JP6738814B2 - 抗ＥｐｈＡ４抗体 - Google Patents

Description

本発明は、ＥｐｈＡ４に結合する抗体に関する。

ＥｐｈＡ４は、レセプター型チロシンキナーゼファミリーの１つである。Ｅｐｈｒｉｎ ｔｙｐｅ Ａおよびｔｙｐｅ ＢがＥｐｈＡ４のリガンドとして知られており、ＥｐｈＡ４とそのリガンドであるｅｐｈｒｉｎが結合すると、脱接着シグナルが誘導される。ＥｐｈＡ４は、運動ニューロンに発現しており、神経回路形成期の脊髄において、運動ニューロンの非投射領域にｅｐｈｒｉｎが発現されていることにより、正確な軸索ガイダンスが制御されている。

従来の研究から、ＥｐｈＡ４の機能阻害は、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、以下「ＡＬＳ」とも称する）やアルツハイマー病等の神経変性疾患、脊髄損傷に対して有効な治療手段であることが示唆されている。

ＥｐｈＡ４がＡＬＳの表現型を調整する遺伝子であることが報告されている（特許文献１、非特許文献１）。ＥｐｈＡ４の遺伝的欠損やＥｐｈＡ４−Ｆｃ等によるアンタゴニズムが、マウス・ラットにおける脊髄損傷時の軸索伸長や機能的回復を促進することを示している（非特許文献２および非特許文献３）。
既存のＥｐｈＡ４阻害薬として、ＫＹＬペプチドや化合物１が知られているが（特許文献１、非特許文献１および非特許文献２）、中和活性を有する抗体については報告がない。

ＷＯ２０１２／１５６３５１Ａ１

Ｖａｎ Ｈｏｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．, Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｖｏｌ１８： １４１８−１４２２，２０１２ Ｇｏｌｄｓｈｍｉｔ ｅｔ ａｌ．, ＰＬｏＳ ｏｎｅ，ｖｏｌ６：ｅ２４６３６，２０１１ Ｓｐａｎｅｖｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，ｖｏｌ３０：１０２３−１０３４，２０１３

本発明は、ＥｐｈＡ４に結合し、ＥｐｈＡ４とそのリガンドとの結合を阻害し得る、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片、および、これらを有効成分として含む医薬組成物を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＥｐｈＡ４に結合し、ＥｐｈＡ４とそのリガンドとの結合を阻害し得る、抗ＥｐｈＡ４抗体を取得することで、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、一実施形態において、次の発明に関する。
（１）抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
（ａ）配列番号２６または配列番号２７に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ１；
（ｂ）配列番号２８または配列番号２９に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ２；
（ｃ）配列番号３０に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ３；
（ｄ）配列番号３１に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ１；
（ｅ）配列番号３２に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ２；および
（ｆ）配列番号３３に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ３
を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（２）（１）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
ヒト化されている、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（３）（１）または（２）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合し、ＥｐｈＡ４とｅｐｈｒｉｎとの結合を阻害する、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、重鎖および軽鎖を含み、
前記重鎖の定常領域および前記軽鎖の定常領域がヒト抗体由来の配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（５）（４）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の定常領域はヒトＩｇＧである、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（６）（５）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記ヒトＩｇＧはヒトＩｇＧ_１またはヒトＩｇＧ_２である、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（７）（４）〜（６）のいずれかにに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記軽鎖の定常領域はヒトＩｇκである、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（８）（１）〜（７）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記ＥｐｈＡ４結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖからなる群より選択される、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（９）（８）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記ＥｐｈＡ４結合断片は、Ｆ（ａｂ’）_２である、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（１０）（１）〜（９）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片を含む、
医薬組成物。

（１１）（１０）に記載の医薬組成物であって、
製薬学的に許容される担体をさらに含む、
医薬組成物。

（１２）（１０）または（１１）に記載の医薬組成物であって、
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療のために用いられる、
医薬組成物。

また、本発明は、別の一実施形態において、次の発明に関する。
（１’）抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、重鎖および軽鎖を含み、
前記重鎖の可変領域は、配列番号６６、６８、７０、７２、７４または７６に示すアミノ酸配列または当該配列において１個または複数個のアミノ酸が置換、付加および／または欠失したアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖の可変領域は、配列番号７８、８０、８２、または８４に示すアミノ酸配列または当該配列において１個または複数個のアミノ酸が置換、付加および／または欠失したアミノ酸配列を含み、
ＥｐｈＡ４に特異的に結合し、ＥｐｈＡ４とｅｐｈｒｉｎとの結合を阻害する、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（２’）抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、重鎖および軽鎖を含み、
前記重鎖の可変領域は、配列番号６６、６８、７０、７２、７４または７６に示すアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖の可変領域は、配列番号７８、８０、８２、または８４に示すアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（３’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号６６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号７８のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（４’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号６８のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号７８のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（５’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号７０のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号７８のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（６’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号７２のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号７８のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（７’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号７４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号７８のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（８’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号７６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号７８のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（９’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号６６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８０のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（１０’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号６８のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８０のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（１１’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号７０のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８０のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（１２’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号７２のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８０のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（１３’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号７４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８０のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（１４’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号７６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８０のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（１５’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号６６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８２のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（１６’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号６８のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８２のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（１７’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号７０のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８２のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（１８’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号７２のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８２のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（１９’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号７４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８２のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（２０’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号７６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８２のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（２１’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号６６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８４のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（２２’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号６８のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８４のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（２３’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号７０のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８４のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（２４’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号７２のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８４のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（２５’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号７４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８４のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（２６’）（１’）または（２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域は配列番号７６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８４のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（２７’）（１’）〜（２６’）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合し、ＥｐｈＡ４とｅｐｈｒｉｎとの結合を阻害する、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（２８’）（１’）〜（２７’）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の定常領域および前記軽鎖の定常領域がヒト抗体由来の配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（２９’）（２８’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記重鎖の定常領域はヒトＩｇＧである、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（３０’）（２９’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧ_２、またはヒトＩｇＧ_１とヒトＩｇＧ_２の組み合わせからなるヒトＩｇＧである、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（３１’）（３０’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記ヒトＩｇＧはヒトＩｇＧ_２である、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（３２’）（３１’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記ヒトＩｇＧ_２は、Ｅｕ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおいてＣ１３１Ｓ、Ｃ２１９Ｓ、Ｖ２３４Ａおよび／またはＧ２３７Ａ変異を有し、カルボキシ末端にリシン残基を有さない、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（３３’）（３２’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記ヒトＩｇＧ_２は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（３４’）（３０’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧ_１とヒトＩｇＧ_２の組み合わせからなるヒトＩｇＧである、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（３５’）（３４’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記ヒトＩｇＧ_１とヒトＩｇＧ_２の組み合わせからなるヒトＩｇＧは、ＣＨ１およびヒンジ部がヒトＩｇＧ_１であり、ＣＨ２およびＣＨ３がヒトＩｇＧ_２である、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（３６’）（３５’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記ヒトＩｇＧ_１とヒトＩｇＧ_２の組み合わせからなるヒトＩｇＧは、Ｅｕ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおいてＶ２３４Ａおよび／またはＧ２３７Ａ変異を有し、カルボキシ末端にリシン残基を有さない、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（３７’）（３６’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記ヒトＩｇＧ_１とヒトＩｇＧ_２の組み合わせからなるヒトＩｇＧは、配列番号６０のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（３８’）（２８’）〜（３７’）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記軽鎖の定常領域はヒトＩｇκである、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（３９’）（１’）〜（３８’）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記ＥｐｈＡ４結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖからなる群より選択される、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（４０’）（３９’）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
前記ＥｐｈＡ４結合断片は、Ｆ（ａｂ’）_２である、
抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。

（４１’）（１’）〜（４０’）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片を含む、
医薬組成物。

（４２’）（４１’）に記載の医薬組成物であって、
製薬学的に許容される担体をさらに含む、
医薬組成物。

（４３’）（４１’）または（４２’）に記載の医薬組成物であって、
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療のために用いられる、
医薬組成物。

上記に挙げた本発明の態様の一または複数を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれる。

本発明によれば、ＥｐｈＡ４に結合し、ＥｐｈＡ４とそのリガンドとの結合を阻害し得る、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片、および、これらを有効成分として含む医薬組成物が提供される。

図１は、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ａ）のヒトＥｐｈＡ４およびマウスＥｐｈＡ４に対する結合親和性を示す。 図２は、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ａ）、ＫＹＬペプチドおよび化合物１による、マウスＥｐｈＡ４と、マウスＥｐｈｒｉｎＡ１およびマウスＥｐｈｒｉｎＢ２との結合阻害を示す。 図３は、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ａ）、およびＫＹＬペプチドによる、ヒトＥｐｈＡ４と、ヒトＥｐｈｒｉｎＡ５およびヒトＥｐｈｒｉｎＢ３との結合阻害を示す。 図４Ａは、抗体Ａ−ＩｇＧ（抗体Ａ）および抗体Ａ−Ｆａｂの、マウスＥｐｈＡ４に対する結合親和性を示す。 図４Ｂは、抗体Ａ−ＩｇＧ（抗体Ａ）および抗体Ａ−Ｆ（ａｂ’）_２の、マウスＥｐｈＡ４に対する結合親和性を示す。 図４Ｃは、抗体Ａ−ＩｇＧ（抗体Ａ）および抗体Ａ−Ｆａｂの、ヒトＥｐｈＡ４に対する結合親和性を示す。 図４Ｄは、抗体Ａ−ＩｇＧ（抗体Ａ）および抗体Ａ−Ｆ（ａｂ’）_２の、ヒトＥｐｈＡ４に対する結合親和性を示す。 図５は、抗体Ａ−ＩｇＧ（抗体Ａ）、抗体Ａ−Ｆ（ａｂ’）_２、抗体Ａ−Ｆａｂ、およびＫＹＬペプチドによる、マウスＥｐｈＡ４とマウスＥｐｈｒｉｎＢ２との結合阻害を示す。 図６は、抗体ＡのヒトＥｐｈレセプター（図６Ａ）およびマウスＥｐｈレセプター（図６Ｂ）に対する結合特異性を示す。 図７は、抗体Ａの、マウスＥｐｈＡ４、ラットＥｐｈＡ４、サルＥｐｈＡ４およびヒトＥｐｈＡ４との結合活性を示す。 図８は、抗体Ａが、海馬ニューロンにおいて、ＥｐｈｒｉｎＡ１により誘発されるＥｐｈＡ４自己リン酸化を濃度依存的に抑制することを示す。図８中のｐＹは、リン酸化ＥｐｈＡ４を示す。 図９は、抗体Ａが、海馬ニューロンにおいて、ＥｐｈｒｉｎＡ１により誘発されるｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｅ ｃｏｌｌａｐｓｅを濃度依存的に抑制することを示す。 図１０は、抗体Ａが、マウス新生仔脳において、ＥｐｈｒｉｎＡ１により誘発されるＥｐｈＡ４自己リン酸化を抑制することを示す。図１０中のｐＹは、リン酸化ＥｐｈＡ４を示す。 図１１は、実施例１３で実施した評価系の模式図を示す。 図１２は、抗体Ａが、マウスＥＳ細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＬＳモデルにおいて、運動ニューロンを保護することを示す。 図１３は、実施例１４で実施した評価系の模式図を示す。 図１４は、抗体Ａが、ヒトｉＰＳ細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＬＳモデルにおいて、運動ニューロンを保護することを示す。 図１５は、横軸にＥｐｈＡ４−Ｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ（ＥｐｈＡ４−ＬＢＤ）のアミノ酸、縦軸にＦａｂの構造領域を示す。黒のビットは相互作用が存在する組み合わせの交点を示す。また、１残基のアミノ酸に対して存在する複数のビットは相互作用の種類（水素結合・表面接触等）に対応している。ビットの数が多いアミノ酸ほど多様な相互作用でＦａｂと結合していることを示す。 図１６は、ＥｐｈＡ４−Ｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ（ＥｐｈＡ４−ＬＢＤ）の表面構造を示す。図１６において、色の濃い領域がＦａｂ結合領域に該当する。また、図中、結合領域に含まれるアミノ酸名と残基番号が該当する位置に示され、結合するＦａｂのＨ鎖およびＬ鎖のＣＤＲがリボンモデルで示される。

本発明は、ＥｐｈＡ４に結合する抗ＥｐｈＡ４抗体に関する。
本発明で使用される抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４を認識して結合することができる抗体であり、以下に述べるように、該抗体は、無傷の抗体であってもよいし、あるいは、ＥｐｈＡ４との結合親和性を有する限り、その抗原結合断片や合成抗体（例えば組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等）であってもよい。本発明において、ＥｐｈＡ４は、ヒト、マウス、ラットおよびサル由来のＥｐｈＡ４を指すものと理解することができる。ヒト、マウス、ラットおよびサル由来のＥｐｈＡ４は、米国生物工学情報センターが提供するＧｅｎｂａｎｋ等、配列情報が登録された公共のデータベースから入手できるほか、近縁関係にある動物種のＥｐｈＡ４の塩基配列情報を元にプライマーを設計し、所望の動物種から抽出したＲＮＡからクローニングすることで、ＥｐｈＡ４遺伝子の配列情報を入手することが可能である。例えば、ヒト、マウス、ラット、サルのＥｐｈＡ４の塩基配列情報は、それぞれＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００４４３８．４、ＮＭ＿００７９３６．３、ＮＭ＿００１１６２４１１．１、ＮＭ＿００１２６０８７０としてデータベース上に登録されている。

本発明の一態様において、ＥｐｈＡ４は、配列番号１に示すアミノ酸配列または当該アミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸が置換、付加および／または欠失したアミノ酸配列を含むか、または、配列番号３に示すアミノ酸配列または当該アミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸が置換、付加および／または欠失したアミノ酸配列を含む。本発明において、ＥｐｈＡ４に関して使用される「複数個」は、その元となる配列と同等の機能特性を保持する限り限定されないが、２個〜１００個、例えば２個〜９０個、２個〜８０個、２個〜７０個、２個〜６０個、２個〜５０個、２個〜４０個、２個〜３０個、２個〜２０個、２個〜１０個、または２個〜５個であるか、または、アミノ酸中のアミノ酸数の１０％以内、例えば９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、または５％以内である。

本発明の一態様において、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合する抗体である。「特異的な結合」という用語は、当該技術分野において当業者に周知の用語であり、抗体またはその抗原結合断片の、抗原やエピトープに対する特異的な結合を決定するための方法も周知である。本発明の一実施形態において、「特異的な結合」は、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片が、他の標的分子に結合するよりも、より大きな結合親和性、結合活性で、より迅速に、および／または、より長時間持続して、ＥｐｈＡ４に免疫学的反応により結合可能であると理解される。この関連で、ある標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、その他の標的に特異的に結合することを排除しない。本発明の別の実施形態において、「特異的な結合」は、ＥｐｈＡ４に対して少なくとも約１０^−７Ｍ、または少なくとも約１０^−８Ｍ、または少なくとも約１０^−９Ｍ、または少なくとも約１０^−１０Ｍ、または少なくとも約１０^−１１Ｍ、または少なくとも約１０^−１２Ｍ、またはそれ以上のＫＤを持つ抗体によって示されうる。また、本発明のさらに別の実施形態では、「特異的な結合」は、ＥｐｈＡ４と免疫学的反応により結合するが、Ｅｐｈレセプターの他のサブクラスおよびサブタイプとは実質的に結合しないと理解される。

本発明の一態様において、本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、ＥｐｈＡ４の細胞外領域に結合する抗体である。例えば、本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、配列番号２に示すアミノ酸配列または当該アミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸が置換、付加および／または欠失したアミノ酸配列を含むか、または配列番号４に示すアミノ酸配列または当該アミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸が置換、付加および／または欠失したアミノ酸配列を含む、ＥｐｈＡ４細胞外領域のいずれかの部位に結合する抗体または抗原結合断片であることができる。本発明において、ＥｐｈＡ４の細胞外領域に関して使用される「複数個」は、これに限定されるものではないが、２個〜５０個、例えば２個〜４５個、２個〜４０個、２個〜３５個、２個〜３０個、２個〜２５個、２個〜２０個、２個〜１５個、２個〜１０個、または２個〜５個であるか、または、アミノ酸中のアミノ酸数の１０％以内、例えば９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、または５％以内である。

