CN101598733B - Ev71病毒中和表位抗原检测试剂盒或试剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及EV71病毒中和表位抗原检测试剂盒或试剂及其制备方法。具体而言,本发明采用具有光谱性活性的HD6单克隆抗体对EV71病毒抗原进行定量检测。本发明的试剂盒或试剂具有易于操作、灵敏度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及病毒抗原含量检测试剂盒及其制备方法,具体涉及对EV71病毒抗原含量进行定量的酶联免疫试剂盒及其制备方法。
背景技术
手足口病是全球性传染病,世界大部分地区均有此病流行的报道。1957年新西兰首次报道该病,1958年分离出柯萨奇病毒,1959年提出手足口病名称。手足口病的早期病原体主要为Cox A16型,但1969年美国在中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出EV71病毒并被首次确认。此后EV71感染与Cox A16感染交替出现,成为手足口病的主要病原体。20世纪70年代中期,保加利亚、匈牙利相继暴发以中枢神经系统为主要临床特征的EV71性流行病,其中保加利亚于1975年报告病例750例(其中149人致瘫,44人死亡)。1994年英国暴发了Cox A16引起的手足口,病患者大多为1-4岁婴幼儿。英国1963年以来的流行病学数据显示,手足口病流行的间隔期为2-3年。20世纪90年代后期,EV71开始东南亚地区流行。1997年马来西亚发生了主要由EV71引起的手足口病流行,4-8月共有2628人发病,4-6月有29例病人死亡。
由于无疫苗、药物等特异性的防控手段,该病存在隐性感染和轻症病例多,传染源难以发现和控制,儿童普遍易感,传播途径多,难以有效阻断等原因,预防控制EV71带来的手足口病难度较大。由于EV71引起的手足口病影响范围的广泛性、危害的严重性,该病在我国已纳入丙类传染病管理。鉴于此,国内外学者、生物公司正致力于EV71病毒疫苗的研究。
疫苗的有效性在于诱导机体产生中和抗体,与病毒结构蛋白上的 中和抗原表位结合,阻断该表位与敏感细胞的细胞膜上的相应受体结合,从而阻止该病毒入侵敏感细胞,发挥疫苗的保护作用。EV71病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构,无包膜和突出,直径约24~30nm,其基因组为单股正链RNA。EV71型病毒基因组编码的分子量分别为35KD、28KD、24KD和7KD的多肽VP1(α)、VP2(β)、VP 3(γ)、VP4(δ)。这些多肽构成原聚体,继而再拼装成具有五聚体样结构的亚单位(pentameric unit)。60个亚单位通过各自的结构域相互连接,最终形成病毒的外壳。
VP1、VP2和VP3三个多肽暴露在病毒外壳的表面,而VP4包埋在病毒外壳的内侧与病毒核心紧密连接。在这些蛋白中,VP1被认为是负责病毒与靶细胞结合的蛋白质,因此它具有中和病毒主要的抗原决定簇,直接决定病毒的抗原性。A、B、C三基因型EV71病毒的VP1同源性较高,大于94%。资料显示,VP1是一个高度保守的区域,是EV71病毒有效的中和决定簇与合适的靶抗原。VP1起始于2438bp-3328bp(BrCr),由891个核苷酸组成。1999年,Brown等根据1970~1998年分离于美国和其它5个国家的113株EV71的VP1全基因序列,将EV71分为A、B、C三个基因型。核苷酸序列型间差异为16.5%~19.7%。
同时,研究表明肠道病毒存在着众多的型内、型间的交叉反应性,并且存在着较高的重组性。其中EV71与Cox A16的相似性达到了80%,拥有很多共同表位,许多克隆抗体EV71的单抗具有了与Cox A16的交叉反应性。成为EV71抗原检测方法建立的一项制约。
