ES2846175T3 - Anticuerpo anti-EphA4 - Google Patents

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Toshio Imai
Eiji Inoue
Akio Yamada
Aki Nakatani
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Yuichi Ono
Shunsuke Ito
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Abstract

Un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo, que comprende (a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 27; (b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 29; (c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 30; (d) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 31; (e) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 32; y (f) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 33.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpo anti-EphA4
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un anticuerpo que se une a EphA4.
Antecedentes de la invención
EphA4 es un miembro de la familia de receptores tirosina quinasa. La efrina tipo A y tipo B se conocen como ligandos de EphA4. Tras la unión de EphA4 a su ligando efrina, se inducen señales de desadhesión. EphA4 se expresa en neuronas motoras y regula la guía axonal correcta a través de la efrina expresada en regiones no proyectivas de las neuronas motoras en la médula espinal durante una etapa de formación de la red neuronal.
Estudios previos sugieren que la inhibición funcional de EphA4 es un procedimiento terapéutico eficaz para enfermedades neurodegenerativas tales como la esclerosis lateral amiotrófica (en lo sucesivo, también denominada "ELA") y la enfermedad de Alzheimer, y lesión de la médula espinal.
Se ha descrito que el gen EphA4 ajusta el fenotipo de la ELA (bibliografía de patente 1 y bibliografía no de patente 1). Se ha descubierto que el defecto genético de EphA4 o el antagonismo por EphA4-Fc o similar promueve el alargamiento axonal o la recuperación funcional en el momento de la lesión de la médula espinal en ratones o ratas (bibliografía no de patente 2; y bibliografía no de patente 3).
El péptido KYL y el compuesto 1 se conocen como inhibidores de señalización de EphA4 existentes (bibliografía de patente 1; bibliografía no de patente 1; y bibliografía no de patente 2).
Baron de Barsey ("Queen Elisabeth Medical Foundation Report 2014", 30 de marzo de 2015) describe nanocuerpos anti-EphA4 específicos.
El documento WO 2016/019280 describe anticuerpos monoclonales anti-EphA4 completamente humanos con distintas características de unión.
Sin embargo, no ha habido ningún informe sobre un anticuerpo que tenga actividad neutralizante.
Técnica anterior
Bibliografía de patente 1: WO2012/156351 A1
Bibliografía no de patente 1: Van Hoecke et al., Nature Medicine, vol. 18: 1418-1422, 2012
Bibliografía no de patente 2: Goldschmit et al., PLoS one, vol. 6: e24636, 2011
Bibliografía no de patente 3: Spanevello et al., Journal o f Neurotrauma, vol. 30: 1023-1034, 2013
Resumen de la invención
Un objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo que es capaz de unirse a EphA4 e inhibir la unión entre EphA4 y su ligando, y una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo como principio activo.
Los autores de la presente invención han llevado a cabo estudios diligentes para lograr el objetivo y por consiguiente completaron la presente invención obteniendo un anticuerpo anti-EphA4 capaz de unirse a EphA4 e inhibir la unión entre EphA4 y su ligando.
Específicamente, en una realización, la presente invención se refiere a las siguientes invenciones.
(1) Un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo, que comprende
(a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 27;
(b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 29;
(c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 30;
(d) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 31;
(e) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 32; y
(f) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 33.
(2) El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (1), en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a EphA4 del mismo es humanizado.
(3) El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (1) o (2), en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a EphA4 del mismo se une específicamente a EphA4 e inhibe la unión entre EphA4 y la efrina.
(4) El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (3), en donde
el anticuerpo o el fragmento de unión a EphA4 del mismo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, y la región constante de la cadena pesada y la región constante de la cadena ligera cada una comprende una secuencia derivada de anticuerpo humano.
(5) El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (4), en donde
la región constante de la cadena pesada deriva de IgG humana.
(6) El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (5), en donde
la IgG humana es IgG1 humana o IgG2 humana.
(7) El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con uno cualquiera de (4) a (6), en donde
la región constante de la cadena ligera deriva de IgK humana.
(8) El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (7), en donde
el fragmento de unión a EphA4 se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')2 y Fv.
(9) El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (8), en donde
el fragmento de unión a EphA4 es F(ab')2.
(10) Una composición farmacéutica que comprende
un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (9). (11) La composición farmacéutica de acuerdo con (10) que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
(12) La composición farmacéutica de acuerdo con (10) o (11), en donde
la composición farmacéutica es para usar en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA).
En otra realización, la presente invención también se refiere a las siguiente invenciones.
(1') Un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo, que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde
una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 66, 68 o 70, y
una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 78, 80, 82 u 84.
(2') Un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (1'), en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 66, y
una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 78. (3') Un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (1') en donde
una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 68, y
una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 78. (4') Un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (1') en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 70, y
una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 78. (5') Un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (1') en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 66, y
una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 80. (6') Un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (1'), en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 68, y
una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 80. (7') Un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (1'), en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 70, y
una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 80. (8') Un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (1') en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 66, y
una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 82. (9') Un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (1') en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 68, y
una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 82. (10') Un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (1'), en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 70, y
una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 82. (11') Un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (1') en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 66, y
una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 84. (12') Un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (1') en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 68, y
una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 84. (13') Un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (1'), en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 70, y
una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 84. (14') Un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con uno cualquiera de (1') a (13'), en donde
el anticuerpo o el fragmento de unión a EphA4 del mismo se une específicamente a EphA4 e inhibe la unión entre EphA4 y la epinefrina.
(15') Un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con uno cualquiera de (1') a (14'), en donde
la región constante de la cadena pesada y la región constante de la cadena ligera cada una comprende una secuencia derivada de anticuerpo humano.
(16') El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (15'), en donde la región constante de la cadena pesada deriva de IgG humana.
(17') El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (16'), en donde la IgG humana es IgG humana que consiste en IgG2 humana o una combinación de IgG1 humana e IgG2 humana. (18') El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (17'), en donde la IgG humana es IgG2 humana.
(19') El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (18'), en donde la IgG2 humana tiene una mutación C131S, C219S, V234A y/o G237A con la numeración Eu, y no tiene un resto de lisina en el carboxi terminal.
(20') El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (19'), en donde la IgG2 humana comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 62.
(21') El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (17'), en donde la IgG humana es IgG humana que consiste en una combinación de IgG1 humana y IgG2 humana.
(22') El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (21'), en donde en la IgG humana que consiste en una combinación de IgG1 humana y IgG2 humana, una región CH1 y una región bisagra son de IgG1 humana, y una región CH2 y una región CH3 son de IgG2 humana.
(23') El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (22'), en donde la IgG humana que consiste en una combinación de IgG1 humana e IgG2 humana tiene una mutación V234A y/o una mutación G237A en la numeración Eu, y no tiene un resto de lisina en el carboxi terminal.
(24') El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (23'), en donde la IgG humana que consiste en una combinación de IgG1 humana e IgG2 humana comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 60.
(25') El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con uno cualquiera de (15') a (24'), en donde
la región constante de la cadena ligera deriva de IgK humana.
(26') El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con uno cualquiera de (1') a (25'), en donde
el fragmento de unión a EphA4 se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')2 y Fv.
(27') El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con (26'), en donde el fragmento de unión a EphA4 es F(ab')2.
(28') Una composición farmacéutica que comprende
un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con uno cualquiera de (1') a (27'). (29') La composición farmacéutica de acuerdo con (28') que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
(30') La composición farmacéutica de acuerdo con (28') o (29'), en donde
la composición farmacéutica es para usar en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA).
Uno o cualquier combinación de uno o más de los aspectos de la presente invención mencionados antes también está incluido en el alcance de la presente invención.
La presente invención proporciona un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo que es capaz de unirse a EphA4 e inhibir la unión entre EphA4 y su ligando, y una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo como un principio activo.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra la afinidad de unión de un anticuerpo monoclonal anti-EphA4 (anticuerpo A) por EphA4 humano y EphA4 de ratón.
La Fig. 2 muestra la inhibición de la unión de EphA4 de ratón a la efrina A1 de ratón y efrina B2 de ratón por el anticuerpo monoclonal anti-EphA4 (anticuerpo A), péptido KYL y compuesto 1.
La Fig. 3 muestra la inhibición de EphA4 humano a efrina A5 humana y efrina B3 humana por el anticuerpo monoclonal anti-EphA4 (anticuerpo A), y péptido KYL.
La Fig. 4A muestra la afinidad de unión del anticuerpo A-IgG (anticuerpo A) y anticuerpo A-Fab para EphA4 de ratón La Fig. 4B muestra la afinidad de unión del anticuerpo A-IgG (anticuerpo A) y anticuerpo A-F(ab ')2 para EphA4 de ratón.
La Fig. 4C muestra la afinidad de unión del anticuerpo A-IgG (anticuerpo A) y anticuerpo A-Fab para EphA4 humano. La Fig. 4D muestra la afinidad de unión del anticuerpo A-IgG (anticuerpo A) y anticuerpo A-F(ab ')2 para EphA4 humano. La Fig. 5 muestra la inhibición de la unión entre EphA4 de ratón y efrina B2 de ratón por el anticuerpo A-IgG (anticuerpo A), anticuerpo A-F(ab')2 , anticuerpo A-Fab, y péptido KYL.
La Fig. 6 muestra la especificidad de unión del anticuerpo A por el receptor Eph humano (Fig. 6A) y receptor Eph de ratón (Fig. 6B).
La fig. 7 muestra la actividad de unión del anticuerpo A frente a EphA4 de ratón, rata, mono y humano.
La fig. 8 muestra que el anticuerpo A suprime, de manera dependiente de la concentración, la autofosforilación de EphA4 inducida por la efrina A1 en neuronas del hipocampo. El pY en la Fig. 8 presenta EphA4 fosforilado.
La fig. 9 muestra que el anticuerpo A suprime, de una manera dependiente de la concentración, el colapso de conos de crecimiento inducido por la efrina A1 en las neuronas del hipocampo.
La fig. 10 muestra que el anticuerpo A suprime la autofosforilación de EphA4 inducida por la efrina A1 en el cerebro de ratón de recién nacido. El pY en la Fig. 10 presenta EphA4 fosforilado.
La fig. 11 muestra una vista esquemática de un sistema de evaluación llevado a cabo en el ejemplo 13.
La fig. 12 muestra que el anticuerpo A protege las neuronas motoras en modelos de ELA in vitro utilizando células ES de ratón.
La fig. 13 muestra una vista esquemática de un sistema de evaluación llevado a cabo en el ejemplo 14.
La fig. 14 muestra que el anticuerpo A protege las neuronas motoras en modelos de ELA in vitro usando células iPS humanas.
La fig. 15 muestra los aminoácidos del dominio de unión al ligando de EphA4 (EphA4-LBD) en el eje de abscisas y la región estructural de Fab en el eje de ordenadas. Los bits negros representan los puntos de intersección de combinaciones que tienen una interacción. Una pluralidad de bits que se presentan para un aminoácido corresponde a los tipos de interacción (enlace de hidrógeno, contacto de superficie, etc.). Un aminoácido que tiene un número mayor de bits significa que el aminoácido se une a Fab con diversas interacciones.
La fig. 16 muestra la estructura de superficie del dominio de unión a ligando de EphA4 (EphA4-LBD). En la Fig. 16, las regiones de color oscuro corresponden a las regiones de unión a Fab. En esta figura, los nombres y los números de los restos de aminoácidos contenidos en las regiones de unión se muestran en las posiciones correspondientes, y las CDR de la cadena H y la cadena L de Fab que se van a unir se indican por modelos de cinta.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-EphA4 que se une a EphA4.
El anticuerpo anti-EphA4 usado en la presente invención es un anticuerpo que puede reconocer y unirse a EphA4. Como se menciona a continuación, el anticuerpo puede ser un anticuerpo intacto o puede ser un fragmento de unión al antígeno del mismo o un anticuerpo sintético (p. ej., un anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado) siempre que tenga afinidad de unión por EphA4. En la presente invención, se puede entender que EphA4 se refiere a EphA4 derivado de ser humano, ratón, rata o mono. El EphA4 derivado de ser humano, ratón, rata o mono se puede obtener de una base de datos pública en la que se registra información de secuencia, tal como el GenBank proporcionada por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (EE.UU.). Alternativamente, se diseñan cebadores basándose en la información de la secuencia de nucleótidos en EphA4 de una especie animal estrechamente relacionada con el mismo, y la información de la secuencia en el gen EphA4 se puede obtener por clonación a partir de ARN extraído de la especie animal deseada. Por ejemplo, la información de la secuencia de nucleótidos en EphA4 humano, de ratón, rata o mono está registrada con los números de acceso de GenBank NM_004438.4, n M_007936.3, NM_001162411.1 y NM_001260870, respectivamente, en la base de datos.
En un aspecto de la presente invención, EphA4 comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos por la sustitución, adición y/o eliminación de uno o más aminoácidos, o la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos por sustitución, adición y/o eliminación de uno o más aminoácidos. En la presente invención, la expresión "o más" usado para EphA4 no está limitado siempre que la secuencia resultante mantenga características funcionales equivalentes a la secuencia original. La expresión "o más" es de 2 a 100, por ejemplo, de 2 a 90, 2 a 80, 2 a 70, 2 a 60, 2 a 50, 2 a 40, 2 a 30, 2 a 20, 2 a 10, o 2 a 5 o está dentro del 10%, por ejemplo, dentro del 9%, dentro del 8%, dentro del 7%, dentro del 6% o dentro del 5% del número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos.
En un aspecto de la presente invención, el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo es un anticuerpo que se une específicamente a EphA4. La expresión "unión específica" es una expresión bien conocida por los expertos en la técnica, y también es bien conocido un método para determinar la unión específica de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo a un antígeno o un epítopo. En una realización de la presente invención, se entiende que la "unión específica" significa que el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo es capaz de unirse a EphA4 a través de reacción inmunológica más rápidamente y/o durante un tiempo más prolongado con mayor afinidad de unión y mayor actividad de unión en comparación con su unión a otras moléculas diana. En este contexto, no se excluye la unión específica a otras dianas de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a una diana. En otra realización de la presente invención, la "unión específica" se puede indicar por un anticuerpo que tiene KD de al menos aproximadamente 10-7 M, al menos aproximadamente 10-8 M, al menos aproximadamente 10-9 M, al menos aproximadamente 10-10 M, al menos aproximadamente 10-11 M, o al menos aproximadamente 10-12 M o más para EphA4. En una realización alternativa adicional de la presente invención, se entiende que la "unión específica" es que se une a EphA4 a través de reacción inmunológica, pero no se une sustancialmente a otras subclases y subtipos de receptores de Eph.
En un aspecto de la presente invención, el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención es un anticuerpo que se une a la región extracelular de EphA4. El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención es como se define en las reivindicaciones y puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2. o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos por sustitución, adición y/o eliminación de uno o más aminoácidos, o comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos por sustitución, adición y/o eliminación de uno o más aminoácidos, y se une a cualquier sitio en la región extracelular de EphA4. En la presente invención, la expresión "o más" usada para la región extracelular de EphA4 es, pero no se limita a, de 2 a 50, por ejemplo, de 2 a 45, 2 a 40, 2 a 35, 2 a 30, 2 a 25, 2 a 20, 2 a 15, 2 a 10 o 2 a 5, o dentro del 10%, por ejemplo, dentro del 9%, dentro del 8%, dentro del 7%, dentro del 6% o dentro del 5% del número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos.
En un aspecto de la presente invención, el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo se puede unir específicamente a EphA4 e inhibir la unión entre EphA4 y efrina.
En una realización de la presente invención, el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo se puede unir específicamente a al menos uno de EphA4 humano, EphA4 de ratón, EphA4 de rata y EphA4 de mono e inhibir la unión de los mismos a sus ligandos. En una realización preferida de la presente invención, el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo se puede unir específicamente a dos o más de EphA4 humano, EphA4 de ratón, EphA4 de rata y EphA4 de mono e inhibir la unión de los mismos a sus ligandos. En otra realización preferida de la presente invención, el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo se puede unir específicamente a todos de EphA4 humano, EphA4 de ratón, EphA4 de rata y EphA4 de mono e inhibir la unión de los mismos a sus ligandos.
Se puede usar un método generalmente conocido por los expertos en la técnica como un método para medir las propiedades de unión al antígeno (p. ej., afinidad de unión y reactividad cruzada entre especies) del anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo. Por ejemplo, la afinidad de unión se puede medir mediante el uso del biosensor Biacore (R), biosensor KinExA, ensayo de centelleo de proximidad, ELISA, inmunoensayo ORIGEN (IGEN International), citometría de flujo, extinción de fluorescencia, transferencia de fluorescencia, presentación en levadura y/o inmunotinción, aunque el método no se limita a estos. La actividad neutralizante del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo frente a la unión entre EphA4 y su ligando se puede medir mediante el uso del biosensor Biacore (R), ELISA y/o citometría de flujo, aunque el método no se limita a estos.
El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención puede ser cualquiera de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal y un fragmento de unión a EphA4 del mismo siempre que se una a EphA4, preferiblemente, que se una específicamente a EphA4.
En la presente invención, el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención puede ser de cualquier clase tal como IgG, IgA o IgM (o subclase de las mismas) y no está limitado por una clase particular. Las inmunoglobulinas se clasifican en diferentes clases dependiendo de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo de sus regiones constantes de la cadena pesada (también llamada cadena H). Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, algunas de las cuales se pueden dividir en subclases (isotipos) de, por ejemplo, IgG1, IgG2 , IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Las regiones constantes de la cadena pesada que corresponden a diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan respectivamente a, 5, £, y y M. Los tipos de la cadena ligera (también denominada cadena L) de los anticuerpos son las cadenas A y k.
El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención puede ser un anticuerpo IgG y puede ser, por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o un anticuerpo IgG2. Además, el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención puede ser un monómero, un dímero o un multímero en algunos casos.
En un aspecto de la presente invención, el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención puede ser una combinación de anticuerpos IgG derivados de diferentes subclases, tal como anticuerpo IgG que consiste en una combinación de anticuerpo IgG1 y anticuerpo IgG2.