本発明の一態様において、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合し、ＥｐｈＡ４とｅｐｈｒｉｎとの結合を阻害することができる。

本発明の一実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、ヒトＥｐｈＡ４、マウスＥｐｈＡ４、ラットＥｐｈＡ４、およびサルＥｐｈＡ４のうちの少なくとも１つに特異的に結合し、そのリガンドとの結合を阻害することができる。本発明の好ましい実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、ヒトＥｐｈＡ４、マウスＥｐｈＡ４、ラットＥｐｈＡ４、およびサルＥｐｈＡ４のうち２つ以上に特異的に結合し、そのリガンドとの結合を阻害することができる。本発明の別の好ましい実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、ヒトＥｐｈＡ４、マウスＥｐｈＡ４、ラットＥｐｈＡ４、およびサルＥｐｈＡ４の全てと特異的に結合し、そのリガンドとの結合を阻害することができる。

抗体またはその抗原結合断片の、抗原への結合特性（例えば、結合親和性および種交差反応性）を測定する方法は、当該技術分野において当業者に公知の方法を用いてよい。例えば、結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）バイオセンサー、ＫｉｎＥｘＡバイオセンサー、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ免疫測定法（ＩＧＥＮ社）、フローサイトメトリー、蛍光消光、蛍光転移、酵母ディスプレイ、および/または、免疫染色を使用して測定してよいが、これらに限定されない。抗体またはその抗原結合断片の、ＥｐｈＡ４とそのリガンドの結合に対する中和活性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）バイオセンサー、ＥＬＩＳＡ、および/または、フローサイトメトリーを使用して測定してよいが、これらに限定されない。

本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、ＥｐｈＡ４と結合する、好ましくは特異的に結合する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはそのＥｐｈＡ４結合断片のいずれであってもよい。

本発明において、本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ（またはこれらのサブクラス）等の任意のクラスであってよく、特定のクラスに限定されない。重鎖（Ｈ鎖と呼ぶこともある）の定常領域の抗体アミノ酸配列により、免疫グロブリンは、異なるクラスに分類される。５つの主な免疫グロブリンのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらの幾つかは、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１およびＩｇＡ_２というサブクラス（アイソタイプ）にさらに細分化され得る。異なるクラスの免疫グロブリンの対応する重鎖の定常領域は、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれている。また、抗体の軽鎖（Ｌ鎖と呼ぶこともある）の種類にはλ鎖およびκ鎖が存在する。

本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、ＩｇＧ抗体であってよく、例えば、ＩｇＧ_１抗体またはＩｇＧ_２抗体等であってよい。また、本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、場合により、単量体、二量体または多量体の形態であってよい。

本発明の一態様において、本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、異なるサブクラスのＩｇＧ抗体の組み合わせであってよく、例えば、ＩｇＧ_１抗体およびＩｇＧ_２抗体の組み合わせからなるＩｇＧ抗体等であってよい。

本明細書において、抗体の抗原結合断片は、当該抗体の機能的、構造的断片であって、当該抗体が結合可能な抗原に対する結合性を保持しているものであれば特に限定されない。抗体の抗原結合断片の例としては、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、１本鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の修飾構造体等が挙げられる。一態様において、本発明の抗体の結合断片は、Ｆ（ａｂ’）_２である。

抗体の抗原結合断片は、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼによる、完全な抗体のタンパク質消化を介して得ることができ、または組換え宿主細胞（例えば、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞等の真核生物、または、大腸菌等の原核生物）により直接産生させてもよい。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的に結合させることによってＦ（ａｂ’）_２断片を形成させてもよい。また、Ｆ（ａｂ’）_２は、Ｆ（ａｂ’）_２分子の組み立てを促進するロイシンジッパーＧＣＮ４を使用して形成させてもよい。また、ｓｃＦｖを化学合成技術で生産する場合には、自動合成機を使用することができる。ｓｃＦｖを遺伝子組換え技術で生産する場合には、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含む適切なプラスミドを、適切な宿主細胞（例えば、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞等の真核生物、または、大腸菌等の原核生物）に導入することができる。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーション等の周知の操作により作製してもよい。その結果生じるｓｃＦｖは、当該技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を使用して単離してもよい。

本発明において、抗体の可変領域は、抗体軽鎖の可変領域および／または抗体重鎖の可変領域を意味してよく、抗体の定常領域は、抗体軽鎖の定常領域および／または抗体重鎖の定常領域を意味してよい。重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、超可変領域としても知られる３つのＣＤＲにより連結される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲにより、近傍に保持されており、他方の鎖におけるＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。ＣＤＲを決定するための技術としては、限定はされないが、例えば、（１）異種間配列可変性に基づくアプローチ（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ ｅｄ．， １９９１， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）；および（２）抗原−抗体複合体の結晶構造学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２７３：９２７−９４８）が挙げられる。これらのアプローチや、他のアプローチを組合せて用いてもよい。重鎖の定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ部から構成されており、ＣＨ１、ヒンジ部、ＣＨ２、ＣＨ３の順序でアミノ末端（Ｎ末端）からカルボキシ末端（Ｃ末端）へ配置されている。軽鎖の定常領域は、１つのドメインＣＬで構成されている。

本発明において、モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体のポピュレーションから得られる抗体を意味してよい。すなわち、そのポピュレーションに含まれる個々の抗体は、若干存在し得る可能性のある天然の突然変異体を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一抗原部位に対するものであり、非常に特異的である。さらに、異なる抗原や異なるエピトープを標的とする典型的なポリクローナル抗体とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープを標的とするものである。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体ポピュレーションから得られる抗体の特性を示し、特定の方法による抗体の生産を必要とするものとして限定的に解されるべきではない。

本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、非ヒト哺乳動物（例えば、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ等）の抗体、または、それらのＥｐｈＡ４結合断片であってよい。キメラ抗体は、例えば、非ヒト（例えば、マウスまたはラット）抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域に導入した抗体であり、例えば、可変領域は非ヒト抗体由来、定常領域はヒト抗体由来となっている抗体を指してよい。ヒト化抗体は、例えば、非ヒト抗体の超可変領域（相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ））ともいう）をヒト抗体に導入した抗体であり、例えば、ＣＤＲは非ヒト抗体由来、それ以外の抗体領域はヒト抗体由来となっている抗体を指してよい。ただし、本発明において、キメラ抗体とヒト化抗体の境界は必ずしも明確である必要はなく、キメラ抗体ともヒト化抗体とも呼びうるような状態であってもよい。本発明において好ましいヒト化抗体の態様としては、ＣＤＲはげっ歯類抗体由来、それ以外の抗体領域はヒト抗体由来となっている抗体であり、特に好ましくは、ＣＤＲはマウス抗体由来、それ以外の抗体領域はヒト抗体由来となっている抗体である。ヒト化は、ＣＤＲ移植法（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ， Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（２００１） ａｎｄ Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６９−８３（２００５））を用いて行うことができる他、当該技術分野において公知の方法（例えばＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）を参照）を用いて、ＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列に対して置換することによっても行うことができる。ヒト化抗体は、典型的にはいくつかのＣＤＲ残基、および場合によってはいくつかのＦＲ残基が非ヒト抗体の類似した部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。

抗原性を減少させるためには、ヒト化抗体の作製において、軽鎖および重鎖の両方でヒト可変領域の使用を選択することが重要であり得る。「最良適合」法によれば、既知のヒトＦＲ配列の全ライブラリーに対して、げっ歯類抗体の可変領域の配列がスクリーニングされる。次に、げっ歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のヒトＦＲとして受け入れられる。例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：２２９６−２３０８（１９９３）およびＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１−９１７（１９８７）を参照されたい。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定の亜群の、全てのヒト抗体の共通配列に由来する特定のフレームワークが用いられる。いくつかの異なるヒト化抗体に対して、同じフレームワークが用いられ得る。例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｅｔ ＵＳＡ ８９：４２８５−４２８９（１９９２） ａｎｄ Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１ ：２６２３−２６３２（１９９３）を参照されたい。

さらに、ヒト化抗体は一般に、抗原に対する高い結合親和性およびその他の好ましい生物学的性質を保持されることが望ましい。この目標を達成するため、一方法によれば、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いた、親配列および様々な概念的ヒト化産物の分析工程によって調製される。一般に三次元の免疫グロブリンモデルが利用可能であり、当業者に知られている。選択された候補である免疫グロブリン配列の有望な三次元立体構造を模式化し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を検討することにより、候補である免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補である免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。この方法により、単数または複数の標的抗原（例えばＥｐｈＡ４またはその断片）に対する結合親和性の増大のような、望ましい抗体の特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント配列およびインポート配列から選択して、組み合わせることができる。

言うまでもなく、上記に例示したキメラ抗体またはヒト化抗体を、当該抗体の機能を保持させたまま（あるいは、当該抗体の機能を付加、向上させるために）適宜改変（例えば、抗体の修飾、または、抗体のアミノ酸配列の部分的な置換、付加および／または欠失）した抗体も、本発明の抗体に含まれる。より具体的には、抗体産生細胞により産生される抗体の不均一性を減少させるため、重鎖のカルボキシ末端（Ｃ末端）に位置するリシン（Ｌｙｓ）を遺伝子改変等の人為的方法によって欠失させた抗体も、本発明の範囲に含まれる。また、抗体のエフェクター機能を修飾するために定常領域のアミノ酸配列を改変した抗体も本発明の範囲に含まれ、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性および／または抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）活性を低下させるために、ヒトＩｇＧ_２抗体のＥｕ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２３４位のバリン（Ｖａｌ）がアラニン（Ａｌａ）に置換され、２３７位のグリシン（Ｇｌｙ）がアラニン（Ａｌａ）に置換された抗体等も本発明の範囲に含まれる。さらに、本発明の抗体のＣＤＲ配列を有する抗体結合部位と共に、異なる抗原に結合する抗原結合部位を併せ持つ二重特異性抗体（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２０１２），ｍＡｂｓ ４, １８２−９７）も本発明の範囲に含まれる。

本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、所望により、修飾してもよい。本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片の修飾は、（ａ）例えばシートまたはヘリックスコンホメーション等の、修飾領域におけるアミノ酸配列の三次元的な構造；（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性の状態；または、（ｃ）側鎖の容積の維持に対する修飾の効果、を変化させる修飾であってもよく、あるいはこれらの変化が明白に観察されないような修飾であってもよい。

本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片の修飾は、例えば、構成するアミノ酸残基の置換、欠失、付加等によって達成してよい。

本明細書において、アミノ酸とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸、例えばセリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）のみならず、アミノ酸変異体および誘導体といった、非天然アミノ酸も含まれる。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えばＬ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体、アミノ酸誘導体等の化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチン等、生体内でタンパク質の構成材料とならないアミノ酸；および当業者に公知のアミノ酸の特性を有する、化学的に合成された化合物等が挙げられることを当然に理解する。非天然アミノ酸の例としては、α−メチルアミノ酸（α−メチルアラニン等）、Ｄ−アミノ酸（Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸等）、ヒスチジン様アミノ酸（２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン等）、側鎖に余分なメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）および側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸等）等が挙げられる。

天然に存在するアミノ酸残基は、例えば、一般的な側鎖特性に基づいて、次のグループに分類され得る：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

抗体またはその抗原結合断片を構成するアミノ酸配列の非保存的置換は、これらのグループの１つに属するアミノ酸を他のグループに属するアミノ酸と交換することにより行ってもよい。より保存的な置換は、これらのグループの１つに属するアミノ酸を同一グループの他のアミノ酸と交換することにより行ってもよい。同様に、アミノ酸配列の欠失または置換を適宜行ってもよい。

抗体またはその抗原結合断片を構成するアミノ酸の修飾としては、例えば、糖によるグリコシル化、アセチル化またはリン酸化等の翻訳後修飾であってもよい。抗体は、その定常領域における保存された位置でグリコシル化され得る。抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ−結合型またはＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型は、アスパラギン残基の側鎖に対する糖質部分の結合を意味する。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−スレオニン、および、アスパラギン−Ｘ−システイン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に対する糖質部分を酵素的に付加するための認識配列である。これらのトリペプチド配列のいずれかが抗体またはその抗原結合断片に存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が存在する。Ｏ−結合型グリコシル化は、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、または、キシロースのいずれかの、ヒドロキシアミノ酸（例えば、セリンまたはスレオニン）への結合であってよく、場合により、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンへの結合であってもよい。グリコシル化の条件（グリコシル化を、生物学的手法を用いて行う場合には、例えば、宿主細胞や細胞培地の種類、ｐＨ等）を、当業者は目的に応じて適宜、選択することができる。

本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、さらに、当業者に公知の技術常識に基づいて、その他の修飾方法により、単独または組み合わせて、修飾されてよい。

本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、当業者に周知の方法によって産生されてよい。例えば、本発明のＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片を産生するハイブリドーマを用いて抗体を産生させてよく、もしくは、本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片をコードする遺伝子を発現ベクターに組み込み、当該発現ベクターを、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等に導入することによって抗体を産生させてもよい。本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片をコードする遺伝子は、シグナル配列をコードするＤＮＡを有すことが好ましく、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、および、軽鎖可変領域をコードするＤＮＡの５´末端にシグナル配列をコードするＤＮＡを有することがより好ましい。シグナル配列は、分泌タンパク質や膜内在性タンパク質が、リボソーム上で合成された後に、脂質２重層を通り抜けるのに必要な、タンパク質のＮ末端に存在するアミノ酸残基であり、本発明においては、この機能を有する配列であれば特に限定されるものではない。本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片が含み得るシグナル配列としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、ウマ、トリ、イヌ、ネコ、酵母等に由来するシグナル配列が挙げられる。シグナル配列の具体的な一態様としては、重鎖に関するシグナル配列としては、配列番号１０または配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられ、軽鎖に関するシグナル配列としては、配列番号１２または配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。また、機能的に同等であれば、配列番号１０で表されるアミノ酸配列、配列番号５５で表されるアミノ酸配列、配列番号１２で表されるアミノ酸配列または配列番号５８で表されるアミノ酸配列において、１または複数個（例えば２、３、４または５個）のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を有してもよい。

本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、当業者に公知の方法に従って、単離または精製されたものであってよい。ここで、「単離された」または「精製された」は、自然の状態から、人為的に単離されたか、精製されたことを意味する。分子または組成物が自然に発生したものである場合、それが変化したかもしくは本来の環境から除去されたか、またはその両方であるとき、それは「単離された」かまたは「精製された」である。単離または精製の方法の例としては、電気泳動的、分子生物学的、免疫学的またはクロマトグラフィー的手法等が挙げられ、具体的には、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、または、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー、あるいは、等電点電気泳動等が挙げられるがこれらに限定されない。

本発明の別の好ましい実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、以下のＣＤＲを有している：
（ａ）配列番号２６または配列番号２７に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；
（ｂ）配列番号２８または配列番号２９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；
（ｃ）配列番号３０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；
（ｄ）配列番号３１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；
（ｅ）配列番号３２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および
（ｆ）配列番号３３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３。
本発明の一実施態様において、前記抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり、好ましくはヒト化抗体である。

本発明の別の好ましい実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、以下のＣＤＲを有している：
（ａ）配列番号２６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；
（ｂ）配列番号２８に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；
（ｃ）配列番号３０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；
（ｄ）配列番号３１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；
（ｅ）配列番号３２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および
（ｆ）配列番号３３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３。

本発明の別の好ましい実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、以下のＣＤＲを有している：
（ａ）配列番号２７に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；
（ｂ）配列番号２９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；
（ｃ）配列番号３０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；
（ｄ）配列番号３１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；
（ｅ）配列番号３２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および
（ｆ）配列番号３３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３。