常规的针对EV71病毒的诊断方法主要通过分离病毒,中和抗体检测和免疫组织化学法来进行。但这些方法费时、费力,无法满足疾病流行期间同时大量处理大量标本的需要。同时,鉴于EV71病毒的危害性,有必要开发一种简单快速易行的检测EV71病毒抗原表位含量的检测方法。该研究使用的抗EV71单克隆抗体具有高效的EV71病毒A、B、C三基因型的中和效果,同时与Cox A16无交叉反应性,有效避免了抗原检测中与EV7180%相似性的Cox A16的假阳性干扰。因此,所述方法 的成功开发对于疫苗的研发中抗原表位这一有效组分的检测有着重要的意义,同时该方法也为EV71疾病的防治、早期筛查、诊断工作提供了准确、简便、有效的监测手段,具有广泛的应用范围和社会需求。
发明内容
本发明针对疫苗研发过程中样品有效抗原表位的监控,出于缩短检测周期、节约成本以及尽可能地减少实验动物使用的人道主义精神出发,提供一种EV71病毒中和表位抗原定量酶联免疫诊断试剂盒或试剂、其制备方法及其使用方法。
具体的,本发明一方面提供了一种检测EV71抗原含量的试剂盒或试剂,其包含保藏号为CGMCC No.2937的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段。
另一方面,本发明提供了本发明所述的试剂盒或试剂在定量或定性检测EV71抗原中的用途。
再一方面,本发明提供了一种定量或定性检测EV71抗原的方法,其中包括使用本发明所述的试剂盒或试剂。
还一方面,本发明提供了一种制备本发明所述的试剂盒或试剂的方法,其中使用保藏号为CGMCC No.2937的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段
优选地,本发明所述的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段是生物标记或化学标记的(例如酶标记的或荧光标记的),进一步优选地,其中所述的标记是辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶标记或是荧光素标记、生物素、胶体金离子、碱性磷酸酶标记的。
优选地,本发明的试剂盒或试剂进一步包含针对EV71的多克隆抗体或包被有针对EV71的多克隆抗体的包被板;和/或优选地进一步包含阳性参考品、样品稀释液、浓缩洗液、显色液A、显色液B和终止液和/或说明书。
优选地,本发明所述的针对EV71的多克隆抗体是选自如下基因型病毒的一种或多种的多克隆抗体:A型EV71病毒;选自B1、B2、B3、B4和B5型的B型EV71病毒EV71病毒;以及选自C1、C2、C3、C4和C5型的C型EV71病毒。
优选地,本发明的EV71抗原选自A、B、C三种基因型的EV71病毒的抗原。进一步优选的,所述B型EV71病毒选自B1、B2、B3、B4和B5型EV71病毒,以及C型EV71病毒选自C1、C2、C3、C4和C5型EV71病毒。
优选地,本发明所述的检测方法是通过ELISA方法来实现的;本发明的试剂盒或试剂是用于通过ELISA进行对EV71抗原进行定量的。
另外,对于本发明所述的多克隆抗体或单克隆抗体,其是指针对EV71或EV71抗原的多克隆抗体或单克隆抗体。
与现有技术相比,本发明具有以下突出优点:
1、本试剂盒检测的是EV71中和表位,对于疫苗生产过程中的有效表位的研究具有重要的指导意义。对于疫苗研究过程中有效组分的监控,非常有效。
2、本试剂盒采用多克隆抗体包被,可以最大限度的捕获抗原。
3、本试剂盒采用HD6单克隆抗体作为酶标记第二抗体,该抗体与其他肠道病毒无交叉反应,有效的保证了试剂盒的特异性。
4、该试剂盒可用于EV71病毒A、B、C三基因型抗原的检测,具有广泛适用性,即广谱性。
5、本试剂盒所用包被多克隆抗体和酶标单克隆抗体,对于EV71病毒的A、B、C三种基因型均有较高的中和效果,该试剂盒检测的为病毒的表位,抗原表位与疫苗免疫后效果直接相关,因此,该方法检测到的抗原含量与疫苗的有效性直接相关。可用于疫苗免疫原性与抗原性的相关性分析,便于建立体外检测方法,用于体内试验的替代,减少实验动物的使用。