En la presente memoria descriptiva, el fragmento de unión al antígeno del anticuerpo no está particularmente limitado siempre que el fragmento de unión al antígeno sea un fragmento funcional y estructural del anticuerpo y mantenga la actividad de unión frente al antígeno al que se puede unir el anticuerpo. Los ejemplos del fragmento de unión al antígeno del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a Fab, Fab', F(ab')2 , Fv y Fv monocatenario (scFv), sus variantes, proteínas de fusión que comprenden un resto de anticuerpo y otras estructuras modificadas de moléculas de inmunoglobulina que comprenden un sitio de reconocimiento de antígenos. En un aspecto, el fragmento de unión del anticuerpo de la presente invención es F(ab')2.
El fragmento de unión al antígeno del anticuerpo se puede obtener, por ejemplo, por digestión de la proteína del anticuerpo completo con una proteasa tal como papaína o pepsina, o se puede producir directamente mediante células hospedantes recombinantes (p. ej., eucariotas tales como células de levadura, células vegetales, células de insectos o células de mamíferos, o procariotas tales como E. coli). Por ejemplo, los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente de E. coli y unir químicamente para formar un fragmento F(ab')2. Alternativamente, F(ab')2 se puede formar usando la cremallera de leucina GCN4, que promueve el ensamblaje de moléculas F(ab')2. En el caso de producir scFv por una técnica de síntesis química, se puede usar un sintetizador automático. En el caso de producir scFv por una técnica de recombinación de genes, se puede transferir un plásmido adecuado que contiene un polinucleótido que codifica scFv a células hospedantes adecuadas (p. ej., eucariotas tales como células de levadura, células vegetales, células de insectos o células de mamíferos, o procariotas tales como E. coli). El polinucleótido que codifica el scFv de interés se puede preparar por una operación bien conocida tal como la ligación de polinucleótidos. El scFv resultante se puede aislar usando una técnica convencional de purificación de proteínas conocida en la técnica.
En la presente invención, la región variable del anticuerpo puede significar una región variable de una cadena ligera de anticuerpo y/o una región variable de una cadena pesada de anticuerpo, y la región constante del anticuerpo puede significar una región constante de una cadena ligera de anticuerpo y/o una región constante de una cadena pesada de anticuerpo. La región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera están compuestas cada una de cuatro regiones armazón (FR) conectadas por tres CDR también conocidas como regiones hipervariables. Las CDR en cada cadena se mantienen muy próximas por las FR y contribuyen, junto con las CDR en la otra cadena, a la formación del sitio de unión al antígeno del anticuerpo. Los ejemplos de técnicas para determinar las CDR incluyen, pero no se limitan a: (1) un enfoque basado en la variabilidad de secuencia entre especies (p. ej., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD); y (2) un enfoque basado en el estudio cristalográfico de un complejo antígeno-anticuerpo (Al-lazikani et al., 1997 J. Molec. Biol.
273: 927-948). Estos enfoques u otros enfoques se pueden usar en combinación. La región constante de la cadena pesada se compone de tres dominios, es decir, CH1, CH2 y CH3, y una región bisagra, y están situados desde el extremo amino (extremo N) al extremo carboxi (extremo C) en el orden de CH1, una región de bisagra, CH2 y CH3. La región constante de la cadena ligera está compuesta por un dominio CL.
En la presente invención, el anticuerpo monoclonal puede significar un anticuerpo que se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos. Específicamente, los anticuerpos individuales contenidos en la población son idénticos excepto por los mutantes naturales que podrían estar presentes hasta cierto punto. El anticuerpo monoclonal se dirige a un solo sitio del antígeno y es muy específico. Además, a diferencia de un anticuerpo policlonal típico que se dirige a diferentes antígenos o diferentes epítopos, cada anticuerpo monoclonal se dirige a un solo epítopo en un antígeno. El modificador "monoclonal" indica las características del anticuerpo que se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, y no debe interpretarse de manera restrictiva como que requiere la producción del anticuerpo por un método particular.
El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo de mamífero no humano (p. ej., mono, ratón, rata, conejo, bovino, caballo o cabra), o un fragmento de unión a EphA4 del mismo. El anticuerpo quimérico es, por ejemplo, un anticuerpo que comprende las regiones variables de un anticuerpo no humano (p. ej., de ratón o rata) unidas a las regiones constantes de un anticuerpo humano, y puede referirse, por ejemplo, a un anticuerpo que tiene regiones variables derivadas de anticuerpo no humano y regiones constantes derivadas de anticuerpo humano. El anticuerpo humanizado es, por ejemplo, un anticuerpo que comprende las regiones hipervariables (también denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR)) de un anticuerpo no humano introducidas en un anticuerpo humano y puede referirse, por ejemplo, a un anticuerpo que tiene CDR derivadas de un anticuerpo no humano y las otras regiones del anticuerpo derivadas de un anticuerpo humano. Sin embargo, en la presente invención, no se requiere necesariamente que la distinción entre el anticuerpo quimérico y el anticuerpo humanizado sea clara, y el anticuerpo puede estar en una forma que se pueda considerar tanto como el anticuerpo quimérico como el anticuerpo humanizado. Un aspecto preferido del anticuerpo humanizado de acuerdo con la presente invención es un anticuerpo que tiene CDR derivadas de anticuerpo de roedor y las otras regiones del anticuerpo derivadas de un anticuerpo humano, en particular preferiblemente un anticuerpo que tiene CDR derivadas de anticuerpos de ratón y las otras regiones del anticuerpo derivadas de un anticuerpo humano. La humanización se puede realizar usando un método de injerto de CDR (Kontermann y Dubel, Antibody Engineering, Springer Lab Manual (2001); y Tsurushita et al., Methods 36: 69-83 (2005)) y también se puede realizar por un método conocido en la técnica (véase, p. ej., Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988); y Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)) que implica reemplazar secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. El anticuerpo humanizado es típicamente un anticuerpo humano, algunos restos de CDR y, opcionalmente, algunos restos de FR se reemplazan con restos derivados de sitios análogos de un anticuerpo no humano.
Para reducir la antigenicidad, puede ser importante seleccionar el uso de regiones variables humanas tanto en la cadena ligera como en la cadena pesada en la preparación del anticuerpo humanizado. De acuerdo con un método de "mejor ajuste", de la biblioteca completa de secuencias de FR humanas conocidas se criban las secuencias de regiones variables de un anticuerpo de roedor. A continuación, las secuencias humanas más similares a las secuencias de roedores se aceptan como FR humanas del anticuerpo humanizado. Véase, por ejemplo, Sims et al., J. Immunol. 151: 2296-2308 (1993) y Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987). En otro método, se usan armazones particulares derivados de secuencias comunes de todos los anticuerpos humanos para subgrupos particulares de la cadena ligera o cadena pesada. Se pueden usar los mismos armazones para algunos anticuerpos humanizados diferentes. Véase, por ejemplo, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Set ilSA 89: 4285-4289 (1992) y Presta et al., J. Immunol. 151: 2623-2632 (1993).
Además, generalmente es deseable que el anticuerpo humanizado mantenga una alta afinidad de unión por el antígeno y otras propiedades biológicas preferidas. Con el fin de lograr este objetivo, de acuerdo con un método, el anticuerpo humanizado se prepara por la etapa de analizar secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y secuencias humanizadas. En general, se puede usar un modelo de inmunoglobulina tridimensional y es conocido por los expertos en la técnica. Se puede usar un programa informático que ilustra e indica posibles conformaciones tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. Estas indicaciones se pueden estudiar para analizar las posibles funciones de los restos en las funciones de las secuencias de inmunoglobulinas candidatas, es decir, para analizar los restos que influyen en la capacidad de las inmunoglobulinas candidatas para unirse al antígeno. Por este método, se pueden seleccionar los restos de FR de una secuencia receptora y una secuencia de importación y combinarse para lograr así características de anticuerpo deseables tales como afinidad de unión mejorada por uno o más antígenos diana (p. ej., EphA4 o un fragmento del mismo).
No hace falta decir que el anticuerpo de la presente descripción también incluye un anticuerpo derivado del anticuerpo quimérico o el anticuerpo humanizado ilustrado antes por modificación genética adecuada (p. ej., la modificación del anticuerpo o la sustitución, adición y/o eliminación parcial de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo) de modo que el anticuerpo mantenga sus funciones (o se imparta una función al anticuerpo o se mejore una función del anticuerpo). Más específicamente, un anticuerpo que carece de lisina (Lys) situada en el extremo carboxi (extremo C) de la cadena pesada por un método artificial tal como la modificación genética con el fin de reducir la heterogeneidad de los anticuerpos producidos por células productoras de anticuerpos también se incluye en el alcance de la presente invención. Además, un anticuerpo que tiene secuencias de aminoácidos modificadas en la región constante para modificar una función efectora del anticuerpo, tal como un anticuerpo en el que la valina (Val) en la posición 234 del anticuerpo IgG2 humano con la numeración Eu se ha sustituido por alanina (Ala), y la glicina (Gly) en la posición 237 se ha sustituido por alanina (Ala) para así reducir la actividad de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o de la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP) también se incluye en el alcance de la presente invención. Además, un anticuerpo biespecífico (Kontermann (2012), mAbs 4, 182-97) que tiene, junto con una región de unión al anticuerpo que tiene secuencias de CDR del anticuerpo de la presente invención, una región de unión al antígeno que se une a otro antígeno también está incluido en el alcance de la presente invención.
El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente descripción se puede modificar, si se desea. La modificación del anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente descripción puede ser una modificación que cambie (a) la estructura tridimensional de una secuencia de aminoácidos en una región de modificación, tal como la conformación de hoja o hélice; (b) la carga eléctrica o el estado hidrófobo de la molécula en un sitio diana; o (c) los efectos de una modificación en el mantenimiento del volumen de la cadena lateral, o puede ser una modificación por la cual estos cambios no se observan claramente.
La modificación del anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente descripción se puede lograr, por ejemplo, por la sustitución, eliminación y/o adición de un resto o restos de aminoácidos constituyentes.
En la presente memoria descriptiva, el aminoácido se usa en su sentido más amplio e incluye no solo aminoácidos naturales, por ejemplo, serina (Ser), asparagina (Asn), valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (Ile), alanina (Ala), tirosina (Tyr), glicina (Gly), lisina (Lys), arginina (Arg), histidina (His), ácido aspártico (Asp), ácido glutámico (Glu), glutamina (Gln), treonina (Thr), cisteína (Cys), metionina (Met), fenilalanina (Phe), triptófano (Trp) y prolina (Pro), sino aminoácidos no naturales tales como variantes y derivados de aminoácidos. Los expertos en la técnica comprenden naturalmente, teniendo en cuenta esta amplia definición, que los ejemplos del aminoácido en la presente memoria descriptiva incluyen: L-aminoácidos; D-aminoácidos; aminoácidos químicamente modificados tales como variantes de aminoácidos y derivados de aminoácidos; aminoácidos, tales como norleucina, p-alanina y ornitina, que no sirven como materiales que constituyen proteínas in vivo; y compuestos sintetizados químicamente que tienen las características de los aminoácidos generalmente conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos de aminoácidos no naturales incluyen a-metilaminoácidos (a-metilalanina, etc.), D-aminoácidos (ácido D-aspártico, ácido D-glutámico, etc.), aminoácidos similares a la histidina (2-amino-histidina, p-hidroxi-histidina, homohistidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, etc.), aminoácidos que tienen metileno adicional en sus cadenas laterales ("homo" aminoácidos), y aminoácidos en los que un grupo funcional ácido carboxílico en la cadena lateral se reemplaza con un grupo ácido sulfónico (ácido cisteico, etc.).
Los restos de aminoácidos de origen natural se pueden clasificar en, por ejemplo, los siguientes grupos en función de las características generales de la cadena lateral:
(1) restos hidrófobos: Met, Ala, Val, Leu e Ile;
(2) restos hidrófilos neutros: Cys, Ser y Thr;
(3) restos ácidos: Asp y Glu;
(4) restos básicos: Asn, Gln, His, Lys y Arg;
(5) restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly y Pro; y
(6) restos aromáticos: Trp, Tyr y Phe.
La sustitución no conservadora de una secuencia de aminoácidos que constituye el anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno se puede realizar reemplazando un aminoácido que pertenece a uno de estos grupos por un aminoácido que pertenece a cualquiera de los otros grupos. Se puede realizar una sustitución más conservadora reemplazando un aminoácido que pertenece a uno de estos grupos por otro aminoácido que pertenece al mismo grupo que él. Asimismo, la eliminación o la sustitución en una secuencia de aminoácidos se puede realizar de manera adecuada.
La modificación de aminoácido o aminoácidos que constituyen el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser, por ejemplo, una modificación postraduccional tal como glicosilación con un azúcar, acetilación o fosforilación. El anticuerpo se puede glicosilar en una posición conservada en su región constante. La glicosilación del anticuerpo normalmente es del tipo unida a N o unida a O. La glicosilación unida a N significa la unión de un resto de carbohidrato a la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina, asparagina-X-treonina y asparagina-X-cisteína (en donde X es cualquier aminoácido distinto de prolina) son secuencias de reconocimiento para añadir enzimáticamente un resto de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Cualquiera de estas secuencias de tripéptidos está presente en el anticuerpo o en el fragmento de unión al antígeno del mismo, de modo que está presente un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación unida a O puede ser la unión de N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido (p. ej., serina o treonina), o puede ser la unión de las mismas a 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina en algunos casos. Los expertos en la técnica pueden seleccionar adecuadamente las condiciones de glicosilación (en el caso de realizar la glicosilación mediante el uso de un enfoque biológico, por ejemplo, células hospedantes y el tipo y pH de un medio celular) según el propósito.
El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención se puede modificar adicionalmente usando otros métodos de modificación solos o en combinación basándose en el sentido común técnico generalmente conocido por los expertos en la técnica.
El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención se puede producir por un método bien conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un hibridoma que produce el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención, se puede usar para producir un anticuerpo, o un gen que codifica el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención, se puede integrar en un vector de expresión, que después se puede transferir a células de E. coli, células COS de mono, células de ovario de hámster chino (CHO) o similares para producir un anticuerpo. El gen que codifica el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención, preferiblemente tiene ADN que codifica una secuencia señal y más preferiblemente tiene ADN que codifica una secuencia señal en cada uno de los extremos 5' del ADN que codifica la región variable de la cadena pesada y ADN que codifica la región variable de la cadena ligera. La secuencia señal son los restos de aminoácidos situados en el extremo N de una proteína, que son necesarios para que una proteína secretora o una proteína de membrana integral pase a través de la bicapa lipídica después de ser sintetizada en el ribosoma. La secuencia señal de acuerdo con la presente descripción no está particularmente limitada siempre que la secuencia tenga esta función. Ejemplos de la secuencia señal que puede estar contenida en el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención, incluyen secuencias señal derivadas de un ser humano, un ratón, una rata, un conejo, un burro, una cabra, un caballo, un pollo, un perro, un gato, una levadura y similares. Un aspecto específico de la secuencia señal incluye un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 55 como la secuencia señal para la cadena pesada, y un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 58 como la secuencia señal para la cadena ligera. La secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10, la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 55, la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 12 o la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 58 pueden tener la sustitución, adición y/o eliminación de uno o más (p. ej., 2, 3, 4 o 5) aminoácidos siempre que la secuencia resultante sea funcionalmente equivalente a la misma.
El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención se puede aislar o purificar de acuerdo con un método generalmente conocido por los expertos en la técnica. En este contexto, el término "aislado" o "purificado" significa estar aislado o purificado artificialmente de un estado natural. Cuando una molécula o composición de origen natural se altera o elimina de su entorno original, o ambos, la molécula o la composición se "aísla" o "se purifica". Los ejemplos del método de aislamiento o purificación incluyen enfoques electroforéticos, biológicos moleculares, inmunológicos y cromatográficos e incluyen específicamente, pero no se limitan a, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía de HPLC de fase inversa y electroforesis de enfoque isoeléctrico.
En la presente invención, el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo tiene las siguientes CDR:
(a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 27;
(b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 29;
(c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 30;
(d) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 31;
(e) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 32; y
(f) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 33.
En una realización de la presente invención, el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico, preferiblemente un anticuerpo humanizado.
En un aspecto preferido alternativo de la presente descripción, el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo tiene las siguientes CDR:
(a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 26;
(b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 28;
(c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 30;
(d) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 31;
(e) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 32; y
(f) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 33.
En la presente invención, el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo tiene las siguientes CDR:
(a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 27;
(b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 29;
(c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 30;
(d) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 31;
(e) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 32; y
(f) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 33.
En un aspecto preferido alternativo de la presente descripción, el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 11 o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia por la sustitución, adición y/o eliminación de uno o más aminoácidos, y una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 13 o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia por la sustitución, adición y/o eliminación de uno o más aminoácidos.
En un aspecto preferido alternativo de la presente descripción, el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74 o 76, o una derivada de la secuencia por la sustitución, adición y/o eliminación de uno o más aminoácidos derivada de dicha secuencia por sustitución, adición y/o eliminación de uno o más aminoácidos, y una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 78, 80, 82 u 84, o una secuencia de aminoácidos derivada de dicha secuencia por la sustitución, adición y/o eliminación de uno o más aminoácidos.
En este contexto, la expresión "o más" usada para la región variable de la cadena pesada o la región variable de la cadena ligera en el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente descripción, no está limitada siempre que se mantenga la afinidad por EphA4 e inhiba la unión entre EphA4 y la efrina. La expresión "o más" es de 2 a 15, más preferiblemente de 2 a 10, por ejemplo, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 o está dentro del 10%, por ejemplo, dentro del 9%, dentro del 8%, dentro del 7%, dentro del 6%, dentro del 5%, dentro del 4%, dentro del 3%, dentro del 2%, o dentro del 1% del número de aminoácido en la secuencia de aminoácidos.
En una realización preferida alternativa de la presente descripción, el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 11, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 13.
En una realización preferida alternativa de la presente descripción, el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, en donde dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 66, 68, 70, 72, 74 o 76, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID n O: 78, 80, 82 u 84.
En una realización preferida alternativa de la presente descripción, el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, en donde
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 66, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 78, o
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 68, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 78, o
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 70, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 78, o
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 72, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 78, o
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 74, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 78, o
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 76, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 78.