本発明の別の好ましい実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、重鎖および軽鎖を含んでおり、前記重鎖の可変領域は、配列番号１１に示すアミノ酸配列または当該配列において１個または複数個のアミノ酸が置換、付加および／または欠失したアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は、配列番号１３に示すアミノ酸配列または当該配列において１個または複数個のアミノ酸が置換、付加および／または欠失したアミノ酸配列を含んでいる。

本発明の別の好ましい実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、重鎖および軽鎖を含んでおり、前記重鎖の可変領域は、配列番号６６、６８、７０、７２、７４または７６に示すアミノ酸配列または当該配列において１個または複数個のアミノ酸が置換、付加および／または欠失したアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は、配列番号７８、８０、８２、または８４に示すアミノ酸配列または当該配列において１個または複数個のアミノ酸が置換、付加および／または欠失したアミノ酸配列を含んでいる。

ここで、本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片の重鎖可変領域または軽鎖可変領域に関して使用される「複数個」は、ＥｐｈＡ４に対する結合親和性を保持し、ＥｐｈＡ４とｅｐｈｒｉｎとの結合を阻害する限り限定されないが、２個〜１５個、より好ましくは２個〜１０個、例えば、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個または２個であり、またはアミノ酸配列中のアミノ酸数の１０％以内、例えば９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内または１％以内である。

本発明の別の好ましい実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んでおり、前記重鎖可変領域は、配列番号１１に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号１３に示すアミノ酸配列を含んでいる。

本発明の別の好ましい実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んでおり、前記重鎖の可変領域は、配列番号６６、６８、７０、７２、７４または７６に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は、配列番号７８、８０、８２、または８４に示すアミノ酸配列を含んでいる。

本発明の別の好ましい実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んでおり、
前記重鎖の可変領域は配列番号６６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号７８のアミノ酸配列を含むか、または、
前記重鎖の可変領域は配列番号６８のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号７８のアミノ酸配列を含むか、または、
前記重鎖の可変領域は配列番号７０のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号７８のアミノ酸配列を含むか、または、
前記重鎖の可変領域は配列番号７２のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号７８のアミノ酸配列を含むか、または、
前記重鎖の可変領域は配列番号７４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号７８のアミノ酸配列を含むか、または、
前記重鎖の可変領域は配列番号７６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号７８のアミノ酸配列を含む。

本発明の別の好ましい実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んでおり、
前記重鎖の可変領域は配列番号６６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８０のアミノ酸配列を含むか、または、
前記重鎖の可変領域は配列番号６８のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８０のアミノ酸配列を含むか、または、
前記重鎖の可変領域は配列番号７０のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８０のアミノ酸配列を含むか、または、
前記重鎖の可変領域は配列番号７２のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８０のアミノ酸配列を含むか、または、
前記重鎖の可変領域は配列番号７４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８０のアミノ酸配列を含むか、または、
前記重鎖の可変領域は配列番号７６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８０のアミノ酸配列を含む。

本発明の別の好ましい実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んでおり、
前記重鎖の可変領域は配列番号６６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８２のアミノ酸配列を含むか、または、
前記重鎖の可変領域は配列番号６８のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８２のアミノ酸配列を含むか、または、
前記重鎖の可変領域は配列番号７０のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８２のアミノ酸配列を含むか、または、
前記重鎖の可変領域は配列番号７２のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８２のアミノ酸配列を含むか、または、
前記重鎖の可変領域は配列番号７４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８２のアミノ酸配列を含むか、または、
前記重鎖の可変領域は配列番号７６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８２のアミノ酸配列を含む。

本発明の別の好ましい実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んでおり、
前記重鎖の可変領域は配列番号６６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８４のアミノ酸配列を含むか、または、
前記重鎖の可変領域は配列番号６８のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８４のアミノ酸配列を含むか、または、
前記重鎖の可変領域は配列番号７０のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８４のアミノ酸配列を含むか、または、
前記重鎖の可変領域は配列番号７２のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８４のアミノ酸配列を含むか、または、
前記重鎖の可変領域は配列番号７４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８４のアミノ酸配列を含むか、または、
前記重鎖の可変領域は配列番号７６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は配列番号８４のアミノ酸配列を含む。

本発明の特定の実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、ヒトＩｇＧ_２の定常領域を有している。好ましくは、前記ヒトＩｇＧ_２定常領域は、Ｃ１３１Ｓ、Ｃ２１９Ｓ、Ｖ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ（Ｅｕ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）から選択されるアミノ酸変異の少なくとも１つを有している。一実施形態において、前記ヒトＩｇＧ２定常領域は、Ｃ１３１ＳおよびＣ２１９Ｓのアミノ酸変異の組み合わせを有している。一実施形態において、前記ヒトＩｇＧ_２定常領域は、Ｖ２３４ＡおよびＧ２３７Ａのアミノ酸変異の組み合わせを有している。別の実施形態において、前記ヒトＩｇＧ_２定常領域は、Ｃ１３１Ｓ、Ｃ２１９Ｓ、Ｖ２３４ＡおよびＧ２３７Ａの全てのアミノ酸変異を有している。さらに別の態様において、前記ヒトＩｇＧ_２定常領域は、Ｃ末端リシン残基を有しない。

本発明の好ましい実施形態において、ヒトＩｇＧ_２の定常領域は、配列番号６２のアミノ酸配列を含んでいる。

本発明の特定の実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、ヒトＩｇＧ_１とヒトＩｇＧ_２の組み合わせからなるヒトＩｇＧ定常領域を有している。好ましくは、前記ヒトＩｇＧ定常領域は、ＣＨ１およびヒンジ部がヒトＩｇＧ_１であり、ＣＨ２およびＣＨ３がヒトＩｇＧ_２である。一実施形態において、前記ヒトＩｇＧ定常領域は、Ｖ２３４ＡまたはＧ２３７Ａ（Ｅｕ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）のアミノ酸変異を有している。別の態様において、前記ヒトＩｇＧ定常領域は、Ｖ２３４ＡおよびＧ２３７Ａのアミノ酸変異を有している。さらに別の態様において、前記ヒトＩｇＧ定常領域は、Ｃ末端リシン残基を有しない。

本発明の好ましい実施形態において、ヒトＩｇＧ_１とヒトＩｇＧ_２の組み合わせからなるヒトＩｇＧ定常領域は、配列番号６０のアミノ酸配列を含んでいる。

本発明は、一態様において、本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片を含む、医薬組成物に関する。

本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片を含む医薬組成物は、水性または乾燥製剤の形において、さらに、製薬学的に許容される担体、賦形剤、および／また、安定剤を含んでよい。許容される担体、賦形剤、および／または安定剤には、例えば生理食塩水；リン酸、クエン酸またはその他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；アミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリン類を含む、単糖類、二糖類、およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール類；ナトリウムのような、塩を形成する対イオン；またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が含まれる。

本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片を含む医薬組成物は、例えば、マイクロカプセル内、コロイド性薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、またはナノカプセル）内、またはマクロエマルション内に封入されてよい。抗体の投与を必要とするいずれの疾患にも適した放出特性を有する製剤において、抗体の持続放出投与が望まれる場合には、抗体のマイクロカプセル化が意図され得る。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸類、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩との共重合体、非分解性のエチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）のような、分解性の乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドから構成される、注射用ミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。

一態様によれば、本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、ＥｐｈＡ４とそのリガンドとの結合を阻害することができるため、本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片を含む医薬組成物は、ＡＬＳの治療に有用であり得る。すなわち、本発明は、他の態様において、治療上有効量の、本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片を対象に投与する工程を含む、ＡＬＳの治療方法を包含する。また、本発明は、他の態様において、ＡＬＳの治療薬を製造するための、本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片の使用を包含する。本発明は、他の態様において、ＡＬＳの治療する方法において使用するための抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片を包含する。

本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、治療法において単独か、または、その他の薬剤または組成物と併用して用いることができる。例えば本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、別の薬剤と同時または異時に投与されてよい。このような併用療法には、併用投与（同じかまたは別々の製剤に２以上の薬剤が含まれる）および分離投与（例えば同時にまたは連続的に）が含まれる。２以上の薬剤を別々に投与する場合、本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片の投与は、付随する治療法に先立つか、または続いて行われてよい。

本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片を含む医薬組成物を投与する対象は限定されず、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ等）に対して本発明を用いることができる。

本発明の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片を含む医薬組成物の対象への投与方法（投与経路、投与量、１日の投与回数、投与のタイミング、等）は限定されず、対象の健康状態、疾患の程度、併用する薬剤の種類等に応じて、当業者（例えば、医師）が適宜決定することができる。

技術的に矛盾しない限り、本明細書に記載の、あらゆる態様の任意の一または複数を、適宜組み合わせて、本発明を実施してよいことを当業者は理解する。さらに、技術的に矛盾しない限り、本明細書に記載の、好ましいまたは有利なあらゆる態様を、適宜組み合わせて、本発明を実施することが好ましいであろうことを当業者は理解する。

本明細書中に引用される文献は、参照により、それらのすべての開示が、明確に本明細書に援用されているとみなされるべきであって、当業者は、本明細書の文脈に従って、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、それらの文献における関連する開示内容を、本明細書の一部として援用して理解できる。

本明細書中に引用される文献は、本出願の出願日前の関連技術の開示のみを目的として提供され、本発明者らが、先行発明または任意の他の理由によって、かかる開示に先行する権利を持たないことを自認するものとして解釈されてはならない。これらの文献のすべての記述は、本出願人が入手可能であった情報に基づいており、これらの記述内容が正確であるという自認を何ら構成しない。

本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。

本明細書において用いられる「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記載された事項（部材、ステップ、要素または数字等）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素または数字等）が存在することを排除しない。「かならる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」および／または「実質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語で記載される態様を包含する。

本明細書において用いられる「中和活性」という用語は、ＥｐｈＡ４とそのリガンドの結合を阻害する活性、および／または、ＥｐｈＡ４がそのリガンドの結合によりヒト生体内で誘導する、シグナル伝達や、細胞の分子発現応答もしくは機能性変化を阻害する活性を意味する。

異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語および科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書および関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、または、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。

第１の、第２の等の用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はこれらの用語自身によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第１の要素を第２の要素と記し、同様に、第２の要素は第１の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。

本明細書において、成分含有量や数値範囲等を示すのに用いられる数値は、特に明示がない限り、用語「約」で修飾されているものと理解されるべきである。例えば、「４℃」とは、特に明示がない限り、「約４℃」を意味するものと理解され、その程度を、当業者は技術常識と本明細書の文意に従って、合理的に理解できることは当然である。

文脈上明白に他の意味を示す場合を除き、本明細書および請求の範囲で使用される場合、単数形で表される各態様は、技術的に矛盾しない限り、複数形であってもよいことが理解され、逆もまた真である。

以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。関連技術分野の当業者は、本発明の精神または範囲を変更させることなく、様々な改変、付加、欠失、置換等を伴って本発明を実施できる。

実施例１：抗マウスＥｐｈＡ４モノクローナル抗体の作製
マウス抗マウスＥｐｈＡ４モノクローナル抗体の作製
マウスＥｐｈＡ４（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿０３１９６２．２、配列番号１）に結合するモノクローナル抗体を作製するため、マウスＥｐｈＡ４の細胞外領域（２０〜５４７位）（配列番号２）に分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）およびヒスチジンタグを融合したタンパク質（以下、「マウスＥｐｈＡ４細胞外領域−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓタンパク質」という、配列番号４３）を以下の工程により調製した。

まず、マウスＥｐｈＡ４のシグナル配列（配列番号４２）と細胞外領域（配列番号２）をコードするＤＮＡ配列をマウスの脳由来のＴｏｔａｌ ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、ＳＥＡＰ、およびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列を有するｐＥＮＴＲ１Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＳａｌＩ／ＮｏｔＩサイトにクローニングした。次に、マウスＥｐｈＡ４のシグナル配列と細胞外領域、ＳＥＡＰ、およびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列をＧａｔｅｗａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＬＲ反応により、ｐｃＤＮＡ３．１＿ｒｆｃＢベクターに移し、ｐｃＤＮＡ３．１−マウスＥｐｈＡ４細胞外領域−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓ発現ベクターを構築した。構築したｐｃＤＮＡ３．１−マウスＥｐｈＡ４細胞外領域−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓ発現ベクターを、ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１ （ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へ形質移入した。６日間のインキュベーション（５％ＣＯ_２、３７℃）の後、培養上清を回収した。回収した培養上清より、マウスＥｐｈＡ４細胞外領域−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓタンパク質（配列番号４３）を、Ｐｒｏｔｉｎｏカラム（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いて精製した。

２０μｇのマウスＥｐｈＡ４細胞外領域−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓタンパク質を、同量のＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄアジュバント（ＴｉｔｅｒＭａｘ ＵＳＡ）、あるいはＧＥＲＢＵアジュバント（ＧＥＲＢＵ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ）と混合し、Ｂａｌｂ／ｃマウスの足蹠へ皮下注射した。その後、３、７、および１０日目に同様にマウスＥｐｈＡ４細胞外領域−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓタンパク質を投与した。このとき、ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄアジュバント（ＴｉｔｅｒＭａｘ ＵＳＡ）は１０日目のみ、ＧＥＲＢＵアジュバント（ＧＥＲＢＵ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ）は３、７、および１０日目に使用した。１３日目にマウスを屠殺し（ｓａｃｒｉｆｉｃｅｄ）、末梢リンパ節を回収してリンパ節細胞を調製した。ＧｅｎｏｍｅＯＮＥ−ＣＦ（Ｉｓｈｉｈａｒａ Ｓａｎｇｙｏ Ｋａｉｓｈａ，Ｌｔｄ．）の存在下で、調製したリンパ節細胞とＰ３Ｕ１ミエローマ細胞（京都大学より分与）とを５：１の割合で融合した。前記融合細胞は、９６ウェルプラスチックプレートで培養した。７日間のインキュベーション（５％ＣＯ_２、３７℃）の後、培養上清を回収した。

得られた培養上清を用いて、マウス、ラットおよびヒトＥｐｈＡ４に対する反応性、ならびに、マウスＥｐｈＡ４とマウスＥｐｈｒｉｎＡ１との結合阻害活性を有するウェルをピックアップした。

マウス、ラットおよびヒトのＥｐｈＡ４に対する反応性は、マウスＥｐｈＡ４の細胞外領域、ラットＥｐｈＡ４（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿００１１５５８８３．１）の細胞外領域（２０〜５４７位）またはヒトＥｐｈＡ４（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿００４４２９．１、配列番号３）の細胞外領域（２０〜５４７位）（配列番号４）に対して、ヒトＩｇＧ_１のＦｃ領域とヒスチジンタグを融合したタンパク質（以下、それぞれ「マウスＥｐｈＡ４細胞外領域−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質」、「ラットＥｐｈＡ４細胞外領域−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質」または「ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質」という）を用い、ＥＬＩＳＡにて評価した。

マウス、ラットまたはヒトＥｐｈＡ４細胞外領域−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質は、以下の工程により調製した。最初に、ｐｃＤＮＡ３．１−マウス、ラットまたはヒトＥｐｈＡ４細胞外領域−Ｆｃ−Ｈｉｓ発現ベクターを構築した。まず、マウス、ラットまたはヒトＥｐｈＡ４のシグナル配列と細胞外領域をコードするＤＮＡ配列をマウス、ラットまたはヒトの脳由来のＴｏｔａｌ ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、ＦｃおよびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列を有するｐＥＮＴＲ１Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＳａｌＩ／ＮｏｔＩサイトにクローニングした。次に、マウス、ラットまたはヒトのＥｐｈＡ４のシグナル配列と細胞外領域、ＦｃおよびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列をＧａｔｅｗａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＬＲ反応により、ｐｃＤＮＡ３．１＿ｒｆｃＢベクターに移し、ｐｃＤＮＡ３．１−マウス、ラットまたはヒトＥｐｈＡ４細胞外領域−Ｆｃ−Ｈｉｓ発現ベクターを構築した。構築したこれらの発現ベクターを、ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へ形質移入した。６日間のインキュベーション（５％ＣＯ_２、３７°Ｃ）の後、培養上清を回収した。