6、肠道病毒存在着众多的型内、型间的交叉反应性,并且存在着较高的重组性,其中EV71与Cox A16的相似性达到了80%。该方法与Cox A16无交叉反应,说明该HD6单克隆抗体与Cox A16无交叉反应,避免了许多克隆抗体EV71单抗具有与Cox A16的交叉反应性对EV71抗原检测方法建立的制约因素;更加有利于EV71疾病的筛查、手足口病的疾病调查;对于EV71疫苗与Cox A16疫苗的区别、分析、比较至关重要。
为更清楚地说明本发明,现结合如下实施例进行详细说明,但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述,并不能解释为对本申请的限制。
实施例1:EV71纯化液的制备及纯度、活性鉴定
将C4基因型EV71接种于Vero细胞,培养后收获培养液,灭活后纯化EV71病毒,并通过除菌过滤后制备EV71纯化液,以得到免疫抗原。(可参见:Bishop NE,Hago DL,Borovec SV et al.Rapid andefficient purification of hepatitis Avirus from cell culture(快速高效的从细胞培养物中纯化肝炎病毒).J VirolMethods,1994,47:203-216)
对于上述制备的EV71纯化液通过HPLC方法鉴定其抗原纯度,结果大于95%,并将该纯化液于2-8℃下放置。其中,HPLC检测方法包括如下流程:采用PBS平衡柱子40分钟至基线水平后上样;使用加样针吸取100ulEV71纯化液,并注入到加样器中,其中采用TOSHO TSK G6000
PWXL分子筛柱以及缓冲液0.01M PBS pH7.2。HPLC的检测结果如表1所示。
表1 EV71纯化液HPLC结果
当然,本领域技术人员明白,采取上述方法也可制备出其他基因型的EV71纯化液,且制备出的纯化液可用于下面的实施例中。
实施例2:抗EV71多克隆抗体的制备、效价检测以及纯化
将实施例1获得的EV71纯化液用弗氏完全佐剂等体积混合并乳化,以用于免疫新西兰大白兔,从而制备出抗EV71的血清(含抗EV71的多克隆抗体)。
使用间接ELISA法对抗EV71血清进行针对A、B、C三基因型抗体效价检测,同时采用微量中和实验法检测抗EV71多克隆抗体对EV71病毒A、B、C三基因型进行中和试验。
以C4基因型为例,按如下进行抗EV71多克隆抗体的间接法效价检测:将实施例1获得的EV71纯化液稀释100倍后包被于酶标板(100ul/孔),并包被过夜;洗板3遍,用10%小牛血清封闭酶标板,200ul/孔,37℃下封闭1小时;然后将上述获得的抗EV71多克隆抗体的血清进行如下稀释:1∶102、103、104、105、2*105、4*105、8*105和1.6*106,并以100ul/孔的量进行加样,37℃下温育1小时;洗板5遍,加入1∶8,000稀释的羊抗兔Ig-HRP(购自KPL公司)100ul/孔,37℃下温育1小时,并洗板5遍;进行显色,并于450nm下读数。
表2 抗EV71多克隆抗体间接法效价450nm吸光度结果
兔1、兔2两份抗EV71多克隆抗体对于EV71间接ELISA效价均大于1.6*106,大于普遍认可的105的抗体效价,可用于酶联免疫试验的原料制备。
抗EV71多克隆抗体中和试验:
培养Vero细胞,将上述抗EV71多克隆抗体由1∶8开始进行2倍系列稀释至适宜稀释度,每份样品平行稀释2孔。不同稀释度的多克隆抗体血清分别与100CCID50的病毒液混匀,并于36℃下在CO2培养箱中孵育。孵育结束后每孔加入Vero细胞悬液100ul,并于36℃下在CO2培养箱中培养7天,进行病变观察。同时设立阴性对照、标准阳性血清对照、空白样品对照及正常细胞对照。根据病变观察结果确定待测样品(含抗EV71多克隆抗体的血清)的中和抗体滴度。结果见下表。