En una realización preferida alternativa de la presente descripción, un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, en donde
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 66, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 80, o
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 68, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 80, o
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 70, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 80, o
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 72, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 80, o
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 74, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 80, o
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 76, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 80.
En una realización preferida alternativa de la presente descripción, un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, en donde
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 66, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 82, o
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 68, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 82, o
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 70, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 82, o
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 72, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 82, o
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 74, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 82, o
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 76, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 82.
En una realización preferida alternativa de la presente descripción, un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, en donde
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 66, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 84, o
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 68, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 84, o
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 70, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 84, o
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 72, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 84, o
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 74, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 84, o
dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 76, y dicha región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 84.
En una realización específica de la presente invención, un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo tiene una región constante de IgG2 humana. Preferiblemente, dicha región constante de IgG2 humana tiene al menos una mutación de aminoácido seleccionada de C131S, C219S, V234A y G237A (numeración EU). En una realización, dicha región constante de IgG2 humana tiene una combinación de mutaciones de aminoácidos C131S y C219S. En una realización, dicha región constante de IgG2 humana tiene una combinación de mutaciones de aminoácidos V234A y G237A. En otra realización, dicha región constante de IgG2 humana tiene todas las mutaciones de aminoácidos de C131S, C219S, V234A y G237A. En una realización alternativa adicional, dicha región constante de IgG2 humana no tiene un resto de lisina en el extremo C.
En una realización preferida de la presente invención, la región constante de IgG2 humana comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 62.
En una realización específica de la presente invención, un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo tiene una región constante de IgG humana que consiste en una combinación de IgG1 humana e IgG2 humana. Preferiblemente, en dicha región constante de IgG humana, CH1 y una región bisagra son de IgG1 humana, y CH2 y CH3 son de IgG2 humana. En una realización, dicha región constante de IgG humana tiene la mutación de aminoácidos V234A o G237A (numeración Eu). En otro aspecto, dicha región constante de IgG humana tiene las mutaciones de aminoácidos V234A y G237A. En un aspecto alternativo adicional, dicha región constante de IgG humana no tiene un resto de lisina en el extremo C.
En una realización preferida de la presente invención, la región constante de IgG humana que consiste en una combinación de IgG1 humana e IgG2 humana comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 60.
En un aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención.
La composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención puede comprender además un vehículo, excipiente y/o estabilizante farmacéuticamente aceptable en forma de una preparación acuosa o seca. Los ejemplos del vehículo, excipiente y/o estabilizante aceptables incluyen: solución salina fisiológica; soluciones tampón de fosfato, citrato u otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas (p. ej., albúmina sérica, gelatina e inmunoglobulinas); polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa y dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol y sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; y tensioactivos no iónicos tales como TWEEN (marca registrada), PLURONICS (marca registrada) y PEG.
La composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención puede estar incluida, por ejemplo, en una microcápsula, un sistema de suministro de fármaco coloidal (p. ej., un liposoma, una microesfera de albúmina, una microemulsión, una nanopartícula o nanocápsula) o una microemulsión. Cuando se desea la administración de liberación sostenida del anticuerpo para una preparación que tiene propiedades de liberación adecuadas para cualquier enfermedad que necesite la administración del anticuerpo, se puede pretender que el anticuerpo esté microencapsulado. Ejemplos de la matriz de liberación sostenida incluyen poliéster, hidrogeles (p. ej., poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) y poli(alcohol vinílico)), poli(ácidos lácticos), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de Y-etilo, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradable (microesferas para inyección constituidas por un copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) tales como LUPRON DEPOT (marca registrada) y poli(ácido D-(-)-3-hidroxibutírico).
En un aspecto, el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención puede inhibir la unión entre EphA4 y su ligando. Por lo tanto, la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención puede ser útil en el tratamiento de la ELA. Específicamente, un aspecto alternativo de la presente descripción abarca un método para tratar la ELA, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención a un sujeto. Un aspecto alternativo de la presente descripción abarca el uso del anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención para producir un fármaco terapéutico para la ELA. Un aspecto alternativo de la presente invención abarca el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo para su uso en un método para tratar la ELA.
El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención se puede usar solo o en combinación con un fármaco o composición adicional en el método de tratamiento. Por ejemplo, el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención se puede administrar al mismo tiempo o en momentos diferentes con un fármaco adicional. Dicha terapia de combinación incluye la administración combinada (dos o más fármacos están contenidos en la misma preparación o preparaciones separadas) y la administración separada (p. ej., concurrente o continua). En el caso de administrar por separado dos o más fármacos, el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención se puede administrar antes o después del método de tratamiento concomitante.
El sujeto para administrar la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención no está limitado, y la composición farmacéutica de la presente invención se puede usar para, por ejemplo, un ser humano o un mamífero no humano (un mono, un ratón, una rata, un conejo, ganado, un caballo, una cabra, etc.).
El método para administrar la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de la presente invención al sujeto (vía de administración, dosis, número de dosis por día, momento de administración, etc.) no es limitado y puede ser determinado adecuadamente por los expertos en la técnica (p. ej., un médico) de acuerdo con el estado de salud del sujeto, la gravedad de la enfermedad, el tipo de fármaco que se va a usar en combinación con el mismo, etc.
Los expertos en la técnica deben comprender que la presente invención se puede llevar a cabo por uno cualquiera de o una combinación adecuada de dos o más de todos los aspectos descritos en la presente memoria descriptiva, a menos que surja una contradicción técnica. Además, los expertos en la técnica deben entender que la presente invención se puede llevar a cabo preferiblemente por una combinación adecuada de todos los aspectos preferibles o ventajosos descritos en la presente memoria descriptiva, a menos que surja una contradicción técnica.
La bibliografía citada en la presente memoria descriptiva se proporciona simplemente con el propósito de describir técnicas relacionadas antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. No debe entenderse que los autores de la presente invención admitan no tener ningún derecho antes de dicha descripción debido a las invenciones anteriores o cualquier otra razón. Todas las declaraciones de esta bibliografía se basan en información que ha estado disponible por los autores de la presente invención, y no se admite que el contenido de estas declaraciones sea exacto.
Los términos de la presente memoria descriptiva se usan para ilustrar realizaciones particulares y no pretenden limitar la invención.
El término "comprender" usado en la presente memoria descriptiva significa que los elementos descritos (miembros, etapas, factores, números, etc.) están presentes y la presencia de los otros elementos (miembros, etapas, factores, números, etc.) no está excluida de estos, a menos que el contexto evidentemente requiera una interpretación diferente. La expresión "consiste en" abarca aspectos descritos por las expresiones "consiste en" y/o "consisten esencialmente en".
La expresión "actividad neutralizante" usado en la presente memoria descriptiva significa la actividad de inhibir la unión entre EphA4 y su ligando y/o la actividad de inhibir la transducción de señales o la respuesta de expresión molecular o cambio funcional de las células inducido por la unión entre EphA4 y su ligando en el cuerpo vivo de un ser humano.
Todos los términos (incluyendo términos técnicos y términos científicos) usados en el presente documento tienen los mismos significados que los entendidos en un sentido amplio por los expertos en la técnica a la que pertenece la presente invención, a menos que se defina lo contrario. Los términos usados en el presente documento deben interpretarse como que tienen significados de acuerdo con los significados en la presente memoria descriptiva y los campos técnicos relacionados y no deben interpretarse en un sentido idealizado o excesivamente formal, a menos que se defina lo contrario.
Términos tales como "primero" o "segundo" se usan para expresar varios factores. Sin embargo, se entiende que estos factores no están limitados por estos términos en sí mismos. Estos términos se usan simplemente para diferenciar un factor de los otros factores. Por ejemplo, el primer factor se puede describir como el segundo factor, y viceversa, sin apartarse del alcance de la presente invención.
En la presente memoria descriptiva, debe entenderse que los valores numéricos usados para indicar el contenido de componentes, intervalos numéricos, etc., están modificados por el término "aproximadamente" a menos que se especifique lo contrario. Por ejemplo, "4°C" se interpreta con el significado de "aproximadamente 4°C" a menos que se especifique lo contrario. Los expertos en la técnica pueden comprender naturalmente su alcance de forma racional de acuerdo con el sentido común técnico y el contexto de la presente memoria descriptiva.
Debe entenderse que cada aspecto indicado en una forma singular usado en la presente memoria descriptiva y reivindicaciones puede estar en una forma plural, y viceversa, a menos que el contexto requiera evidentemente una interpretación diferente y a menos que surja una contradicción técnica.
En lo sucesivo, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los ejemplos. Sin embargo, la presente invención se puede realizar mediante varios aspectos y no se pretende que esté limitada por los ejemplos descritos en el presente documento.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación de anticuerpo monoclonal anti-EphA4 de ratón
Preparación de anticuerpo monoclonal de ratón anti-EphA4 de ratón
Con el fin de preparar un anticuerpo monoclonal que se une a EphA4 de ratón (número de acceso de GenBank NP_031962.2, SEQ ID NO: 1), se preparó una proteína de una región extracelular de EphA4 de ratón (posiciones 20 a 547) (SEQ ID NO: 2) fusionada con fosfatasa alcalina secretada (SEAP) y marcador de histidina (en lo sucesivo, denominada "proteína de región extracelular de EphA4 de ratón-SEAP-His", SEQ ID NO: 43) mediante las siguientes etapas.
Primero, una secuencia de ADN que codifica la secuencia señal (SEQ ID NO: 42) y la región extracelular (SEQ ID NO: 2) de EphA4 de ratón se amplificó por RT-PCR usando ARN total derivado de cerebro de ratón y se clonó en el sitio SalI/NotI de un vector pENTR1A (Invitrogen/Life Technologies) que tiene una secuencia de ADN que codifica SEAP y el marcador de histidina. A continuación, la secuencia de ADN que codifica la secuencia señal y la región extracelular de EphA4 de ratón, SEAP y marcador de histidina se transfirió a un vector pcDNA3.1_rfcB por reacción LR usando el Gateway System (Invitrogen/Life Technologies) para construir un vector de expresión de pcDNA3.1- región extracelular de EphA4 de ratón-SEAP-His. Se transfectaron células HEK293EBNA (Invitrogen/Life Technologies) con el vector de expresión de pcDNA3.1-región extracelular de EphA4 de ratón-SEAP-His construido usando TransIT-LT1 (TAKARA). Después de incubación (5% de CO2 , 37°C) durante 6 días, se recuperó el líquido sobrenadante del cultivo. A partir del líquido sobrenadante del cultivo recuperado, la proteína de región extracelular de EphA4 de ratón-SEAP-His (SEQ ID NO: 43) se purificó usando la columna Protino (MACHEREY-NAGEL).
Se mezclaron 20 pg de la proteína de región extracelular de EphA4 de ratón-SEAP-His con la misma cantidad de adyuvante TiterMax Gold (TiterMax USA) o adyuvante GERBU (GERBU Biotechnik), y la mezcla se inyectó por vía subcutánea en la planta de la pata de un ratón Balb/c. Después, los días 3, 7 y 10, se administró la proteína de región extracelular de EphA4 de ratón-SEAP-His de la misma forma que antes. En esta operación, el adyuvante TiterMax Gold (TiterMax EE.UU.) se usó solo para el día 10, y el adyuvante GERBU (GERBU Biotechnik) se usó para los días 3, 7 y 10. El día 13, el ratón se sacrificó y se recuperó el ganglio linfático periférico para preparar las células de ganglio linfático. Las células de ganglio linfático preparadas y células de mieloma P3U1 (amablemente proporcionadas por la Universidad de Kyoto) se fusionaron en una proporción de 5:1 en presencia de GenomONE-CF (Ishihara Sangyo Kaisha). Las células fusionadas se cultivaron en una placa de plástico de 96 pocillos. Después de la incubación (5% de CO2 , 37°C) durante 7 días, se recuperó el líquido sobrenadante del cultivo.
El líquido sobrenadante del cultivo obtenido se usó para recoger un pocillo que tenía reactividad con EphA4 de ratón, rata y humano y actividad inhibidora frente a la unión entre EphA4 de ratón y la efrina A1 de ratón.
La reactividad con EphA4 de ratón, rata y humano se evaluó por ELISA usando una proteína de la región extracelular de EphA4 de ratón, la región extracelular (posiciones 20 a 547) de EphA4 de rata (número de acceso de GenBank NP_001155883.1), o la región extracelular (posiciones 20 a 547) (SEQ ID NO: 4) de EphA4 humano (número de acceso de GenBank NP_004429.1, SEQ ID NO: 3) fusionada con una región Fc de IgG1 humana y marcador de histidina (en lo sucesivo, denominada "proteína de región extracelular de EphA4 de ratón-Fc-His", "proteína de región extracelular de EphA4 de rata-Fc-His" o "proteína de región extracelular de EphA4 humana-Fc-His", respectivamente).
La proteína de región extracelular de EphA4 de ratón, rata o humano-Fc-His se preparó por las siguientes etapas. Primero, se construyó un vector de expresión de pcDNA3.1-región extracelular de EphA4 de ratón, rata o humano-Fc-His. Primero, se amplificó una secuencia de ADN que codifica la secuencia señal y la región extracelular de EphA4 de ratón, rata o humano por RT-PCR usando ARN total derivado de cerebro de ratón, rata o humano y se clonó en el sitio SalI/NotI de un vector pENTR1A (Invitrogen/Life Technologies) que tiene una secuencia de ADN que codifica Fc y el marcador de histidina. A continuación, la secuencia de ADN que codifica la secuencia señal y la región extracelular de EphA4 de ratón, rata o humano, Fc y marcador de histidina se transfirió a un vector pcDNA3.1_rfcB a través de la reacción LR usando el Gateway System (Invitrogen/Life Technologies) para construir un vector de expresión de pcDNA3.1-región extracelular de EphA4 de ratón, rata o humano-Fc-His. Se transfectaron células HEK293EBNA (Invitrogen/Life Technologies) con cada uno de los vectores de expresión construidos usando TransIT-LT1 (TAKARA). Después de incubación (5% de CO2 , 37°C) durante 6 días, se recuperó el líquido sobrenadante de cada cultivo.
Se llevó a cabo un ELISA usando la proteína de región extracelular de EphA4 de ratón, rata o humano-Fc-His de acuerdo con las siguientes etapas. Cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Nunc) se recubrió con un anticuerpo anti-IgG humana (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Después de incubación durante la noche a 4°C, cada pocillo se bloqueó con 1 x BlockAce (Sumitomo Dainippon Pharma) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces con Tween 20/PBS al 0,02% (Nacalai Tesque), se añadió a cada pocillo el líquido sobrenadante de cultivo que contenía la proteína de región extracelular de EphA4 de ratón, rata o humano-Fc-His (concentración final: 1 nM) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces, se añadió a cada pocillo el líquido sobrenadante de cultivo de las células fusionadas. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 hora y el posterior lavado tres veces, se añadió al mismo un anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch Laboratories) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces, se añadió una solución de TMBZ (3,3',5,5'-tetrametilbencidina, Sigma-Aldrich) a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 5 a 20 minutos. Se añadió a cada pocillo una cantidad igual de una solución de parada de la reacción (H2SO42 N, Wako Pure Chemical Industries). La absorbancia a 450 nm se leyó usando un lector de microplacas (PerkinElmer).
La actividad inhibidora frente a la unión entre EphA4 de ratón y la efrina A1 de ratón se evaluó de acuerdo con las siguientes etapas. Cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Nunc) se recubrió con un anticuerpo anti-fosfatasa alcalina (Seradyn). Después de la incubación durante la noche a 4°C, cada pocillo se bloqueó con 1 x BlockAce (Sumitomo Dainippon Pharma) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar con Tween 20/PBS al 0,02% (Nacalai Tesque) tres veces, se añadió la proteína región extracelular de EphA4 de ratón-SEAP-His (concentración final: 10 nM) a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces, se añadieron a cada pocillo la quimera Efrina A1-Fc (R&D Systems, concentración final: 20 nM) y el líquido sobrenadante de cultivo de las células fusionadas. Después de incubación a temperatura ambiente durante 1 hora y el posterior lavado tres veces, se le añadió un anticuerpo anti-IgG humana marcado con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch Laboratories) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces, se añadió una solución de TMBZ (3,3',5,5'-tetrametilbencidina, Sigma-Aldrich) a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 5 a 20 minutos. Se añadió a cada pocillo una cantidad igual de una solución de parada de la reacción (H2SO42 N, Wako Pure Chemical Industries). La absorbancia a 450 nm se leyó usando un lector de microplacas (PerkinElmer).
Del pocillo recogido a través de estas etapas, se clonó un hibridoma por el método de dilución limitante. Finalmente, se obtuvo un clon de hibridoma que expresa un anticuerpo de ratón anti-EphA4 que tiene actividad de reacción frente a EphA4 de ratón, rata y humano y que tiene actividad inhibidora frente a la unión entre EphA4 de ratón y la efrina A1 de ratón.
El clon de hibridoma obtenido se cultivó y el anticuerpo anti-EphA4 (anticuerpo A) se purificó del líquido sobrenadante de cultivo usando proteína A (GE Healthcare). El isotipo del anticuerpo A se determinó usando un kit de isotipado de anticuerpos monoclonales (Serotec) y era IgG1 para la cadena pesada y k para la cadena ligera.
