所述融合細胞的培養上清液。在室溫下培養1小時並清洗3次後，添加辣根過氧化物酶標記抗人IgG抗體(Jackson ImmunoResearch Loboratories)，在室溫下培養1小時。清洗3次後，對孔中添加TMBZ(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺、西格瑪(Sigma))溶液，在室溫下培養5~20分鐘。對孔中添加等量的反應停止溶液(2N H₂SO₄、和光純藥)，利用酶標儀(PerkinElmer)讀取450nm的吸光度。

藉由有限稀釋法，從經過所述步驟而選出的孔而轉殖融合瘤，最終獲得表現具有針對小鼠、大鼠及人的EphA4的反應活性且具有小鼠EphA4與小鼠肝配蛋白A1的結合抑制活性的小鼠抗EphA4抗體的融合瘤轉殖體。

培養所獲得的融合瘤轉殖體，使用蛋白A(GE Healthcare)從培養上清液精製抗EphA4抗體(抗體A)。抗體A的同種型係利用單株抗體同種型鑒定套組(Serotec)而確定，對於重鏈而言為IgG₁，對於輕鏈而言為κ。

抗體A的序列分析

藉由5'-RACE(5'-rapid amplification of cDNA ends，cDNA 5'末端快速擴增技術)法，將編碼抗體A的重鏈及輕鏈的信號序列、及可變區的DNA序列進行擴增。使用TRIZOL(Invitrogen/LifeTechnologies)，由所述融合瘤而製備總RNA，並利用DNase(deoxyribonuclease，去氧核糖核酸酶)(QIAGEN，RNase free DNase set(無RNase的DNase套組))進行處理。使用cDNA合成套組(塔卡拉(TAKARA))，由所述總RNA而製備雙鏈cDNA。將藉由寡聚DNA ad29S(ACATCACTCCGT)(序列編號5)及寡聚DNA ad29AS(ACGGAGTGATGTCCGTCGACGTATCTCTGCGTTGATACTTCAGCGTAGCT)(序列編號6)的退火而獲得的5'-連接物附加在所述cDNA上。將所獲得的cDNA利用5'-正向引物(5'-PCR4引物，AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG)(序列編號7)及3'-反向引物(小鼠IgG重鏈的擴增係使用GCCAGTGGATAGACTGATGG(序列編號8)，小鼠Igκ輕鏈的擴增係使用GATGGATACAGTTGGTGCAGC(序列編號9))進行擴增。將經擴增的cDNA插入到pCR2.1載體(Invitrogen/LifeTechnologies) 中。使用ABI3130XL而分析抗體A的基因序列。作為由藉由本分析所鑒定出的抗體A的基因序列所編碼的胺基酸序列，重鏈信號序列為序列編號10，重鏈可變區為序列編號11，輕鏈信號序列為序列編號12，輕鏈可變區為序列編號13。作為編碼抗體A的基因序列的核苷酸序列，重鏈信號序列為序列編號14，重鏈可變區為序列編號15，輕鏈信號序列為序列編號16，輕鏈可變區為序列編號17。

抗體A的重鏈及輕鏈的全長序列係藉由以下的步驟而取得。使用TRIZOL(Invitrogen/LifeTechnologies)，由所述融合瘤而製備總RNA，並利用DNase(QIAGEN，RNase free DNase set)進行處理。使用cDNA合成套組(kit)(塔卡拉(TAKARA))，由所述總RNA而製備cDNA。將所獲得的cDNA用於模板，使用5'正向引物(重鏈的擴增係使用GCGAAGCTTGCCGCCACCATGGCTTGGGTGTGGACCTTGC(序列編號18)，輕鏈的擴增係使用GCGAAGCTTGCCGCCACCATGAGTGTGCCCACTCAGGTCC(序列編號19))與3'反向引物(重鏈的擴增係使用GCGGAATTCATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC(序列編號20)，輕鏈的擴增係使用CGCGAATTCACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGAC(序列編號21))，將編碼抗體A的重鏈及輕鏈的基因序列藉由PCR進行擴增，分別轉殖在pEE6.4及pEE12.4載體(Lonza)上。使用ABI3130XL對基因序列進行分析。作為由藉由本分析所鑒定出的抗體A的基因序列所編碼的胺基酸序列，重鏈恒定區為序列編號22，輕鏈恒定區為序列編號23。作為編碼抗體A的基因序列的核苷酸序列，重鏈恒定區為序列編號24，輕鏈恒定區為序列編號25。

抗體A的CDR係藉由如下方法而確定：依據Kabat的編號系統(Kabat numbering system)，使用Abysis軟體(UCL)對抗體A的胺基酸序列進行編號，基於該編號，依據用以鑒定CDR的Kabat的定義(Kabat definition)或AbM的定義法(AbM definition method)而確定。將抗體A的CDR的胺基酸序列及核苷酸序列分別示於表1及表2。

實施方式2：抗EphA4單株抗體針對小鼠及人EphA4的結合親和性

藉由使用Biacore A100(GE Healthcare)的表面等離子共振(SPR法)而確定實施方式1中所獲得的抗體A針對小鼠及人EphA4的結合親和性。首先，將利用小鼠IgG₁抗體對大鼠免疫並藉由常用方法所製作的大鼠抗小鼠IgG₁抗體固定在傳感晶片CM5上。大鼠抗小鼠IgG₁抗體在傳感晶片CM5上的固定係藉由使用N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)及N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(EDC)的胺偶合法而進行，封閉係使用乙醇胺(傳感晶片及固定用試劑均由GE Healthcare公司製造)。使用固定用緩衝液(10mM乙酸鈉，pH值4.5)，稀釋至1~2μg/mL，依據Biacore A100所附帶的操作說明，固定在傳感晶片上。將抗體A使用運行緩衝液HBS-EP(GE Healthcare，BR-1001-88)加以稀釋，對流動檢測池上送液120秒鐘而進行捕獲(70~100RU程度的捕獲量)。繼而，將使用HBS-EP在50、25、12.5、6.3、3.1、1.6、0.8、0nM的範圍內進行連續稀釋的小鼠或者人EphA4細胞外區域-SEAP-His添加至120秒鐘傳感晶片，依序觀測添加時(結合相，120秒鐘)及添加結束後(解離相，900秒鐘)的結合反應曲線。在各觀測結束後，添加3M MgCl₂(30秒鐘、和光純藥)而再生傳感晶片。對於所獲得的結合反應曲線，利用使用有系統附帶軟體BIA evaluation軟體的1：1的結合模型而進行擬合分析，而算出針對小鼠及人的EphA4的結合親和性(KD=kd/ka)。

抗體A針對小鼠及人EphA4的結合親和性(KD值)分別為7.29×10^-10M、6.61×10^-10M(圖1)。針對小鼠及人EphA4的其他結合參數也為大致相同程度。因此，認為抗體A針對小鼠及人的EphA4具有相同程度的結合親和性。

實施方式3：抗EphA4單株抗體的小鼠EphA4-小鼠配位基結合抑制活性

關於實施方式1中所獲得的抗體A，小鼠EphA4與小鼠配位基的結合抑制活性的評價係依據以下的步驟而進行。將抗鹼性磷酸酶抗體(Thermo SCIENTIFIC)塗布在96孔培養盤(Nunc)的孔上。在4℃下培養一晚後，利用1%Block Ace(DS Pharma Biomedical)，將孔在室溫下封閉1小時。利用0.05% Tween20/PBS(Thermo SCIENTIFIC)清洗3次後，對孔中添加實施方式1的方法中所獲得的小鼠EphA4細胞外區域-SEAP-His蛋白質(最終濃度10nM)，在室溫下培養1小時。清洗3次後，對孔中添加配位基與經連續稀釋的抗體A(0、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000nM)、作為EphA4抑制藥而已知的KYL肽(KYLPYWPVLSSL，0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100μM、委託北海道系統-科學進行合成)及化合物1(0、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000μM、式1、Matrix Scientific)。此外，配位基係使用小鼠肝配蛋白A1-Fc嵌合體(R & D Systems、最終濃度20nM)及小鼠肝配蛋白B2-Fc嵌合體(R & D Systems、最終濃度0.6nM)。在室溫下培養1小時並清洗3次後，添加辣根過氧化物酶標記抗人IgG抗體(Jackson ImmunoResearch Loboratories)，在室溫下培養1小時。清洗3次後，對孔中添加TMBZ(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺、西格瑪(Sigma))溶液，在室溫下培養2分鐘。對孔中添加等量的反應停止溶液(1N H₂SO₄、和光純藥)，利用酶標儀(Molecular Devices)而讀取450nm的吸光度。

式1[化1]

抗體A濃度依賴性地抑制小鼠EphA4與小鼠配位基的結合，針對小鼠肝配蛋白A1、肝配蛋白B2結合的IC₅₀值分別為約1.2、1.2nM。現有的EphA4抑制藥KYL肽針對小鼠肝配蛋白A1、肝配蛋白B2結合的IC₅₀值分別為約1.3、1.3μM(圖2)。化合物1的活性更弱，也未見濃度依賴性。因此顯示，抗體A抑制小鼠EphA4與小鼠配位基的結合，其活性與現有的EphA4抑制藥KYL肽相比，活性強1,000倍以上。

