CN103374069B - 一种抗狂犬病毒的结合分子2e1 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗狂犬病毒的结合分子2E1。本发明的结合分子能够结合具有天然构象的狂犬病毒，与一些动物源性的结合分子相比，本发明的结合分子免疫原性大大减少，且亲和性良好。不仅治疗效果好，而且副作用低。

Description

一种抗狂犬病毒的结合分子2E1

技术领域

本发明属于生物技术和免疫学领域；更具体地，本发明涉及一种抗狂犬病毒的结合分子。

背景技术

狂犬病是一种病毒性人畜共通的传染病，可以在人类和动物之间传播。大多数人类的狂犬病毒感染始于被RV病毒感染的动物咬伤或抓伤，病毒通过动物唾液进入人体。人类患狂犬病的临床表现可分为四个阶段，潜伏期(平均1-3个月，没有任何症状)、前驱期(感染者开始出现全身不适、发烧、疲倦、不安等症状)、兴奋期(全身痉挛、幻觉、怕水怕光怕风)、昏迷期(深度昏迷，最后因咽喉部痉挛窒息身亡或衰竭而死)。在未接种疫苗的动物或人类中，患狂犬病几乎是100％死亡率(参考A Human Monoclonal Antibody Cocktail as a NovelComponent of Rabies Postexposure Prophylaxis，2007)。

全球，每年大约有一亿人需要狂犬病毒的暴露后处理，约有4-7万人每年死于狂犬病，95％主要集中在非洲、中国和印度。因此，目前迫切需要对于狂犬病的安全、有效、价格低廉的预防治疗方法。

狂犬病毒(Rabies virus，RABV)属于弹状病毒科弹状病毒属，是引起狂犬病的病原体。它的外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链RNA。病毒颗粒外有囊膜，内有核蛋白壳。囊膜的最外层有由糖蛋白构成的许多纤突，排列比较整齐，此突起具有抗原性，能刺激机体产生中和抗体。病毒含有5种主要蛋白(L、N、G、M1和M2)和2种微小蛋白(P40和P43)。L蛋白呈现转录作用；N蛋白是组成病毒粒子的主要核蛋白，是诱导狂犬病细胞免疫的主要成分，常用于狂犬病病毒的诊断、分类和流行病学研究；G蛋白是构成病毒表面纤突的糖蛋白，具有凝集红细胞的特性，是狂犬病病毒与细胞受体结合的结构，在狂犬病病毒致病与免疫中起着关键作用；M1蛋白为特异性抗原，并与M2构成细胞表面抗原。

目前用来预防那些已暴露在狂犬病毒下的人出现类似狂犬病的症状的主要方法，就是使用减毒的狂犬病毒作为疫苗再结合从免疫过的人或马体内获得的免疫球蛋白。但这些血液制品的安全问题及批次间的不稳定性等大大限制了该方法的应用性，迫使人们寻求新的预防和治疗狂犬病的方法。

治疗性抗体用于病毒感染性疾病的治疗早有报道，抗血清用于治疗SARS和重症H5N1禽流感病毒感染者的案例已经证明了抗体在治疗病毒感染中发挥的重要作用。具有中和活性的抗狂犬病毒的全人单克隆抗体具有以下潜在优势：一方面它可以阻断病毒与靶细胞的结合；另一方面通过补体和T细胞、NK细胞等效应细胞的作用，将被病毒感染的细胞杀死。1986年，第一株治疗器官移植出现的排斥反应的鼠单抗——莫罗单抗-CD3(murmonabCD3，hocloneOKT3)获得美国FDA批准上市，但由于其在人体内会产生人抗鼠抗体(HAMA)反应，限制了应用。随着免疫学和分子生物学的发展，基因工程抗体迅速发展，嵌合抗体，人源化抗体和全人抗体生产技术不断发展，将HAMA反应降至最低乃至消除。2009年，美国FDA批准的14个药物中有4个为全人抗体，这标志着全人治疗性单克隆抗体时代的来临，全人抗体成为抗体药物未来的发展方向(参考A Human Monoclonal Antibody Cocktail as a Novel Component of RabiesPostexposure Prophylaxis，2007)。

狂犬病毒主要蛋白中的G蛋白，能与乙酰胆碱受体结合从而使病毒具有神经毒性，并是目前已知的唯一使体内产生保护性中和抗体的蛋白，因而成为科学家们研究制备抗体药物的对象。图8为G蛋白的结构示意图。狂犬病病毒G蛋白通常由524个氨基酸组成，其中前19个氨基酸构成疏水性信号肽，介导G蛋白进入内质网，信号肽被切除后形成由505个氨基酸组成的成熟G蛋白。成熟G蛋白在结构上分为3个区域：1～439位氨基酸构成膜外区，位于病毒颗粒包膜的表面，携带有狂犬病病毒主要的抗原决定位点，并参与受体识别和膜融合的过程；440～461为跨膜区，与G蛋白在病毒脂质双层膜上的固定有关；462～505为膜内区，位于病毒包膜内表面，提供M与N的作用位点(参考AHuman Monoclonal Antibody Cocktail as a Novel Component of RabiesPostexposure Prophylaxis，2007)。

至2011年，已经明确的G蛋白的中和抗原位点有三个：G1只含有一个表位，是次要抗原位点；GII位于34～200位氨基酸区段，其中两个主要表位(34～42和198～200区段)通过二硫键连接，是一个典型的空间构象抗原位点；G III大致位于330～357区段，是最主要的抗原区，也是空间依赖性抗原位点。此外，G上还存在一些线性中和表位：244～281位氨基酸表位、218～240位氨基酸表位、251位色氨酸(Trp251)表位。目前市场上应用最广的狂犬病毒中和性单抗SO57是作用于图8所示的抗原区I的表位上。