マウス、ラットまたはヒトＥｐｈＡ４細胞外領域−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質を用いたＥＬＩＳＡは、以下の工程に従って行った。抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１ｘブロックエース（大日本製薬）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ナカライテスク）で３回洗浄した後、各ウェルにマウス、ラットまたはヒトＥｐｈＡ４細胞外領域−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質を含む培養上清を加え（最終濃度１ｎＭ）、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、各ウェルに前記融合細胞の培養上清を添加した。室温にて１時間インキュベートして３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、各ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ）溶液を加え、５〜２０分、室温にてインキュベートした。各ウェルに等量の反応停止溶液（２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

マウスＥｐｈＡ４とマウスＥｐｈｒｉｎＡ１との結合阻害活性の評価は、以下の工程に従って行った。抗アルカリフォスファターゼ抗体（Ｓｅｒａｄｙｎ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１ｘブロックエース（大日本製薬）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ナカライテスク）で３回洗浄した後、ウェルにマウスＥｐｈＡ４細胞外領域−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓタンパク質を加え（最終濃度１０ｎＭ）、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＥｐｈｒｉｎＡ１−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、最終濃度２０ｎＭ）と前記融合細胞の培養上清を添加した。室温にて１時間インキュベートして３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ）溶液を加え、５〜２０分、室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

上記工程を経てピックアップしたウェルより限界希釈法にてハイブリドーマをクローニングし、最終的にマウス、ラットおよびヒトのＥｐｈＡ４に対する反応活性を有し、かつ、マウスＥｐｈＡ４とマウスＥｐｈｒｉｎＡ１との結合阻害活性を有するマウス抗ＥｐｈＡ４抗体を発現するハイブリドーマクローンを得た。

得られたハイブリドーマクローンを培養し、培養上清からＰｔｏｔｅｉｎ Ａ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて抗ＥｐｈＡ４抗体（抗体Ａ）を精製した。抗体Ａのアイソタイプは、モノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｓｅｒｏｔｅｃ）にて決定し、重鎖に対してはＩｇＧ_１、軽鎖に対してはκであった。

抗体Ａの配列解析
抗体Ａの重鎖および軽鎖のシグナル配列、および可変領域をコードするＤＮＡ配列を、５’−ＲＡＣＥ（５’−ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法によって増幅した。前記ハイブリドーマから、ＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて全ＲＮＡを調製し、ＤＮａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ， ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ ｓｅｔ）で処理した。ｃＤＮＡ合成キット（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、前記全ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製した。オリゴＤＮＡ ａｄ２９Ｓ（ACATCACTCCGT）（配列番号５）およびオリゴＤＮＡ ａｄ２９ＡＳ（ACGGAGTGATGTCCGTCGACGTATCTCTGCGTTGATACTTCAGCGTAGCT）（配列番号６）のアニーリングによって得られた５’アダプターを前記ｃＤＮＡに付加した。得られたｃＤＮＡを、５’フォワードプライマー（５’−ＰＣＲ４ ｐｒｉｍｅｒ，AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG) （配列番号７）および３’リバースプライマー（マウスＩｇＧ重鎖の増幅にはGCCAGTGGATAGACTGATGG（配列番号８）を用い、マウスＩｇκ軽鎖の増幅にはGATGGATACAGTTGGTGCAGC（配列番号９）を用いた）によって増幅した。増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に挿入した。抗体Ａの遺伝子配列を、ＡＢＩ３１３０ＸＬを用いて解析した。本解析によって同定された抗体Ａの遺伝子配列にコードされたアミノ酸配列として、重鎖シグナル配列は配列番号１０であり、重鎖可変領域は配列番号１１であり、軽鎖シグナル配列は配列番号１２であり、軽鎖可変領域は配列番号１３である。抗体Ａの遺伝子配列をコードするヌクレオチド配列として、重鎖シグナル配列は配列番号１４であり、重鎖可変領域は配列番号１５であり、軽鎖シグナル配列は配列番号１６であり、軽鎖可変領域は配列番号１７である。

抗体Ａの重鎖および軽鎖の全長配列は、以下の工程により取得した。前記ハイブリドーマから、ＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて全ＲＮＡを調製し、ＤＮａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ， ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ ｓｅｔ）で処理した。ｃＤＮＡ合成キット（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、前記全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡを鋳型に用い、抗体Ａの重鎖および軽鎖をコードする遺伝子配列を５’フォワードプライマー（重鎖の増幅にはGCGAAGCTTGCCGCCACCATGGCTTGGGTGTGGACCTTGC（配列番号１８）を使用し、軽鎖の増幅にはGCGAAGCTTGCCGCCACCATGAGTGTGCCCACTCAGGTCC（配列番号１９）を使用した）と３’リバースプライマー（重鎖の増幅にはGCGGAATTCATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC（配列番号２０）を使用し、軽鎖の増幅にはCGCGAATTCACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGAC（配列番号２１）を使用した）を用いて、ＰＣＲにて増幅し、ｐＥＥ６．４、およびｐＥＥ１２．４ベクター（Ｌｏｎｚａ）にそれぞれクローニングした。遺伝子配列を、ＡＢＩ３１３０ＸＬを用いて解析した。本解析によって同定された抗体Ａの遺伝子配列にコードされたアミノ酸配列として、重鎖定常領域は配列番号２２であり、軽鎖定常領域は配列番号２３である。抗体Ａの遺伝子配列をコードするヌクレオチド配列として、重鎖定常領域は配列番号２４であり、軽鎖定常領域は配列番号２５である。

抗体ＡのＣＤＲは、抗体Ａのアミノ酸配列をＫａｂａｔの番号付システム（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）に従い、Ａｂｙｓｉｓソフトフェア（ＵＣＬ）を用いて番号付けし、この番号を基に、ＣＤＲの同定のためのＫａｂａｔの定義（Ｋａｂａｔ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）、または、ＡｂＭの定義法（ＡｂＭ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）に従って決定した。抗体ＡのＣＤＲのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を表１および表２にそれぞれ示した。

実施例２：抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のマウスおよびヒトＥｐｈＡ４に対する結合親和性
実施例１で得た抗体ＡのマウスおよびヒトＥｐｈＡ４に対する結合親和性をＢｉａｃｏｒｅ Ａ１００(ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ法）により決定した。まず、マウスＩｇＧ_１抗体をラットに免疫して常法により作製したラット抗マウスＩｇＧ_１抗体をセンサーチップＣＭ５へ固定化した。ラット抗マウスＩｇＧ_１抗体のセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、および、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いた（センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）。固定化用緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ４．５）を用いて１−２μｇ／ｍＬに希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ａ１００付属のプロトコルに従い、センサーチップ上に固定した。抗体Ａをランニング緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＢＲ−１００１−８８）を用いて希釈し、フローセル上に１２０秒間送液しキャプチャーさせた（７０−１００ＲＵ程度のキャプチャー量）。続いてＨＢＳ−ＥＰを用いて５０，２５，１２．５，６．３，３．１，１．６，０．８，０ｎＭの範囲で系列希釈したマウスもしくはヒトＥｐｈＡ４細胞外領域−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓを１２０秒間センサーチップに添加し、添加時（結合相，１２０秒間）、および、添加終了後（解離相，９００秒間）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、３Ｍ ＭｇＣｌ_２（３０秒間、和光純薬）を添加してセンサーチップを再生した。得られた結合反応曲線に対して、システム付属ソフトＢＩＡ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、マウスおよびヒトのＥｐｈＡ４に対する結合親和性（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を算出した。

抗体ＡのマウスおよびヒトＥｐｈＡ４に対する結合親和性（ＫＤ値）は、それぞれ７．２９×１０^−１０Ｍ，６．６１×１０^−１０Ｍであった（図１）。マウスおよびヒトＥｐｈＡ４に対するその他の結合パラメータもほぼ同程度であった。よって、抗体Ａは、マウスおよびヒトのＥｐｈＡ４に対して同程度の結合親和性を持つと考えられる。

実施例３：抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のマウスＥｐｈＡ４−マウスリガンド結合阻害活性
実施例１で得た抗体Ａについて、マウスＥｐｈＡ４とマウスリガンドとの結合阻害活性の評価は、以下の工程に従って行った。抗アルカリフォスファターゼ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で３回洗浄した後、ウェルに実施例１の方法で得たマウスＥｐｈＡ４細胞外領域−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓタンパク質を加え（最終濃度１０ｎＭ）、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにリガンドと系列希釈した抗体Ａ（０，０．００１，０．００３，０．０１，０．０３，０．１，０．３，１，３，１０，３０，１００，３００，１０００ｎＭ）、ＥｐｈＡ４阻害薬として知られるＫＹＬペプチド（ＫＹＬＰＹＷＰＶＬＳＳＬ、０，０．００３，０．０１，０．０３，０．１，０．３，１，３，１０，３０，１００μＭ、北海道システム・サイエンスに委託合成）および化合物１（０，０．０３，０．１，０．３，１，３，１０，３０，１００，３００，１０００μＭ、式１、Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。なお、リガンドにはマウスＥｐｈｒｉｎＡ１−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、最終濃度２０ｎＭ）およびマウスＥｐｈｒｉｎＢ２−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、最終濃度０．６ｎＭ）を用いた。室温にて１時間インキュベートして３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ）溶液を加え、２分、室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

式１
抗体Ａは、マウスＥｐｈＡ４とマウスリガンドとの結合を濃度依存的に抑制し、マウスＥｐｈｒｉｎＡ１、ＥｐｈｒｉｎＢ２結合に対するＩＣ_５０値はそれぞれ約１．２、１．２ｎＭであった。既存のＥｐｈＡ４阻害薬であるＫＹＬペプチドの、マウスＥｐｈｒｉｎＡ１、ＥｐｈｒｉｎＢ２結合に対するＩＣ_５０値は、それぞれ約１．３、１．３μＭであった（図２）。化合物１は、さらに活性は弱く、濃度依存性も認められなかった。よって、抗体ＡはマウスＥｐｈＡ４とマウスリガンドとの結合を阻害し、その活性は既存のＥｐｈＡ４阻害薬であるＫＹＬペプチドと比較して１，０００倍以上活性が強いことが示された。

実施例４：抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のヒトＥｐｈＡ４−ヒトリガンド結合阻害活性
実施例１で得た抗体Ａについて、ヒトＥｐｈＡ４とヒトリガンドとの結合阻害活性の評価は、以下の工程に従って行った。抗アルカリフォスファターゼ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で３回洗浄した後、ウェルに実施例１の方法で得たヒトＥｐｈＡ４細胞外領域−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓタンパク質を加え（最終濃度１０ｎＭ）、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにリガンドと系列希釈した抗体Ａ（０，０．００３，０．０１，０．０３，０．１，０．３，１，３，１０，３０，１００，３００，１０００，３０００ｎＭ）、ＥｐｈＡ４阻害薬であるＫＹＬペプチド（ＫＹＬＰＹＷＰＶＬＳＳＬ、０，０．００３，０．０１，０．０３，０．１，０．３，１，３，１０，３０，１００３００，１０００，３０００μＭ、東レリサーチセンターに委託合成）を添加した。なお、リガンドにはビオチン化ヒトＥｐｈｒｉｎＡ５−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、最終濃度０．７ｎＭ）およびビオチン化ヒトＥｐｈｒｉｎＢ３−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、最終濃度２．３ｎＭ）を用いた。室温にて１時間インキュベートして３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ）溶液を加え、２分、室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖｉｃｅｓまたはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

抗体Ａは、ヒトＥｐｈＡ４とヒトリガンドとの結合を濃度依存的に抑制し、ヒトＥｐｈｒｉｎＡ５、ＥｐｈｒｉｎＢ３結合に対するＩＣ_５０値はそれぞれ約２．７、１．９ｎＭであった。ＥｐｈＡ４阻害薬であるＫＹＬペプチドの、ヒトＥｐｈｒｉｎＡ５、ＥｐｈｒｉｎＢ３結合に対するＩＣ_５０値は、それぞれ約６．１、１．６μＭであった（図３）。よって、抗体ＡはヒトＥｐｈＡ４とヒトリガンドとの結合も強く阻害することが示された。

実施例５：ＥｐｈＡ４結合断片のマウスおよびヒトＥｐｈＡ４に対する結合親和性
まず、ＥｐｈＡ４結合断片として、抗体ＡのＦａｂ断片とＦ（ａｂ’）_２断片（以下、それぞれ抗体Ａ−Ｆａｂ、抗体Ａ−Ｆ（ａｂ’）_２と記載）を調製した。

抗体Ａ−Ｆａｂの調製は、以下の工程に従って行った。１．５ｍＬチューブ（エッペンドルフ）に抗体Ａ（４．３６ｍｇ／ｍＬ，１ｍＬ）、１０ｍＭ Ｌシステイン（和光純薬）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）および２．１８μｇ／ｍＬパパイン（Ｓｉｇｍａ）を混合し、３７℃で１２時間インキュベートした。インキュベート後のチューブに対し、終濃度が５０ｍＭとなるようにｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ（和光純薬）を加えた。反応停止後、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）に対して透析を行い、抗体溶液に０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ）−ＨＣｌ／５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０、和光純薬）を等量加えてからｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦ ｒｅｓｉｎを用いた精製を行った。ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦ ８００ｕＬを２ｍＬチューブに充填し、超純水、Ｂｉｎｄｉｎｇバッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ）−ＨＣｌ／３Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０、和光純薬））の順に３．５Ｃ．Ｖ．ずつ添加してｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦを平衡化させた。抗体溶液に０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ）−ＨＣｌ／５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０、和光純薬）を等量加えたものをカラムに通し、カラムから溶出された溶液（スルー）を回収し再度カラムに添加、この操作を３度繰り返した後、最後にスルーを回収した。さらに、Ｂｉｎｄｉｎｇバッファー２．５ｍＬを加えて洗浄を２回繰り返した。スルーおよび洗浄画分をＰＢＳに対して透析することで、抗体Ａ−Ｆａｂを得た。

抗体Ａ−Ｆ（ａｂ’）_２の調製は、以下の工程に従って行った。抗体Ａを０．２Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０、和光純薬）に対して一晩、４℃で透析した。透析した溶液を回収し、０．２２μｍフィルトレーション（Ｍｉｌｌｐｏｒｅ）を行い、その後に定量し、抗体濃度が４．０ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。ペプシン（Ｓｉｇｍａ）を室温に戻し、０．２Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０、和光純薬）を用いて２．０ｍｇ／ｍＬに調製した。１．５ｍＬチューブ（エッペンドルフ）に抗体Ａ（４．０ｍｇ／ｍＬ，８００μＬ）、ペプシン溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ，１６μＬ）および０．２Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０、和光純薬）を６４μＬ／チューブで混合し、３７℃で１５時間インキュベートした。インキュベート後のチューブに対し、２Ｍ Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を１１２μＬ／チューブで加え反応停止後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子種を確認した。反応停止後、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析した。つづいてｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，１７−１２７９−０２）を用いて抗体Ａ−Ｆ（ａｂ’）_２の精製を行った。ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ｒｅｓｉｎ １ｍＬを５ｍＬチューブに充填し、超純水、Ｂｉｎｄｉｎｇバッファーの順に３．５Ｃ．Ｖ．ずつ添加してｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦを平衡化させた。透析後に透析した溶液に０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ）−ＨＣｌ／５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０、和光純薬）を等量加えて平衡化した抗体溶液をカラムに通し、スルーを回収し再度カラムに添加する操作を３度繰り返し、最後にスルーを回収した。さらに、Ｂｉｎｄｉｎｇバッファー ５ｍＬを加え、洗浄を２回繰り返した。未反応のＩｇＧ等を除去するため０．１Ｍ Ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ３．０、和光純薬）で溶出した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子種を確認した。スルーおよび洗浄画分をＰＢＳに対して透析することで、抗体Ａ−Ｆ（ａｂ’）_２を得た。