實施方式4：抗EphA4單株抗體的人EphA4-人配位基結合抑制活性

關於實施方式1中所獲得的抗體A，人EphA4與人配位基的結合抑制活性的評價係依據以下的步驟而進行。將抗鹼性磷酸酶抗體(Thermo SCIENTIFIC)塗布在96孔培養盤(Nunc)的孔上。在4℃下培養一晚後，利用1%Block Ace(DS Pharma Biomedical)，將孔在室溫下封閉1小時。利用0.05% Tween20/PBS(Thermo SCIENTIFIC)清洗3次後，對孔中添加實施方式1的方法中所獲得的人EphA4細胞外區域-SEAP-His蛋白質(最終濃度10nM)，在室溫下培養1小時。清洗3次後，對孔中添加配位基與經連續稀釋的抗體A(0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、3000nM)、EphA4抑制藥KYL肽(KYLPYWPVLSSL，0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100300、1000、3000μM，委託東麗分析研究中心進行合成)。此外，配位基係使用生物素化人肝配蛋白A5-Fc嵌合體(R & D Systems、最終濃度0.7nM)及生物素化人肝配蛋白 B3-Fc嵌合體(R & D Systems、最終濃度2.3nM)。在室溫下培養1小時並清洗3次後，添加辣根過氧化物酶標記鏈黴抗生物素蛋白(GE Healthcare)，在室溫下培養1小時。清洗3次後，對孔中添加TMBZ(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺、西格瑪(Sigma))溶液，在室溫下培養2分鐘。對孔中添加等量的反應停止溶液(1N H₂SO₄、和光純藥)，利用酶標儀(Molecular Devices或PerkinElmer)而讀取450nm的吸光度。

抗體A濃度依賴性地抑制人EphA4與人配位基的結合，針對人肝配蛋白A5、肝配蛋白B3結合的IC₅₀值分別為約2.7、1.9nM。EphA4抑制藥KYL肽針對人肝配蛋白A5、肝配蛋白B3結合的IC₅₀值分別為約6.1、1.6μM(圖3)。因此顯示，抗體A也強力地抑制人EphA4與人配位基的結合。

實施方式5：EphA4結合片段針對小鼠及人EphA4的結合親和性

首先，製備抗體A的Fab片段與F(ab')₂片段(以下，分別記載為抗體A-Fab、抗體A-F(ab')₂)作為EphA4結合片段。

抗體A-Fab的製備係依據以下的步驟而進行。在1.5mL試管(艾本德(Eppendorf))中混合抗體A(4.36mg/mL，1mL)、10mM L-半胱胺酸(和光純藥)、1mM EDTA(Gibco)及2.18μg/mL木瓜酶(西格瑪(Sigma))，在37℃下培養12小時。對培養後的試管，以最終濃度成為50mM的方式添加碘乙醯胺(和光純藥)。反應停止後，對PBS(西格瑪(Sigma))進行透析，對抗體溶液等量添加0.1M Tris(西格瑪(Sigma))-HCl/5M NaCl(pH值8.0、和光純藥)後使用rProtein A FF樹脂進行精製。將rProtein A FF 800uL填充至2mL試管中，以3.5C.V.依序添加超純水、結合緩衝液(0.1M Tris(西格瑪(Sigma))-HCl/3M NaCl(pH值8.0、和光純藥))，而使rProtein A FF平衡化。對抗體溶液等量添加0.1M Tris(西格瑪(Sigma))-HCl/5M NaCl(pH值8.0、和光純藥)，將所獲得的溶液通入柱中，回收從柱中溶出的溶液(過柱液)再次添加至柱中，重複該操作3次後，最後回收過柱液。接著，添加結合緩衝液2.5mL，重複清洗2次。藉由將過柱液及清洗組分對PBS進行透析，而獲得抗體A-Fab。

抗體A-F(ab')₂的製備係依據以下的步驟而進行。將抗體A對0.2M乙酸緩衝液(pH值4.0、和光純藥)在4℃下透析一晚。回收經透析的溶液，進行0.22μm過濾(密理博(Millpore))，其後進行定量，以抗體濃度成為4.0mg/mL的方式進行製備。待胃蛋白酶(西格瑪(Sigma))恢復至室溫，使用0.2M乙酸緩衝液(pH值4.0、和光純藥)而製備為2.0mg/mL。在1.5mL試管(艾本德(Eppendorf))中將抗體A(4.0mg/mL，800μL)、胃蛋白酶溶液(2.0mg/mL，16μL)及0.2M乙酸緩衝液(pH值4.0、和光純藥)以64μL/試管進行混合，在37℃下培養15小時。對培養後的試管，以112μL/試管添加2M Tris-base(西格瑪(Sigma))而停止反應後，利用SDS-PAGE而確認分子種類。反應停止後，對100mM Tris-HCl(pH值8.0)進行透析。繼而，使用rProtein A FF(GE Healthcare，17-1279-02)而進行抗體A-F(ab')₂的精製。將rProtein A樹脂1mL填充至5mL試管中，以3.5C.V.依序添加超純水、結合緩衝液，而使rProtein A FF平衡化。透析後，對經透析的溶液等量添加0.1M Tris(西格瑪(Sigma))-HCl/5M NaCl(pH值8.0、和光純藥)進行平衡化，將所獲得的抗體溶液通入柱中，回收過柱液再次添加至柱中，重複該操作3次，最後回收過柱液。接著，添加結合緩衝液5mL，重複清洗2次。為了去除未反應的IgG等，而利用0.1M檸檬酸鹽(pH值3.0、和光純藥)進行溶出後，利用SDS-PAGE而確認分子種類。藉由將過柱液及清洗組分對PBS進行透析，而獲得抗體A-F(ab')₂。

其次，藉由使用Biacore T200(GE Healthcare)的表面等離子共振(SPR法)而確定抗體A-Fab及抗體A-F(ab')₂針對小鼠及人EphA4的結合親和性。將實施方式1中所獲得的抗體A設為各比較對照。首先，將抗His標籤抗體(GE Healthcare)固定在傳感晶片CM5上。抗His標籤抗體在傳感晶片CM5上的固定係藉由使用N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)及N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(EDC)的胺偶合法而進行，封閉係使用乙醇胺(傳感晶片及固定用試劑均由GE Healthcare公司製造)。使用固定用緩衝液(10mM乙酸鈉，pH值4.5)而稀釋為3μg/mL，依據Biacore T200所附帶的操作說明而固定在傳感晶片上。

將小鼠或者人EphA4細胞外區域-SEAP-His蛋白質使用運行緩衝液HBS-EP(GE Healthcare，BR-1001-88)進行稀釋，對流動檢測池上送液120秒鐘而進行捕獲(此時為10~20RU左右的捕獲量)。繼而，將使用HBS-EP進行連續稀釋的抗體A(50、16.7、5.6、1.9、0.6、0nM)、抗體A-Fab(500、166.7、55.6、18.5、6.2、0nM)及抗體A-F(ab')₂(50、16.7、5.6、1.9、0.6、0nM)添加至120秒鐘傳感晶片，依序觀測添加時(結合相，120秒鐘)及添加結束後(解離相，900秒鐘)的結合反應曲線。在各觀測結束後，添加3M MgCl₂(30秒鐘、和光純藥)而再生傳感晶片。對於所獲得的結合反應曲線，利用使用有系統附帶軟體BIA evaluation軟體的1：1的結合模型進行擬合分析，而算出針對小鼠及人的EphA4的結合親和性(KD=kd/ka)。

抗體A-Fab針對小鼠及人EphA4的結合親和性(KD值)分別為4.51×10^-8M、4.04×10^-8M(圖4A，圖4C)。另一方面，抗體A-F(ab')₂針對小鼠及人EphA4的結合親和性(KD值)分別為2.29×10^-11M、5.30×10^-11M(圖4B，圖4D)。

實施方式6：EphA4結合片段的EphA4-配位基結合抑制活性

關於實施方式5中所獲得的抗體A-Fab及抗體A-F(ab')₂，EphA4與配位基的結合抑制活性的評價係依據以下的步驟而進行。將抗鹼性磷酸酶抗體(Thermo SCIENTIFIC)塗布在96孔培養盤(Nunc)的孔上。在4℃下培養一晚後，利用1%Block Ace(DS Pharma Biomedical)，將孔在室溫下封閉1小時。利用0.05% Tween20/PBS(Thermo SCIENTIFIC)清洗3次後，對孔中添加實施方式1的方法中所獲得的小鼠EphA4細胞外區域-SEAP-His蛋白質(最終濃度10nM)，在室溫下培養1小時。清洗3次後，對孔中添加配位基與經連續稀釋的抗體A(0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、3000nM)、抗體A-Fab(0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、3000nM)、抗體A-F(ab')₂(0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、3000nM)、及EphA4抑制藥KYL肽(KYLPYWPVLSSL，0、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、3000μM，委託東麗分析研究中心進行合成)。此外，配位基係使用生物素化小鼠肝配蛋白B2-Fc嵌合體(R & D Systems、最終濃度2.5nM)。在室溫下培養1小時並清洗3次後，辣根過氧化物酶標記鏈黴抗生物素蛋白(GE Healthcare)，在室溫下培養1小時。清洗3次後，對孔中添加TMBZ(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺、西格瑪(Sigma))溶液，在室溫下培養2分鐘。對孔中添加等量的反應停止溶液(1N H₂SO₄、和光純藥)，利用酶標儀(Molecular Devices或PerkinElmer)而讀取450nm的吸光度。