Análisis de secuencia del anticuerpo A
Las secuencias de ADN que codifican las secuencias señal de la cadena pesada y de la cadena ligera y las regiones variables del anticuerpo A se amplificaron por 5'-RACE (amplificación rápida de extremos 5' de ADNc). Se preparó ARN total a partir del hibridoma usando TRIZOL (Invitrogen/Life Technologies) y se trató con DNasa (Qiagen N.V., conjunto de DNasa sin RNasa). Se preparó ADNc bicatenario a partir del ARN total usando un kit de síntesis de ADNc (TAKARA). Se añadió el adaptador 5' obtenido por la reasociación de oligo-ADN ad29S (ACATCACTCCGT) (SEQ ID NO: 5) y oligo-ADN ad29AS (ACGGAGTGATGTCCGTCGACGTATCTCTGCGTTGATACTTCAGCGTAGCT) (SEQ ID NO: 6) al ADNc. El ADNc obtenido se amplificó usando el cebador directo 5' (cebador 5'-PCR4, AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG) (SEQ ID NO: 7) y se usó el cebador inverso 3' (GCCAGTGGATAGACTGATGG (SEQ ID NO: 8) para la amplificación del gen de la cadena pesada de IgG de ratón, y se usó GATGGATACAGTTGGTGCAGC (SEQ ID NO: 9) para la amplificación del gen de la cadena ligera de IgK de ratón). El ADNc amplificado se insertó en un vector pCR2.1 (Invitrogen/Life Technologies). La secuencia del gen del anticuerpo A se analizó usando ABI3130XL. En cuanto a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia del gen del anticuerpo A identificada por este análisis, la secuencia señal de la cadena pesada se muestra en la SEQ ID NO: 10; la región variable de la cadena pesada se muestra en la SEQ ID NO: 11; la secuencia señal de la cadena ligera se muestra en la SEQ ID NO: 12; y la región variable de la cadena ligera se muestra en la SEQ ID NO: 13. En cuanto a la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia del gen del anticuerpo A, la secuencia señal de la cadena pesada se muestra en la SEQ ID NO: 14, la región variable de la cadena pesada se muestra en la SEQ ID NO: 15; la secuencia señal de la cadena ligera se muestra en la SEQ ID NO: 16; y la región variable de la cadena ligera se muestra en la SEQ ID NO: 17.
Las secuencias de longitud completa de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo A se obtuvieron por las siguientes etapas. Se preparó ARN total a partir del hibridoma usando TRIZOL (Invitrogen/Life Technologies) y se trató con DNasa (Qiagen N.V., conjunto de DNasa sin RNasa). El ADNc se preparó a partir del ARN total usando un kit de síntesis de ADNc (TAKARA). El ADNc obtenido se usó como molde en la PCR para amplificar las secuencias de genes que codifican la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo A usando el cebador directo 5' (GCGAAGCTTGCCGCCACCATGGCTTGGGTGTGGACCTTGC (SEQ ID NO: 18) que se usó para la amplificación del gen de la cadena pesada, y GCGAAGCTTGCCGCCACCATGAGTGTGCCCACTCAGGTCC (SEQ ID NO: 19) se usó para la amplificación del gen de la cadena ligera) y el cebador inverso 3' (GCGGAATTCATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC (SEQ ID NO: 20) se usó para la amplificación del gen de la cadena pesada y CGCGAATTCACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGAC (SEQ ID NO: 21) se usó para la amplificación del gen de la cadena ligera). Los productos de amplificación se clonaron en vectores pEE6.4 y pEE12.4 (Lonza), respectivamente. Estas secuencias de genes se analizaron usando ABI3130XL. En cuanto a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia del gen del anticuerpo A identificada por este análisis, la región constante de la cadena pesada se muestra en la SEQ ID NO: 22, y la región constante de la cadena ligera se muestra en la SEQ ID NO: 23. En cuanto a la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia del gen del anticuerpo A, la región constante de la cadena pesada se muestra en la SEQ ID NO: 24, y la región constante de la cadena ligera se muestra en SEQ ID NO: 25.
Las CDR del anticuerpo A se determinaron numerando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo A usando el software Abysis (UCL) según el sistema de numeración de Kabat e identificando las CDR según la definición de Kabat o el método de definición de AbM basado en los números. Las secuencias de aminoácidos de CDR y las secuencias de nucleótidos del anticuerpo A se muestran en las Tablas 1 y 2, respectivamente.
[Tabla 1]
Tabla 1. Secuencias de aminoácidos de las CDR del anticuerpo A
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[Tabla 2]
Tabla 2. Secuencias de aminoácidos de las CDR del anticuerpo A
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Ejemplo 2: Afinidad de unión del anticuerpo monoclonal anti-EphA4 por EphA4 de ratón y humano
La afinidad de unión del anticuerpo A obtenido en el ejemplo 1 por EphA4 de ratón y humano se determinó por resonancia de plasmón de superficie (SPR) usando Biacore A100 (Ge Healthcare). Primero, se inmovilizó un anticuerpo de rata anti-IgG1 de ratón producido con un procedimiento convencional inmunizando una rata con un anticuerpo IgG1 de ratón en el chip detector CM5. La inmovilización del anticuerpo de rata anti-IgG1 de ratón en el chip detector CM5 se llevó a cabo por el método de acoplamiento de amina usando N-hidroxisuccinimida (NHS) e hidrocloruro de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC). Se usó etanolamina para bloquear (el chip detector y los reactivos para la inmovilización fueron fabricados todos por GE Healthcare). El anticuerpo se diluyó con una solución tampón para inmovilización (acetato de sodio 10 mM, pH 4,5) en 1 a 2 pg/ml y se inmovilizó en el chip detector de acuerdo con el protocolo adjunto a Biacore A100. El anticuerpo A se diluyó con una solución tampón de análisis de HBS-EP (GE Healthcare, BR-1001 -88), se inyectó en una celda de flujo durante 120 segundos y se capturó (cantidad de anticuerpo capturado: aproximadamente de 70 a 100 RU). Posteriormente, se añadió al chip detector la región extracelular de EphA4 de ratón o humano-SEAP-His diluida en serie en el intervalo de 50, 25, 12,5, 6,3, 3,1, 1,6, 0,8 y 0 nM usando HBS-EP durante 120 segundos. Las curvas de la reacción de unión se observaron secuencialmente en el momento de la adición (fase de asociación, durante 120 s) y después de completarse la adición (fase de disociación, durante 900 s). Después de completar cada observación, el chip detector se regeneró por la adición de MgCl23 M (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (durante 30 segundos). Las curvas de reacción de unión obtenidas se sometieron a análisis de ajuste con modelos de unión 1:1 usando la evaluación del software BIA adjunta al sistema para calcular la afinidad de unión (KD = kd/ka) para EphA4 de ratón y humano.
La afinidad de unión (KD) del anticuerpo A por EphA4 de ratón y humano era de 7,29 x 10-10 M y 6,61 x 10-10 M, respectivamente (Fig. 1). Otros parámetros de unión para EphA4 de ratón y humano eran casi equivalentes. Por consiguiente, se considera que el anticuerpo A tiene una afinidad de unión equivalente por EphA4 de ratón y humano.
Ejemplo 3: Actividad inhibidora de la unión de EphA4 de ratón-ligando de ratón del anticuerpo monoclonal anti-EphA4
Se evaluó la actividad inhibidora del anticuerpo A obtenido en el ejemplo 1 contra la unión entre EphA4 de ratón y su ligando de ratón de acuerdo con las siguientes etapas. Cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Nunc) se recubrió con un anticuerpo anti-fosfatasa alcalina (Thermo Fisher Scientific). Después de la incubación durante la noche a 4°C, cada pocillo se bloqueó con BlockAce al 1 % (DS Pharma Biomedical) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces con Tween 20/PBS al 0,05% (Thermo Fisher Scientific), se añadió la proteína región extracelular de EphA4 de ratón-SEAP-His obtenida por el método del ejemplo 1 (concentración final: 10 nM) a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces, se añadieron a cada pocillo ligandos y anticuerpo A en dilución seriada (0, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,3, 10, 30, 100, 300 y 1000 nM) o un péptido KYL inhibidor de EphA4 conocido (KYLPYWPVLSSL, 0, 0,003, 0,01,0,03, 0,1,0,3, 1,3, 10, 30 y 100 pM, su síntesis se subcontrató a Hokkaido System Science) o compuesto 1 (0, 0,03, 0,1,0,3, 1,3, 10, 30, 100, 300 y 1000 pM, fórmula 1, Matrix Scientific). Los ligandos usados eran la quimera de efrina A1 -Fc de ratón (R&D Systems, concentración final: 20 nM) y la quimera de efrina B2-Fc de ratón (R&D Systems, concentración final: 0,6 nM). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 hora y el posterior lavado tres veces, se le añadió un anticuerpo anti-IgG humana marcado con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch Laboratories) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces, se añadió una solución de TMBZ (3,3',5,5'-tetrametilbencidina, Sigma-Aldrich) a cada pocilio y se incubó a temperatura ambiente durante 2 minutos. Se añadió a cada pocilio una cantidad igual de una solución de parada de la reacción (H2SO4 1 N, Wako Pure Chemical Industries). La absorbancia a 450 nm se leyó usando un lector de microplaca (Molecular Devices).
Fórmula 1
[Fórmula 1]
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El anticuerpo A suprimía la unión entre EphA4 de ratón y su ligando de ratón de una manera dependiente de la concentración con valores de CI50 de aproximadamente 1,2 y 1,2 nM para la unión a la efrina A1 y efrina B2 de ratón, respectivamente. Los valores de CI50 del péptido KYL inhibidor de EphA4 existente eran de aproximadamente 1,3 y 1,3 pM para la unión a la efrina A1 y efrina B2 de ratón, respectivamente (Fig. 2). El compuesto 1 tenía actividad más débil y no se encontró dependencia con la concentración. Por consiguiente, se encontró que el anticuerpo A inhibía la unión entre EphA4 de ratón y el ligando de ratón con la actividad 1.000 o más veces más fuerte que la del péptido KYL inhibidor de EphA4 existente.
Ejemplo 4: Actividad inhibidora de la unión de EphA4 humano-ligando humano del anticuerpo monoclonal anti-EphA4
Se evaluó la actividad inhibidora del anticuerpo A obtenido en el ejemplo 1 frente a la unión entre EphA4 humano y su ligando humano de acuerdo con las siguientes etapas. Cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Nunc) se recubrió con un anticuerpo anti-fosfatasa alcalina (Thermo Fisher Scientific). Después de incubación durante la noche a 4°C, cada pocillo se bloqueó con BlockAce al 1 % (DS Pharma Biomedical) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces con Tween 20/PBS al 0,05% (Thermo Fisher Scientific), se añadió la proteína de región extracelular EphA4 humana-SEAP-His obtenida por el método del ejemplo 1 (concentración final: 10 nM) a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces, se añadieron los ligandos y el anticuerpo A (0, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 y 3000 nM) o un péptido KYL inhibidor de EphA4 (KYLPYWPVLSSL, 0, 0,003, 0,01,0,03, 0,1,0,3, 1,3, 10, 30, 100, 300, 1000 y 3000 pM, su síntesis se subcontrató a Toray Research Center) diluidos en serie a cada pocillo. Los ligandos usados eran la quimera de efrina A5-Fc humana biotinilada (R&D Systems, concentración final: 0,7 nM) y quimera de efrina B3-Fc humana biotinilada (R&D Systems, concentración final: 2,3 nM). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 hora y posterior lavado tres veces, se le añadió estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano picante (GE Healthcare) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces, se añadió una solución de TMBZ (3,3',5,5'-tetrametilbencidina, Sigma-Aldrich) a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 2 minutos. Se añadió a cada pocillo una cantidad igual de una solución de parada de la reacción (H2SO4 1 N, Wako Pure Chemical Industries). La absorbancia a 450 nm se leyó usando un lector de microplacas (Molecular Devices o PerkinElmer).
El anticuerpo A suprimía la unión entre EphA4 humana y su ligando humano de una manera dependiente de la concentración con valores de CI50 de aproximadamente 2,7 y 1,9 nM para la unión a la efrina A5 y efrina B3 humanas, respectivamente. Los valores de CI50 del péptido KYL inhibidor de EphA4 eran de aproximadamente 6,1 y 1,6 pM para la unión a la efrina A5 y efrina B3 humanas, respectivamente (Fig. 3). Por consiguiente, también se encontró que el anticuerpo A inhibe fuertemente la unión entre EphA4 humano y su ligando humano.
Ejemplo 5: Afinidad de unión del fragmento de unión a EphA4 por EphA4 de ratón y humano
Primero, se prepararon un fragmento Fab y un fragmento F(ab')2 del anticuerpo A (en lo sucesivo, denominado anticuerpo A-Fab y anticuerpo A-F(ab')2 , respectivamente) como fragmentos de unión a EphA4.
La preparación del anticuerpo A-Fab se llevó a cabo de acuerdo con las siguientes etapas. En un tubo de 1,5 ml (Eppendorf), el anticuerpo A (4,36 mg/ml, 1 ml), L-cisteína 10 mM (Wako Pure Chemical Industries), EDTA 1 mM (Gibco) y papaína 2,18 pg/ml (Sigma- Aldrich) se mezclaron y se incubaron a 37°C durante 12 horas. Se añadió yodoacetamida (Wako Pure Chemical Industries) a una concentración final de 50 mM al tubo después de la incubación. Después de terminar la reacción, la solución de anticuerpo se dializó contra PBS (Sigma-Aldrich). A la solución de anticuerpo, se añadió una cantidad igual de Tris-HCl 0,1 M (Sigma-Aldrich)/NaCl 5 M (pH 8,0, Wako Pure Chemical Industries), seguido de purificación usando resina rProtein A FF. Se llenó un tubo de 2 ml con 800 pl de rProtein A FF, que después se equilibró por la adición de 3,5 V.C. cada uno de agua ultrapura y un tampón de unión (Tris-HCl 0,1 M (Sigma-Aldrich)/NaCl 3 M (pH 8,0, Wako Pure Chemical Industries)) en este orden. La solución de anticuerpo complementada con una cantidad igual de Tris-HCl 0,1 M (Sigma-Aldrich)/NaCl 5 M (Wako Pure Chemical Industries) (pH 8,0) se inyectó en la columna. Se recuperó una solución eluida de la columna (fracción de flujo continuo) y se añadió de nuevo a la columna. Esta operación se repitió tres veces. Después, se recuperó la fracción de flujo continuo de la serie final. El lavado se repitió dos veces mediante la adición de 2,5 ml de un tampón de unión. Las fracciones de flujo continuo y de lavado se dializaron contra PBS para obtener el anticuerpo A-Fab.
La preparación del anticuerpo A-F(ab ')2 se llevó a cabo de acuerdo con las siguientes etapas. Se dializó el anticuerpo A contra un tampón de acetato 0,2 M (pH 4,0, Wako Pure Chemical Industries) durante la noche a 4°C. La solución dializada se recuperó y se filtró a través de un filtro de 0,22 pm (Merck Millipore), y después se cuantificó y la concentración de anticuerpo se ajustó a 4,0 mg/ml. La pepsina (Sigma-Aldrich) se llevó de nuevo a temperatura ambiente y se ajustó a 2,0 mg/ml usando un tampón de acetato 0,2 M (pH 4,0, Wako Pure Chemical Industries). En un tubo de 1,5 ml (Eppendorf), se mezclaron el anticuerpo A (4,0 mg/ml, 800 pl), la solución de pepsina (2,0 mg/ml, 16 pl) y un tampón de acetato 0,2 M (pH 4,0, Wako Pure Chemical Industries) con 64 pl/tubo y se incubaron a 37°C durante 15 horas. La reacción se terminó por la adición de 112 pl/tubo de Tris-base 2 M (Sigma-Aldrich) al tubo después de la incubación. Después, la especie molecular se confirmó por SDS-PAGE. Después de terminar la reacción, la solución de anticuerpo se dializó contra T ris-HCl 100 mM (pH 8,0). Posteriormente, el anticuerpo A-F(ab ')2 se purificó usando rProtein A FF (GE Healthcare, 17-1279-02). Se llenó un tubo de 5 ml con 1 ml de resina de rProteína A, que después se equilibró por la adición de 3,5 V.C. cada uno de agua ultrapura y un tampón de unión en este orden. Se inyectó en la columna la solución de anticuerpo dializada equilibrada por la adición de una cantidad igual de Tris-HCl 0,1 M (Sigma-Aldrich)/NaCl 5 M (pH 8,0, Wako Pure Chemical Industries). Se recuperó una fracción de flujo continuo y se añadió de nuevo a la columna. Esta operación se repitió tres veces. Después, se recuperó la fracción de flujo continuo de la serie final. Después, el lavado se repitió dos veces por la adición de 5 ml de un tampón de unión. Con el fin de eliminar la IgG sin reaccionar, etc., la elución se llevó a cabo con citrato 0,1 M (pH 3,0, Wako Pure Chemical Industries). Después, la especie molecular se confirmó por SDS-PAGE. Las fracciones de flujo continuo y lavado se dializaron contra PBS para obtener el anticuerpo A-F(ab')2.
A continuación, se determinó la afinidad de unión del anticuerpo A-Fab y el anticuerpo A-F(ab ')2 por EphA4 de ratón y humano por resonancia de plasmón de superficie (SPR) usando Biacore T200 (GE Healthcare). El anticuerpo A obtenido en el ejemplo 1 se usó como control para la comparación de cada fragmento. Primero, se inmovilizó un anticuerpo anti-marcador de His en el chip detector CM5. La inmovilización del anticuerpo anti-marcador de His en el chip detector CM5 se realizó por el método de acoplamiento de amina usando N-hidroxisuccinimida (NHS) e hidrocloruro de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC). Se usó etanolamina para bloquear (el chip detector y los reactivos para la inmovilización eran todos fabricados por GE Healthcare). El anticuerpo se diluyó con una solución de tampón para inmovilización (acetato de sodio 10 mM, pH 4,5) en 3 pg/ml y se inmovilizó en el chip detector de acuerdo con el protocolo adjunto a Biacore T200.
La proteína de región extracelular EphA4 de ratón o humana-SEAP-His se diluyó con una solución de tampón de análisis HBS-EP (GE Healthcare, BR-1001-88), se inyectó en una celda de flujo durante 120 segundos y se capturó (cantidad de proteína capturada: aproximadamente de 10 a 20 RU). Posteriormente, se añadieron el anticuerpo A (50, 16,7, 5,6, 1,9, 0,6 y 0 nM), el anticuerpo A-Fab (500, 166,7, 55,6, 18,5, 6,2 y 0 nM) o el anticuerpo A-F(ab ')2 (50, 16,7, 5,6, 1,9, 0,6 y 0 nM) diluidos en serie usando HBS-EP al chip detector durante 120 segundos. Las curvas de la reacción de unión se observaron secuencialmente en el momento de la adición (fase de asociación, durante 120 s) y después de completarse la adición (fase de disociación, durante 900 s). Después de completar cada observación, el chip detector se regeneró por la adición de MgCl2 3 M (Wako Pure Chemical Industries) (durante 30 s). Las curvas de reacción de unión obtenidas se sometieron a análisis de ajuste con modelos de unión 1:1 usando el software de evaluación BIA adjunto al sistema para calcular la afinidad de unión (KD = kd/ka) para EphA4 de ratón y humano.