表3 抗EV71多克隆抗体中和效价结果
结果显示:2份抗EV71多克隆抗体对于EV71病毒A、B、C三基因型均具有较高的中和效果;同时对于国内2007年与2008年广泛流行的C4基因型山东株与C4安徽株同时具有较强的中和效果。因此该2份抗EV71多克隆抗体具有较高的间接法效价与中和效价。
针对上述获得的含抗EV71多克隆抗体的血清进行如下的纯化与纯度分析。
采用葡萄球菌A蛋白(SPA)亲和层析法(可参见:Valds VelizR,Garcia J,Reyes B,et al.A very sensitive enzyme-linkedimmunoabsorbent assay to staphylococcal Protein A in thepresence of immunoglobulins(在免疫球蛋白存在下葡萄球菌A蛋白的高灵敏性酶联免疫吸附试验)).Biochem Biophys Res Commun,2003,303(3):863-867.)对抗EV71多克隆抗体兔1进行纯化;对纯化后的抗EV71多克隆抗体采用BCA试剂盒(Micro BCATM ProteinAssay Kit PIERCE公司,货号23235)检测纯化的抗EV71多克隆抗体的蛋白浓度为11.2mg/ml;将适当稀释的抗EV71多克隆抗体进行SDS-PAGE还原型电泳:适当稀释纯化的多克隆抗体后取100ul,加入6*SDS-PAGE电泳上样缓冲液20ul,沸水煮沸混合样品3-5分钟;配制SDS-PAGE还原型电泳胶,将煮沸后的样品取样10ul上样进行电泳;预染蛋白marker(美国,New England Biolabs)上样13ul;电泳结束后将电泳胶采用考马斯亮蓝染色,用脱色液脱色完全;扫描电泳胶,分析纯化抗体的纯度。
经分析,纯化后兔抗EV71多克隆抗体在约48KD与22KD有两条主蛋白条带,分别为多克隆抗体的重链与轻链;纯化抗体的纯度为:97.8%,纯度≥80%,纯度较高。通过上述制备流程与纯化方法,可以制的高纯度的兔抗EV71多克隆抗体,满足酶标试验的要求。
从上可以看出,通过上述方法制备了与EV71病毒具有高活性、与EV71病毒A、B、C三基因型具有广谱中和效果的兔抗EV71多克隆抗体,且该多克隆抗体经纯化后,纯化大于95%,可用于ELISA原料。对纯化后的抗EV71多克隆抗体采用2ml/支进行分装,共5支,-20℃冻存。
实施例3:抗EV71单克隆抗体的制备
采用EV71纯化液三次免疫BALB/c小鼠,对间接ELISA法效价最高的BALB/c小鼠取脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按比例融合,于HAT培养液上培养融合杂交的瘤细胞。进行三次亚克隆,每次亚克隆时,检测各细胞孔的间接ELISA法效价,对于OD值大于0.4的孔进行克隆化。间接法检测方法:采用A、B、C三基因型EV71纯化液1∶100包被酶标板,加入细胞培养上清,采用羊抗小鼠IgG-HRP(JacksonImmunoresearch公司)作为酶标试剂。
最终,本申请的发明人经过上述筛选获得了理想的杂交瘤细胞株,申请人于2009年3月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区大屯路,中国科学院微生物研究所)对其进行了保藏,保藏号为CGMCC No.2937(所对应的本发明的编号为HD6,分类命名是抗EV71单克隆抗体细胞株)。
将上述保藏的HD6细胞株进行扩大培养,并将细胞注射BALB/c小鼠腹腔,制备抗EV71单克隆抗体腹水。(可参见:金伯泉主编.2002.《细胞和分子免疫学试验技术》.第四军医大学出版社.p9-17)