次に、抗体Ａ−Ｆａｂおよび抗体Ａ−Ｆ（ａｂ’）_２のマウスおよびヒトＥｐｈＡ４に対する結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ法）により決定した。実施例１で得た抗体Ａを各々の比較対照とした。まず、抗Ｈｉｓタグ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をセンサーチップＣＭ５へ固定化した。抗Ｈｉｓタグ抗体のセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、および、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いた（センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）。固定化用緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ４．５）を用いて３μｇ／ｍＬに希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００付属のプロトコルに従い、センサーチップ上に固定した。

マウスもしくはヒトＥｐｈＡ４細胞外領域−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓタンパク質をランニング緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＢＲ−１００１−８８）を用いて希釈し、フローセル上に１２０秒間送液しキャプチャーさせた（このとき１０−２０ＲＵ程度のキャプチャー量）。続いてＨＢＳ−ＥＰを用いて系列希釈した抗体Ａ（５０，１６．７，５．６，１．９，０．６，０ｎＭ）、抗体Ａ−Ｆａｂ（５００，１６６．７，５５．６，１８．５，６．２，０ｎＭ）および抗体Ａ−Ｆ（ａｂ’）_２（５０，１６．７，５．６，１．９，０．６，０ｎＭ）を１２０秒間センサーチップに添加し、添加時（結合相，１２０秒間）、および、添加終了後（解離相，９００秒間）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、３Ｍ ＭｇＣｌ_２（３０秒間、和光純薬）を添加してセンサーチップを再生した。得られた結合反応曲線に対して、システム付属ソフトＢＩＡ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、マウスおよびヒトのＥｐｈＡ４に対する結合親和性（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を算出した。

抗体Ａ−ＦａｂのマウスおよびヒトＥｐｈＡ４に対する結合親和性（ＫＤ値）は、それぞれ４．５１×１０^−８Ｍ、４．０４×１０^−８Ｍであった（図４Ａ，図４Ｃ）。一方で、抗体Ａ−Ｆ（ａｂ’）_２のマウスおよびヒトＥｐｈＡ４に対する結合親和性（ＫＤ値）は、それぞれ２．２９×１０^−１１Ｍ、５．３０×１０^−１１Ｍであった（図４Ｂ，図４Ｄ）。

実施例６：ＥｐｈＡ４結合断片のＥｐｈＡ４−リガンド結合阻害活性
実施例５で得た抗体Ａ−Ｆａｂおよび抗体Ａ−Ｆ（ａｂ’）_２について、ＥｐｈＡ４とリガンドとの結合阻害活性の評価は、以下の工程に従って行った。抗アルカリフォスファターゼ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で３回洗浄した後、ウェルに実施例１の方法で得たマウスＥｐｈＡ４細胞外領域−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓタンパク質を加え（最終濃度１０ｎＭ）、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにリガンドと系列希釈した抗体Ａ（０，０．００３，０．０１，０．０３，０．１，０．３，１，３，１０，３０，１００，３００，１０００，３０００ｎＭ）、抗体Ａ−Ｆａｂ（０，０．００３，０．０１，０．０３，０．１，０．３，１，３，１０，３０，１００，３００，１０００，３０００ｎＭ）、抗体Ａ−Ｆ（ａｂ’）_２（０，０．００３，０．０１，０．０３，０．１，０．３，１，３，１０，３０，１００，３００，１０００，３０００ｎＭ）、およびＥｐｈＡ４阻害薬であるＫＹＬペプチド（ＫＹＬＰＹＷＰＶＬＳＳＬ、０，０．０００３，０．００１，０．００３，０．０１，０．０３，０．１，０．３，１，３，１０，３０，１００，３００，１０００，３０００μＭ，東レリサーチセンターに委託合成）を添加した。なお、リガンドにはビオチン化マウスＥｐｈｒｉｎＢ２−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、最終濃度２．５ｎＭ）を用いた。室温にて１時間インキュベートして３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ）溶液を加え、２分、室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖｉｃｅｓまたはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

抗体Ａ（抗体Ａ−ＩｇＧ）、抗体Ａ−Ｆａｂ、抗体Ａ−Ｆ（ａｂ’）_２およびＫＹＬペプチドのＩＣ_５０値はそれぞれ２．６（あるいは３．６）、４３８．５、２．９ｎＭ、５．２９３μＭであった（図５）。ＫＹＬペプチドと比較すると、抗体Ａおよび抗体Ａ−Ｆ（ａｂ’）_２は、１０００倍以上の活性を持ち、抗体Ａ−ＦａｂにおいてもＫＹＬペプチドと比較すると１０倍以上の活性を有していた。

実施例７：抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のヒトＥｐｈレセプターに対する選択性
実施例１に記載の方法に従って、ヒトの各Ｅｐｈレセプター（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ６）のシグナル配列と細胞外領域をコードするＤＮＡ配列を組織由来のＴｏｔａｌ ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、ヒトＩｇＧ_１のＦｃ領域およびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列を有するｐＥＮＴＲ１Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。次に、ヒトの各Ｅｐｈレセプターのシグナル配列と細胞外領域、ＦｃおよびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列をＧａｔｅｗａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＬＲ反応により、ｐｃＤＮＡ３．１＿ｒｆｃＢベクターに移し、ヒトの各Ｅｐｈレセプターの細胞外領域に対してヒトＩｇＧ_１のＦｃ領域とＨｉｓタグを融合したタンパク質（「Ｅｐｈレセプター細胞外領域−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質」という）を発現するベクター（「Ｅｐｈレセプター細胞外領域−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質発現ベクター」という）を構築した。

次に、１０ｃｍディッシュ（ファルコン）にＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞(Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｉｓ)を播種して３７℃で１日培養した。上記で得られたヒトの各Ｅｐｈレセプター細胞外領域−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質発現ベクターを、ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞へ形質移入した。４日間のインキュベーション（５％ＣＯ_２、３７℃）の後、培養上清を回収し、室温で１５００ｒｐｍ、５分間遠心した。遠心上清を０．２２μｍフィルター(Ｍｉｌｌｐｏｒｅ)でろ過し、Ｈｅｐｅｓ(ＤＯＪIＮＤＯ)とアジ化ナトリウム(和光純薬)がそれぞれ最終濃度２０ｍＭ、０．０２％となるように加えた。

抗体Ａについて、ヒトＥｐｈレセプターの結合活性の評価は、以下の工程に従って行った。
ロバ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ナカライ）で３回洗浄した後、各ウェルにヒトの各Ｅｐｈレセプター細胞外領域‐Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質（最終濃度１ｎＭ）を播種し、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにヒトＩｇＧ溶液（１００μｇ／ｍＬ、三菱ウェルファーマ）および抗体Ａ（１０μｇ／ｍＬ）を添加し、室温にて１時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ロバ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ）溶液を加え、適度な発色を確認したらウェルに等量の反応停止溶液（１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。
抗体Ａは、ヒトＥｐｈレセプターファミリー間ではヒトＥｐｈＡ４にのみ特異的に反応活性を有していた（図６Ａ）。

実施例８：抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のマウスＥｐｈレセプターに対する選択性
実施例１に記載の方法に従って、マウスの各Ｅｐｈレセプター（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ６）のシグナル配列と細胞外領域をコードするＤＮＡ配列を組織由来のＴｏｔａｌ ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、ヒトＩｇＧ_１のＦｃ領域およびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列を有するｐＥＮＴＲ１Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。次に、マウスの各Ｅｐｈレセプター（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ６）のシグナル配列と細胞外領域、ＦｃおよびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列をＧａｔｅｗａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＬＲ反応により、ｐｃＤＮＡ３．１＿ｒｆｃＢベクターに移し、マウスの各Ｅｐｈレセプターの細胞外領域−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質発現ベクターを構築した。マウスＥｐｈＡ２の細胞外領域−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質発現ベクターの構築では、マウスＥｐｈＡ２のシグナル配列と細胞外領域をコードするＤＮＡ配列を組織由来のＴｏｔａｌ ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、ＦｃおよびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列を有するｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングして、マウスＥｐｈＡ２細胞外領域−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質発現ベクターを構築した。

次に、１０ｃｍディッシュ（ファルコンまたはＢＤバイオサイエンス）にＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞(Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｉｓ)を播種して３７℃で１日培養した。上記のようにして得られたマウスＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ１０、 ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ６細胞外領域−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質発現ベクターを、ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞へ形質移入した。４日間のインキュベーション（５％ＣＯ_２、３７℃）の後、培養上清を回収し、室温で１５００ｒｐｍ、５分間遠心した。遠心上清を０．２２μｍフィルター(Ｍｉｌｌｐｏｒｅ)でろ過し、Ｈｅｐｅｓ(ＤＯＪIＮＤＯ)とアジ化ナトリウム(和光純薬)がそれぞれ最終濃度２０ｍＭ、０．０２％となるように加えた。

抗体Ａについて、マウスＥｐｈレセプターの結合活性の評価は、以下の工程に従って行った。
ロバ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で３回洗浄した後、各ウェルにマウスの各Ｅｐｈレセプター細胞外領域‐Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質（最終濃度１ｎＭ）を播種し、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにヒトＩｇＧ溶液（１００μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）および抗体Ａ（１０μｇ／ｍＬ）を添加し、室温にて１時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ロバ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ）溶液を加え、適度な発色を確認したらウェルに等量の反応停止溶液（１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。
抗体Ａは、マウスＥｐｈレセプターファミリー間ではマウスＥｐｈＡ４にのみ特異的に反応活性を有していた（図６Ｂ）。

実施例９：抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のマウス、ラット、サルおよびヒトＥｐｈＡ４に対する反応性
マウス、ラット、サルおよびヒトＥｐｈＡ４細胞外領域−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質の作製は、以下の工程に従って行った。まず、実施例１に記載の方法に従って、サルＥｐｈＡ４細胞外領域−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質発現ベクターを構築した。ベクター構築において利用するサルＥｐｈＡ４のアミノ酸配列を配列番号４４、その細胞外領域は配列番号４５として示す。次に１０ｃｍディッシュ（ファルコン）にＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞(Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｉｓ)を播種して３７℃で1日培養した。サルＥｐｈＡ４細胞外領域−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質発現ベクター、および実施例１に記載のマウスＥｐｈＡ４、ラットＥｐｈＡ４およびヒトＥｐｈＡ４細胞外領域−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質発現ベクターを、ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１ （ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞へ形質移入した。４日間のインキュベーション（５％ＣＯ_２、３７℃）の後、培養上清を回収し、室温で１５００ｒｐｍ、５分間遠心した。遠心上清を０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｐｏｒｅ） でろ過し、Ｈｅｐｅｓ（ＤＯＪＩＮＤＯ）とアジ化ナトリウム(和光純薬)がそれぞれ最終濃度２０ｍＭ、０．０２％となるように加えた。

抗体Ａについて、各種Ｅｐｈレセプターの結合活性の評価は、以下の工程に従って行った。
ロバ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１％ブロックエース（大日本製薬）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ナカライテスク）で３回洗浄した後、ウェルにマウス、ラット、サルおよびヒトＥｐｈＡ４細胞外領域−Ｆｃ−Ｈｉｓタンパク質（最終濃度１ｎＭ）を播種し、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにヒトＩｇＧ溶液（１００μｇ／ｍＬ、三菱ウェルファーマ）および抗体Ａ（０，０．００１２８，０．００６４，０．０３２，０．１６，０．８，４，２０μｇ／ｍＬ）を添加し、室温にて１時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ロバ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ）溶液を加え、適度な発色を確認したらウェルに等量の反応停止溶液（１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

抗体Ａは、マウス、ラット、サルおよびヒトＥｐｈＡ４いずれにおいても同等の反応活性を有していた（図７）。

実施例１０：抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体の海馬ニューロンにおけるリガンド誘発ＥｐｈＡ４自己リン酸化阻害効果
ラット海馬ニューロンの調製は、以下の工程に従って行った。妊娠１８日目のラット（日本チャールズ・リバー）から胎仔を取り出し、頭部を切開して脳を取り出した。実体顕微鏡下で海馬領域を切り出したのち、ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ溶液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ（和光純薬），５ｍＭ ＫＣｌ（和光純薬），７ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４（和光純薬），２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ＤＯＪＩＮＤＯ），０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ），０．２５％トリプシン（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｉｓ））に入れて３７℃で１０分間振とうした。溶液を除き、２０％Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ／Ｈａｎｋｓ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）を加えた。液を除いて、Ｈａｎｋｓ緩衝液で２回洗浄したのち、Ｈａｎｋｓ緩衝液中で海馬組織をピペッティングして細胞懸濁液を作製した。培養液（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｉｓ），１×Ｂ−２７ｓｕｐｐｌｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｉｓ），０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｉｓ））を入れたポリＬリジンをコートした６ウェルディッシュ（ファルコン）に細胞を播種した。

海馬ニューロンを用いたＥｐｈＡ４自己リン酸化阻害活性評価は、以下の工程に従って行った。６ウェルディッシュ（ファルコン）に播種したラット海馬ニューロンに、マウスＥｐｈｒｉｎＡ１−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、最終濃度１０ｎＭ），抗体Ａ（０，１，１０，１００，１０００ｎＭ）もしくはＥｐｈＡ４阻害薬であるＫＹＬペプチド（ＫＹＬＰＹＷＰＶＬＳＳＬ、０，０．０１，０．１，１，１０，１００μＭ、北海道システム・サイエンスに委託合成）を処置して４５分後にｃｏｌｄ−ＰＢＳ（和光純薬）で洗浄して，ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（以上、和光純薬），１×ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ナカライテスク），１×ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ナカライテスク））を加えて細胞を回収した。４℃で１５分間の混合後、１５０００ｒｐｍ，４℃，１５分間の冷却遠心を行って上清を回収した。上清にウサギ抗ＥｐｈＡ４ポリクローナル抗体（株式会社医学生物学研究所）を加えて９０分間反応させたのち、ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加えてさらに３０分間反応させた。３０００ｒｐｍ，４℃，１分間の冷却遠心を行って上清を除き、１ｍＬのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを加えた。この操作を３回行なったのち、２ＸＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加えて、１０分間煮沸した。このサンプルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗リン酸化チロシン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたウェスタンブロッティングを行った。さらに、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）を用いたウェスタンブロッティングも行い、バンド強度を定量化し、リン酸化ＥｐｈＡ４／総ＥｐｈＡ４の値を算出した。なお、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）は、ヒトＥｐｈＡ４のＣ末端側領域に対する合成ペプチドを免疫原としており、Ｎ末端側に細胞外領域をもつヒトＥｐｈＡ４では中和活性をもたない抗体と認識される。

抗体ＡおよびＥｐｈＡ４阻害薬であるＫＹＬペプチドは、海馬ニューロンにおいて、マウスＥｐｈｒｉｎＡ１により誘発されるＥｐｈＡ４自己リン酸化を濃度依存的に抑制し、そのＩＣ_５０値はそれぞれ２４．２ｎＭ、９．９１μＭであった（図８）。本結果は、抗体Ａが細胞系においてもＫＹＬペプチドと同様にＥｐｈＡ４／ｅｐｈｒｉｎシグナリングに拮抗することを示すものである。

実施例１１：抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体の海馬ニューロンにおけるリガンド誘発成長円錐崩壊（ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｅ ｃｏｌｌａｐｓｅ）に対する抑制効果
ラット海馬ニューロンの調製は、上記実施例１０に記載されるように行い、細胞は培養液を入れたポリＬリジンをコートした９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ）に播種した。