抗體A(抗體A-IgG)、抗體A-Fab、抗體A-F(ab')₂及KYL肽的IC₅₀值分別為2.6(或者3.6)、438.5、2.9nM、5.293μM(圖5)。如果與KYL肽相比，則抗體A及抗體A-F(ab')₂具有1000倍以上的活性，對於抗體A-Fab而言，與KYL肽相比也具有10倍以上的活性。

實施方式7：抗EphA4單株抗體針對人Eph受體的選擇性

依據實施方式1中所記載的方法，使用源於組織的總RNA，將編碼人的各Eph受體(EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB6)的信號序列與細胞外區域的DNA序列藉由RT-PCR進行擴增，轉殖在具有編碼人IgG₁的Fc區域及組胺酸標籤的DNA序列的pENTR1A載體(Invitrogen/LifeTechnologies)上。其次，將編碼人的各Eph受體的信號序列與細胞外區域、Fc及組胺酸標籤的DNA序列藉由Gateway System(Invitrogen/LifeTechnologies)的LR反應而轉移至pcDNA3.1_rfcB載體上，而構建表現對人的各Eph受體的細胞外區域融合了人IgG₁的Fc區域與His標籤的蛋白質(稱為“Eph受體細胞外區域-Fc-His蛋白質”)的載體(稱為“Eph受體細胞外區域-Fc-His蛋白質表現載體”)。

其次，向10cm培養皿(Falcon)中接種HEK293EBNA細胞(Life technologies)並在37℃下培養1天。使用TransIT-LT1(塔卡拉(TAKARA))，將以上所獲得的人的各Eph受體細胞外區域-Fc-His蛋白質表現載體轉導至HEK293EBNA細胞中。在4天的培養(5%CO₂、37℃)後，回收培養上清液，在室溫下以1500rpm離心5分鐘。將離心上清液利用0.22μm過濾器(密理博(Millpore))進行過濾，將Hepes(4-羥乙基呱嗪乙磺酸)(東仁化學科技(DOJINDO))與疊氮化鈉(和光純藥)以最終濃度分別成為20mM、0.02%的方式進行添加。

關於抗體A，人Eph受體的結合活性的評價係依據以下的步驟而進行。

將驢抗人IgG抗體(Jackson ImmunoResearch Loboratories)塗布在96孔培養盤(Nunc)的孔上。在4℃下培養一晚後，利用1%Block Ace(DS Pharma Biomedical)，將孔在室溫下封閉1小時。利用0.05% Tween20/PBS(Nacalai)清洗3次後，對各孔中接種人的各Eph受體細胞外區域-Fc-His蛋白質(最終濃度1nM)，在室溫下培養1小時。清洗3次後，對孔中添加人IgG溶液(100μg/mL、三菱製藥(Mitsubishi Pharma))及抗體A(10μg/mL)，在室溫下培養1小時。添加辣根過氧化物酶標記驢抗小鼠IgG抗體(Jackson ImmunoResearch Loboratories)，在室溫下培養1小時。清洗3次後，對孔中添加TMBZ(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺、西格瑪(Sigma))溶液，在確認到適度的顯色後，對孔中添加等量的反應停止溶液(1N H₂SO_4、和光純藥)，利用酶標儀(PerkinElmer)而讀取450nm的吸光度。

抗體A在人Eph受體家族間僅對人EphA4特異性地具有反應活性(圖6A)。

實施方式8：抗EphA4單株抗體針對小鼠Eph受體的選擇性

依據實施方式1中所記載的方法，使用源於組織的總RNA，將編碼小鼠的各Eph受體(EphA1、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB6)的信號序列與細胞外區域的DNA序列藉由RT-PCR進行擴增，轉殖在具有編碼人IgG₁的Fc區域及組胺酸標籤的DNA序列的pENTR1A載體(Invitrogen/LifeTechnologies)上。其次，將編碼小鼠的各Eph受體(EphA1、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB6)的信號序列與細胞外區域、Fc及組胺酸標籤的DNA序列藉由Gateway System(Invitrogen/LifeTechnologies)的LR反應而轉移至 pcDNA3.1_rfcB載體上，而構建小鼠的各Eph受體的細胞外區域-Fc-His蛋白質表現載體。在小鼠EphA2的細胞外區域-Fc-His蛋白質表現載體的構建中，使用源於組織的總RNA，將編碼小鼠EphA2的信號序列與細胞外區域的DNA序列藉由RT-PCR進行擴增，轉殖在具有編碼Fc及組胺酸標籤的DNA序列的pcDNA3.1載體上，而構建小鼠EphA2細胞外區域-Fc-His蛋白質表現載體。

其次，向10cm培養皿(Falcon或BD Bioscience)中接種HEK293EBNA細胞(Life technologies)，在37℃下培養1天。使用TransIT-LT1(塔卡拉(TAKARA))，將藉由所述方式而獲得的小鼠EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB6細胞外區域-Fc-His蛋白質表現載體轉導至HEK293EBNA細胞中。在4天的培養(5%CO₂、37℃)後，回收培養上清液，在室溫下以1500rpm離心5分鐘。將離心上清液利用0.22μm過濾器(密理博(Millpore))進行過濾，將Hepes(東仁化學科技(DOJINDO))與疊氮化鈉(和光純藥)以最終濃度分別成為20mM、0.02%的方式進行添加。

關於抗體A，小鼠Eph受體的結合活性的評價係依據以下的步驟而進行。

將驢抗人IgG抗體(Jackson ImmunoResearch Loboratories)塗布在96孔培養盤(Nunc)的孔上。在4℃下培養一晚後，利用1%Block Ace(DS Pharma Biomedical)，將孔在室溫下封閉1小時。利用0.05% Tween20/PBS(Thermo SCIENTIFIC)清洗3次後，對各孔中接種小鼠的各Eph受體細胞外區域-Fc-His蛋白質(最終濃度1nM)，在室溫下培養1小時。清洗3次後，對孔中添加人IgG溶液(100μg/mL、西格瑪(Sigma))及抗體A(10μg/mL)，在室溫下培養1小時。添加辣根過氧化物酶標記驢抗小鼠IgG抗體(Jackson ImmunoResearch Loboratories)，在室溫下培養1小時。清洗3次後，對孔中添加TMBZ(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺、西格瑪(Sigma))溶液，在確認到適度的顯色後，對孔中添加等量的反應停止溶液(1N H₂SO_4、和光純藥)，利用酶標儀(PerkinElmer)而讀取450nm的吸光度。

抗體A在小鼠Eph受體家族間僅對小鼠EphA4特異性地具有反應活性(圖6B)。

實施方式9：抗EphA4單株抗體針對小鼠、大鼠、猴及人EphA4的反應性

小鼠、大鼠、猴及人EphA4細胞外區域-Fc-His蛋白質的製作係依據以下的步驟而進行。首先，依據實施方式1中所記載的方法，而構建猴EphA4細胞外區域-Fc-His蛋白質表現載體。將在載體構建中所利用的猴EphA4的胺基酸序列示於序列編號44，將其細胞外區域示於序列編號45。其次，向10cm培養皿(Falcon)中接種HEK293EBNA細胞(Life technologies)，在37℃下培養1天。使用TransIT-LT1(塔卡拉(TAKARA))，將猴EphA4細胞外區域-Fc-His蛋白質表現載體、及實施方式1中所記載的小鼠EphA4、大鼠EphA4及人EphA4細胞外區域-Fc-His蛋白質表現載體轉導至HEK293EBNA細胞中。在4天的培養(5%CO₂、37℃)後，回收培養上清液，在室溫下以1500rpm離心5分鐘。將離心上清液利用0.22μm過濾器(密理博(Millpore))進行過濾，將Hepes(東仁化學科技(DOJINDO))與疊氮化鈉(和光純藥)以最終濃度分別成為20mM、0.02%的方式進行添加。

關於抗體A，各種Eph受體的結合活性的評價係依據以下的步驟而進行。

將驢抗人IgG抗體(Jackson ImmunoResearch Loboratories)塗布在96孔培養盤(Nunc)的孔上。在4℃下培養一晚後，利用1%Block Ace(大日本製藥)，將孔在室溫下封閉1小時。利用0.05% Tween20/PBS(Nacalai Tesque)清洗3次後，對孔中接種小鼠、大鼠、猴及人EphA4細胞外區域-Fc-His蛋白質(最終濃度1nM)，在室溫下培養1小時。清洗3次後，對孔中添加人IgG溶液(100μg/mL、三菱製藥(Mitsubishi Pharma))及抗體A(0、0.00128、0.0064、0.032、0.16、0.8、4、20μg/mL)，在室溫下培養1小時。添加辣根過氧化物酶標記驢抗小鼠IgG抗體(Jackson ImmunoResearch Loboratories)，在室溫下培養1小時。清洗3次後，對孔中添加TMBZ(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺、西格瑪(Sigma))溶液，在確認到適度的顯色後，對孔中添加等量的反應停止溶液(1N H₂SO₄、和光純藥)，利用酶標儀(PerkinElmer)而讀取450nm的吸光度。