La afinidad de unión (KD) del anticuerpo A-Fab por EphA4 de ratón y humano era de 4,51 x 10-8 M y 4,04 x 10-8 M, respectivamente (Figs. 4A y 4C). Por otro lado, la afinidad de unión (KD) del anticuerpo A-F(ab ')2 por EphA4 de ratón y humano era de 2,29 x 10-11 M y 5,30 x 10-11 M, respectivamente (Figs. 4B y 4D).
Ejemplo 6: Actividad inhibidora de la unión de EphA4 de ratón-ligando de ratón del fragmento de unión de EphA4
Se evaluó la actividad inhibidora del anticuerpo A-Fab y el anticuerpo A-F(ab ')2 obtenidos en el ejemplo 5 contra la unión entre EphA4 y su ligando de acuerdo con las siguientes etapas. Cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Nunc) se revistió con un anticuerpo anti-fosfatasa alcalina (Thermo Fisher Scientific). Después de incubación durante la noche a 4°C, cada pocillo se bloqueó con BlockAce al 1% (DS Pharma Biomedical) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces con Tween 20/PBS al 0,05% (Thermo Fisher Scientific), se añadió la proteína región extracelular EphA4 de ratón-SEAP-His obtenida por el método del ejemplo 1 (concentración final: 10 nM) a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces, se añadieron a cada pocillo un ligando y el anticuerpo A (0, 0,003, 0,01,0,03, 0,1,0,3, 1,3, 10, 30, 100, 300, 1000 y 3000 nM), anticuerpo A-Fab (0, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 y 3000 nM), anticuerpo A-F(ab ')2 (0, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 y 3000 nM), o el péptido KYL inhibidor de EphA4 (KYLPYWPVLSSL, 0, 0,0003, 0,001,0,003, 0,01,0,03, 0,1,0,3, 1,3, 10, 30, 100, 300, 1000 y 3000 pM, su síntesis se subcontrató al Centro de Investigación Toray) diluidos en serie. El ligando usado era la quimera de efrina B2-Fc de ratón biotinilada (R&D Systems, concentración final: 2,5 nM). Después de incubación a temperatura ambiente durante 1 hora y posterior lavado tres veces, se le añadió estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano picante (GE Healthcare) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces, se añadió una solución de TMBZ (3,3',5,5'-tetrametilbencidina, Sigma-Aldrich) a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 2 minutos. Se añadió a cada pocillo una cantidad igual de una solución de parada de la reacción (H2SO4 1 N, Wako Pure Chemical Industries). La absorbancia a 450 nm se leyó usando un lector de microplacas (Molecular Devices o PerkinElmer).
Los valores de CI50 del anticuerpo A (anticuerpo A-IgG), anticuerpo A-Fab, anticuerpo A-F(ab')2 y péptido KYL eran de 2,6 (o 3,6) nM, 438,5 nM, 2,9 nM y 5,293 pM, respectivamente (Fig. 5). El anticuerpo A y el anticuerpo A-F(ab')2 tenían 1000 o más veces la actividad del péptido KYL, y el anticuerpo A-Fab también tenía 10 o más veces la actividad del péptido KYL.
Ejemplo 7: Selectividad del anticuerpo monoclonal anti-EphA4 por el receptor Eph humano
De acuerdo con el método descrito en el ejemplo 1, una secuencia de ADN que codifica la secuencia señal y la región extracelular de cada receptor Eph humano (EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA10, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4 y EphB6) se amplificó por RT-PCR usando ARN total derivado de tejido y se clonó en un vector pENTR1A (Invitrogen/Life Technologies) que tiene una secuencia de ADN que codifica una región Fc de IgG 1 humana y marcador de histidina. A continuación, la secuencia de ADN que codifica la secuencia señal y la región extracelular de cada receptor Eph humano, Fc y marcador de histidina se transfirió a un vector pcDNA3.1_rfcB a través de la reacción LR usando el Gateway System (Invitrogen/Life Technologies) para construir un vector para la expresión de una proteína de la región extracelular de cada receptor Eph humano fusionada con la región Fc de IgG 1 humana y el marcador de His (denominada "proteína de región extracelular del receptor Eph-Fc-His") (este vector se denomina "vector de expresión de la proteína de región extracelular del receptor Eph-Fc-His").
A continuación, se inocularon células HEK293EBNA (Life Technologies) en una placa de 10 cm (Falcon) y se cultivaron a 37°C durante 1 día. Las células HEK293EBNA se transfectaron con cada vector de expresión de la proteína de región extracelular del receptor Eph humano-Fc-His obtenidos anteriormente usando TransIT-LT1 (TAKARA). Después de incubación (5% de CO2 , 37°C) durante 4 días, se recuperó el líquido sobrenadante del cultivo y se centrifugó a 1500 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos. El líquido sobrenadante de la centrifugación se filtró a través de un filtro de 0,22 pm (Merck Millipore) y se le añadieron Hepes (Dojindo Laboratories) y azida sódica (Wako Pure Chemical Industries) en concentraciones finales de 20 mM y 0,02%, respectivamente.
Se evaluó la actividad de unión del anticuerpo A frente a cada receptor Eph humano de acuerdo con las siguientes etapas.
Cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Nunc) se recubrió con un anticuerpo de burro anti-IgG humana (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Después de incubación durante la noche a 4°C, cada pocillo se bloqueó con BlockAce al 1% (DS Pharma Biomedical) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar con Tween 20/PBS al 0,05% (Nacalai Tesque) tres veces, cada proteína de región extracelular del receptor Eph humano-Fc-His se diseminó (concentración final: 1 nM) en cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces, se añadieron a cada pocillo una solución de IgG humana (100 pg/ml, Mitsubishi Pharma) y el anticuerpo A (10 pg/ml) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió a los mismos un anticuerpo de burro anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch Laboratories) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces, se añadió a cada pocillo una solución de TMBZ (3,3' 5,5'-tetrametilbencidina, Sigma-Aldrich). Después de la confirmación de desarrollo moderado del color, se añadió a cada pocillo una cantidad igual de una solución de parada de la reacción (H2SO4 1 N, Wako Pure Chemical Industries). La absorbancia a 450 nm se leyó usando un lector de microplacas (PerkinElmer).
El anticuerpo A tenía específicamente actividad de reacción solo con EphA4 humano entre los miembros de la familia del receptor Eph humano (Fig. 6A).
Ejemplo 8: Selectividad del anticuerpo monoclonal anti-EphA4 para el receptor Eph de ratón
De acuerdo con el método descrito en el ejemplo 1, se amplificó una secuencia de ADN que codifica la secuencia señal y la región extracelular de cada receptor Eph de ratón (EphA1, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA10, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4, y EphB6) por RT-pCr usando ARN total derivado de tejido y se clonó en un vector pENTR1A (Invitrogen/Life Technologies) que tiene una secuencia de ADN que codifica una región Fc de IgG1 humana y marcador de histidina. A continuación, la secuencia de ADN que codifica la secuencia señal y la región extracelular de cada receptor Eph de ratón (EphA1, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA10, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4 y EphB6), Fc, y el marcador de histidina se transfirió a un vector pcDNA3.1_rfcB a través de la reacción LR usando el Gateway System (Invitrogen/Life Technologies) para construir cada vector de expresión de la proteína de región extracelular del receptor Eph de ratón-Fc-His. Para la construcción de un vector de expresión de la proteína de región extracelular de EphA2 de ratón-Fc-His, se amplificó una secuencia de ADN que codifica la secuencia señal y la región extracelular de EphA2 de ratón por RT-PCR usando ARN total derivado de tejido y se clonó en un vector pcDNA3.1 que tiene una secuencia de ADN que codifica Fc y el marcador de histidina para construir un vector de expresión de la proteína de región extracelular de EphA2 de ratón-Fc-His.
A continuación, se inocularon células HEK293EBNA (Life Technologies) en una placa de 10 cm (Falcon o BD Biosciences) y se cultivaron a 37°C durante 1 día. Las células HEK293EBNA se transfectaron con el vector de expresión de la proteína de región extracelular de EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA10, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4 o EphB6 de ratón-Fc-His obtenido como se ha descrito antes usando TransIT-LT1 (TAKARA). Después de incubación (5% de CO2 , 37°C) durante 4 días, se recuperó el líquido sobrenadante del cultivo y se centrifugó a 1500 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos. El líquido sobrenadante de la centrifugación se filtró a través de un filtro de 0,22 gm (Merck Millipore) y se le añadieron Hepes (Dojindo Laboratories) y azida sódica (Wako Pure Chemical Industries) en concentraciones finales de 20 mM y 0,02%, respectivamente.
Se evaluó la actividad de unión del anticuerpo A frente a cada receptor Eph de ratón de acuerdo con las siguientes etapas.
Cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Nunc) se recubrió con un anticuerpo de burro anti-IgG humana (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Después de incubación durante la noche a 4°C, cada pocillo se bloqueó con BlockAce al 1% (DS Pharma Biomedical) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar con Tween 20/PBS al 0,05% (Thermo Fisher Scientific) tres veces, se inoculó cada proteína de región extracelular del receptor Eph de ratón-Fc-His (concentración final: 1 nM) en cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces, se añadieron a cada pocillo una solución de IgG humana (100 gg/ml, Sigma-Aldrich) y el anticuerpo A (10 gg/ml) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió a los mismos un anticuerpo de burro anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch Laboratories) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces, se añadió a cada pocillo una solución de TMBZ (3,3',5,5'-tetrametilbencidina, Sigma-Aldrich). Después de confirmar el desarrollo moderado de color, se añadió a cada pocillo una cantidad igual de una solución de detención de la reacción (H2SO4 1 N, Wako Pure Chemical Industries). La absorbancia a 450 nm se leyó usando un lector de microplacas (PerkinElmer).
El anticuerpo A tenía específicamente actividad de reacción sólo con EphA4 de ratón entre los miembros de la familia de receptores Eph de ratón (Fig. 6B).
Ejemplo 9: Reactividad del anticuerpo monoclonal anti-EphA4 con EphA4 de ratón, rata, mono y humano
Se prepararon proteínas de región extracelular de EphA4 de ratón, rata, mono y humano-Fc-His de acuerdo con las siguientes etapas. Primero, de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 1, se construyó un vector de expresión de la proteína de región extracelular de EphA4 de mono-Fc-His. La secuencia de aminoácidos de EphA4 de mono usada en la construcción del vector se muestra en la SEQ ID NO: 44, y su región extracelular se muestra en la SEQ ID NO: 45. A continuación, se inocularon células HEK293EBNA (Life Technologies) en una placa de 10 cm (Falcon) y se cultivaron a 37°C durante 1 día. Las células HEK293EBNA se transfectaron con el vector de expresión de la proteína de región extracelular de EphA4 de mono-Fc-His o el vector de expresión de la proteína de región extracelular de EphA4 de ratón, EphA4 de rata o EphA4 humano-Fc-His descrito en el ejemplo 1 usando TransIT-LT1 (TAKARA). Después de incubación (5% de CO2 , 37°C) durante 4 días, se recuperó el líquido sobrenadante del cultivo y se centrifugó a 1500 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos. El líquido sobrenadante de la centrifugación se filtró a través de un filtro de 0,22 gm (Merck Millipore) y se le añadieron Hepes (Dojindo Laboratories) y azida sódica (Wako Pure Chemical Industries) a concentraciones finales de 20 mM y 0,02%, respectivamente.
Se evaluó la actividad de unión del anticuerpo A frente a varios receptores Eph de acuerdo con las siguientes etapas.
Cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Nunc) se recubrió con un anticuerpo de burro anti-IgG de ratón (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Después de incubación durante la noche a 4°C, cada pocillo se bloqueó con BlockAce al 1% (Sumitomo Dainippon Pharma) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar con Tween 20/PBS al 0,05% (Nacalai Tesque) tres veces, se diseminó la proteína de región extracelular de EphA4 de ratón, rata, mono o humano-Fc-His (concentración final: 1 nM) en cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces, se añadieron una solución de IgG humana (100 gg/ml, Mitsubishi Pharma) y anticuerpo A (0, 0,00128, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4 y 20 gg/ml) a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió a los mismos un anticuerpo de burro anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch Laboratories) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces, se añadió a cada pocillo una solución de TMBZ (3,3',5,5'-tetrametilbencidina, Sigma-Aldrich). Después de confirmar el desarrollo moderado del color, se añadió a cada pocillo una cantidad igual de una solución de detención de la reacción (H2SO4 1 N, Wako Pure Chemical Industries). La absorbancia a 450 nm se leyó usando un lector de microplacas (PerkinElmer).
El anticuerpo A tenía una actividad de reacción equivalente frente a todos los EphA4 de ratón, rata, mono y humano (Fig. 7).
Ejemplo 10: Efecto inhibidor del anticuerpo monoclonal anti-EphA4 en la autofosforilación de EphA4 inducida por ligando en neuronas del hipocampo
Se prepararon neuronas de hipocampo de rata de acuerdo con las siguientes etapas. Se extrajo un feto de una rata preñada de 18 días (Charles River Laboratories Japan) y se hizo una incisión en la cabeza para aislar el cerebro. Se extirpó una región del hipocampo bajo un microscopio estereoscópico, después se puso en una solución de digestión (NaCl 137 mM (Wako Pure Chemical Industries), KCl 5 mM (Wako Pure Chemical Industries), Na2HPÜ47 mM (Wako Pure Chemical Industries), Hepes 25 mM (Dojindo Laboratories), DNasa 0,5 mg/ml (Sigma-Aldrich) y 0,25% de tripsina (Life Technologies)), y se agita a 37°C durante 10 minutos. La solución se retiró y se añadió suero bovino fetal al 20%/solución tampón de Hanks (Sigma-Aldrich) a los tejidos del hipocampo. La solución se retiró y los tejidos del hipocampo se lavaron dos veces con una solución tampón de Hanks y después se pipetearon en una solución tampón de Hanks para preparar una suspensión celular. Las células se inocularon en una placa de 6 pocillos (Falcon) recubierta con poli-L-lisina que contenía una solución de cultivo (medio neurobasal (Life Technologies), 1 x suplemento B-27 (Life Technologies) y L-glutamina 0,5 mM (Life Technologies)).
La evaluación de la actividad inhibidora de la autofosforilación de EphA4 usando las neuronas del hipocampo se llevó a cabo de acuerdo con las siguientes etapas. Las neuronas del hipocampo de rata inoculadas en una placa de 6 pocillos (Falcon) se trataron con quimera de efrina A1 de ratón-Fc (R&D Systems, concentración final: 10 nM), anticuerpo A (0, 1, 10, 100 y 1000 nM) o péptido KYL (KYLPYWPv Ls SL, un inhibidor de EphA4, su síntesis se subcontrató a Hokkaido System Science, 0, 0,01, 0,1, 1, 10 y 100 pM) y se lavó con PBS frío (Wako Pure Chemical Industries) 45 minutos después. Se le añadió un tampón de lisis (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 al 1% (Wako Pure Chemical Industries), 1 x inhibidor de proteasa (Nacalai Tesque) y 1 x inhibidor de fosfatasa (Nacalai Tesque)) para recuperar las células. Después de mezclar a 4°C durante 15 minutos, se recuperó el líquido sobrenadante por centrifugación refrigerada a 15000 rpm a 4°C durante 15 minutos. Se añadió al líquido sobrenadante un anticuerpo policlonal de conejo anti-EphA4 (Medical & Biological Laboratories) y se hizo reaccionar durante 90 minutos. Después, se le añadieron perlas de proteína G (GE Healthcare) y se hizo reaccionar más durante 30 minutos. El líquido sobrenadante se separó por centrifugación refrigerada a 3000 rpm a 4°C durante 1 minuto, seguido de la adición de 1 ml de tampón de lisis. Esta operación se realizó tres veces. Después, se añadió tampón de muestra 2 x SDS a cada muestra, que después se hirvió durante 10 minutos. Esta muestra se usó en SDS-PAGE y transferencia Western usando un anticuerpo anti-tirosina fosforilada (Santa Cruz Biotechnology). Se llevó a cabo además transferencia Western usando un anticuerpo monoclonal anti-EphA4 (Abnova) y se cuantificó la intensidad de la banda para calcular un valor de EphA4 fosforilado/EphA4 total. El anticuerpo monoclonal anti-EphA4 (Abnova), cuyo inmunógeno es un péptido sintético para una región C-terminal de EphA4 humano, se reconoce como un anticuerpo que carece de actividad neutralizante frente a EphA4 humano que tiene una región extracelular N-terminal.
El anticuerpo A y el péptido KYL (un inhibidor de EphA4) suprimían, de una manera dependiente de la concentración, la autofosforilación de EphA4 inducida por la efrina A1 de ratón en las neuronas del hipocampo, y los valores de CI50 eran 24,2 nM y 9,91 pM, respectivamente (Fig. 8). Estos resultados demostraban que el anticuerpo A antagoniza la señalización de EphA4/efrina, como con el péptido KYL, en los sistemas celulares.
Ejemplo 11: Efecto inhibidor del anticuerpo monoclonal anti-EphA4 en el colapso de conos de crecimiento inducido por ligando en neuronas del hipocampo
Se prepararon neuronas del hipocampo de rata como se describe en el ejemplo 10 anterior. Las células se inocularon en una placa de 96 pocillos (Greiner Bio-One) recubierta con una solución de cultivo que contenía poli-L-lisina.