海馬ニューロンを用いたｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｅ ｃｏｌｌａｐｓｅアッセイは、以下の工程に従って行った。９６ウェルディッシュ（ｇｒｅｉｎｅｒ）に播種した培養２日目のラット海馬ニューロンに、ＰＢＳ（和光純薬）、抗体Ａ（０．１，０．３，１μＭ）もしくはＥｐｈＡ４阻害薬であるＫＹＬペプチド（ＫＹＬＰＹＷＰＶＬＳＳＬ，１０，３０，１００μＭ、東レリサーチセンターで委託合成）を１５分間処置した後、ヤギ抗ヒトＦｃγフラグメントＩｇＧ_１抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と１：５の割合でプレクラスター化したマウスＥｐｈｒｉｎＡ１−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、最終濃度１μｇ／ｍＬ）を３０分間処置した。その後、培養液を除き、２％ＰＦＡ（和光純薬）／４％Ｓｕｃｒｏｓｅ（和光純薬）／ＰＢＳを加えて２０分間静置し、細胞を固定した。液を除き、細胞をＰＢＳで３回洗浄したのち、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（和光純薬）／ＰＢＳを加えて、１５分間、細胞透過処理を行った。液を除き、２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えて、１時間ブロッキングを施したあと、抗Ｔａｕ−１抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗ＭＡＰ−２抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を２時間反応させた。１次抗体液を除き、ＰＢＳで３回洗浄したのち、２次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６ Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）を１時間反応させた。２次抗体液を除き、ＰＢＳで３回洗浄したのち、ＳｌｏｗＦａｄｅＧｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）を加えて封入し、ＢＩＯＲＥＶＯ（ＫＥＹＥＮＣＥ）で観察を行った。それぞれのサンプルについて、３０視野からｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｅを形成するニューロンを計数し、ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｅ ｃｏｌｌａｐｓｅを起こしているニューロン数の割合を算出した。

抗体ＡおよびＥｐｈＡ４阻害薬であるＫＹＬペプチドは、海馬ニューロンにおいて、マウスＥｐｈｒｉｎＡ１により誘発されるｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｅ ｃｏｌｌａｐｓｅを濃度依存的に抑制した（図９）。よって、抗体Ａは、細胞系において、ＫＹＬペプチドと同様にＥｐｈＡ４を機能的に阻害することが示された。

実施例１２：抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおけるリガンド拮抗作用
マウス新生仔を用いたｉｎ ｖｉｖｏ拮抗アッセイは、以下の工程に従って行った。保育８日齢のマウス（日本チャールズ・リバー）にＰＢＳ（和光純薬）、抗体Ａもしくは、ジニトロフェノールをマウスに免疫して常法により作製したコントロール抗体（マウス抗ジニトロフェノール抗体）をそれぞれ３００ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した（３０ｍＬ／ｋｇ）。２４時間後に４％イソフルラン（インターベット）麻酔下に頭皮を切開し、マウスＥｐｈｒｉｎＡ１−Ｆｃキメラ（３００ｐｍｏｌ／ｈｅａｄ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）もしくはＰＢＳ（和光純薬）を側脳室内に投与し、その１時間後に断頭によってマウスを安楽死させた後、大脳半球を摘出した。採材した大脳半球を、バイオマッシャー（登録商標）I（ニッピ）の回収用チューブにセットしたフィルターチューブに入れ、破砕棒を挿入したのち、１５０００ｒｐｍ，４℃，２分間の冷却遠心を行って破砕した。破砕物を、ＴＮＥ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１×ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ナカライテスク），１×ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ナカライテスク））に縣濁した。ホモジネートの一部に、３×ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加えて、１０分間煮沸し、タンパク質の定量を行った。このサンプルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）、抗アクチン抗体（ＳＩＧＭＡ）を用いたウェスタンブロッティングを行った。残りのホモジネートは、タンパク質の定量を行ったのち、タンパク質量３ｍｇ相当を分注し、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（和光純薬）、０．１％ ＳＤＳ（ナカライテスク）を加えて、４℃で１５分間の混合後、１５０００ｒｐｍ，４℃，１５分間の冷却遠心を行って上清を回収した。上清の一部に、３×ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加えて、１０分間煮沸し、Ｉｎｐｕｔサンプルとした。このサンプルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）、抗アクチン抗体（ＳＩＧＭＡ）を用いたウェスタンブロッティングを行った。残りの上清にウサギ抗ＥｐｈＡ４ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を加えて６０分間反応させたのち、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加えてさらに３０分間反応させた。３０００ｒｐｍ，４℃，２分間の冷却遠心を行って上清を除き、０．５ｍＬのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（和光純薬)，０．１％ ＳＤＳ（ナカライテスク），１×ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ナカライテスク），１×ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ナカライテスク））を加えた。この操作を３回行なったのち、ビーズに１×ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加えて、１０分間煮沸し、Ｂｅａｄｓサンプルとした。このサンプルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗リン酸化チロシン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたウェスタンブロッティングを行った。さらに、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）を用いたウェスタンブロッティングも行い、バンド強度を定量化し、リン酸化ＥｐｈＡ４／総ＥｐｈＡ４の値を算出した。なお、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）は、ヒトＥｐｈＡ４のＣ末端側領域に対する合成ペプチドを免疫原としており、Ｎ末端側に細胞外領域をもつヒトＥｐｈＡ４では中和活性をもたない抗体と認識される。

マウス新生仔側脳室内へのマウスＥｐｈｒｉｎＡ１投与は、大脳半球において、ＥｐｈＡ４の自己リン酸化を惹起した。抗体Ａは、マウスＥｐｈｒｉｎＡ１により誘発されるＥｐｈＡ４自己リン酸化を６６％抑制した（図１０）。よって、抗体Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても、ＥｐｈＡ４とそのリガンドとの結合を阻害することが示された。

実施例１３：抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＬＳモデルにおけるマウスＥＳ細胞由来運動ニューロン保護効果
マウスＥＳ細胞の維持培養は、以下の工程に従って行った。−８０℃で凍結保存されたマウスＥＳ細胞（１２９×１／ＳｖＪ）を恒温槽内で融解した後、３７℃に加温したマウスＥＳ細胞培地（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ），０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ），１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），２ｍＭ Ｌ‐グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），１％非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン−１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ＥＳＧＲＯ（登録商標） ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）含有ＫｎｏｃｋＯｕｔ^ＴＭ ＤＭＥＭ （Ｇｉｂｃｏ））に希釈した。各細胞懸濁液を遠心後（１５００ｒｐｍ、３分、室温）、上清を除き、新たな培地に懸濁後、予めフィーダー細胞を播種した培養ディッシュに移し、ＣＯ_２インキュベーター内（５％ＣＯ_２、３７℃）で維持培養を行った。

マウス新生仔からのアストロサイトの樹立および維持培養は、以下の工程に従って行った。生後２日齢の野生型マウス新生仔（Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｍｓＳｌｃ（日本エスエルシー））、および野生型マウスと変異ヒトＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）Ｔｇ−（Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＿Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））マウスとの交雑マウスの新生仔をイソフルラン（インターベット）吸入麻酔または断頭により安楽死させた後、大脳皮質を単離し、０．２５％トリプシン‐ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３７℃、１５分処理により分散した。酵素処理後、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）および１％ペニシリン ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）（１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）４ｍＬによって希釈し、酵素消化を停止させた。その後、セルストレーナー（ＢＤバイオサイエンス）により、単一細胞以外の不純物をフィルトレーションし、１５００ｒｐｍで５分遠心した。上清をアスピレートし、新しい１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ ４ｍＬに希釈して、個体毎に６０ｍｍカルチャーディッシュに播種、３７℃にて培養した。播種２日後に培地をアスピレートし、新たな１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ ４ｍＬを加え培地交換を行った。コンフリューエントに達した後、非接着性細胞を含む培養上清を回収し変異ヒトＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）のジェノタイピングに供した。新たにＰＢＳ（和光純薬）２ｍＬを加え、再度アスピレートした。０．２５％トリプシン‐ＥＤＴＡ １ｍＬを加え３７℃、３分インキュベートした。１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ ３ｍＬで酵素処理を停止させ、１５００ｒｐｍ、３分遠心した。遠心後、培地をアスピレートし、新たな１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ６ｍＬを加え、１００ｍｍカルチャーディッシュに播種することで継代培養を行った（継代数２）。コンフリューエントに達した後、培地をアスピレート後、ＰＢＳ（和光純薬）３ｍＬを加え、再度アスピレートした。０．２５％トリプシン‐ＥＤＴＡ ２ｍＬを加え３７℃、３分インキュベートした。１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ４ｍＬで酵素処理を停止させ、１５００ｐｍ、３分遠心した。遠心後、培地をアスピレートし、新たな１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ１２ｍＬを加え、６ｍＬずつ１００ｍｍカルチャーディッシュに播種して継代培養を行った（継代数３）。３継代目のアストロサイトの培地をアスピレートし、ＰＢＳ（和光純薬）２ｍＬを加え、再度アスピレートした。０．２５％トリプシン‐ＥＤＴＡを２ｍＬ加え、３７℃、３分インキュベーションし、４ｍＬの１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭを加え、酵素処理を停止した。懸濁液を回収し、１５００ｒｐｍ、３分遠心を行い、Ｃｅｌｌ ｂａｎｋｅｒ（日本全薬工業）に希釈して試験供試まで−８０℃で凍結保存した。試験供試に際しては、凍結保存した細胞懸濁液をそれぞれ恒温槽内で融解した後、３７℃に加温した１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで希釈した。各細胞懸濁液を遠心後（１５００ｒｐｍ、３分、室温）、上清を除き、新たな培地に懸濁後、８ウェルチャンバー（ｉｂｉｄｉ）に播種し、ＣＯ_２インキュベーター内（５％ＣＯ_２、３７℃）で維持培養を行った。

変異ヒトＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）のジェノタイピングは、ＲＥＤＥｘｔｒａｃｔ−Ｎ−Ａｍｐ^ＴＭ Ｔｉｓｓｕｅ ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて行った。マウスＥＳ細胞の維持培養の工程において、継代培養時に回収した、変異ヒトＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）発現アストロサイトの非接着性細胞を含む培養上清を１．５ｍＬチューブに回収し、１５００ｒｐｍ、３分遠心を行った。遠心後、上清をアスピレートし、ＰＢＳ １ｍＬを加えて洗浄、再度遠心した後にアスピレートした。抽出溶液５０μＬ，および組織調製溶液１２．５μＬを混合し、サンプルに加えた。混和後、ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）チューブに移して、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標） ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））にて５５℃、１０分→９５℃、３分→４℃、∞のサイクルでゲノム抽出を行った。その後、中和溶液Ｂ ５０μＬを加え中和化した。

抽出したゲノムを用いて表３に示す組成でゲノミックＰＣＲを行った。ＰＣＲで使用するプライマー配列は表４に示す。ＰＣＲ後１％アガロースゲル／１００Ｖ／２０分にて電気泳動を行った。内部標準３２４ｂｐ、および変異ヒトＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）２３６ｂｐの２つのバンドが検出されたものを変異ヒトＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）発現アストロサイトと同定した。

Ｒｅｄ ｍｉｘ＝ＲＥＤＥｘｔｒａｃｔ−Ｎ−Ａｍｐ ＰＣＲ反応ミックス.

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＬＳモデルにおける運動ニューロン保護効果の評価は、以下の工程に従って行った。培養維持されたマウスＥＳ細胞を０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ／０．０５％ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ）で処理し、細胞を培養ディッシュから剥離した。遠心して細胞を回収後、懸濁液を作製し低吸着性１２ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に１．２×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した（第０日目）。ＤＦＫ培地（５％ＫｎｏｃｋＯｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），２ｍＭ Ｌ−グルタミン，１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン−１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン，および０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール含有アドバンスドＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）：ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［１：１］培地）内で２日間浮遊凝集塊培養を行った。第２日目に，ＤＦＫ培地を１μＭレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）および２μＭ ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）含有ＤＦＫ培地に交換した。その後、２日に１度の頻度で培地交換を行い、５日間（第３日目〜第７日目）培養し、運動ニューロンへと分化誘導した。

第７日目、分化した運動ニューロンの細胞魂を細胞分散液Ａｃｃｕｍａｘ（ＭＳ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分散し，細胞密度５．５×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液に調整した。その懸濁液を予めマウス由来野生型アストロサイトまたは変異ヒトＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）発現アストロサイトを培養維持した８ウェルチャンバーに２００μＬ／ｗｅｌｌで播種し、アストロサイトと運動ニューロンの共培養細胞として評価に使用した。

野生型アストロサイトと運動ニューロンとの共培養で観察される運動ニューロン数をコントロールとした。薬物処置群では、変異ヒトＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）発現アストロサイトと運動ニューロンとの共培養を行い、条件をｖｅｈｉｃｌｅ添加（ＩｇＧ、および０．１％超純水）、抗体Ａ（１０，３０，１００ ｎＭ）、ＥｐｈＡ４−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、３，１０，３０ ｎＭ）、ＫＹＬペプチド（東レリサーチセンター、１，３, １０ μＭ）とした。各条件で３７℃，５％ＣＯ_２において２日間培養後、抗ウサギＩＳＬ１抗体（Ａｂｃａｍ）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ）を用いて運動ニューロンを免疫細胞化学的に染色した。単位面積あたりのＩＳＬ１／Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２共陽性細胞を生存運動ニューロンとして計数し、運動ニューロン生存率はコントロールに対する百分率（％）として算出した。なお、図１１に評価系の工程を示す簡単な模式図を示した。

変異ヒトＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）発現アストロサイト／マウスＥＳ細胞由来運動ニューロン共培養では、運動ニューロン生存率は著しく低下した（４０〜５０％）。抗体Ａは、変異ヒトＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）発現アストロサイトにより誘発されるマウスＥＳ細胞由来運動ニューロン死を濃度依存的に抑制した（図１２）。また、抗体Ａと同様にＫＹＬペプチドおよびＥｐｈＡ４−Ｆｃ処置によっても本実験系において運動ニューロン保護効果が認められたことから、抗体Ａは、本ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＬＳモデルにおいてＥｐｈＡ４／ｅｐｈｒｉｎシグナリングを阻害することでマウスＥＳ細胞由来運動ニューロンの生存を促進することが示された。

実施例１４：抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のＩｎ ｖｉｔｒｏ ＡＬＳモデルにおけるヒトｉＰＳ細胞由来運動ニューロン保護効果
ヒトｉＰＳ細胞の維持培養は、以下の工程に従って行った。液体窒素でＳｔｅｍ ｃｅｌｌ ｂａｎｋｅｒ（Ｔａｋａｒａ）にて凍結保存されたヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）を液体窒素気層から取り出し，素早く予め３７ ℃に加温しておいたヒトｉＰＳ細胞培養培地(Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８, Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ) ５ ｍＬに懸濁・融解した。１５ ｍＬコニカルチューブ (ファルコン)に細胞懸濁液を回収し、遠心後（１０００ｒｐｍ、５分、室温），上清を除き，新たな培地に懸濁後，あらかじめ０．５μｇ/ｃｍ^２ Ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)でコーティングを行ったφ６０ ｍｍ細胞培養ディッシュ (Ｆａｌｃｏｎ ＢＤ)に播種し、１０μＭ Ｙ-２７６３２ (和光純薬)を添加し、ＣＯ₂ インキュベーター内（５％ＣＯ_２、３７℃）で維持培養を行った。毎日、培地交換を行い、コンフルーエントに達した時点で、実験に供した。