抗體A對於小鼠、大鼠、猴及人EphA4均具有同等的反應活性(圖7)。

實施方式10：抗EphA4單株抗體在海馬神經元中的配位基誘發EphA4自磷酸化抑制效果

大鼠海馬神經元的製備係依據以下的步驟而進行。從妊娠第18天的大鼠(日本Charles River)取出胚胎，切開頭部取出腦。在立體顯微鏡下切出海馬區域後，添加消化溶液(137mM NaCl(和光純藥)、5mM KCl(和光純藥)、7mM Na₂HPO₄(和光純藥)、25mM Hepes(東仁化學科技(DOJINDO))、0.5mg/ml DNase(西格瑪(Sigma))，0.25%胰蛋白酶(Life technologies))，在37℃下振搖10分鐘。去除溶液，添加20%胎牛血清/Hanks緩衝液(西格瑪(Sigma))。去除液體，利用Hanks緩衝液清洗2次後，在Hanks緩衝液中對海馬組織進行吸液而製作細胞懸浮液。向塗布了添加有培養液(神經基質培養基(Life technologies)，1×B-27添加劑(Life technologies)、0.5mM L-穀醯胺(Life technologies))的聚L-賴胺酸的6孔培養皿(Falcon)中接種細胞。

使用海馬神經元的EphA4自磷酸化抑制活性評價係依據以下的步驟而進行。對接種至6孔培養皿(Falcon)中的大鼠海馬神經元，利用小鼠肝配蛋白A1-Fc嵌合體(R & D Systems、最終濃度10nM)、抗體A(0、1、10、100、1000nM)或者EphA4抑制藥KYL肽(KYLPYWPVLSSL，0、0.01、0.1、1、10、100μM、委託北海道系統-科學進行合成)進行處置，45分鐘後利用cold-PBS(和光純藥)進行清洗，添加裂解緩衝液(20mM Tris、150mM NaCl、1mM EDTA、1%TritonX-100(以上為和光純藥)，1×蛋白酶抑制劑(Nacalai Tesque)、1×磷酸酶抑制劑(Nacalai Tesque))，並回收細胞。在4℃下混合15分鐘後，進行15000rpm、4℃、15分鐘的冷卻離心，回收上清液。向上清液中添加兔抗EphA4多株抗體(醫學生物學研究所股份有限公司)反應90分鐘後，添加蛋白G珠(GE Healthcare)進一步反應30分鐘。進行3000rpm、4℃、1分鐘的冷卻離心並去除上清液，添加1mL的裂解緩衝液。進行該操作3次後，添加2×SDS樣品緩衝液，煮沸10分鐘。使用該樣品進行SDS-PAGE，進行使用抗磷酸化酪胺酸抗體(Santa Cruz biotechnology)的西方墨點法。此外，也進行使用抗EphA4單株抗體(Abnova)的西方墨點法，將帶強度定量化，算出磷酸化EphA4/總EphA4的值。此外，抗EphA4單株抗體(Abnova)被認為是以針對人EphA4的C末端側區域的合成肽作為免疫原，對於N末端側具有細胞外區域的人EphA4不具有中和活性的抗體。

抗體A及EphA4抑制藥KYL肽在海馬神經元中濃度依賴性地抑制小鼠由肝配蛋白A1所誘發的EphA4自磷酸化，其IC₅₀值分別為24.2nM、9.91μM(圖8)。本結果顯示，抗體A在細胞系中也與KYL肽同樣地拮抗EphA4/肝配蛋白信號傳送。

實施方式11：抗EphA4單株抗體在海馬神經元中針對配位基誘發成長錐萎陷(growth cone collapse)的抑制效果

大鼠海馬神經元的製備係如所述實施方式10中記載的方式進行，細胞係接種至塗布了添加有培養液的聚L-賴胺酸的96孔培養盤(greiner)中。

使用海馬神經元的生長錐萎陷分析係依據以下的步驟而進行。對接種至96孔培養皿(greiner)中的培養第2天的大鼠海馬神經元，利用PBS(和光純藥)、抗體A(0.1、0.3、1μM)或者EphA4抑制藥KYL肽(KYLPYWPVLSSL，10、30、100μM，委託東麗分析研究中心進行合成)處置15分鐘後，利用與山羊抗人Fcγ片段IgG₁抗體(Jackson Immuno Research)以1：5的比例進行聚類化的小鼠肝配蛋白A1-Fc嵌合體(R & D Systems、最終濃度1μg/mL)處置30分鐘。其後，去除培養液，添加2%PFA(和光純藥)/4%蔗糖(和光純藥)/PBS並靜置20分鐘，而將細胞進行固定。去除液體，將細胞利用PBS清洗3次後，添加0.25%TritonX-100(和光純藥)/PBS，進行細胞透過處理15分鐘。去除液體，添加2%BSA(西格瑪(Sigma))/0.25%TritonX-100/Opti-MEM(Life technologies)，實施1小時封閉後，使之與抗Tau-1抗體(Millipore)、抗MAP-2抗體(Millipore)反應2小時。去除1次抗體液，利用PBS清洗3次後，使之與2次抗體、Alexa Fluor 546鬼筆環肽(Molecular probes)反應1小時。去除2次抗體液，利用PBS清洗3次後，添加封入SlowFadeGold抗淬滅劑(Molecular probes)，利用BIOREVO(KEYENCE)進行觀察。對於各樣品，從30個視野計數形成生長錐的神經元，而算出引起了生長錐萎陷的神經元數的比例。

抗體A及EphA4抑制藥KYL肽在海馬神經元中濃度依賴性地抑制小鼠由肝配蛋白A1所誘發的生長錐萎陷(圖9)。因此顯示，抗體A在細胞系中與KYL肽同樣地功能性地抑制EphA4。

實施方式12：抗EphA4單株抗體在體內的配位基拮抗作用

使用新生小鼠的體內拮抗分析係依據以下的步驟而進行。將對保育8天齡的小鼠(日本Charles River)免疫PBS(和光純藥)、抗體A或者二硝基苯酚並藉由常用方法所製作的對照抗體(小鼠抗二硝基苯酚抗體)分別以300mg/kg的用量進行皮下投予(30mL/kg)。在24小時後，在4%異氟醚(Intervet)麻醉下切開頭皮，對側腦室內投予小鼠肝配蛋白A1-Fc嵌合體(300pmol/head、R & D Systems)或者PBS(和光純藥)，1小時後藉由斷頭而使小鼠安樂死後，摘取大腦半球。將所採集的大腦半球添加至BioMasher(註冊商標)I(Nippi)的回收用試管上所設置的過濾器試管中，插入破碎棒後，進行15000rpm、4℃、2分鐘的冷卻離心而進行破碎。使破碎物懸浮在TNE緩衝液(20mM Tris、150mM NaCl、1mM EDTA、1×蛋白酶抑制劑(Nacalai Tesque)、1×磷酸酶抑制劑(Nacalai Tesque))中。對勻漿的一部分添加3×SDS樣品緩衝液，煮沸10分鐘，並進行蛋白質的定量。使用該樣品進行SDS-PAGE，進行使用驢抗人IgG(H+L)抗體(Jackson ImmunoResearch)、抗EphA4單株抗體(Abnova)、抗肌動蛋白抗體(SIGMA)的西方墨點法。剩餘的勻漿係在進行了蛋白質的定量後，分注相對於蛋白質量3mg，並添加1% TritonX-100(和光純藥)、0.1% SDS(Nacalai Tesque)，在4℃下混合15分鐘後，進行15000rpm、4℃、15分鐘的冷卻離心，回收上清液。對上清液的一部分添加3×SDS樣品緩衝液，煮沸10分鐘，作為Input樣品。使用該樣品進行SDS-PAGE，進行使用抗EphA4單株抗體(Abnova)、抗肌動蛋白抗體(SIGMA)的西方墨點法。向剩餘的上清液中添加兔抗EphA4多株抗體(Santa Cruz Biotechnology)，使之反應60分鐘後，添加蛋白G珠(GE Healthcare)進一步反應30分鐘。進行3000rpm、4℃、2分鐘的冷卻離心而去除上清液，並添加0.5mL的裂解緩衝液(20mM Tris、150mM NaCl、1mM EDTA、1%TritonX-100(和光純藥)、0.1% SDS(Nacalai Tesque)、1×蛋白酶抑制劑(Nacalai Tesque)、1×磷酸酶抑制劑(Nacalai Tesque))。進行該操作3次後，對珠添加1×SDS樣品緩衝液，煮沸10分鐘，作為Beads樣品。使用該樣品進行SDS-PAGE，進行使用抗磷酸化酪胺酸抗體(Santa Cruz biotechnology)的西方墨點法。此外，也進行使用抗EphA4單株抗體(Abnova)的西方墨點法，將帶強度定量化，而算出磷酸化EphA4/總EphA4的值。此外，抗EphA4單株抗體(Abnova)被認為是以針對人EphA4的C末端側區域的合成肽作為免疫原，對於N末端側具有細胞外區域的人EphA4不具有中和活性的抗體。

對新生小鼠側腦室內投予小鼠肝配蛋白A1在大腦半球中引起EphA4的自磷酸化。抗體A將小鼠由肝配蛋白A1所誘發的EphA4自磷酸化抑制了66%(圖10)。因此顯示，抗體A在體內也抑制EphA4與其配位基的結合。