对制备的抗EV71单克隆抗体腹水HD6进行间接ELISA法效价检测:将按照实施例1所制备的EV71纯化液按1∶100稀释后以100ul/孔包被于酶标板,并过夜;加入封闭液,封闭后将腹水以1∶102、1∶103、1∶104、1∶105、1∶106和1∶107的比例稀释,并以100ul/孔加样;反应后洗板,加入1∶10000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP;反应后洗板显色终止读数。结果如表4所示。
表4 HD6单克隆抗体腹水间接法效价检测450nm吸光度结果
结果显示:HD6单克隆抗体对于A、B、C型EV71病毒均有较强的间接ELISA法的活性。
对HD6的单克隆抗体进行中和效价检测
同实施例2的中和抗体实验一样,将HD6单克隆抗体腹水与A、B、C基因型EV71病毒进行中和实验,结果如表5所示。
表5 HD6单克隆抗体腹水A、B、C基因型EV71病毒中和实验结果
从上表可以看出,阴性对照<1∶8,实验成立。进一步地,HD6对EV71 病毒A、B、C三基因型均具有较高中和活性的单克隆抗体细胞株,具有广谱中和活性。
针对上述获得的含抗EV71单克隆抗体的腹水进行如实施例2一样的纯化与纯度分析。采用KODAK Ge1200凝胶成像仪扫描电泳图分析,抗EV71单克隆抗体在50KD与28KD左右有两条蛋白条带,分别为单克隆抗体的重链与轻链;纯度为:93.2%,纯度≥80%,纯度较高。由此,可制得可用于酶标试验的、高纯度的抗EV71单克隆抗体。
实施例4:EV71抗原参考品的制备
将C4型EV71病毒纯化液配制为抗原含量为400U/ml的溶液;然后向该溶液添加牛血清白蛋白(BSA,Maverick,纯度>98%,货号00906)作为保护剂。对其进行分装,1.0ml/瓶,制备EV71抗原参考品;并进行37℃热加速试验,其中分别于1天、3天、7天、14天取样,进行抗原含量检测,结果如下表。
表6 抗原参考品热加速试验结果
结果显示:
1、同一温度下3次试验结果变异系数<15%,试验无差异;
2、3次检测,每一次样品的37℃不同时间的结果,变异系数<15%,说明该配方组成下的抗原参考品37℃放置14天,抗原含量稳定,无 下降。
该配方下,EV71抗原参考品37℃热加速14天,抗原含量保持稳定。将采用该配方配制的EV71抗原参考品分装于2ml的西林瓶,1.0ml/瓶,置于2-8℃长期放置,以作为本发明方法的检测用抗原参考品。检测样品时,可将参考品稀释至抗原含量为80、40、20、10、5U/ml。
实施例5:抗EV71多克隆抗体包被板的制备
使用实施例2制备的纯化的抗EV71多克隆抗体作为包被抗体,以最佳包被抗体浓度(11.2mg/ml,用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释)每孔100ul加于酶标板反应孔内,并于4℃下放置14-20小时。弃去包被液,用洗液洗板3次,拍干;加入封闭液(10%小牛血清,0.01MPBS)150u l/孔,于37℃下封闭1小时,弃去封闭液,拍干,15-30℃自然干燥4小时,真空封装,最后将封装后的包被板于2-8℃下保存。
实施例6:酶标抗体的制备:将实施例3中获得的纯化抗EV71单克隆抗体HD6采用过碘酸钠氧化法标记辣根过氧化物酶,标记后加等体积甘油分装,-20℃放置。
实施例7:样品稀释液、浓缩洗液、终止液的配制
1、样品稀释液
小牛血清 100ml
0.01M PBS 900ml
生物素防腐剂 0.5ml
2、浓缩洗液
NaH2PO4.2H2O 2.96g
Na2HPO4.12H2O 29.0g
NaCl 234g
Tween-20 20ml
加纯化水至 1000ml
3、终止液
浓硫酸 112ml
纯化水 888ml
实施例8:显色液的配制
1)显色液A
醋酸钠 27.2g
柠檬酸 3.2g
30%H2O2 0.6ml
双蒸水至 1000ml
2)显色液B
TMB 0.4g
EDTA-Na2 0.4g
柠檬酸 1.9g
甘油 100ml
双蒸水至 1000ml