El ensayo de colapso de conos de crecimiento usando las neuronas del hipocampo se llevó a cabo de acuerdo con las siguientes etapas. Las neuronas del hipocampo de rata del día 2 de cultivo inoculadas en la placa de 96 pocillos (Greiner Bio-One) se trataron con PBS (Wako Pure Chemical Industries), anticuerpo A (0,1,0,3 y 1 pM) o un péptido KYL inhibidor de EphA4 (KYLPYWPVLSSL, 10, 30 y 100 pM, su síntesis se subcontrató al Centro de Investigación Toray) durante 15 minutos y después se trató con anticuerpo de cabra anti-fragmento Fcy de IgG1 humana (Jackson ImmunoResearch Laboratories)-quimera de efrina A1 de ratón-Fc agrupada previamente (R&D systems, concentración final: 1 pg/ml) (relación: 1:5) durante 30 minutos. Después, se retiró la solución de cultivo y se añadió PFA al 2% (Wako Pure Chemical Industries)/sacarosa al 4% (Wako Pure Chemical Industries)/PBS, y se dejó reposar durante 20 minutos para fijar las células. La solución se retiró y las células se lavaron con PBS tres veces, seguido de la adición de Triton X-100 al 0,25% (Wako Pure Chemical Industries)/PBS para el tratamiento de penetración celular durante 15 minutos. La solución se retiró y se bloqueó durante 1 hora por la adición de BSA al 2% (Sigma-Aldrich)/Triton X-100 al 0,25%/Opti-MEM (Life Technologies) y después se hizo reaccionar con un anticuerpo anti-Tau-1 (Merck Millipore) y un anticuerpo anti-MAP-2 (Merck Millipore) durante 2 horas. Se retiró la solución de anticuerpo primario, se lavó con PBS tres veces y se hizo reaccionar con un anticuerpo secundario y Alexa Fluor 546 Phalloidin (Molecular Probes) durante 1 hora. La solución de anticuerpo secundario se separó y se lavó con PBS tres veces, y después se encerró por la adición de reactivos de antidecoloración SlowFade Gold (Molecular Probes) y se observó bajo BIOREVO (Keyence). Las neuronas que forman el cono de crecimiento se contaron en 30 campos de visión por muestra para calcular la proporción del número de neuronas que causan el colapso de conos de crecimiento.
El anticuerpo A y el péptido KYL inhibidor de EphA4 suprimían, de una manera dependiente de la concentración, el colapso de conos de crecimiento inducido por la efrina A1 de ratón en las neuronas del hipocampo (Fig. 9). Por consiguiente, se muestra que el anticuerpo A inhibe funcionalmente EphA4, como con el péptido KYL, en sistemas celulares.
Ejemplo 12: Efecto antagonista del ligando del anticuerpo monoclonal anti-EphA4 in vivo
El ensayo de competición in vivo usando ratones recién nacidos se realizó de acuerdo con las siguientes etapas. Se administraron PBS (Wako Pure Chemical Industries), anticuerpo A o un anticuerpo de control (anticuerpo antidinitrofenol de ratón) producido con un procedimiento convencional inmunizando ratas con dinitrofenol, por vía subcutánea en una dosis de 300 mg/kg (30 ml/kg) a cada ratón de 8 días de edad (Charles River Laboratories Japan). Después de 24 horas, se hizo una incisión en el cuero cabelludo bajo anestesia con isoflurano al 4% (Intervet), y se administró quimera de efrina A1 de ratón-Fc (300 pmol/cabeza, R&D Systems) o PBS (Wako Pure Chemical Industries) en el ventrículo lateral. 1 hora después, el ratón se sacrificó por decapitación, seguido de la extirpación del hemisferio cerebral. El hemisferio cerebral recogido se puso en un tubo de filtro cargado en un tubo para la recuperación de BioMasher (R) I (Nippi). Después de insertar una varilla trituradora, el hemisferio cerebral se homogeneizó por centrifugación refrigerada a 15000 rpm a 4°C durante 2 minutos. El homogeneizado se suspendió en tampón TNE (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1x inhibidor de proteasa (Nacalai Tesque), 1x inhibidor de fosfatasa (Nacalai Tesque)). Se añadió 3 x tampón de muestra SDS a una porción del homogeneizado, que después se hirvió durante 10 minutos, seguido de cuantificación de proteínas. Esta muestra se usó en SDS-PAGE y transferencia Western usando un anticuerpo de burro anti-IgG humana (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories), un anticuerpo monoclonal anti-EphA4 (Abnova) y un anticuerpo anti-actina (Sigma-Aldrich). El homogeneizado restante se sometió a cuantificación de proteínas y después se dispensó en una cantidad correspondiente a 3 mg de proteína, y se le añadió Triton X-100 al 1% (Wako Pure Chemical Industries) y SDS al 0,1% (Nacalai Tesque). Después de mezclar a 4°C durante 15 minutos, el líquido sobrenadante se recuperó por centrifugación refrigerada a 15000 rpm a 4°C durante 15 minutos. Se añadió 3 x tampón de muestra SDS a una porción del líquido sobrenadante, que después se hirvió durante 10 minutos para preparar una muestra de entrada. Esta muestra se usó en SDS-PAGE y transferencia Western usando un anticuerpo monoclonal anti-EphA4 (Abnova) y un anticuerpo anti-actina (Sigma-Aldrich). Se añadió un anticuerpo policlonal de conejo anti-EphA4 (Santa Cruz Biotechnology) al líquido sobrenadante restante y se hizo reaccionar durante 60 minutos. Después, se le añadieron perlas de proteína G (GE Healthcare) y se hizo reaccionar más durante 30 minutos. El líquido sobrenadante se separó por centrifugación refrigerada a 3000 rpm a 4°C durante 2 minutos, seguido de la adición de 0,5 ml de tampón de lisis (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 al 1% (Wako Pure Chemical Industries), SDS al 0,1% (Nacalai Tesque), 1 x inhibidor de proteasa (Nacalai Tesque), 1 x inhibidor de fosfatasa (Nacalai Tesque)). Esta operación se realizó tres veces. Después, se añadió 1 x tampón de muestra SDS a las perlas, que después se hirvieron durante 10 minutos para preparar una muestra de perlas. Esta muestra se usó en SDS-PAGE y transferencia Western usando un anticuerpo anti-tirosina fosforilada (Santa Cruz Biotechnology). Se realizó además una transferencia Western usando un anticuerpo monoclonal anti-EphA4 (Abnova) y se cuantificó la intensidad de la banda para calcular un valor de EphA4 fosforilado/EphA4 total. El anticuerpo monoclonal anti-EphA4 (Abnova), cuyo inmunógeno es un péptido sintético para una región C-terminal de EphA4 humano, se reconoce como un anticuerpo que carece de actividad neutralizante contra EphA4 humano que tiene una región extracelular N-terminal.
La administración de efrina A1 de ratón en el ventrículo lateral del ratón recién nacido inducía la autofosforilación de EphA4 en un hemisferio cerebral. El anticuerpo A suprimía la autofosforilación de EphA4 inducida por la efrinaA1 de ratón en 66% (Fig. 10). Por consiguiente, se muestra que el anticuerpo A también inhibe la unión entre EphA4 y su ligando in vivo.
Ejemplo 13: Efecto protector de neuronas motoras del anticuerpo monoclonal anti-EphA4 en un modelo de ELA in vitro derivado de células ES de ratón
Las células ES de ratón se mantuvieron y cultivaron de acuerdo con las siguientes etapas. Las células ES de ratón (129x1/SvJ) crioconservadas -80°C se descongelaron en un baño termostático y después se diluyeron con un medio de cultivo de células ES de ratón (KnockOut(TM) DMEM (Gibco) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS, Gibco), p-mercaptoetanol 0,1 mM (Gibco), piruvato de sodio 1 mM (Invitrogen), L-glutamina 2 mM (Invitrogen), 1% de aminoácidos no esenciales (Invitrogen), penicilina 100 unidades/ml-estreptomicina 100 pg/ml (Invitrogen) y factor inhibidor de la leucemia ESGRO(R) 1000 unidades/ml (Merck Millipore)) calentado a 37°C. Cada suspensión de células se centrifugó (1500 rpm, 3 min, temperatura ambiente), seguido de la eliminación del líquido sobrenadante. Las células se suspendieron en un medio nuevo, después se transfirieron a una placa de cultivo con células alimentadoras inoculadas de antemano y se mantuvieron y cultivaron en una incubadora con CO2 (5% de CO2 , 37°C).
Se establecieron astrocitos a partir de un ratón recién nacido y se mantuvieron y cultivaron de acuerdo con las siguientes etapas. Un ratón recién nacido genéticamente intacto de dos días de edad (C57BL/6JJmsSlc (Japan SLC)) y un ratón híbrido recién nacido de un ratón genéticamente intacto y un ratón de variante de SOD1 humana (G93A) Tg-(B6.Cg-Tg(SOD1_G93A)1Gur/J (Jackson ImmunoResearch Laboratories)) se sacrificó cada uno mediante anestesia por inhalación con isoflurano (Intervet) o decapitación. Después, se aisló la corteza cerebral de cada ratón y se dispersó por tratamiento con tripsina-EDTA al 0,25% (Invitrogen) a 37°C durante 15 minutos. Después del tratamiento enzimático, las células se diluyeron con 4 ml de medio Eagle modificado por Dulbecco (Gibco) que contenía FBS al 10% (Gibco) y penicilina-estreptomicina al 1% (Invitrogen) (FBS-DMEM al 10%) para terminar la digestión enzimática. Después, las impurezas distintas de las células individuales se sometieron a filtración usando un tamiz de células (BD Biosciences) y las células se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos. El líquido sobrenadante se aspiró, se diluyó con 4 ml de FBS-DMEM al 10% de nueva aportación, se inoculó en una placa de cultivo de 60 mm de forma individual y se cultivó a 37°C. Dos días después de la inoculación, se aspiró el medio y se reemplazó por la adición de 4 ml de FBS-DMEM al 10% de nueva aportación. Después de alcanzar la confluencia, se recuperó un líquido sobrenadante del cultivo que contenía células no adherentes y se sometió a genotipado de la variante de SOD1 humana (G93A). Se añadieron de nuevo 2 ml de PBS (Wako Pure Chemical Industries) al líquido sobrenadante y se aspiró de nuevo. Se añadió a las células 1 ml de tripsina-EDTA al 0,25% y se incubaron a 37°C durante 3 minutos. El tratamiento enzimático se terminó con 3 ml de FBS-DMEM al 10% y las células se centrifugaron a 1500 rpm durante 3 minutos. Después de la centrifugación, se aspiró el medio y se añadieron 6 ml de FBS-DMEM al 10% de nueva aportación a las células, que se inocularon en una placa de cultivo de 100 mm y se subcultivaron (número de pases: 2). Después de alcanzar la confluencia, se aspiró el medio y después se añadieron 3 ml de PBS (Wako Pure Chemical Industries) a las células y se aspiró nuevamente. Se añadieron 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25% a las células y se incubaron a 37°C durante 3 minutos. El tratamiento enzimático se terminó con 4 ml de FBS-DMEM al 10% y las células se centrifugaron a 1500 rpm durante 3 minutos. Después de la centrifugación, se aspiró el medio y se añadieron 12 ml de FBS-DMEM al 10% de nueva aportación a las células, después 6 ml de estos se inocularon en una placa de cultivo de 100 mm y se subcultivaron (número de pases: 3). Se aspiró el medio de los astrocitos en el número de pases de 3 y se añadieron 2 ml de PBS (Wako Pure Chemical Industries) a las células y se aspiró de nuevo. Se añadieron 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25% a las células y se incubaron a 37°C durante 3 minutos. El tratamiento enzimático se terminó por adición de 4 ml de FBS-DMEM al 10%. La suspensión se recuperó, se centrifugó a 1500 rpm durante 3 minutos, se diluyó con Cell banker (Nippon Zenyaku Kogyo) y se crioconservó a -80°C hasta que se sometió a un ensayo. Cuando se sometió a un ensayo, cada suspensión celular crioconservada se descongeló en un baño de termostato y después se diluyó con FBS-DMEM al 10% calentado a 37°C. Después de la centrifugación (1500 rpm, 3 min, temperatura ambiente) de cada suspensión celular, se separó el líquido sobrenadante y las células se suspendieron en un medio de nueva aportación, después se inocularon en una cámara de 8 pocillos (ibidi) y se mantuvieron y cultivaron en una incubadora con CO2 (5% de CO2 , 37°C).
El genotipado de la variante de SOD1 humana (G93A) se realizó usando el kit de PCR de tejido REDExtract-N-Amp(TM) (Sigma-Aldrich). En la etapa de mantener y cultivar las células ES de ratón, el líquido sobrenadante del cultivo que contenía células no adherentes de astrocitos que expresan la variante de SOD1 humana (G93A) recuperado durante el subcultivo se recuperó en un tubo de 1,5 ml y se centrifugó a 1500 rpm durante 3 minutos. Después de la centrifugación, se aspiró el líquido sobrenadante y las células se lavaron por la adición de 1 ml de PBS y se centrifugaron de nuevo, seguido de la aspiración de PBS. Se mezclaron 50 pl de una solución de extracción y 12,5 pl de una solución de preparación de tejido y se añadieron a cada muestra. Después de mezclar, la mezcla se transfirió a un tubo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), seguido de la extracción del genoma en un ciclo de 55°C durante 10 minutos ^ 95°C durante 3 minutos ^ 4°C M usando el sistema de PCR GeneAmp(R) 9700 (Applied Biosystems(R)). Después, la solución de reacción se neutralizó por la adición de 50 pl de solución de neutralización B.
El genoma extraído se usó en PCR genómica según la composición mostrada en la Tabla 3. Las secuencias de cebadores usadas en la PCR se muestran en la Tabla 4. Cada producto de PCR resultante se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1% a 100 V durante 20 minutos. Las muestras con dos bandas de un patrón interno de 324 pb y la variante de SOD1 humana (G93A) de 236 pb detectadas se identificaron como astrocitos que expresan la variante de SOD1 humana (G93A).
[Tabla 3]
Tabla 3. Mezcla de PCR genómica
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[Tabla 4]
Tabla 4. Secuencias de nucleótidos de cebadores
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El efecto protector de la neurona motora en los modelos de ELA in vitro se evaluó de acuerdo con las siguientes etapas. Las células ES de ratón cultivadas y mantenidas se trataron con tripsina al 0,25%/solución de EDTA al 0,05% (Gibco) para disociar las células de la placa de cultivo. Las células se recuperaron por centrifugación y después se preparó una suspensión y se inocularon 1,2 x 105 células/ml en una placa de 12 pocillos de baja adsorción (Nunc) (día 0). El cultivo flotante de agregados se realizó durante 2 días en un medio DFK (medio DMEM avanzado/F-12 (Invitrogen):Neurobasal (Invitrogen) [1:1] que contenía 5% de reemplazo de suero KnockOut (Invitrogen), L-glutamina 2 mM, penicilina 100 unidades/ml - estreptomicina 100 pg/ml y p-mercaptoetanol 0,1 mM). El día 2, el medio DFK se reemplazó por un medio DFK que contenía ácido retinoico 1 pM (Sigma-Aldrich) y purmorfamina 2 pM (Stemgent). Después, se realizó el reemplazo del medio con una frecuencia de una vez cada dos días. La diferenciación en neuronas motoras se indujo por cultivo durante 5 días (días 3 a 7).
El día 7, las masas celulares de las neuronas motoras diferenciadas se dispersaron en una solución de dispersión celular Accumax (MS Tech) y se prepararon en una suspensión que tenía una densidad celular de 5,5 x 105 células/ml. Se inocularon 200 pl/pocillo de suspensión en la cámara de 8 pocillos que contenía los astrocitos genéticamente intactos derivados de ratón o los astrocitos que expresaban la variante de SOD1 humana (G93A) cultivados y mantenidos por adelantado, y las células cocultivadas resultantes de los astrocitos y las neuronas motoras se usaron en la evaluación.
El número de neuronas motoras observadas por el cocultivo de los astrocitos genéticamente intactos y las neuronas motoras se usó como control. Para el grupo tratado con fármaco, los astrocitos que expresan la variante de SOD1 humana (G93A) y las neuronas motoras se cocultivaron en unas condiciones que implicaba la adición de vehículo (IgG y agua ultrapura al 0,1%), anticuerpo A (10, 30 y 100 nM), EphA4-Fc (R&D Systems, 3, 10 y 30 nM) o péptido KYL (Toray Research Center, 1, 3 y 10 pM). Después de cultivo durante 2 días a 37°C en un ambiente de CO2 al 5% en cada condición, las neuronas motoras se tiñeron inmunocitoquímicamente con un anticuerpo anti-ISL1 de conejo (Abcam) y Hoechst 33342 (Molecular Probes). Las células copositivas ISL1/Hoechst 33342 por unidad de área se contaron como neuronas motoras vivas, y se calculó la tasa de supervivencia de las neuronas motoras como un porcentaje (%) con respecto al control. La fig. 11 muestra una vista esquemática simple que muestra las etapas del sistema de evaluación.
La tasa de supervivencia de las neuronas motoras se redujo significativamente en el cocultivo de neuronas motoras derivadas de células ES de ratón/astrocitos que expresan la variante de SOD1 humana (40-50%). El anticuerpo A suprimía, de una manera dependiente de la concentración, la muerte de la neuronas motoras derivada de células ES de ratón inducida por los astrocitos que expresan la variante de SOD1 humana (G93A) (Fig. 12). Se confirmó que el tratamiento con péptido KYL o EphA4-Fc, como con el anticuerpo A, tiene un efecto protector de la neurona motora en este sistema experimental, mostrando que el anticuerpo A promueve la supervivencia de las neuronas motoras derivadas de células ES de ratón por inhibición de la señalización de EphA4/efrina en este modelo de ELA in vitro.
Ejemplo 14: Efecto protector de neuronas motoras del anticuerpo monoclonal anti-EphA4 en un modelo de ELA in vitro derivado de células iPS humanas
Las células iPS humanas se mantuvieron y cultivaron de acuerdo con las siguientes etapas. Células iPS humanas (201B7) criopreservadas en nitrógeno líquido usando el banco de células madre (TAKARA) se extrajeron de la fase gaseosa del nitrógeno líquido y se suspendieron y descongelaron inmediatamente en 5 ml de un medio de cultivo de células iPS humanas (Essential 8, Thermo Fisher Scientific) precalentado a 37°C. La suspensión celular se recuperó en un tubo cónico de 15 ml (Falcon) y se centrifugó (1000 rpm, 5 min, temperatura ambiente), seguido de la separación del líquido sobrenadante. Las células se suspendieron en un medio de nueva aportación y después se diseminaron en una placa de cultivo celular de 60 mm de O (Falcon BD) recubierta con 0,5 pg/cm2 de vitronectina humana recombinante (Invitrogen) de antemano. Se le añadió Y-27632 10 pM (Wako Pure Chemical Industries) y las células se mantuvieron y cultivaron en una incubadora con CO2 (5% de CO2 , 37°C). El reemplazo del medio se realizó todos los días y las células se sometieron al experimento cuando alcanzaron la confluencia.