實施方式13：抗EphA4單株抗體的活體外ALS模型的源於小鼠ES細胞的運動神經元保護效果

小鼠ES細胞的維持培養係依據以下的步驟而進行。使在-80℃下冷凍保存的小鼠ES細胞(129×1/SvJ)在恒溫槽內融化後，利用加溫至37℃的小鼠ES細胞培養基(含有10%胎牛血清(FBS，Gibco)、0.1mM β-巰基乙醇(Gibco)、1mM丙酮酸鈉(Invitrogen)、2mM L-穀醯胺(Invitrogen)、1% 非必需胺基酸(Invitrogen)、100units/mL青黴素-100μg/mL鏈黴素(Invitrogen)及1000units/mL ESGRO(註冊商標)白血病抑制因子(Millipore)的KnockOut^TM DMEM(Gibco))進行稀釋。將各細胞懸浮液進行離心後(1500rpm、3分鐘、室溫)，去除上清液，懸浮在新的培養基中之後，轉移至預先接種了飼養細胞的培養皿中，在CO₂培養箱內(5%CO₂、37℃)進行維持培養。

來自新生小鼠的星狀細胞的建立及維持培養係依據以下的步驟而進行。將出生後2天齡的野生型新生小鼠(C57BL/6J Jms Slc(日本SLC))、及野生型小鼠與變異人SOD1(G93A)Tg-(B6.Cg-Tg(SOD1_G93A)1Gur/J(Jackson Laboratories))小鼠的交雜小鼠的新生仔利用異氟醚(Intervet)進行吸入麻醉或藉由斷頭而安樂死後，單獨分離大腦皮質，利用0.25%胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)藉由37℃、15分鐘處理而進行分散。在酶處理後，利用含有10%FBS(Gibco)及1%青黴素-鏈黴素(Invitrogen)的達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(Gibco)(10%FBS-DMEM)4mL進行稀釋，而停止酶消化。其後，利用細胞濾網(BD Bioscience)，對單一細胞以外的雜質進行過濾，並以1500rpm離心5分鐘。吸取上清液，稀釋至新的10%FBS-DMEM 4mL中，對於每個個體，接種至60mm培養皿中，在37℃下進行培養。接種2天后，吸取培養基，添加新的10%FBS-DMEM 4mL而進行培養基更換。在達到鋪滿後，回收包含非黏附細胞的培養上清液，供於變異人SOD1(G93A)的基因型分型。重新添加PBS(和光純藥)2mL，再次進行吸取。添加0.25%胰蛋白酶-EDTA 1mL，在37℃下培養3分鐘。利用10%FBS-DMEM 3mL而停止酶處理，並以1500rpm離心3分鐘。離心後，吸取培養基，添加新的10%FBS-DMEM 6 mL，接種至100mm培養皿中，由此進行傳代培養(傳代數2)。在達到鋪滿後，吸取培養基，其後添加PBS(和光純藥)3mL，再次進行吸取。添加0.25%胰蛋白酶-EDTA 2mL，並在37℃下培養3分鐘。利用10%FBS-DMEM 4mL而停止酶處理，並以1500rpm離心3分鐘。離心後，吸取培養基，添加新的10%FBS-DMEM 12mL，以每孔6mL接種至100mm培養皿中進行傳代培養(傳代數3)。吸取第3傳代的星狀細胞的培養基，添加PBS(和光純藥)2mL，再次進行吸取。添加0.25%胰蛋白酶-EDTA 2mL，在37℃下培養3分鐘，添加4mL的10%FBS-DMEM，而停止酶處理。回收懸浮液，以1500rpm離心3分鐘，稀釋至Cell banker(日本全藥工業)中，在供於試驗前在-80℃下冷凍保存。在供於試驗供時，將冷凍保存的細胞懸浮液分別在恒溫槽內融化後，利用加溫至37℃的10%FBS-DMEM進行稀釋。將各細胞懸浮液離心後(1500rpm、3分鐘、室溫)，去除上清液，懸浮於新的培養基中之後，接種至8孔培養玻片(ibidi)，在CO₂培養箱內(5%CO₂、37℃)進行維持培養。

變異人SOD1(G93A)的基因型分型係使用REDExtract-N-Amp^TM組織PCR套組(西格瑪(Sigma))而進行。在小鼠ES細胞的維持培養的步驟中，將在傳代培養時所回收的包含變異人SOD1(G93A)表現星狀細胞的非黏附細胞的培養上清液回收至1.5mL試管中，以1500rpm離心3分鐘。離心後，吸取上清液，添加PBS 1mL進行清洗，再次離心後，將其吸取。將提取溶液50μL、及組織製備溶液12.5μL混合，添加至樣品中。混合後，轉移至聚合酶鏈反應(PCR)試管中，利用GeneAmp(註冊商標)PCR系統9700(Applied biosystems(註冊商標))以55℃、10分鐘→95℃、3分鐘→4℃、∞的循環進行基因組提取。其後，添加中和溶液B 50μL而進行中和化。

使用所提取的基因組，以表3所示的組成進行基因組PCR。PCR中所使用的引物序列如表4所示。在PCR後，利用1%瓊脂糖凝膠/100V/20分鐘進行電泳。將檢測到內標324bp及變異人SOD1(G93A)236bp的2條帶的細胞鑒定為變異人SOD1(G93A)表現星狀細胞。

Red mix=REDExtract-N-Amp PCR反應混合物.

活體外ALS模型的運動神經元保護效果的評價係依據以下的步驟而進行。利用0.25%胰蛋白酶/0.05%EDTA溶液(Gibco)對經培養維持的小鼠ES細胞進行處理，將細胞從培養皿剝離。進行離心而回收細胞後，製作懸浮液，以1.2×10⁵cells/mL接種至低吸附性12孔培養盤(Nunc)中(第0天)。在DFK培養基(含有5%KnockOut血清替代品(Invitrogen)、2mM L-穀醯胺、100units/mL青黴素-100μg/mL鏈黴素及0.1mM β-巰基乙醇的高級DMEM/F-12(Invitrogen)：神經元培養基(Invitrogen)〔1：1〕培養基)內進行2天懸浮凝聚塊培養。第2天將DFK培養基換為含有1μM視黃酸(西格瑪(Sigma))及2μM purmorphamine(Stemgent)的DFK培養基。其後，以2天1次的頻率更換培養基，培養5天(第3天~第7天)，而分化誘導為運動神經元。

將第7天所分化的運動神經元的細胞塊利用細胞分散液Accumax(MS technologies)進行分散，而製備為細胞密度5.5×10⁵cells/mL的懸浮液。將該懸浮液以200μL/well接種至預先培養維持了源於小鼠的野生型星狀細胞或變異人SOD1(G93A)表現星狀細胞的8孔培養玻片中，作為星狀細胞與運動神經元的共培養細胞而用於了評價。

將在野生型星狀細胞與運動神經元的共培養中所觀察到的運動神經元數設為對照。在藥物處置組中，進行變異人SOD1(G93A)表現星狀細胞與運動神經元的共培養，將條件設為添加溶劑(IgG及0.1%超純水)、抗體A(10、30、100nM)、EphA4-Fc(R & D Systems，3、10、30nM)、KYL肽(東麗分析研究中心，1、3、10μM)。在各條件下以37℃、5%CO₂培養2天後，使用抗兔ISL1抗體(Abcam)及Hoechst33342(Molecular probe)而將運動神經元進行免疫細胞化學染色。將每單位面積的ISL1/Hoechst33342共陽性細胞計數為存活運動神經元，運動神經元存活率係作為相對於對照的百分率(%)而算出。此外，圖11表示揭露評價系統的步驟的簡單示意圖。

在源於變異人SOD1(G93A)表現星狀細胞/小鼠ES細胞的運動神經元共培養中，運動神經元存活率顯著降低(40~50%)。抗體A濃度依賴性地抑制由變異人SOD1(G93A)表現星狀細胞所誘發的源於小鼠ES細胞的運動神經元的死亡(圖12)。另外，與抗體A同樣地也利用KYL肽及EphA4-Fc處置，在本實驗系中可見運動神經元保護效果，因此顯示抗體A在該體內ALS模型中藉由抑制EphA4/肝配蛋白信號傳送而促進源於小鼠ES細胞的運動神經元的存活。

實施方式14：抗EphA4單株抗體的活體外ALS模型的源於人iPS細胞的運動神經元保護效果

人iPS細胞的維持培養係依據以下的步驟而進行。將在液氮中以幹細胞凍存液(Takara)冷凍保存的人iPS細胞(201B7)從液氮層中取出，迅速懸浮於預先加溫至37℃的人iPS細胞培養基(Essential 8,Thermofisher scientific)5mL中進行融化。將細胞懸浮液回收至15mL圓錐管(Falcon)中，離心後(1000rpm、5分鐘、室溫)，去除上清液，並懸浮於新的培養基後，接種至預先塗布了0.5μg/cm²人重組玻連蛋白(Invitrogen)的 60mm細胞培養皿(Falcon BD)中，添加10μM Y-27632(和光純藥)，在CO₂培養箱內(5%CO₂、37℃)進行維持培養。每天更換培養基，在達到鋪滿的時刻供於實驗。