实施例9:试剂盒检测操作程序
对于本发明的试剂盒,可采用如下步骤进行使用:
1)取出试剂,室温平衡15-30分钟;
2)将400U/ml的抗原参考品稀释至80、40、20、10、5U/ml,采用样品稀释到该抗原含量范围;
3)100ul/孔加入抗原参考品,样品稀释液作为阴性对照,稀释样品,各加2孔;37℃孵育70分钟;
4)用1∶20倍稀释的洗液洗板5遍,最后一次拍干;
5)每孔加100ul标记的单克隆抗体,37℃下孵育60分钟;
6)同4)进行洗板;
7)用1∶1混合的显色液A、显色液B以100ul/孔的量加至酶标板,37℃下孵育10分钟;
8)加入终止液,2M H2SO450u1/孔,在酶标仪上读取450nm的OD值;
9)中和表位抗原含量计算。
对于本发明的抗原含量的计算,可采用如下方法进行:将抗原参考品的中和表位抗原含量对OD值均值采用Excel进行散点作图,添加趋势线,选取“显示公式”与“显示R平方值”;要求R平方值≥98%试验方成立;将待检样品的OD值均值代入公式的Y,计算稀释后的中和表位抗原含量;样品的中和表位抗原含量为=计算结果x稀释倍数。
上述操作程序和/或抗原含量的计算方法可作为本发明试剂盒的说明书而成为试剂盒的一部分。
实施例10:试剂盒的线性范围、线性、特异性、灵敏度、准确性、精密性与重复性检测。
对于本实施例中所用到的各试剂或材料,如包被的酶标板以及标记的单克隆抗体等,如果上述各实施例具体涉及到了其制备,则本实施例中所用到的试剂或材料即是上述实施例所制备的试剂或材料。
1)灵敏度与线性范围见表
将实施例4中的EV71抗原参考品稀释至160U/ml,然后以2倍梯度稀释至:80、40、20、10、5、2.5U/ml,加样于酶标板,并采用实施例9的程序进行试验。结果如下:
表7 EV71抗原检测方法灵敏度与线性范围试验吸光度值
抗原含量在80-5U/ml时,0D值≥阴性对照*2.1,该方法的检测灵敏度为5U/ml。抗原含量在80-5U/ml时,连续5点线性≥0.98,检测线性范围为80-5U/ml。
2)线性
实施例4中的EV71抗原参考品400U/ml用样品稀释液稀释至80、40、20、10、5U/ml,采用实施例9的程序进行试验,结果见下表。
表8 EV71抗原检测方法线性试验吸光度值结果
结果显示:该方法的线性相关系数R2≥0.99。线性良好。
3)特异性
采用实施例9的程序对:甲肝病毒收获液、乙脑病毒灭活液、H5N1灭活疫苗原液、新生牛血清、人白蛋白、2%血清维持液、Vero细胞、CoxA16收获液进行特异性试验,检测结果见下表9。
表9:检测EV71病毒抗原含量方法特异性试验450nm吸光度结果
结论:该试剂盒仅对EV71抗原参考品反应,而对Vero细胞、甲肝病毒收获液、Cox A16、乙脑病毒灭活液等等无反应。由此说明,该检测系统对于EV71抗原有较高的特异性。
4)准确性试验
双人稀释EV71抗原参考品,使理论抗原含量依次为10U/ml、20U/ml、40U/ml,采用实施例9的实验程序,检测上述稀释的抗原含量,其中每人单独稀释8次以获得针对每个抗原含量的8份平行的抗原参考品;比较检测结果与理论值的差异,统计各样品检测的准确性。结果如下:
表10 EV71抗原检测方法准确性试验
结果:10u/ml准确性为:89%-116%;20u/ml准确性为:88%-119%;40u/ml准确性为:92%-115.5%。准确性在80%-120%之间,准确性较高。
5)精密性试验:
将EV71抗原参考品双人分别稀释,使理论抗原含量依次为10U/ml、20U/ml、40U/ml,采用实施例9的实验程序,检测上述稀释样品的抗原含量,其中每人单独稀释8次以获得针对每个抗原含量的8份平行的抗原参考品;分析变异系数(CV%)即检测精密性。结果如下:
表11 EV71抗原检测方法精密性试验结果
结果显示,单人8次的变异系数均小于10%,变异系数较小,精密性高。
6)双人重复性试验:
对EV71抗原参考品双人分别稀释,使理论抗原含量依次为10、20、40U/ml,每人稀释8次,采用实施例9的实验程序检测稀释样品的抗原含量,进行重复性试验,结果如下:
表12 EV71抗原检测方法重复性试验结果
双人重复试验显示:变异系数<10%,具有较好的重复性。
实施例11:试剂盒的应用
本发明的试剂盒包括:抗EV71多克隆抗体包被板为1块,酶标记物为1瓶,抗原参考品为1瓶,样品稀释液为1瓶,显色液A为1瓶、显色液B为1瓶,终止液为1瓶,浓缩洗液为1瓶,和/或说明书为1份。
同实施例10一样,对于本实施例中所用到的各试剂或材料,如包被的酶标板以及标记的单克隆抗体等,如果上述各实施例具体涉及到了其制备,则本实施例中所用到的试剂或材料即是上述实施例所制备的试剂或材料。
应用该试剂盒并根据实施例9的试剂盒操作流程进行EV71病毒纯化前、后样品的抗原含量检测、EV71病毒纯化中间产品的抗原含量检测以及EV71疫苗解离后抗原含量的检测,以证明该试剂盒对于EV71病毒较纯样品与杂的样品检测的适用性,方法对于EV71病毒纯化中间产品的监控性以及对于EV71铝吸附抗原的检测情况。
1、EV71病毒纯化前、后样品抗原含量检测分析
检测A、B、C基因型EV71病毒纯化前、后样品的抗原含量,分析该方法对于不同基因型EV71病毒的检出性,结果见下表。
表13 EV71抗原检测方法对EV71病毒纯化前后样品检测结果
结果显示:对于EV71病毒A、B、C三基因型纯化前后样品具有较好的反应性和检出性。
2、EV71病毒纯化中间产品抗原含量分析
检测三批C4型EV71病毒纯化中间产品的抗原含量,计算单位蛋白浓度下抗原含量的变化,分析纯化工艺是否可以有效的去除无关蛋白,富集有效的EV71抗原决定簇抗原(见表14)。
表14 EV71抗原检测方法工序分析
随着EV71病毒的纯化工艺不断深化,检测到的单位蛋白中的抗原含量整体呈上升趋势,说明该试剂盒能检测不同含量的抗原,能反映工艺的有效即反应工艺流程是否去除了杂蛋白并富集了EV71抗原。同时,该试剂盒的检测结果与纯化工艺相吻合,反应了纯化趋势,验证了本发明试剂盒的有效性。
3、疫苗解离抗原分析
将8批C4型EV71疫苗采用柠檬酸缓冲系统进行铝吸附样品的解离,检测解离后样品的抗原含量;将检测结果与理论值比较,分析该试剂盒对于EV71铝吸附样品的检测效果。结果如下:
表15 EV71双抗体夹心ELISA检测方法成品检测分析
应用该试剂盒检测铝吸附EV71解离后样品的抗原,与理论值比较,回收率在82%-119%之间,具有较好的准确性,可用于EV71疫苗中抗原含量的检测。
该方法对于EV71病毒纯化前、后的样品检测效果好;对于EV71纯化中间产品的抗原含量检测结果与纯化工艺相吻合,反映了EV71病毒抗 原决定簇的纯化趋势;同时该方法对于解离后的EV71铝吸附样品的抗原含量检测结果与理论值的回收率为82%-119%,准确性高。
另外,本发明人利用本实施例的上述试剂盒并采用实施例9中所述的试剂盒检测操作程序对一些病毒抗原样本进行了检测,结果如下:
表16 EV71抗原检测方法对不同基因型EV71病毒种子检测结果
在此需要申明的是,本发明的发明人通过对其他基因型的EV71病毒进行了与本实施例类似的实验,也同样获得了与上述一致的结果。另外,本发明的发明人通过使用其他基因型的多克隆抗体(如A型和B3型)以及HD6单克隆抗体对基因型A、B3以及C4的抗原进行了同本实施例相似的实验,也取得了类似的结果,在此不一一赘述。
结论:
由于多克隆抗体具有较强的病毒捕获性,而单克隆抗体的特异性较强,同时单克隆抗体为病毒的抗原决定簇表位,因此确定选用多克隆抗体包被和单克隆抗体标酶的模式建立中和表位抗原含量定量的酶联免疫检测方法。