El efecto protector de neuronas motoras en los modelos de ELA in vitro se evaluó de acuerdo con las siguientes etapas. El medio de cultivo de las células iPS humanas mantenidas y cultivadas se aspiró y las células se lavaron con 2 ml de PBS (Wako Pure Chemical Industries). Después de la aspiración de PBS, se añadieron 500 pl de EDTA 0,5 mM a las células, que después se incubaron durante 2 a 3 minutos en una incubadora con CO2 (5% de CO2 , 37°C) (las células se confirmaron al microscopio cada 30 segundos, y la incubación se interrumpió cuando la asociación intercelular se volvió débil). La reacción de EDTA se terminó por suspensión en 5 ml de un medio de cultivo de células iPS humanas y las células se recuperaron en un tubo cónico de 15 ml. Las células se centrifugaron a 1000 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos y se aspiró el líquido sobrenadante. La suspensión celular que contenía masas de células iPS humanas se inoculó en una cantidad de aproximadamente 1/10 por pocillo en una placa de cultivo celular de 6 pocillos de baja adhesión (Nunclon Sphere, Nunc) y se cultivó en una incubadora con CO2 (5% de CO2 , 37°C) usando un medio DFK (medio DMEM avanzado/F-12 (Invitrogen):neurobasal (Invitrogen) [1:1] medio que contiene un suplemento de B27 al 2%, reemplazo de suero KnockOut al 5% (Invitrogen), L-glutamina 2 mmol/l, penicilina 100 unidades/ml-estreptomicina 100 pg/ml y p-mercaptoetanol 0,1 mmol/l) complementado con SB431542 2 pM (Sigma-Aldrich), LDN193189 300 nM (Sigma-Aldrich) y CHIR99021 3 pM (Sigma-Aldrich). El reemplazo del medio se realizó cada 2 días por el siguiente método. Primero, se recuperaron agregados de células diferenciadas de células iPS humanas (SFEB) en un medio base en un tubo cónico de 15 ml y se dejó reposar a temperatura normal durante 5 minutos para precipitar las masas celulares. Este líquido sobrenadante se aspiró y se añadió un medio DFK de nueva aportación y SB4315422 pM (Sigma-Aldrich), LDN193189300 nM (Sigma-Aldrich, CHIR99021 3 pM (Sigma-Aldrich) y después se devolvió al pocillo original para el reemplazo del medio. El día de cultivo 8, los SFEB se recuperaron en un medio base en un tubo cónico de 15 ml y se dejaron reposar a temperatura normal durante 5 minutos para precipitar los SFEB. Este líquido sobrenadante se aspiró y se añadió un medio DFK de nueva aportación y después ácido retinoico 0,1 pM (Sigma-Aldrich) y purmorfamina 0,5 pM (Miltenyi Biotec), y después se devolvió al pocillo original y se cultivó en una incubadora con CO2 (5% de CO2 , 37°C). El reemplazo del medio se realizó cada 2 días. El día de cultivo 12, los SFEB se recuperaron en un medio base en un tubo cónico de 15 ml y se dejaron reposar a temperatura normal durante 5 minutos para precipitar los SFEB. Se aspiró el líquido sobrenadante y se añadieron 500 pl de Accumax (MS TechnoSystems) a las células, que después se pipetearon varias veces y después se incubaron durante 5 minutos en una incubadora con CO2 (37°C, 5% de CO2). Las células se sacaron de la incubadora, se suspendieron en 5 ml de medio DFK y se pipetearon varias veces para dispersar las masas celulares. La suspensión celular se disoció en células individuales por filtración a través de un tamiz de células (Falcon). Después, se contó el número de células usando una cámara de recuento. La suspensión celular se recuperó en otro tubo cónico de 15 ml y se centrifugó a 1000 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se preparó una suspensión que tenía una densidad celular de 5,5 x 105 células/ml con un medio de cultivo de neuronas motoras (medio DMEM avanzado/F-12 (Invitrogen):neurobasal (Invitrogen) [1:1] medio que contenía 2% de suplemento B27, suero de caballo al 1%, L-glutamina 2 mmol/l, penicilina 100 unidades/ml - estreptomicina 100 pg/ml y p-mercaptoetanol 0,1 mmol/l) y se inocularon 200 pl/pocillo en una cámara de 8 pocillos que contenía astrocitos genéticamente intactos o astrocitos que expresan la variante de SOD1 humana (G93A) inoculados con 8 x 104 células/pocillo con antelación. Las células cocultivadas resultantes de los astrocitos y las neuronas motoras se usaron en la evaluación (el establecimiento, congelación, descongelación, inoculación y mantenimiento y cultivo de los astrocitos genéticamente intactos y que expresan la variante de SOD1 humana (G93A) y se llevaron a cabo de la misma manera que en el ejemplo 13). El número de neuronas motoras observadas por el cocultivo de los astrocitos genéticamente intactos y las neuronas motoras se usó como control. Para el grupo tratado con fármaco, los astrocitos que expresan la variante de SOD1 humana (G93A) y las neuronas motoras se cocultivaron en unas condiciones que implicaban la adición de vehículo (IgG y agua ultrapura al 0,1%), anticuerpo A (10, 30 y 100 nM), el péptido KYL inhibidor de EphA4 (KYLPYWPVLSSL, 1,3 y 10 pM, su síntesis se subcontrató al Centro de Investigación Toray), o EphA4-Fc (3, 10 y 30 nM, R&D systems). Después de cultivo durante 2 días a 37°C en un ambiente de CO2 al 5% en cada condición, las neuronas motoras se tiñeron inmunocitoquímicamente con un anticuerpo anti-ISL1 (obtenido de Developmental Studies Hybridoma Bank) y Hoechst 33342 (Molecular Probes). Las células copositivas ISL1/Hoechst 33342 por pocillo se contaron como neuronas motoras vivas, y la tasa de supervivencia de las neuronas motoras se calculó como % con respecto al control. La fig. 13 muestra una vista esquemática simple que muestra las etapas del sistema de evaluación.
La tasa de supervivencia de las neuronas motoras se redujo significativamente (aproximadamente 50%) en el cocultivo de neuronas motoras derivadas de células iPS humanas/astrocitos que expresan la variante de SOD1 humana (G93A), al igual que con el sistema de ensayo que usa células ES de ratón. El anticuerpo A suprimía, de una manera dependiente de la concentración, la muerte de neuronas motoras derivadas de células iPS humanas inducida por los astrocitos que expresan la variante de SOD1 humana (G93A) (Fig. 14). Se confirmó que el tratamiento con péptido KYL o EphA4-Fc, como con el anticuerpo A, tiene un efecto protector de neuronas motoras derivadas de células iPS humanas en este sistema experimental. Por consiguiente, se muestra que el anticuerpo A también promueve la supervivencia de neuronas motoras inhibiendo la unión entre EphA4 y su ligando en células humanas.
Ejemplo 15: Mapeo de epítopos del dominio de unión al ligando de EphA4 (EphA4-LBD) por cristalografía de rayos X
Con el fin de preparar un complejo de anticuerpo A-Fab preparado en el ejemplo 5 y un antígeno EphA4-LBD, se preparó EphA4-LBD (Qin H. et al., J. Biol. Chem., 283: 29473 - 29484 (2008)). Se mezclaron 1,33 mol (950 M, 1,4 ml) de EphA4-LBD y 0,9 mol (150 M, 6 ml) de anticuerpo A-Fab de modo que EphA4-LBD tenía aproximadamente 1,5 veces la relación molar del anticuerpo A-Fab. La mezcla se incubó en hielo durante 30 minutos. A continuación, la solución mezclada se aplicó a HILOAD 26/60 Superdex 75 calidad de preparación (GE Healthcare), seguido de elución con una solución tampón para cromatografía (T ris/HCl 25 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM). Las fracciones que contenían el complejo se analizaron por SDS PAGE y las fracciones de alta pureza se recogieron y se concentraron en 34 mg/ml. Este concentrado se usó en la cristalización.
La cristalización del complejo se llevó a cabo por el método de difusión de vapor de gota sedente usando un aparato de cristalización automático sistema Hydra II Plus One (Matrix Technologies). La placa usada era MRC-2 (Molecular Dimensions). La composición de una solución de depósito era Tris/HCl 100 mM (pH 7,5 a 8,5) y polietilenglicol 400 al 30%. Esta solución de depósito y la solución de complejo descritas antes se mezclaron en una relación de volumen de 1:1 para preparar gotitas de cristalización. La placa de cristalización preparada se dejó reposar a 20°C.
Como resultado de llevar a cabo la cristalización en las condiciones descritas antes, se obtuvieron cristales que tenían un grupo espacial P212121, constante de red a de 70,0 angstroms, constante de red b de 82,3 angstroms y constante de red c de 216,0 angstroms. Los datos de difracción a 2,1 angstroms se obtuvieron por la incidencia de rayos X de sincrotrón (1,0 angstroms) en los cristales obtenidos. Los datos de difracción se procesaron con HKL2000 (HKL Research Inc.) y su determinación de fase se realizó por el método de sustitución molecular. El método de sustitución molecular usaba un programa PHASER (versión 2.5.0, McCoy A.J. et al., J. Appl. Cryst. 40: 658-674 (2007)) contenido en CCP4 Software Suite (proyecto computacional colaborativo número 4, [CCP4] versión 6.5.0, Acta Cryst. D 67: 235 - 242 (2011)). Los modelos de búsqueda usados en el método de sustitución molecular eran la estructura cristalina (PDBID:3CKH) de EphA4-LBD y la estructura cristalina de Fab de un anticuerpo diferente determinado en el pasado por los autores de la presente invención. Se construyó un modelo molecular adecuado para una densidad electrónica obtenida de la fase determinada usando un programa COOT (Emsley P. et al., Acta Cryst. D 60: 2126-2132 (2004)) y se sometió a refinamiento de estructura usando un programa REFMAc (Murshudov G.N., Acta Cryst. D 53: 240 - 255 (1997)).
De esta manera, la estructura cristalina del complejo que tiene una resolución de 2,1 angstroms se obtuvo mediante el cálculo de la estructura (R = 0,234, Rlibre = 0,288).
La estructura cristalina obtenida del complejo Fab/EphA4-LBD se analizó usando una herramienta de detección de interacción instalada en un sistema químico computacional MOE 2011.10 (Chemical Computing Group Inc.) para identificar restos de aminoácidos en EphA4-LBD que interaccionan directamente con Fab (FIG. 15). Se usaron ajustes estándar de MOE como protocolo de detección. Los restos de aminoácidos identificados eran Ser58, Met60, Gln71, Val72, Cys73, Thr104, Arg106, Gln156, Asp161, Arg162, Ile163, Cys191 e Ile192. La fig. 16 muestra la estructura de la superficie de EphA4-LBD preparada usando Maestro (versión 10.6, Schrodinger). Como resultado, los autores de la presente invención concluyeron que las regiones que tienen estos restos de aminoácidos son regiones de unión a Fab de EphA4-LBD.
Ejemplo 16: Preparación de anticuerpo humanizado de anticuerpo A
Preparación de anticuerpo anti-EphA4 humano humanizado
Se diseñaron regiones variables de cada anticuerpo humanizado. Basándose en la alta homología con las regiones armazón (FR) del anticuerpo A, las FR de la cadena ligera del anticuerpo humano IGKV1-NL1*01 (SEQ ID NO: 50) o IGKV3D-15*01 (SEQ ID NO: 51) y JK1 (SEQ ID NO: 52) y las FR de la cadena pesada IGHV7-4-1*02 (SEQ ID NO: 53) y JH6 (SEQ ID NO: 54) se seleccionaron como FR de anticuerpos humanizados. Después, se predijeron los aminoácidos de la FR que interaccionan con aminoácidos de la CDR usando el modelo de predicción estructural 3D del anticuerpo A de ratón y se usaron en el injerto con CDR (SEQ ID NO: 26 a 30 y 31 a 33). En vista de la mejora de la fosforilación de EphA4 y la actividad de ADCC, una región constante de la cadena pesada de IgG2 humana (SEQ ID NO: 62) que tenía mutaciones C131S, C219S, V234A y G237A y carecía de un resto de lisina C-terminal, o una región constante de la cadena pesada (SEQ ID NO: 60) que contenía CH1 derivado de IgG1 humana y región bisagra y CH2 y CH3 derivadas de IgG2 humana que tiene mutaciones V234A y G237A y que carece de un resto de lisina C-terminal, se usó como región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena ligera de IgK humana (SEQ ID NO: 64) se utilizó como región constante de la cadena ligera. HK1 (SEQ ID NO: 72), HK2 (SEQ ID NO: 74) y HK4 (SEQ ID NO: 76) se diseñaron como regiones variables de la cadena pesada de anticuerpos humanizados que llevan CDR injertadas (SEQ ID NO: 26, 28 y 30) determinado por el método de definición de Kabat. HA1 (SEQ ID NO: 66), HA2 (SEQ ID NO: 68) y HA4 (SEQ iD NO: 70) se diseñaron como regiones variables de la cadena pesada de anticuerpos humanizados que llevan CDR injertadas (SEQ ID NO: 27, 29 y 30) determinado por el método de definición AbM. L1-4 (SEQ ID NO: 78), L1-5 (SEQ ID No : 80) y L1-6 (SEQ ID NO: 82) se diseñaron como regiones variables de la cadena ligera de anticuerpos humanizados usando IGKV1-NL1*01 y JK1. L2-4 (SEQ ID NO: 84) se diseñó como una región variable de la cadena ligera de anticuerpo humanizado usando IGKV3D-15*01 y JK1. Casualmente, en el diseño de las regiones constantes de la cadena pesada, se confirmó la fosforilación de EphA4 de la misma forma que se describe en el Ejemplo 10.
Se sintetizó una secuencia génica que codifica la secuencia de aminoácidos de HK1, HK2 o HK4 convirtiendo la secuencia de aminoácidos de las CDR de la cadena pesada (SEQ ID NO: 26, 28 y 30) del anticuerpo A injertado en IGHV7-4-1*02 (SEQ ID NO: 53) y JH6 (SEQ ID NO: 54) con una secuencia señal (SEQ ID NO: 55) añadida adicionalmente al extremo N, a una secuencia génica de GenScript USA Inc., y preparada por mutagénesis por PCR (HK1: SEQ ID NO: 73, HK2: SEQ ID NO: 75, HK4: SEQ ID NO: 77, secuencia de señal: SEQ ID NO: 57). Se sintetizó una secuencia génica que codifica la secuencia de aminoácidos de HA1, HA2 o HA4 convirtiendo la secuencia de aminoácidos de las CDR de la cadena pesada (SEQ ID NO: 27, 29 y 30) del anticuerpo A injertado en IGHV7-4-1*02 (SEQ ID NO: 53) y JH6 (SEQ ID NO: 54) con una secuencia señal (s Eq ID NO: 55) añadida adicionalmente al extremo N, a una secuencia génica de GenScript USA Inc., y preparada por mutagénesis por PCR (HA1: SEQ ID NO: 67, HA2: SEQ ID NO: 69, HA4: SEQ ID NO: 71, secuencia señal: SEQ ID NO: 56). Los genes que codifican estas regiones variables de la cadena pesada humanizadas y secuencias señal se insertaron en vectores de expresión (pcDNA3.4) que contienen una secuencia génica (SEQ ID NO: 63) que codifica la región constante de IgG2 humana (SEQ ID NO: 62) que tenía mutaciones C131S, C219S, V234A y G237A y carecía de un resto de lisina C-terminal, o vectores de expresión (pcDNA3.4) que contenían una secuencia génica (SEQ ID NO: 61) que codificaban la región constante (SEQ ID NO: 60) que contenía CH1 derivada de IgG1 humana y bisagra y CH2 y CH3 derivadas de IgG2 humana que tenían mutaciones V234A y G237A. Se sintetizó una secuencia génica que codificaba la secuencia de aminoácidos de L1 -4, L1 -5 o L1 -6 convirtiendo la secuencia de aminoácidos de las CDR de la cadena ligera (SEQ ID NO: 31 a 33) del anticuerpo A injertado en IGKV1-NL1*01 (SEQ ID NO: 50) y JK1 (SEQ ID NO: 52) con una secuencia señal (SEQ ID NO: 58) añadida adicionalmente al extremo N, a una secuencia génica de GenScript ilSA Inc., y preparada por mutagénesis por PCR (L1-4: SEQ ID NO: 79, L1-5: SEQ ID NO: 81, L1-6: SEQ ID NO: 83, secuencia señal: SEQ ID NO: 59). Se sintetizó una secuencia génica que codificaba la secuencia de aminoácidos de L2-4 convirtiendo la secuencia de aminoácidos de las CDR de la cadena ligera (SEQ ID NO: 31 a 33) del anticuerpo A injertado en IGKV3D-15*01 (SEQ ID NO: 51) y JK1 (SEQ ID NO: 52) con una secuencia señal (SEQ ID NO: 58) añadida adicionalmente al extremo N, a una secuencia génica de GenScript USA Inc., y preparada por mutagénesis por PCR (L2-4: SEQ ID NO: 85, secuencia señal: SEQ ID NO: 59). Los genes que codificaban estas regiones variables de la cadena ligera humanizada y secuencias señal se insertaron en vectores de expresión (pcDNA3.4) que contenían una secuencia génica (SEQ ID NO: 65) que codificaba la región constante de IgK humana (SEQ ID NO: 64). En este contexto, el término "C131S" se refiere a una mutación que sustituye la cisteína en la posición 131 de la numeración Eu por serina. El término "C219S" se refiere a una mutación que sustituye la cisteína en la posición 219 de la numeración de Eu por serina. El término "V234A" se refiere a una mutación que sustituye la valina en la posición 234 de la numeración de Eu por alanina. El término "G237A" se refiere a una mutación que sustituye la glicina en la posición 237 de la numeración de Eu por alanina. En este contexto, la CH1 se refiere a una región de las posiciones de numeración Eu 118 a 215 en la región constante de IgG humana. La bisagra se refiere a una región de las posiciones de numeración de Eu 216 a 230 en la región constante de IgG humana. La CH2 se refiere a una región de las posiciones de numeración Eu 231 a 340 en la región constante de IgG humana. La CH3 se refiere a una región de las posiciones de numeración Eu 341 a 446 en la región constante de IgG humana. Con el fin de producir estos anticuerpos humanizados, los vectores de expresión descritos anteriormente se usaron en combinación como se muestra en la Tabla 5 usando el sistema de expresión Expi293 (Gibco/Thermo Fisher Scientific) para transfectar células Expi293F (Gibco/Thermo Fisher Scientific). Cada líquido sobrenadante se recuperó y purificó usando proteína A (GE Healthcare).