活體外ALS模型的運動神經元保護效果的評價係依據以下的步驟而進行。吸取所維持培養的人iPS細胞的培養基，利用2mL PBS(和光純藥)進行清洗。吸取PBS後，添加0.5mM EDTA 500μL，在CO₂培養箱內(5%CO₂、37℃)培養2~3分鐘(每30秒利用顯微鏡進行確認，在細胞彼此的結合減弱的時刻中止培養)。藉由懸浮於5mL的人iPS細胞培養基中，而停止EDTA反應，並回收至15mL圓錐管中。以1000rpm、5分鐘、室溫的條件進行離心，並吸取上清液。將人iPS細胞塊以約1/10量的細胞懸浮液接種至低接著性6孔細胞培養盤(Nunclone sphere,Nunc)的1個孔中，向DFK培養基(含有2% B27添加劑、5%KnockOut血清替代品(Invitrogen)、2 mmol/L L-穀醯胺、100units/mL青黴素-100ug/mL鏈黴素、及0.1mmol/L β-巰基乙醇的高級DMEM/F-12(Invitrogen)：神經元培養基(Invitrogen)〔1：1〕培養基)中添加2μM SB431542(西格瑪(Sigma))、300nM LDN193189(西格瑪(Sigma))、3μM CHIR99021(西格瑪(Sigma))，在CO₂培養箱內(5%CO₂、37℃)進行培養。藉由以下的方法，每2天更換培養基。首先，將人iPS細胞分化細胞塊(SFEBs)連同培養基一起回收至15mL圓錐管中，並在常溫下靜置5分鐘，由此使細胞塊沈澱。吸取其上清液，添加新的DFK培養基、及2μM SB431542(西格瑪(Sigma))、300nM LDN193189(西格瑪(Sigma))、3μM CHIR99021(西格瑪(Sigma))，並送回至原來的孔中，由此更換培養基。在培養第8天，將SFEBs連同培養基一起回收至15mL圓錐管中，在常溫下靜置5分鐘，由此使SFEBs沈澱。吸取其上清液，添加新的DFK培養基，並添加0.1μM視黃酸(西格瑪(Sigma))、0.5μM Purmorphamine(Milteny biotechnology)，並送回至原來的孔中，在CO₂培養箱內(5%CO₂、37℃)中進行培養。每2天更換培養基。在培養第12天，將SFEBs連同培養基一起回收至15mL圓錐管中，在常溫下靜置5分鐘，由此使SFEBs沈澱。吸取上清液，添加500μL的Accumax(MS technosystems)並吸液數次後，在CO₂培養箱內(37℃、5%CO₂)中培養5分鐘。從培養箱中取出細胞，懸浮於5mL的DFK培養基中，並吸液數次，由此使細胞塊分散。將細胞懸浮液利用細胞濾網(Falcon)進行過濾而將其解離為單一細胞後，利用血球計算盤而計數細胞數。將細胞懸浮液回收至新的15mL圓錐管中，以1000rpm、5分鐘、室溫進行離心。利用運動神經培養基(含有2% B27添加劑、1%馬血清、2mmol/L L-穀醯胺、100units/mL青黴素-100ug/mL鏈黴素、及0.1mmol/L β-巰基乙醇的高級DMEM/F-12(Invitrogen)：神經元培養基(Invitrogen)〔1：1〕培養基))而製備為細胞密度5.5×10⁵cells/mL的懸浮液，以200μL/well接種至預先以8×10⁴cells/well接種了源於小鼠的野生型星狀細胞或變異人SOD1(G93A)表現星狀細胞的8孔培養玻片中，作為星狀細胞與運動神經元的共培養細胞而用於評價(此外，野生型及人變異SOD1(G93A)表現星狀細胞的建立、冷凍、融化、接種、維持培養係藉由與實施方式13相同的方法而進行)。將在野生型星狀細胞與運動神經元的共培養中所觀察到的運動神經元數設為對照。在藥物處置組中，進行變異人SOD1(G93A)表現星狀細胞與運動神經元的共培養，將條件設為添加溶劑(IgG、及0.1%超純水)、抗體A(10、30、100nM)、EphA4抑制藥KYL肽(KYLPYWPVLSSL，1、3、10μM，委託東麗分析研究中心進行合成)、EphA4-Fc(3、10、30nM，R & D systems)。在各條件下以5%CO₂、37℃培養2天后，使用抗ISL1抗體(從Developmental Studies Hybridoma Bank取得)及Hoechst33342(Molecular probe)而對運動神經元進行免疫細胞化學染色。將每1個孔的ISL1/Hoechst33342共陽性細胞作為存活運動神經元而計數，運動神經元存活率係作為相對於對照的%而算出。圖13表示揭露評價系統的步驟的簡單示意圖。

在源於變異人SOD1(G93A)表現星狀細胞/人iPS細胞的運動神經元共培養中，與使用小鼠ES細胞的分析系同樣地運動神經元存活率顯著降低(約50%)。抗體A濃度依賴性地抑制由變異人SOD1(G93A)表現星狀細胞所誘發的源於人iPS細胞的運動神經元的死亡(圖14)。另外，與抗體A同樣地也利用KYL肽及EphA4-Fc處置，在本實驗系中可見源於人iPS細胞的運動神經元保護效果。因此顯示，抗體A在人細胞內也藉由抑制EphA4與其配位基的結合而促進運動神經元的存活。

實施方式15：藉由X射線晶體結構分析而進行的EphA4-配位基結合區(EphA4-LBD)的表位作圖

為了製作實施方式5中所製備的抗體A-Fab與作為抗原的EphA4-LBD的複合體，而製備EphA4-LBD(Qin H.et al.,J.Biol.Chem.,283：29473-29484(2008))。以EphA4-LBD相對於抗體A-Fab成為約1.5倍的莫耳比的方式，將1.33mol(950M,1.4ml)的EphA4-LBD與0.9mol(150M,6ml)的抗體A-Fab混合，在冰上培養30分鐘。其次，將混合液供於HILOAD 26/60 Superdex 75 prep grade(GE Healthcare)，在色譜用緩衝液(25mM Tris/HCl(pH值7.5)、100mM NaCl)中進行溶出。將包含複合體的組分利用SDS PAGE加以分析，收集高純度的組分，濃縮至34mg/ml，將其用於晶體化。

複合體的晶體化係藉由使用自動晶體化裝置Hydra II Plus One系統(Matrix Technologies Corp.,Ltd.)的坐滴蒸汽擴散法而進行。培養盤係使用MRC-2(Molecular Dimensions)。儲蓄溶液(reservoir solution)的組成為100mM Tris/HCl(pH值7.5~8.5)、30%聚乙二醇400，以該儲蓄溶液與所述複合體溶液的體積比成為1：1的方式進行混合，而製作晶體化微滴。所製作的晶體化培養盤係在20℃下進行靜置。

在所述條件進行晶體化，結果獲得空間群P212121、晶格常數a=70.0Å、b=82.3Å、c=216.0Å的晶體。對所獲得的晶體入射放射光X射線(1.0Å)，取得2.1Å的衍射資料。利用HKL2000(HKL Research Inc.)對衍射資料進行處理，藉由分子置換法而確定位相。分子置換法係使用CCP4軟體套件(Collaborative computational project number 4,〔CCP4〕version 6.5.0,Acta Cryst.D 67：235-242(2011))所含的程式PHASER(version 2.5.0, McCoy Å.J.et al.,J.Appl.Cryst.40：658-674(2007))。作為分子置換法的搜索模型，係使用EphA4-LBD的晶體結構(PDBID：3CKH)與本發明者等人過去所確定的別的抗體的Fab的晶體結構。以與由所確定的位相而獲得的電子密度一致的方式，使用程式COOT(Emsley P.et al.,Acta Cryst.D 60：2126-2132n(2004))而構建分子模型，並使用程式REFMAC(Murshudov G.N.,Acta Cryst.D 53：240-255(1997))而進行結構精密化。

藉由以上的結構計算，而獲得分辨力為2.1Å的複合體晶體結構(R=0.234,Rfree=0.288)。

使用計算化學系統MOE 2011.10(Chemical Computing Group Inc.)所安裝的相互作用檢測工具，對所獲得的Fab/EphA4-LBD複合體的晶體結構進行分析，而鑒定直接與Fab相互作用的EphA4-LBD上的胺基酸殘基(圖15)。檢測條件係使用MOE的標準設定。鑒定出的胺基酸殘基為Ser58、Met60、Gln71、Val72、Cys73、Thr104、Arg106、Gln156、Asp161、Arg162、Ile163、Cys191、Ile192。圖16表示Maestro(version 10.6，Schrödinger，LLC)所製作的EphA4-LBD的表面結構。結果本發明者等人得出結論：該等胺基酸殘基所存在的區域係EphA4-LBD的Fab結合區。

實施方式16：抗體A的人源化抗體的製作

人源化抗人EphA4抗體的製備

設計出人源化抗體的可變區。基於相對於抗體A的框架區(Framework region：FR)的高同源性，選擇人抗體的FR：輕鏈為IGKV1-NL1 ＊ 01(序列編號50)或IGKV3D-15 ＊ 01(序列編號51)及JK1(序列編號52)，重鏈為IGHV7-4-1 ＊ 02(序列編號53)及JH6(序列編號54)作為人源化抗體的FR。其後，使用小鼠抗體A的3D結構預測模型，預測會與CDR的胺基酸相互作用的FR中的胺基酸，與CDR(序列編號26-30及31-33)一起進行移植。就EphA4的磷酸化亢進及ADCC活性的觀點而言，作為重鏈恒定區，使用具有C131S、C219S、V234A及G237A變異且不具有C末端賴胺酸殘基的人IgG₂的恒定區(序列編號62)、或者CH1及鉸鏈部為人IgG₁且CH2及CH3為具有V234A及G237A變異的人IgG₂且不具有C末端賴胺酸殘基的恒定區(序列編號60)。作為輕鏈恒定區，係使用人Igκ(序列編號64)。HK1(序列編號72)、HK2(序列編號74)、及HK4(序列編號76)係設計為移植了藉由Kabat的定義方法所確定的CDR(序列編號26、28、30)的人源化抗體的重鏈可變區，HA1(序列編號66)、HA2(序列編號68)、及HA4(序列編號70)係設計為移植了藉由AbM的定義方法所確定的CDR(序列編號27、29、30)的人源化抗體的重鏈可變區，L1-4(序列編號78)、L1-5(序列編號80)、及L1-6(序列編號82)係設計為使用IGKV1-NL1 ＊ 01及JK1的人源化抗體的輕鏈可變區，L2-4(序列編號84)係設計為使用IGKV3D-15 ＊ 01及JK1的人源化抗體的輕鏈可變區。此外，在重鏈恒定區的設計中，EphA4的磷酸化係使用與實施方式10中所記載的方法相同的方法而確認。