该EV71抗原检测方法具有较好的特异性,尤其是对于Cox A16无交叉反应性;双人对于EV71纯化前、后的样品进行抗原含量重复检测,两人的变异系数<10%,重复性良好;3次的线性相关系数均>0.99,线性较好;对于EV71病毒纯化前后的样品、铝佐剂吸附EV71样品均能较好的检测;同时该试剂盒的检测结果与EV71疫苗的纯化工艺相吻合,反映了EV71抗原决定簇的纯化效果。
由于用于包被的抗EV71多克隆抗体对于EV71病毒A、B、C三基因型具有较好的中和效果,同时用于酶标记的抗EV71单克隆抗体(HD6)为EV71病毒A、B、C的中和性单克隆抗体,因此该方法检测的为EV71病毒抗原决定簇的抗原含量,可用于EV71各基因型病毒中和表位抗原含量的检测,能最有效的反应疫苗的抗原性,更有利于指导EV71病毒疫苗的生产,并用于疫苗抗原性与免疫原性的评价。
Claims (15)
1.一种检测EV71抗原含量的试剂盒或试剂,其包含保藏号为CGMCC No.2937的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段。
2.根据权利要求1所述的试剂盒或试剂,其中所述的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段是生物标记或化学标记的。
3.根据权利要求2所述的试剂盒或试剂,其中所述的标记是辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、碱性磷酸酶标记或葡萄糖氧化酶标记或是荧光素、生物素、胶体金离子标记的。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒或试剂,其进一步包含针对EV71的多克隆抗体或包被有针对EV71的多克隆抗体的包被板。
5.根据权利要求4所述的的试剂盒或试剂,其中针对EV71的多克隆抗体是针对选自如下基因型病毒的一种或多种的多克隆抗体:A型EV71病毒;选自B1、B2、B 3、B4和B5型的B型EV71病毒;以及选自C1、C2、C3、C4和C5型的C型EV71病毒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒或试剂,其进一步包含阳性参考品、样品稀释液、浓缩洗液、显色液和终止液和/或说明书。
7.根据权利要求1所述的试剂盒或试剂,其中所述的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段是酶标记的或荧光标记的。
8.权利要求1-7任一项所述的试剂盒或试剂在定量或定性检测EV71抗原中的用途。
9.权利要求8所述的用途,其中EV71抗原是选自至少一种A、B、C三种基因型的EV71病毒的抗原。
10.权利要求9所述的用途,其中所述B型EV71病毒选自B1、B2、B3、B4和B5型EV71病毒,以及C型EV71病毒选自C1、C2、C3、C4和C5型EV71病毒。
11.一种定量或定性检测EV71抗原的方法,其中包括使用权利要求1-7任一项所述的试剂盒或试剂或使用保藏号为CGMCC No.2937的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段。
12.根据权利要求11所述的定量或定性检测EV71抗原的方法,其中EV71抗原为选自A、B、C三种基因型的EV71病毒的抗原。
13.根据权利要求12所述的定量或定性检测EV71抗原的方法,其中所述B型EV71病毒选自B1、B2、B3、B4和B5型EV71病毒,以及C型EV71病毒选自C1、C2、C3、C4和C5型EV71病毒。
14.根据权利要求11-13中任一项的方法,其是通过间接ELISA法进行的。
15.一种制备权利要求1-7任一项所述的试剂盒或试剂的方法,其中使用保藏号为CGMCC No.2937的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段。
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