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Ejemplo 17: Afinidad del anticuerpo monoclonal anti-EphA4 humanizado por el EphA4 humano
La afinidad de unión de cada anticuerpo monoclonal anti-EphA4 humanizado obtenido en el ejemplo 16 por el EphA4 humano se determinó mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR) usando Biacore T200 (GE Healthcare). Primero, para el ensayo del anticuerpo A, un anticuerpo de rata anti-IgG1 de ratón producido con un método convencional inmunizando ratas con anticuerpo IgG1 de ratón se inmovilizó en el chip detector CM5. La inmovilización del anticuerpo de rata anti-IgG1 de ratón en el chip detectpor CM5 se realizó por el método de acoplamiento de amina usando N-hidroxisuccinimida (NHS) e hidrocloruro de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC). Se usó etanolamina para bloquear (el chip detector y los reactivos para la inmovilización fueron todos fabricados por GE Healthcare). El anticuerpo se diluyó con una solución tampón para inmovilización (acetato de sodio 10 mM, pH 4,5) y se inmovilizó en el chip detector de acuerdo con el protocolo adjunto a Biacore T200. Para el ensayo de cada anticuerpo monoclonal humanizado, se usó un chip de proteína A (Ge Healthcare, 29-1383-03). El anticuerpo A o el anticuerpo monoclonal humanizado se diluyó con una solución tampón de análisis de HBS-EP (GE Healthcare), se inyectó solo en la celda de flujo 2 durante 120 segundos y se capturó (cantidad capturada: aproximadamente 30 a 60 RU). Posteriormente, la proteína de región extracelular de EphA4 humana-SEAP-His en dilución seriada en el intervalo de 50, 16,7, 5,6, 1,9 y 0,6 nM usando HBS-EP se añadió secuencialmente desde los lados de concentración más baja hacia la más alta sin operación de regeneración. Las curvas de la reacción de unión se observaron secuencialmente en el momento de la adición (fase de asociación, durante 120 s) y después de completarse la adición (fase de disociación, durante 900 s). Después de completar cada observación, el chip detector se regeneró por adición de MgCl2 3 M (durante 60 s) o Glicina-HCl 10 mM pH 1,5 (durante 30 segundos). Las curvas de reacción de unión obtenidas se sometieron a análisis de ajuste con modelos de unión 1:1 usando la evaluación de software BIA adjunta al sistema para calcular la afinidad (KD = kd/ka) por EphA4 humano (Tabla 6).
Se encontró que todos los anticuerpos humanizados descritos en la Tabla 5 presentaban afinidad sustancialmente equivalente por su anticuerpo A parental (Tabla 6).
[Tabla 6]
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Ejemplo 18: Actividad inhibidora de la unión de EphA4 humano-ligando humano del anticuerpo monoclonal anti-EphA4 humanizado
Se evaluó la actividad inhibidora de cada anticuerpo monoclonal humanizado anti-EphA4 obtenido en el Ejemplo 16 frente a la unión entre EphA4 humano y su ligando humano de acuerdo con las siguientes etapas. Cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Nunc) se recubrió con un anticuerpo anti-fosfatasa alcalina (Thermo Fisher Scientific). Después de la incubación durante la noche a 4°C, cada pocillo se bloqueó con BlockAce al 1% (DS Pharma Biomedical) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces con Tween 20/PBS al 0,05% (Thermo Fisher Scientific), se añadió la proteína de región extracelular EphA4 humana-SEAP-His obtenida por el método del Ejemplo 2 (concentración final: 10 nM) a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente temperatura durante 1 hora. Después de lavar tres veces, se añadieron a cada pocillo un ligando y cada anticuerpo humanizado diluido en serie del anticuerpo A (0, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 y 3000 nM). El ligando usado era quimera Efrina A5-Fc humana biotinilada (R&D Systems, concentración final: 0,7 nM). Después de incubación a temperatura ambiente durante 1 hora y posterior lavado tres veces, se le añadió estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano picante (GE Healthcare) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces, se añadió una solución de TMBZ (3,3',5,5'-tetrametilbencidina, Sigma-Aldrich) a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 2 minutos. Se añadió a cada pocillo una cantidad igual de una solución de parada de la reacción (H2SO4 1 N, Wako Pure Chemical Industries). La absorbancia a 450 nm se leyó usando un lector de microplacas (PerkinElmer).
Se encontró que todos los anticuerpos humanizados descritos en la Tabla 5 presentaban actividad inhibidora sustancialmente equivalente a su anticuerpo A parental (Tabla 7).
[Tabla 7]
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Ejemplo 19: Selectividad del anticuerpo monoclonal humanizado anti-EphA4 por el receptor Eph humano
Según el método descrito en el ejemplo 7, una secuencia de ADN que codifica la secuencia señal y la región extracelular de cada receptor Eph humano (EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA10, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4 y EphB6) se amplificó mediante RT-PCR usando ARN total derivado de tejido y se clonó en un vector pENTR1A (Invitrogen/life Technologies) que tiene una secuencia de ADN que codifica la proteína SEAP y el marcador de histidina. A continuación, la secuencia de ADN que codifica la secuencia señal y la región extracelular de cada receptor Eph humano, proteína SEAP y marcador de histidina se transfirió a un vector pcDNA3.1_rfcB a través de la reacción LR usando Gateway System (Invitrogen/life Technologies) para construir un vector para la expresión de una proteína de la región extracelular de cada receptor Eph humano fusionada con la proteína SEAP y el marcador His (denominada "proteína de región extracelular del receptor Eph-SEAP-His") (este vector se denomina " vector de expresión de la proteína de región receptor extracelular del receptor Eph-SEAP-His").
A continuación, cada vector de expresión de la proteína de región extracelular del receptor Eph humano-SEAP-His se transfirió a células Expi293F (Gibco/Thermo Fisher Scientific) usando el sistema de expresión Expi293 (Gibco/Thermo Fisher Scientific). Después de la incubación (5% de CO2 , 37°C) durante 5 días, se recuperó el líquido sobrenadante del cultivo y se centrifugó a 1500 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos. El líquido sobrenadante de la centrifugación se filtró a través de un filtro de 0,45 gm (Merck Millipore).
Se evaluó la actividad de unión de cada anticuerpo monoclonal humanizado anti-EphA4 obtenido en el Ejemplo 16 frente a cada receptor Eph humano de acuerdo con las siguientes etapas.
Cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Nunc) se recubrió con un anticuerpo de conejo anti-6-His (Bethyl Laboratories). Cada pocillo se bloqueó a temperatura ambiente durante 1 hora y después se incubó durante la noche con BlockAce al 1 % (DS Pharma Biomedical) a 4°C. Después de lavar con Tween 20/PBS al 0,05% (Nacalai Tesque) tres veces, la se añadió proteína SEAP-His de EphAI, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA10, EphBI, EphB2, EphB3, EphB4 o EphB6 humano (concentración final: 1 nM) a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces, se añadió el anticuerpo humanizado a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces, se le añadió un anticuerpo de burro anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch Laboratories) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces, se añadió a cada pocillo el sistema TMB Microwell Peroxidase Substrate System (Kirkegaard & Perry Laboratories (KPL)). Después de confirmar el desarrollo moderado del color, se añadió a cada pocillo una cantidad igual de una solución de parada de la reacción (H2SO41N, Wako Pure Chemical Industries). La absorbancia a 450 nm se leyó usando un lector de microplacas (Thermo Fisher Scientific).
Los porcentajes con respecto a la absorbancia a 450 nm para EphA4 humano (hEphA4-SEAP-His) como 100% se resumen en la tabla 8. Como resultado, se encontró que todos los anticuerpos humanizados descritos en la tabla 5 se unían específicamente a EphA4 humano, como con su anticuerpo A parental (tabla 8).
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Ejemplo 20: Efecto protector de las neuronas motoras del anticuerpo monoclonal humanizado anti-EphA4 en un modelo de ELA in vitro derivado de células iPS humanas
Las células iPS humanas se mantienen y cultivan de acuerdo con las siguientes etapas. Células iPS humanas (201B7) crioconservadas en nitrógeno líquido usando el banco de células madre (TAKARA) se extraen de la fase gaseosa del nitrógeno líquido y se suspenden y descongelan inmediatamente en 5 ml de un medio de cultivo de células iPS humanas (Essential 8, Thermo Fisher Scientific) precalentado a 37°C. La suspensión celular se recupera en un tubo cónico de 15 ml (Falcon) y se centrifuga (1000 rpm, 5 min, temperatura ambiente), seguido de la eliminación del líquido sobrenadante. Las células se suspenden en un medio nuevo y después se diseminan en una placa de cultivo celular de O 60 mm (Falcon BD) recubierta con 0,5 gg/cm2 de vitronectina humana recombinante (Invitrogen) previamente. Se les añade Y-27632 10 gM (Wako Pure Chemical Industries) y las células se mantienen y cultivan en una incubadora de CO2 (5% de CO2 , 37°C). Se lleva a cabo la sustitución del medio todos los días y las células se someten al experimento cuando alcanzan la confluencia.
El efecto protector de las neuronas motoras del anticuerpo monoclonal humanizado anti-EphA4 obtenido en el ejemplo 16 en los modelos de ELA in vitro se evalúa de acuerdo con las siguientes etapas. El medio de cultivo de las células iPS humanas mantenidas y cultivadas se aspira y las células se lavan con 2 ml de PBS (Wako Pure Chemical Industries). Después de la aspiración de PBS, se añaden 500 gL de EDTA 0,5 mM a las células, que después se incuban durante 2 a 3 minutos en una incubadora de CO2 (5% de CO2 , 37°C) (las células se confirman al microscopio cada 30 segundos, y la incubación se interrumpe cuando la asociación intercelular se debilita). La reacción de EDTA se termina mediante suspensión en 5 ml de un medio de cultivo de células iPS humanas, y las células se recuperan en un tubo cónico de 15 ml. Las células se centrifugan a 1000 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos y se aspira el líquido sobrenadante. La suspensión celular que contiene masas de células iPS humanas se inocula en una cantidad de aproximadamente 1/10 por pocillo en una placa de cultivo celular de 6 pocillos de baja adhesión (Nunclon Sphere, Nunc) y se cultiva en una incubadora de CO2 (5% de CO2 , 37°C) usando un medio DFK (DMEM avanzado/F-12 (Invitrogen):medio neurobasal (Invitrogen) [1:1] medio que contiene suplemento de B27 al 2%, reemplazo de suero KnockOut al 5% (Invitrogen), L-glutamina 2 mmol/l, penicilina 100 unidades/ml- estreptomicina 100 gg/ml y pmercaptoetanol 0,1 mmol/l) complementado con SB4315422 gM (Sigma-Aldrich), LDN193189300 nM (Sigma-Aldrich) y CHIR99021 3 gM (Sigma-Aldrich). Se lleva a cabo la sustitución del medio cada 2 días por el siguiente método. Primero, se recuperan agregados de células diferenciadas de células iPS humanas (SFEB) en un medio base en un tubo cónico de 15 ml y se dejan reposar a temperatura normal durante 5 minutos para precipitar las masas de células. Este líquido sobrenadante se aspira y se añade un medio DFK nuevo y SB431542 2 gM (Sigma-Aldrich), LDN193189 300 nM (Sigma-Aldrich), CHIR99021 3 gM (Sigma-Aldrich) y después se devuelve al pocillo original para la sustitución de medio. El día de cultivo 8, los SFEB se recuperan en un medio base en un tubo cónico de 15 ml y se dejan reposar a temperatura normal durante 5 minutos para precipitar los SFEB. Este líquido sobrenadante se aspira y se añade un medio DFK nuevo y después ácido retinoico 0,1 gM (Sigma-Aldrich) y purmorfamina 0,5 gM (Miltenyi Biotec), y después se devuelve al pocillo original y se cultiva en una incubadora de CO2 (5% de CO2 , 37°C). La sustitución de medio se realiza cada 2 días. El día de cultivo 12, los SFEB se recuperan en un medio base en un tubo cónico de 15 ml y se dejan reposar a temperatura normal durante 5 minutos para precipitar los SFEB. Se aspira el líquido sobrenadante y se añaden 500 gl de Accumax (MS TechnoSystems) a las células, que después se pipetean varias veces y después se incuban durante 5 minutos en una incubadora de CO2 (5% de CO2 , 37°C). Las células se sacan de la incubadora, se suspenden en 5 ml de un medio DFK y se pipetean varias veces para dispersar las masas celulares. La suspensión celular se disocia en células individuales por filtración a través de un filtro de células (Falcon). Después, se cuenta el número de células usando una cámara de recuento. La suspensión celular se recupera en otro tubo cónico de 15 ml y se centrifuga a 1000 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se prepara una suspensión que tiene una densidad celular de 5,5 x 105 células/ml con un medio de cultivo de motoneuronas (DMEM avanzado/F-12 (Invitrogen):medio neurobasal (Invitrogen) [1:1] medio que contiene suplemento B27 al 2%, suero de caballo al 1%, L-glutamina 2 mmol/l, penicilina 100 unidades/ml - estreptomicina 100 gg/ml y p-mercaptoetanol 0,1 mmol/l) y se inoculan 200 gl/pocillo en una cámara de 8 pocillos que contiene astrocitos de tipo natural derivados de ratón o astrocitos que expresan la variante SOD1 humana (G93A) previamente inoculados con 8 x 104 células/pocillo. Las células cocultivadas resultantes de los astrocitos y las neuronas motoras se usan en la evaluación (el establecimiento, congelación, descongelación, inoculación y mantenimiento y cultivo de los astrocitos de tipo natural y los que expresan la variante SOD1 humana (G93A) se realizan de la misma manera como en el ejemplo 13). El número de neuronas motoras observadas por el cocultivo de los astrocitos de tipo natural y las neuronas motoras se usa como control. Para el grupo tratado con fármaco, los astrocitos que expresan la variante SOD1 humana (G93A) y las neuronas motoras se cocultivan en unas condiciones que implican la adición de vehículo (IgG y agua ultrapura al 0,1%) y el anticuerpo humanizado. Después del cultivo durante 2 días a 37°C en un ambiente de 5% de CO2 en cada una de las condiciones, las neuronas motoras se tiñen de forma inmunocitoquímica con un anticuerpo anti-ISL1 (obtenido de Developmental Studies Hybridoma Bank) y Hoechst 33342 (Molecular Probes). Las células copositivas ISL1/Hoechst 33342 por pocillo se cuentan como neuronas motoras vivas, y la tasa de supervivencia de las neuronas motoras se calcula como % con respecto al control.
La tasa de supervivencia de las neuronas motoras se reduce significativamente en el cocultivo de astrocitos que expresan la variante SOD1 humana (G93A)/neuronas motoras derivadas de células iPS humanas. El anticuerpo humanizado descrito en la Tabla 5 suprimió, de una manera dependiente de la concentración, la muerte de neuronas motoras derivadas de células iPS humanas inducida por los astrocitos que expresan la variante SOD1 humana (G93A).

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo, que comprende
(a) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 27;
(b) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 29;
(c) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 30;
(d) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 31;
(e) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 32; y
(f) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 33.
2. El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a EphA4 del mismo está humanizado.
3. El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde
el anticuerpo o el fragmento de unión a EphA4 del mismo se une específicamente a EphA4 e inhibe la unión entre EphA4 y la efrina.
4. El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde
el anticuerpo o el fragmento de unión a EphA4 del mismo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, y una región constante de la cadena pesada y una región constante de la cadena ligera que cada una comprende una secuencia derivada de anticuerpo humano.
5. El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la región constante de la cadena pesada deriva de IgG humana, en donde
la IgG humana opcionalmente es IgG1 humana o IgG2 humana.
6. El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, en donde
la región constante de la cadena ligera deriva de IgK humana.
7. El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde
el fragmento de unión a EphA4 se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, en donde el fragmento de unión a EphA4 opcionalmente es F(ab')2.
8. El anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 7, que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 66, 68 o 70 y una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 78, 80, 82 o 84.
9. El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con la reivindicación 8, en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 66, y una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 78, o en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 68, y una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 78, o
en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 70, y una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 78, o
en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 66, y una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 80, o
en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 68, y una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 80, o
en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 70, y una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 80, o
en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 66, y una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 82, o
en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 68, y una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 82, o
en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 70, y una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 82, o
en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 68, y una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 84.
10. El anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con la reivindicación 8, en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 66, y una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID N0: 84.
11. El anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con la reivindicación 8, en donde una región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 70, y una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 84.
12. El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde
la región constante de la cadena pesada deriva de IgG humana, en donde la IgG humana es IgG humana que consiste en IgG2 humana o una combinación de IgG1 humana y IgG2 humana.
13. El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la IgG humana es IgG2 humana.
14. El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la IgG2 humana tiene una mutación C131S, C219S, V234A y/o G237A con la numeración Eu, y no tiene un resto de lisina en el carboxi terminal, en donde opcionalmente la IgG2 humana comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 62.
15. El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la IgG humana es IgG humana que consiste en una combinación de IgG1 humana e IgG2 humana.
16. El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con la reivindicación 15, en donde en la IgG humana que consiste en una combinación de IgG1 humana e IgG2 humana, una región CH1 y una región bisagra son IgG1 humana, y una región CH2 y una región CH3 son IgG2 humana.
17. El anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la IgG humana que consiste en una combinación de IgG1 humana e IgG2 humana tiene una mutación V234A y/o G237A con la numeración Eu, y no tiene un resto lisina en el carboxi terminal, en donde opcionalmente la IgG humana que consiste en una combinación de IgG1 humana e IgG2 humana comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 60.
18. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-EphA4 o el fragmento de unión a EphA4 del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende además opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.
19. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 18 para usar en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA).
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