編碼HK1、HK2、HK4的胺基酸序列的基因序列係藉由如下方式製作：對IGHV7-4-1 ＊ 02(序列編號53)及JH6(序列編號54)移植抗體A的重鏈CDR(序列編號26、28、30)，將在N末端附加了信號序列(序列編號55)的胺基酸序列藉由GenScript USA Inc.轉化為基因序列而進行合成，並藉由PCR導入變異(HK1：序列編號73、HK2：序列編號75、HK4：序列編號77、信號序列：序列編號57)。編碼HA1、HA2、HA4的胺基酸序列的基因序列係藉由如下方式製作：對IGHV7-4-1 ＊ 02(序列編號53)及JH6(序列編號54)移植抗體A的重鏈CDR(序列編號27、29、30)，將在N末端附加了信號序列 (序列編號55)的胺基酸序列藉由GenScript USA Inc.轉化為基因序列而進行合成，並藉由PCR導入變異(HA1：序列編號67、HA2：序列編號69、HA4：序列編號71、信號序列：序列編號56)。該等編碼人源化重鏈可變區與信號序列的基因係插入至包含編碼具有C131S、C219S、V234A及G237A變異且不具有C末端賴胺酸殘基的人IgG₂的恒定區(序列編號62)的基因序列(序列編號63)的表現載體(pcDNA3.4)及包含編碼CH1及鉸鏈部為人IgG₁且CH2及CH3具有V234A及G237A的人IgG₂並且不具有C末端賴胺酸殘基的恒定區(序列編號60)的基因序列(序列編號61)的表現載體(pcDNA3.4)中。編碼L1-4、L1-5、L1-6的胺基酸序列的基因序列係藉由如下方式製作：對IGKV1-NL1 ＊ 01(序列編號50)及JK1(序列編號52)移植抗體A的輕鏈CDR(序列編號31-33)，將N末端附加了信號序列(序列編號58)的胺基酸序列藉由GenScript USA Inc.轉化為基因序列而進行合成，並藉由PCR導入變異(L1-4：序列編號79、L1-5：序列編號81、L1-6：序列編號83、信號序列：序列編號59)。編碼L2-4的胺基酸序列的基因序列係藉由如下方式製作：對IGKV3D-15 ＊ 01(序列編號51)及JK1(序列編號52)移植抗體A的輕鏈CDR(序列編號31-33)，將N末端附加了信號序列(序列編號58)的胺基酸序列藉由GenScript USA Inc.轉化為基因序列而進行合成，並藉由PCR導入變異(L2-4：序列編號85、信號序列：序列編號59)。該等編碼人源化輕鏈可變區與信號序列的基因係插入至包含編碼人Igκ的恒定區(序列編號64)的基因序列(序列編號65)的表現載體(pcDNA3.4)中。此處，“C131S”表示Eu編號中的131位的半胱胺酸被置換為絲胺酸的變異，“C219S”表示219位的半胱胺酸被置換為絲胺酸的變異，“V234A”表示234位的纈胺酸被置換為丙胺酸的變異，“G237A”表示237位的甘胺酸被置換為丙胺酸的變異。另外，此處CH1表示人IgG恒定區中Eu編號的118位至215位，鉸鏈部表示人IgG恒定區中216位至230位，CH2表示人IgG恒定區中231位至340位，CH3表示341位至446位。為了產生該等人源化抗體，使用Expi293表現系統(Gibco/ThermoFisher)，將所述表現載體以表5的組合轉導至Expi293F細胞(Gibco/ThermoFisher)中。回收上清液，使用蛋白A(GE Healthcare)進行精製。

實施方式17：抗EphA4單株人源化抗體針對人EphA4的親和性

藉由使用Biacore T200(GE Healthcare)的表面等離子共振(SPR法)，而確定實施方式16中所獲得的抗EphA4單株人源化抗體針對人EphA4的結合親和性。首先，對於抗體A的測定用，將利用小鼠IgG₁抗體對大鼠進行免疫並藉由常用方法所製作的大鼠抗小鼠IgG₁抗體固定在傳感晶片CM5上。大鼠抗小鼠IgG₁抗體在傳感晶片CM5上的固定係藉由使用N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)及N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(EDC)的胺偶合法而進行，封閉係使用乙醇胺(傳感晶片或固定用試劑均由GE HEALTHCARE公司製造)。使用固定用緩衝液(10mM乙酸鈉，pH值4.5)進行稀釋，依據Biacore T200所附帶的操作說明，並固定在傳感晶片上。人源化單株抗體的測定係使用蛋白A晶片(GE Healthcare，29-1383-03)。使用運行緩衝液HBS-EP(GE Healthcare)對抗體A及人源化單株抗體進行稀釋，僅對流動檢測池2送液120秒鐘而進行捕獲(30-60RU左右的捕獲量)。繼而，將使用HBS-EP在50、16.7、5.6、1.9、0.6nM的範圍內進行連續稀釋的人EphA4細胞外區域-SEAP-His蛋白質不進行再生操作而連續添加至低濃度側，依序觀測添加時(結合相，120秒鐘)及添加結束後(解離相，900秒鐘)的結合反應曲線。各觀測結束後，添加3M MgCl₂(60秒鐘)或10mM甘胺酸-HCl pH值1.5(30秒鐘)而再生傳感晶片。對於所獲得的結合反應曲線，藉由使用系統附帶軟體BIA evaluation軟體的1：1的結合模型進行擬合分析，而算出針對人EphA4的親和性(KD=kd/ka)(表6)。

得知表5的全部人源化抗體均顯示出與原抗體A大致同等的親和性(表6)。

實施方式18：抗EphA4單株人源化抗體的人EphA4-人配位基結合抑制活性

關於實施方式16中所獲得的抗EphA4單株人源化抗體，人EphA4與人配位基的結合抑制活性的評價係依據以下的步驟而進行。將抗鹼性磷酸酶抗體(Thermo SCIENTIFIC)塗布在96孔培養盤(Nunc)的孔上。在4℃下培養一晚後，利用1%Block Ace(DS Pharma Biomedical股份有限公司)，將孔在室溫下封閉1小時。利用0.05%Tween20/PBS(Thermo SCIENTIFIC)清洗3次後，對孔中接種實施方式2的方法中所獲得的人EphA4細胞外區域-SEAP-His蛋白質(最終濃度10nM)，在室溫下培養1小時。清洗3次後，對孔中添加配位基與經連續稀釋的抗體A人源化抗體(0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、3000nM)。此外，配位基係使用生物素化人肝配蛋白A5-Fc嵌合體(R & D Systems、最終濃度0.7nM)。在室溫下培養1小時並清洗3次後，添加辣根過氧化物酶標記鏈黴抗生物素蛋白(GE Healthcare)，在室溫下培養1小時。清洗3次後，對孔中添加TMBZ(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺、西格瑪(Sigma))溶液，在室溫下培養2分鐘。對孔中添加等量的反應停止溶液(1N H₂SO₄、和光純藥)，利用酶標儀(PerkinElmer)而讀取450nm的吸光度。

可知表5的所有人源化抗體均顯示出與原抗體A大致同等的抑制活性(表7)。

實施方式19：抗EphA4單株人源化抗體針對人Eph受體的選擇性

與實施方式7中所記載的方法同樣地，使用源於組織的總RNA，將編碼人的各Eph受體(EphA1，EphA2，EphA3，EphA4，EphA5，EphA6，EphA7，EphA8，EphA10，EphB1，EphB2，EphB3，EphB4，EphB6)的信號序列與細胞外區域的DNA序列藉由RT-PCR進行擴增，轉殖在具有編碼SEAP蛋白質及組胺酸標籤的DNA序列的pENTR1A載體(Invitrogen/LifeTechnologies)上。其次，藉由Gateway System(Invitrogen/LifeTechnologies)的LR反應，將編碼人的各Eph受體的信號序列與細胞外區域、SEAP蛋白質及組胺酸標籤的DNA序列轉移至pcDNA3.1_rfcB載體上，而構建表現對人的各Eph受體的細胞外區域融合SEAP蛋白質與His標籤的蛋白質(稱為“Eph受體細胞外區域-SEAP-His蛋白質”)的載體(稱為“Eph受體細胞外區域-SEAP-His蛋白質表現載體”)。

其次，使用Expi293表現系統(Gibco/ThermoFisher)，將人的各Eph受體細胞外區域-SEAP-His蛋白質表現載體導入至Expi293F細胞(Gibco/ThermoFisher)中。在5天的培養(5%CO₂、37℃)後，回收培養上清液，在室溫下以1500rpm離心5分鐘。將離心上清液利用0.45μm過濾器(密理博(Millpore))進行過濾。