iｎ ｖｉｔｒｏ ＡＬＳモデルにおける運動ニューロン保護効果の評価は、以下の工程に従って行った。維持培養したヒトｉＰＳ細胞の培養培地をアスピレートし、２ ｍＬ ＰＢＳ (和光純薬)で洗浄した。ＰＢＳをアスピレート後、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを５００ μＬ添加し、ＣＯ₂ インキュベーター内（５％ＣＯ_２、３７℃）で２−３分インキュベートした (３０秒毎に顕微鏡で確認を行い、細胞同士の結合が弱くなった時点で、インキュベートを中止する。)。５ ｍＬのヒトｉＰＳ細胞培養培地で懸濁する事によって、ＥＤＴＡ反応を停止させ、１５ ｍＬコニカルチューブに回収した。１０００ｒｐｍ、５分、室温で遠心を行い、上清をアスピレートした。ヒトｉＰＳ細胞塊を、低接着性６ ｗｅｌｌ細胞培養プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎｅ ｓｐｈｅｒｅ, Ｎｕｎｃ）１ ｗｅｌｌに対して、約１/１０量の細胞懸濁液を播種し、ＤＦＫ培地（２％ Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ, ５％ＫｎｏｃｋＯｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），２ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ−グルタミン，１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ペニシリン−１００ ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン，および０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ β−メルカプトエタノール含有アドバンスドＤＭＥＭ／Ｆ−１２ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）: ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［１：１］培地）に ２ μＭ ＳＢ４３１５４２ (Ｓｉｇｍａ), ３００ ｎＭ ＬＤＮ１９３１８９ (Ｓｉｇｍａ), ３ μM ＣＨＩＲ９９０２１(Ｓｉｇｍａ)を加えてＣＯ₂ インキュベーター内（５％ＣＯ_２、３７℃）で培養した。以下の方法で２日毎に培地交換を行った。まず、ヒトｉＰＳ細胞分化細胞塊 (ＳＦＥＢｓ) を培地ごと１５ ｍＬ コニカルチューブに回収し、５分間常温で静置することで、細胞塊を沈殿させた。この上清をアスピレートし、新たなＤＦＫ培地、および２ μＭ ＳＢ４３１５４２ (Ｓｉｇｍａ), ３００ ｎＭ ＬＤＮ１９３１８９ (Ｓｉｇｍａ), ３ μM ＣＨＩＲ９９０２１(Ｓｉｇｍａ)を添加し、元のｗｅｌｌに戻すことで培地交換を行った。培養８日目に、ＳＦＥＢｓを培地ごと１５ ｍＬ コニカルチューブに回収し、５分間常温で静置することで、ＳＦＥＢｓを沈殿させた。この上清をアスピレートし、新たなＤＦＫ培地を加え、０．１ μＭ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ (Ｓｉｇｍａ), ０．５ μＭ Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ (Ｍｉｌｔｅｎｙ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ)を添加して、元のｗｅｌｌに戻し、ＣＯ₂ インキュベーター内（５％ＣＯ_２、３７℃）で培養した。２日毎に培地交換を行った。培養１２日目に、ＳＦＥＢｓを培地ごと１５ ｍＬ コニカルチューブに回収し、５分間常温で静置することで、ＳＦＥＢｓを沈殿させた。上清をアスピレートし、５００ μＬのＡｃｃｕｍａｘ (ＭＳ ｔｅｃｈｎｏｓｙｓｔｅｍｓ)を加えて数回ピペッティングした後、ＣＯ₂ インキュベーター内（３７℃、５％ＣＯ₂）で５分インキュベートした。インキュベーターから細胞を取り出し、５ ｍＬのＤＦＫ培地で懸濁し、数回ピペッティングすることで、細胞塊を分散させた。細胞懸濁液をセルストレーナー(ファルコン)で、フィルトレーションして単一細胞に解離した後に、血球計算版で細胞数をカウントした。細胞懸濁液を、新たな１５ ｍＬコニカルチューブに回収し、１０００ｒｐｍ、５分、室温で遠心した。運動神経培養培地(２％ Ｂ２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，１％ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ，２ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ−グルタミン，１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ペニシリン−１００ ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン，および０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ β−メルカプトエタノール含有アドバンスドＤＭＥＭ／Ｆ−１２ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）: ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［１：１］培地）)で細胞密度を５．５×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液に調製し、予めマウス由来野生型アストロサイトまたは変異ヒトＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）発現アストロサイトを８×１０^４ ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌで播種した８ウェルチャンバーに２００ μＬ／ｗｅｌｌで播種し、アストロサイトと運動ニューロンの共培養細胞として評価に使用した (なお野生型、およびヒト変異ＳＯＤ１ （Ｇ９３Ａ）発現アストロサイトの樹立・凍結・融解・播種・維持培養は、実施例１３と同様の方法で行った)。野生型アストロサイトと運動ニューロンとの共培養で観察される運動ニューロン数をコントロールとした。薬物処置群では、変異ヒトＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）発現アストロサイトと運動ニューロンとの共培養を行い、条件をｖｅｈｉｃｌｅ添加（ＩｇＧ、および０．１％ 超純水)，抗体Ａ（１０，３０，１００ｎＭ），ＥｐｈＡ４阻害薬であるＫＹＬペプチド（ＫＹＬＰＹＷＰＶＬＳＳＬ、１，３，１０μＭ、東レリサーチセンターで委託合成）、ＥｐｈＡ４−Ｆｃ（３，１０，３０ｎＭ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）とした。各条件で５％ＣＯ_２、３７℃において２日間培養後，抗ＩＳＬ１抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋより入手）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ）を用いて運動ニューロンを免疫細胞化学的に染色した。１ ｗｅｌｌあたりのＩＳＬ１／Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２共陽性細胞を生存運動ニューロンとして計数し、運動ニューロン生存率はコントロールに対する％として算出した。図１３に評価系の工程を示す簡単な模式図を示した。

変異ヒトＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）発現アストロサイト／ヒトｉＰＳ細胞由来運動ニューロン共培養では、マウスＥＳ細胞を用いたアッセイ系と同様に運動ニューロン生存率は著しく低下した（約５０％）。抗体Ａは、変異ヒトＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）発現アストロサイトにより誘発されるヒトｉＰＳ細胞由来運動ニューロン死を濃度依存的に抑制した（図１４）。また、抗体Ａと同様にＫＹＬペプチドおよびＥｐｈＡ４−Ｆｃ処置によっても本実験系においてヒトｉＰＳ細胞由来運動ニューロン保護効果が認められた。よって、抗体Ａは、ヒト細胞においてもＥｐｈＡ４とそのリガンドとの結合を阻害することで運動ニューロンの生存を促進することが示された。

実施例１５:Ｘ線結晶構造解析によるＥｐｈＡ４−Ｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ（ＥｐｈＡ４−ＬＢＤ）のエピトープマッピング
実施例５で調製した抗体Ａ−Ｆａｂと抗原であるＥｐｈＡ４−ＬＢＤの複合体を作製するため、ＥｐｈＡ４−ＬＢＤを調製した（Ｑｉｎ Ｈ. ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ., ２８３: ２９４７３−２９４８４ (２００８)）。ＥｐｈＡ４−ＬＢＤが抗体Ａ−Ｆａｂに対して約１．５倍のモル比になるように、１．３３・ｍｏｌ（９５０・Ｍ, １．４ｍｌ）のＥｐｈＡ４−ＬＢＤと０．９・ｍｏｌ（１５０・Ｍ, ６ｍｌ）の抗体Ａ−Ｆａｂを混合し、氷上で３０分間インキュベートを行った。次に混合液をＨＩＬＯＡＤ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライし、クロマト用緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で溶出を行った。複合体を含む画分をＳＤＳ ＰＡＧＥで分析し、高純度の画分を集めて３４ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、これを結晶化に用いた。

複合体の結晶化は、自動結晶化装置Ｈｙｄｒａ ＩＩ Ｐｌｕｓ Ｏｎｅシステム（Ｍａｔｒｉｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ., Ｌｔｄ.）を用いたシッティングドロップ蒸気拡散法によって行った。プレートはＭＲＣ−２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ）を使用した。リザーバー溶液の組成は１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５−８．５）, ３０％ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏl ４００で、このリザーバー溶液と上記の複合体溶液の体積比が１：１になるよう混合して結晶化ドロップレットを作製した。作製した結晶化プレートは２０℃で静置した。

上記の条件で結晶化を行ったところ、空間群Ｐ２１２１２１, 格子定数ａ＝７０．０Å, ｂ＝８２．３Å, ｃ＝２１６．０Åの結晶が得られた。得られた結晶に放射光Ｘ線（１．０Å）を入射して２．１Åの回折データを取得した。回折データをＨＫＬ２０００ （ＨＫＬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ.）によって処理し、分子置換法によって位相決定を行った。分子置換法にはＣＣＰ４ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｊｅｃｔ ｎｕｍｂｅｒ ４,［ＣＣＰ４］ ｖｅｒｓｉｏｎ ６.５．０, Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ. Ｄ ６７：２３５−２４２（２０１１））に含まれるプログラムＰＨＡＳＥＲ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２.５．０, ＭｃＣｏｙ Å. Ｊ. ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ａｐｐｌ. Ｃｒｙｓｔ. ４０：６５８−６７４（２００７））を用いた。分子置換法のサーチモデルとしてはＥｐｈＡ４−ＬＢＤの結晶構造（ＰＤＢＩＤ：３ＣＫＨ）と本発明者らが過去に決定した別の抗体のＦａｂの結晶構造を用いた。決定した位相から得られた電子密度に合うように分子モデルをプログラムＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ Ｐ. ｅｔ ａｌ., Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ. Ｄ ６０： ２１２６−２１３２ｎ（２００４）)を用いて構築し、構造精密化をプログラムＲＥＦＭＡＣ （Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ Ｇ.Ｎ., Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ. Ｄ ５３：２４０−２５５（１９９７））を用いて行った。
以上の構造計算によって２．１Å分解能の複合体結晶構造を得た（Ｒ＝０．２３４, Ｒｆｒｅｅ＝０．２８８）。

得られたＦａｂ／ＥｐｈＡ４−ＬＢＤ複合体の結晶構造を計算化学システムＭＯＥ ２０１１．１０（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ.）に搭載されている相互作用検出ツールを用いて解析し、Ｆａｂと直接相互作用するＥｐｈＡ４−ＬＢＤ上のアミノ酸残基を同定した（図１５）。検出条件はＭＯＥの標準設定を用いた。同定されたアミノ酸残基は、Ｓｅｒ５８, Ｍｅｔ６０, Ｇｌｎ７１, Ｖａｌ７２, Ｃｙｓ７３, Ｔｈｒ１０４, Ａｒｇ１０６, Ｇｌｎ１５６, Ａｓｐ１６１, Ａｒｇ１６２, Ｉｌｅ１６３, Ｃｙｓ１９１, Ｉｌｅ１９２である。図１６に、Ｍａｅｓｔｒｏ（ｖｅｒｓｉｏｎ １０．６， Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ， ＬＬＣ）で作成したＥｐｈａ４−ＬＢＤの表面構造を示す。この結果、本発明者らはこれらのアミノ酸残基が存在する領域がＥｐｈＡ４−ＬＢＤにおけるＦａｂ結合領域であると結論づけた。

実施例１６：抗体Ａのヒト化抗体の作製
ヒト化抗ヒトＥｐｈＡ４抗体の調製
ヒト化抗体の可変領域を設計した。抗体Ａのフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ：ＦＲ）に対する高い相同性を基に、ヒト抗体のＦＲ；軽鎖についてＩＧＫＶ１−ＮＬ１＊０１（配列番号５０）またはＩＧＫＶ３Ｄ−１５＊０１（配列番号５１）、およびＪＫ１（配列番号５２）、重鎖についてＩＧＨＶ７−４−１＊０２（配列番号５３）、およびＪＨ６（配列番号５４）を、ヒト化抗体のＦＲとして選択した。その後、マウス抗体Ａの３Ｄ構造予測モデルを用いて、ＣＤＲのアミノ酸と相互作用するＦＲにおけるアミノ酸を予測し、ＣＤＲ（配列番号２６−３０、および３１−３３）とともに移植した。ＥｐｈＡ４のリン酸化亢進およびＡＤＣＣ活性の観点から、重鎖定常領域として、Ｃ１３１Ｓ、Ｃ２１９Ｓ、Ｖ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ変異を有し、Ｃ末端リシン残基を有さないヒトＩｇＧ_２の定常領域（配列番号６２）、あるいは、ＣＨ１およびヒンジ部がヒトＩｇＧ_１、ＣＨ２およびＣＨ３がＶ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ変異を有するヒトＩｇＧ_２で、Ｃ末端リシン残基を有さない定常領域（配列番号６０）を用いた。軽鎖定常領域としては、ヒトＩｇκ（配列番号６４）を用いた。ＨＫ１（配列番号７２）、ＨＫ２（配列番号７４）、およびＨＫ４（配列番号７６）は、Ｋａｂａｔの定義方法によって決定されたＣＤＲ（配列番号２６、２８、３０）を移植したヒト化抗体の重鎖可変領域として設計され、ＨＡ１（配列番号６６）、ＨＡ２（配列番号６８）、およびＨＡ４（配列番号７０）は、ＡｂＭの定義方法によって決定されたＣＤＲ（配列番号２７、２９、３０）を移植されたヒト化抗体の重鎖可変領域として設計され、Ｌ１−４（配列番号７８）、Ｌ１−５（配列番号８０）、およびＬ１−６（配列番号８２）は、ＩＧＫＶ１−ＮＬ１＊０１およびＪＫ１を用いるヒト化抗体の軽鎖可変領域として設計され、Ｌ２−４（配列番号８４）は、ＩＧＫＶ３Ｄ−１５＊０１およびＪＫ１を用いるヒト化抗体の軽鎖可変領域として設計された。なお、重鎖定常領域の設計において、ＥｐｈＡ４のリン酸化は、実施例１０に記載の方法と同様の方法を用いて確認された。

ＨＫ１、ＨＫ２、ＨＫ４のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、ＩＧＨＶ７−４−１＊０２（配列番号５３）およびＪＨ６（配列番号５４）に抗体Ａの重鎖ＣＤＲ（配列番号２６、２８、３０）を移植し、シグナル配列（配列番号５５）をＮ末端に付加したアミノ酸配列を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．によって遺伝子配列に変換して合成し、ＰＣＲにて変異を導入して作製した（ＨＫ１：配列番号７３、ＨＫ２：配列番号７５、ＨＫ４：配列番号７７、シグナル配列：配列番号５７）。ＨＡ１、ＨＡ２、ＨＡ４のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、ＩＧＨＶ７−４−１＊０２（配列番号５３）およびＪＨ６（配列番号５４）に抗体Ａの重鎖ＣＤＲ（配列番号２７、２９、３０）を移植し、シグナル配列（配列番号５５）をＮ末端に付加したアミノ酸配列を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．によって遺伝子配列に変換して合成し、ＰＣＲにて変異を導入して作製した（ＨＡ１：配列番号６７、ＨＡ２：配列番号６９、ＨＡ４：配列番号７１、シグナル配列：配列番号５６）。これらのヒト化重鎖可変領域とシグナル配列をコードする遺伝子は、Ｃ１３１Ｓ、Ｃ２１９Ｓ、Ｖ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ変異を有し、Ｃ末端リシン残基を有さないヒトＩｇＧ_２の定常領域（配列番号６２）をコードする遺伝子配列（配列番号６３）を含む発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４）、および、ＣＨ１およびヒンジ部がヒトＩｇＧ_１、ＣＨ２およびＣＨ３がＶ２３４ＡおよびＧ２３７Ａを有するヒトＩｇＧ_２で、Ｃ末端リシン残基を有さない定常領域（配列番号６０）をコードする遺伝子配列（配列番号６１）を含む発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４）に挿入した。Ｌ１−４、Ｌ１−５、Ｌ１−６のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、ＩＧＫＶ１−ＮＬ１＊０１（配列番号５０）およびＪＫ１（配列番号５２）に抗体Ａの軽鎖ＣＤＲ（配列番号３１−３３）を移植し、シグナル配列（配列番号５８）をＮ末端に付加したアミノ酸配列を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．によって遺伝子配列に変換して合成し、ＰＣＲにて変異を導入して作製した（Ｌ１−４：配列番号７９、Ｌ１−５：配列番号８１、Ｌ１−６：配列番号８３、シグナル配列：配列番号５９）。Ｌ２−４のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、ＩＧＫＶ３Ｄ−１５＊０１（配列番号５１）およびＪＫ１（配列番号５２）に抗体Ａの軽鎖ＣＤＲ（配列番号３１−３３）を移植し、シグナル配列（配列番号５８）をＮ末端に付加したアミノ酸配列を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．によって遺伝子配列に変換して合成し、ＰＣＲにて変異を導入して作製した（Ｌ２−４：配列番号８５、シグナル配列：配列番号５９）。これらのヒト化軽鎖可変領域とシグナル配列をコードする遺伝子はヒトＩｇκの定常領域（配列番号６４）をコードする遺伝子配列（配列番号６５）を含む発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４）に挿入した。ここでいう、「Ｃ１３１Ｓ」とは、Ｅｕ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおいて１３１位のシステインがセリンに置換された変異を、「Ｃ２１９Ｓ」とは、２１９位のシステインがセリンに置換された変異を、「Ｖ２３４Ａ」とは、２３４位のバリンがアラニンに置換された変異を、「Ｇ２３７Ａ」とは、２３７位のグリシンがアラニンに置換された変異を表す。また、ここでいう、ＣＨ１とはヒトＩｇＧ定常領域においてＥｕ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇで１１８位から２１５位のことで、ヒンジ部とはヒトＩｇＧ定常領域において２１６位から２３０位のことで、ＣＨ２とはヒトＩｇＧ定常領域において２３１位から３４０位のことで、ＣＨ３とは３４１位から４４６位を表す。これらのヒト化抗体を産生するため、Ｅｘｐｉ２９３発現システム（Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、前記発現ベクターを表５の組み合わせでＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）へ形質移入した。上清を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。