關於實施方式16中所獲得的抗EphA4單株人源化抗體，人Eph受體的結合活性的評價係依據以下的步驟而進行。

將兔抗6-His抗體(Bethyl Loboratories)塗布在96孔培養盤(Nunc)的孔上。將孔在室溫下封閉1小時後，利用1%Block Ace(DS Pharma Biomedical)，在4℃下培養一晚。利用0.05% Tween20/PBS(Nacalai Tesque)清洗3次後，對孔中添加人EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、 EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB6的SEAP-His蛋白質(最終濃度1nM)，在室溫下培養1小時。清洗3次後，對孔中添加人源化抗體，在室溫下培養1小時。清洗3次後，添加辣根過氧化物酶標記驢抗小鼠IgG抗體(Jackson ImmunoResearch Loboratories)，在室溫下培養1小時。清洗3次後，對孔中添加TMB微孔過氧化物酶底物系統(KPL)，在確認到適度的顯色後，對孔中添加等量的反應停止溶液(1N H₂SO₄、和光純藥)，利用酶標儀(Thermo Scientific)而讀取450nm的吸光度。

在表8中匯總將人EphA4(hEphA4-SEAP-His)的450nm的吸光度設為100%時的比例，結果可知表5的所有人源化抗體均與原抗體A同樣地對人EphA4特異性地結合(表8)。

實施方式20：抗EphA4單株人源化抗體的體內ALS模型的源於人iPS細胞的運動神經元保護效果

人iPS細胞的維持培養係依據以下的步驟而進行。將在液氮中以幹細胞凍存液(Takara)進行冷凍保存的人iPS細胞(201B7)從液氮層中取出，迅速懸浮於預先加溫至37℃的人iPS細胞培養基(Essential8,Thermofisher scientific)5mL中進行融化。將細胞懸浮液回收至15mL圓錐管(Falcon)中，離心後(1000rpm、5分鐘、室溫)，去除上清液，並懸浮於新的培養基後，接種至預先利用0.5μg/cm²人重組玻連蛋白(Invitrogen)進行塗布的 60mm細胞培養皿(Falcon BD)中，添加10μM Y-27632(和光純藥)，在CO₂培養箱內(5%CO₂、37℃)中進行維持培養。每天更換培養基，在達到鋪滿的時刻供於實驗。

實施方式16中所獲得的抗EphA4單株人源化抗體的活體外ALS模型的運動神經元保護效果的評價係藉由以下的步驟而進行。吸取所維持培養的人iPS細胞的培養基，利用2mL PBS(和光純藥)進行清洗。吸取PBS後，添加0.5mM EDTA 500μL，在CO₂培養箱內(5%CO₂、37℃)培養2~3分鐘(每30秒鐘利用顯微鏡進行確認，在細胞彼此的結合減弱的時刻中止培養)。藉由懸浮於5mL的人iPS細胞培養基中，而停止EDTA反應，並回收至15mL圓錐管中。以1000rpm在室溫下離心5分鐘，並吸取上清液。將人iPS細胞塊以約1/10量的細胞懸浮液接種至低接著性6孔細胞培養盤(Nunclone sphere,Nunc)的1個孔中，向含有DFK培養基(2%B27添加劑，5% KnockOut血清替代品(Invitrogen)、2mmol/L L-穀醯胺、100units/mL青黴素-100ug/mL鏈黴素、及0.1mmol/L β-巰基乙醇的高級DMEM/F-12(Invitrogen)：神經元培養基(Invitrogen)〔1：1〕培養基)中添加2μM SB431542(西格瑪(Sigma))、300nM LDN193189(西格瑪(Sigma))、3μM CHIR99021(西格瑪(Sigma))，在CO₂培養箱內(5%CO₂、 37℃)進行培養。藉由以下的方法，每2天更換培養基。首先，將人iPS細胞分化細胞塊(SFEBs)連同培養基一起回收至15mL圓錐管中，在常溫下靜置5分鐘，由此使細胞塊沈澱。吸取其上清液，添加新的DFK培養基、及2μM SB431542(西格瑪(Sigma))、300nM LDN193189(西格瑪(Sigma))、3μM CHIR99021(西格瑪(Sigma))，並送回原來的孔中，由此更換培養基。在培養第8天，將SFEBs連同培養基一起回收至15mL圓錐管中，在常溫下靜置5分鐘，由此使SFEBs沈澱。吸取其上清液，添加新的DFK培養基，添加0.1μM視黃酸(西格瑪(Sigma))、0.5μM Purmorphamine(Milteny biotechnology)，並送回至原來的孔中，在CO₂培養箱內(5%CO₂、37℃)進行培養。每2天更換培養基。在培養第12天，將SFEBs連同培養基一起回收至15mL圓錐管中，在常溫下靜置5分鐘，由此使SFEBs沈澱。吸取上清液，添加500μL的Accumax(MS technosystems)並吸液數次後，在CO₂培養箱內(5%CO₂、37℃)培養5分鐘。從培養箱中取出細胞，懸浮於5mL的DFK培養基中，並吸液數次，由此使細胞塊分散。將細胞懸浮液利用細胞濾網(Falcon)進行過濾，而解離為單一細胞後，利用血球計算盤而計數細胞數。將細胞懸浮液回收至新的15mL圓錐管中，以1000rpm在室溫下離心5分鐘。利用運動神經培養基(含有2%B27添加劑、1%馬血清、2mmol/L L-穀醯胺、100units/mL青黴素-100ug/mL鏈黴素、及0.1mmol/L β-巰基乙醇的高級DMEM/F-12(Invitrogen)：神經元培養基(Invitrogen)〔1：1〕培養基))而製備細胞密度為5.5×10⁵cells/mL的懸浮液，以200μL/well接種至預先以8×10⁴cells/well接種了源於小鼠的野生型星狀細胞或變異人SOD1(G93A)表現星狀細胞的8孔培養玻片上，作為星狀細胞與運動神經元的共培養細胞而用於評價(此外，野生型、及人變異SOD1(G93A)表現星狀細胞的建立、冷凍、融化、接種、維持培養係藉由與實施方式13相同的方法而進行)。將在野生型星狀細胞與運動神經元的共培養中所觀察到的運動神經元數設為對照。在藥物處置組中，進行變異人SOD1(G93A)表現星狀細胞與運動神經元的共培養，將條件設為添加溶劑(IgG、及0.1%超純水)、添加人源化抗體。在各條件下在5%CO₂、37℃的條件下培養2天後，使用抗ISL1抗體(從Developmental Studies Hybridoma Bank取得)及Hoechst33342(Molecular probe)對運動神經元進行免疫細胞化學染色。將每1個孔的ISL1/Hoechst33342共陽性細胞作為存活運動神經元而進行計數，運動神經元存活率係作為相對於對照的%而算出。

在源於變異人SOD1(G93A)表現星狀細胞/人iPS細胞的運動神經元共培養中，運動神經元存活率顯著降低。表5中所記載的人源化抗體濃度依賴性地抑制由變異人SOD1(G93A)表現星狀細胞所誘發的源於人iPS細胞的運動神經元的死亡。由此顯示，抗EphA4單株人源化抗體在人細胞內促進運動神經元的存活。

[產業上的可利用性]

本發明提供能夠與EphA4結合，而抑制EphA4與其配位基的結合的抗EphA4抗體或其EphA4結合片段及含有該等作為有效成分的醫藥組合物。本發明的抗體或醫藥組合物可用於治療由EphA4與其配位基的結合所引起的疾病、例如ALS。

<110> 衛材R&D企管股份有限公司

<120> 抗EphA4抗體

<130> ESAP1505F

<150> JP2015-177081

<151> 2015-09-08

<160> 85

<170> PatentIn第3.5版

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Claims

一種抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其含有：(a)包含序列編號26或序列編號27所示之胺基酸序列的CDR-H1；(b)包含序列編號28或序列編號29所示之胺基酸序列的CDR-H2；(c)包含序列編號30所示之胺基酸序列的CDR-H3；(d)包含序列編號31所示之胺基酸序列的CDR-L1；(e)包含序列編號32所示之胺基酸序列的CDR-L2；及(f)包含序列編號33所示之胺基酸序列的CDR-L3。
如請求項1之抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其經人源化。
如請求項1或2之抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中上述抗體或其EphA4結合片段係與EphA4特異性地結合，而抑制EphA4與肝配蛋白的結合。
如請求項1至3項中任一項之抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中上述抗體或其EphA4結合片段含有重鏈及輕鏈，上述重鏈之恒定區及上述輕鏈之恒定區含有源於人抗體之序列。
如請求項4之抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中上述重鏈之恒定區為人IgG。
如請求項5之抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中上述人IgG為人IgG₁或人IgG₂。
如請求項4至6項中任一項之抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中上述輕鏈之恒定區為人Igκ。
如請求項1至7項中任一項之抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中上述EphA4結合片段係選自由Fab、Fab'、F(ab')₂、及Fv所組成之群中。
如請求項8之抗EphA4抗體或其EphA4結合片段，其中上述EphA4結合片段為F(ab')₂。
一種醫藥組合物，其含有如請求項1至9項中任一項之抗EphA4抗體或其EphA4結合片段。
如請求項10之醫藥組合物，其進而含有製藥學上容許之載體。
如請求項10或11之醫藥組合物，其係用於治療肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)。