実施例１７：抗ＥｐｈＡ４モノクローナルヒト化抗体のヒトＥｐｈＡ４に対する親和性
実施例１６で得た抗ＥｐｈＡ４モノクローナルヒト化抗体のヒトＥｐｈＡ４に対する結合親和性をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００(ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ法）により決定した。まず、抗体Ａの測定用に、マウスＩｇＧ_１抗体をラットに免疫して常法により作製したラット抗マウスＩｇＧ_１抗体をセンサーチップＣＭ５へ固定化した。ラット抗マウスＩｇＧ_１抗体のセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、および、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いた（センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥヘルスケア社製）。固定化用緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ４．５）を用いて希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００付属のプロトコルに従い、センサーチップ上に固定した。ヒト化モノクローナル抗体の測定にはＰｒｏｔｅｉｎＡチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２９−１３８３−０３）を用いた。抗体Ａおよびヒト化モノクローナル抗体をランニング緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて希釈し、フローセル２のみに１２０秒間送液しキャプチャーさせた（３０−６０ＲＵ程度のキャプチャー量）。続いてＨＢＳ−ＥＰを用いて５０，１６．７，５．６，１．９，０．６ｎＭの範囲で系列希釈したヒトＥｐｈＡ４細胞外領域−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓタンパク質を再生操作なしに低濃度側から連続添加し、添加時（結合相，１２０秒間）、および、添加終了後（解離相，９００秒間）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、３Ｍ ＭｇＣｌ_２（６０秒間）または１０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ ｐＨ１．５（３０秒間）を添加してセンサーチップを再生した。得られた結合反応曲線に対して、システム付属ソフトＢＩＡ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、ヒトのＥｐｈＡ４に対する親和性（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を算出した（表６）。

表５の全てのヒト化抗体は、元の抗体Ａとほぼ同等の親和性を示すことが分かった（表６）。

実施例１８：抗ＥｐｈＡ４モノクローナルヒト化抗体のヒトＥｐｈＡ４−ヒトリガンド結合阻害活性
実施例１６で得た抗ＥｐｈＡ４モノクローナルヒト化抗体について、ヒトＥｐｈＡ４とヒトリガンドとの結合阻害活性の評価は、以下の工程に従って行った。抗アルカリフォスファターゼ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で３回洗浄した後、ウェルに実施例２の方法で得たヒトＥｐｈＡ４細胞外領域−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓタンパク質を加え（最終濃度１０ｎＭ）を播種し、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにリガンドと系列希釈した抗体Ａヒト化抗体 （０，０．００３，０．０１，０．０３，０．１，０．３，１，３，１０，３０，１００，３００，１０００，３０００ｎＭ）を添加した。なお、リガンドにはビオチン化ヒトＥｐｈｒｉｎＡ５−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、最終濃度０．７ｎＭ）を用いた。室温にて１時間インキュベートして３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ）溶液を加え、２分、室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

表５の全てのヒト化抗体は、元の抗体Ａとほぼ同等の阻害活性を示すことが分かった（表７）。

実施例１９：抗ＥｐｈＡ４モノクローナルヒト化抗体のヒトＥｐｈレセプターに対する選択性
実施例７に記載の方法と同様に、ヒトの各Ｅｐｈレセプター（ＥｐｈＡ１，ＥｐｈＡ２，ＥｐｈＡ３，ＥｐｈＡ４，ＥｐｈＡ５，ＥｐｈＡ６，ＥｐｈＡ７，ＥｐｈＡ８，ＥｐｈＡ１０，ＥｐｈＢ１，ＥｐｈＢ２，ＥｐｈＢ３，ＥｐｈＢ４，ＥｐｈＢ６）のシグナル配列と細胞外領域をコードするＤＮＡ配列を組織由来のＴｏｔａｌ ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、ＳＥＡＰタンパク質およびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列を有するｐＥＮＴＲ１Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。次に、ヒトの各Ｅｐｈレセプターのシグナル配列と細胞外領域、ＳＥＡＰタンパク質およびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列をＧａｔｅｗａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＬＲ反応により、ｐｃＤＮＡ３．１＿ｒｆｃＢベクターに移し、ヒトの各Ｅｐｈレセプターの細胞外領域に対してＳＥＡＰタンパク質とＨｉｓタグを融合したタンパク質（「Ｅｐｈレセプター細胞外領域―ＳＥＡＰ―Ｈｉｓタンパク質」という）を発現するベクター（「Ｅｐｈレセプター細胞外領域―ＳＥＡＰ―Ｈｉｓタンパク質発現ベクター」という）を構築した。

次に、Ｅｘｐｉ２９３発現システム（Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、ヒトの各Ｅｐｈレセプター細胞外領域―ＳＥＡＰ―Ｈｉｓタンパク質発現ベクター を、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に導入した。５日間のインキュベーション（５％ＣＯ_２、３７℃）の後、培養上清を回収し、室温で１５００ｒｐｍ、５ 分間遠心した。遠心上清を０．４５μｍフィルター (Ｍｉｌｌｐｏｒｅ)でろ過した。
実施例１６で得た抗ＥｐｈＡ４モノクローナルヒト化抗体について、ヒトＥｐｈレセプターの結合活性の評価は、以下の工程に従って行った。
ウサギ抗６―Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。ウェルを室温にて１時間ブロッキングした後、１％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）により、４℃にて一晩インキュベートした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ナカライテスク）で３回洗浄した後、ウェルにヒトＥｐｈＡ１，ＥｐｈＡ２，ＥｐｈＡ３，ＥｐｈＡ４，ＥｐｈＡ５，ＥｐｈＡ６，ＥｐｈＡ７，ＥｐｈＡ８，ＥｐｈＡ１０，ＥｐｈＢ１，ＥｐｈＢ２，ＥｐｈＢ３，ＥｐｈＢ４，ＥｐｈＢ６のＳＥＡＰ−Ｈｉｓタンパク質（最終濃度１ｎＭ）、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにヒト化抗体を添加し、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ロバ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＫＰＬ）をウェルに加えて、適度な発色を確認したらウェルに等量の反応停止溶液（１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

ヒトＥｐｈＡ４（ｈＥｐｈＡ４−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓ）の４５０ｎｍの吸光度を１００％としたときの割合を表８にまとめたところ、表５の全てのヒト化抗体は、元の抗体Ａ同様、ヒトＥｐｈＡ４に対して特異的に結合することが分かった（表８）。

実施例２０：抗ＥｐｈＡ４モノクローナルヒト化抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＬＳモデルにおけるヒトｉＰＳ細胞由来運動ニューロン保護効果
ヒトｉＰＳ細胞の維持培養は、以下の工程に従って行う。液体窒素でＳｔｅｍ ｃｅｌｌ ｂａｎｋｅｒ（Ｔａｋａｒａ）にて凍結保存されたヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）を液体窒素気層から取り出し，素早く予め３７℃に加温しておいたヒトｉＰＳ細胞培養培地（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８, Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５ｍＬに懸濁・融解する。１５ｍＬコニカルチューブ（ファルコン）に細胞懸濁液を回収し、遠心後（１０００ｒｐｍ、５分、室温），上清を除き，新たな培地に懸濁後，あらかじめ０．５μｇ/ｃｍ２ Ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコーティングを行ったφ６０ ｍｍ細胞培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ ＢＤ）に播種し、１０μＭ Ｙ-２７６３２（和光純薬）を添加し、ＣＯ_２インキュベーター内（５％ＣＯ_２、３７℃）で維持培養を行う。毎日、培地交換を行い、コンフルーエントに達した時点で、実験に供する。

実施例１６で得た抗ＥｐｈＡ４モノクローナルヒト化抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＬＳモデルにおける運動ニューロン保護効果の評価は、以下の工程に従って行う。維持培養したヒトｉＰＳ細胞の培養培地をアスピレートし、２ｍＬ ＰＢＳ（和光純薬）で洗浄する。ＰＢＳをアスピレート後、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを５００μＬ添加し、ＣＯ_２インキュベーター内（５％ＣＯ_２、３７℃）で２−３分インキュベートする（３０秒毎に顕微鏡で確認を行い、細胞同士の結合が弱くなった時点で、インキュベートを中止する。）。５ｍＬのヒトｉＰＳ細胞培養培地で懸濁する事によって、ＥＤＴＡ反応を停止させ、１５ｍＬコニカルチューブに回収する。１０００ｒｐｍ、５分、室温で遠心を行い、上清をアスピレートする。ヒトｉＰＳ細胞塊を、低接着性６ｗｅｌｌ細胞培養プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎｅ ｓｐｈｅｒｅ, Ｎｕｎｃ）１ｗｅｌｌに対して、約１/１０量の細胞懸濁液を播種し、ＤＦＫ培地（２％Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ, ５％ＫｎｏｃｋＯｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ−グルタミン，１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン−１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン，および０．１ｍｍｏｌ／Ｌ β−メルカプトエタノール含有アドバンスドＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）: ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［１：１］培地）に２μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ）, ３００ｎＭ ＬＤＮ１９３１８９（Ｓｉｇｍａ）, ３μM ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｉｇｍａ）を加えてＣＯ_２インキュベーター内（５％ＣＯ_２、３７℃）で培養する。以下の方法で２日毎に培地交換を行う。まず、ヒトｉＰＳ細胞分化細胞塊（ＳＦＥＢｓ）を培地ごと１５ｍＬ コニカルチューブに回収し、５分間常温で静置することで、細胞塊を沈殿させる。この上清をアスピレートし、新たなＤＦＫ培地、および２ μＭ ＳＢ４３１５４２ (Ｓｉｇｍａ), ３００ ｎＭ ＬＤＮ１９３１８９ (Ｓｉｇｍａ), ３ μM ＣＨＩＲ９９０２１(Ｓｉｇｍａ)を添加し、元のｗｅｌｌに戻すことで培地交換を行う。培養８日目に、ＳＦＥＢｓを培地ごと１５ｍＬ コニカルチューブに回収し、５分間常温で静置することで、ＳＦＥＢｓを沈殿させる。この上清をアスピレートし、新たなＤＦＫ培地を加え、０．１μＭ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ）, ０．５μＭ Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加して、元のｗｅｌｌに戻し、ＣＯ_２インキュベーター内（５％ＣＯ_２、３７℃）で培養する。２日毎に培地交換を行う。培養１２日目に、ＳＦＥＢｓを培地ごと１５ｍＬ コニカルチューブに回収し、５分間常温で静置することで、ＳＦＥＢｓを沈殿させる。上清をアスピレートし、５００μＬのＡｃｃｕｍａｘ（ＭＳ ｔｅｃｈｎｏｓｙｓｔｅｍｓ）を加えて数回ピペッティングした後、ＣＯ_２インキュベーター内（５％ＣＯ_２、３７℃）で５分インキュベートする。インキュベーターから細胞を取り出し、５ｍＬのＤＦＫ培地で懸濁し、数回ピペッティングすることで、細胞塊を分散させる。細胞懸濁液をセルストレーナー（ファルコン）で、フィルトレーションして単一細胞に解離した後に、血球計算版で細胞数をカウントする。細胞懸濁液を、新たな１５ｍＬコニカルチューブに回収し、１０００ｒｐｍ、５分、室温で遠心する。運動神経培養培地（２％Ｂ２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，１％ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ，２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ−グルタミン，１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン−１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン，および０．１ｍｍｏｌ／Ｌ β−メルカプトエタノール含有アドバンスドＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）: ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［１：１］培地））で細胞密度を５．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液に調製し、予めマウス由来野生型アストロサイトまたは変異ヒトＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）発現アストロサイトを８×１０４ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌで播種した８ウェルチャンバーに２００μＬ／ｗｅｌｌで播種し、アストロサイトと運動ニューロンの共培養細胞として評価に使用する（なお野生型、およびヒト変異ＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）発現アストロサイトの樹立・凍結・融解・播種・維持培養は、実施例１３と同様の方法で行う。）。野生型アストロサイトと運動ニューロンとの共培養で観察される運動ニューロン数をコントロールとする。薬物処置群では、変異ヒトＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）発現アストロサイトと運動ニューロンとの共培養を行い、条件をｖｅｈｉｃｌｅ添加（ＩｇＧ、および０．１％ 超純水)，ヒト化抗体の添加とする。各条件で５％ＣＯ_２、３７℃において２日間培養後，抗ＩＳＬ１抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋより入手）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ）を用いて運動ニューロンを免疫細胞化学的に染色する。１ｗｅｌｌあたりのＩＳＬ１／Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２共陽性細胞を生存運動ニューロンとして計数し、運動ニューロン生存率はコントロールに対する％として算出する。

変異ヒトＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）発現アストロサイト／ヒトｉＰＳ細胞由来運動ニューロン共培養では、運動ニューロン生存率は著しく低下する。表５に記載のヒト化抗体は、変異ヒトＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）発現アストロサイトにより誘発されるヒトｉＰＳ細胞由来運動ニューロン死を濃度依存的に抑制する。これによって、抗ＥｐｈＡ４モノクローナルヒト化抗体は、ヒト細胞において運動ニューロンの生存を促進することが示される。

ＥｐｈＡ４に結合し、ＥｐｈＡ４とそのリガンドとの結合を阻害し得る、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片、および、これらを有効成分として含む医薬組成物を提供し得る。本発明に係る抗体または医薬組成物は、ＥｐｈＡ４とそのリガンドの結合に起因する疾患、例えばＡＬＳ、の治療に有用であり得る。

Claims (16)

1. 抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
   前記抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域を含み、
   前記重鎖の可変領域は、
   （ａ）配列番号２７に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ１；
   （ｂ）配列番号２９に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ２；および
   （ｃ）配列番号３０に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ３；
   を含み、
   前記軽鎖の可変領域は、
   （ｄ）配列番号３１に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ１；
   （ｅ）配列番号３２に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ２；および
   （ｆ）配列番号３３に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ３
   を含む、
   抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。
2. 請求項１に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
   ヒト化されている、
   抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。
3. 請求項１または請求項２に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
   前記抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合し、ＥｐｈＡ４とｅｐｈｒｉｎとの結合を阻害する、
   抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
   前記抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片は、重鎖および軽鎖を含み、
   前記重鎖の定常領域および前記軽鎖の定常領域がヒト抗体由来の配列を含む、
   抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。
5. 請求項４に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
   前記重鎖の定常領域はヒトＩｇＧである、
   抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。
6. 請求項５に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
   前記ヒトＩｇＧはヒトＩｇＧ_１またはヒトＩｇＧ_２である、
   抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。
7. 請求項４〜６のいずれか１項に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
   前記軽鎖の定常領域はヒトＩｇκである、
   抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
   前記ＥｐｈＡ４結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖからなる
   群より選択される、
   抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。
9. 請求項８に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片であって、
   前記ＥｐｈＡ４結合断片は、Ｆ（ａｂ’）_２である、
   抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片。
10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片を含む、
    医薬組成物。
11. 請求項１０に記載の医薬組成物であって、
    製薬学的に許容される担体をさらに含む、
    医薬組成物。
12. 請求項１０または１１に記載の医薬組成物であって、
    筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療のために用いられる、
    医薬組成物。
13. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片をコードする単離された核酸。
14. 請求項１３に記載の核酸を含むベクター。
15. 請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
16. 請求項１５に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、抗ＥｐｈＡ４抗体またはそのＥｐｈＡ４結合断片の作製方法。