由此可见，针对狂犬病毒G蛋白而开发的结合分子，未来在对于狂犬病毒暴露后预防及后续的治疗中必将产生重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗狂犬病毒的结合分子。

在本发明的第一方面，提供一种分离的结合分子，其能识别并结合狂犬病毒包膜蛋白G蛋白，所述结合分子包含SEQ ID NO：8所示重链CDR1区、SEQID NO：9所示重链CDR2和SEQ ID NO：10所示重链CDR3区；和

所述结合分子包含SEQ ID NO：14所示轻链CDR1区、SEQ ID NO：15所示轻链CDR2和SEQ ID NO：16所示轻链CDR3区。

在一个优选例中，所述的结合分子包含重链可变区，所述的重链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的结合分子包含轻链可变区，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的结合分子是人单克隆抗体。

在本发明的另一方面，提供编码所述的结合分子的核酸分子。

在本发明的另一方面，提供所述的结合分子在制备用于诊断、治疗和/或预防狂犬病毒感染的药物中的用途。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体，所述表达载体中含有编码所述的结合分子的DNA。

在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有所述的表达载体。

在本发明的另一方面，提供一种组合物，它含有有效量的所述的单克隆抗体，以及药学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种检测狂犬病毒的试剂盒，其包括所述的结合分子。

在本发明的另一方面，提供一种抑制狂犬病毒的方法(较佳地，为非治疗性的方法)，所述的方法包括给予对象(如受试者、患者，或分离自疑似狂犬病毒的场所(如公共区域，车辆，家具等))有效量的所述的结合分子。

在本发明的另一方面，提供一种检测狂犬病毒的方法(较佳地，为非诊断性的方法)，利用所述的结合分子与待测样品进行接触，通过检测所述的结合分子与受试样品的结合情况，获得狂犬病毒的存在情况以及存在量。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、FACS流式细胞仪分选特异性B细胞。

图2、β-actin内参的电泳图谱。

图3、重链基因的电泳图谱。

图4、轻链基因的电泳图谱。

图5、全人单克隆抗体(2E1等)的浓度测定结果。

图6、全人单克隆抗体(2E1等)抗原抗体特异性检测。

图7、全人单克隆抗体(2E1)假病毒中和活性检测。

图8、狂犬病毒G蛋白的结构示意图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，获得一种含有独特的CDR区的抗狂犬病毒广谱中和性的结合分子，优选全人单克隆抗体，该结合分子对于狂犬病毒具有良好的中和作用。在此基础上完成了本发明。

结合分子

本发明提供了能特异性结合狂犬病毒的结合分子。优选地，所述结合分子是人结合分子，其能识别并结合狂犬病毒包膜蛋白G蛋白。本发明的结合分子呈现对于狂犬病毒的中和活性。

本发明的结合分子可以是完整的免疫球蛋白分子例如多克隆或单克隆抗体或者所述结合分子可以是抗原结合片段，包括但不限于Fab、F(ab’)、F(ab’)₂、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体以及至少含有足以赋予与狂犬病毒毒株的特异性抗原结合的免疫球蛋白的片段的(多)肤或其片段。在优选实施方案中，本发明的结合分子是人单克隆抗体。

根据Kabat et al.(1991)所述，CDR区是免疫学感兴趣的蛋白质的序列。在本发明的实施方案中，结合分子可包含本文揭示的二、三、四、五或者所有六个CDR区。优选地，本发明的结合分子包含本文揭示的至少两个CDR。

本发明的另一方面包括本文所述结合分子的功能变体。如果变体能与亲代结合分子竞争特异性结合狂犬病毒或其蛋白片段，则认为该变体分子是本发明结合分子的功能变体。换句话说，所述功能变体仍能结合狂犬病毒或其片段。优选地，所述功能变体能竞争性特异性结合由亲代结合分子特异性结合的至少两(或更多个)不同的狂犬病毒毒株或其片段。此外，如果某分子对于亲代结合分子对其具有中和活性的狂犬病毒、优选对于至少两(或多个)狂犬病毒毒株具有中和活性，则认为该分子是本发明结合分子的功能变体。功能变体包括但不限于一级结构序列基本相似、但是含有例如在亲代结合分子中未发现的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。这种修饰包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。换句话说，亲代结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的所述结合分子的结合特性，即所述结合分子仍能识别并结合其靶位。

所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域已知的标准技术导入，例如定向诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。

保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半肤氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸残基家族分类方式。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换。相似的小变异也可包括氨基酸缺失或者插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫学活性的指导。

此外，功能变体可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代结合分子相比可具有相同或不同的、更高或更低的结合亲和性，但是仍能结合狂犬病毒包膜蛋白G蛋白或其片段。例如，本发明的功能变体与亲代结合分子相比对于狂犬病毒包膜蛋白G蛋白或其片段可具有增加或降低的结合亲和性。优选地，可变区包括但不限于构架区、高变区、特别是CDR3区的氨基酸序列被修饰。通常，轻链和重链可变区包含三个高变区，包括三个CDR，以及更保守的区域，即所谓的构架区((FR)。高变区包含来自CDR的氨基酸残基和来自高变环的氨基酸残基。在本发明范围内的功能变体与本文所述亲代结合分子具有至少大约50％至大约99％、优选至少大约60％至大约99％、更优选至少大约70％至大约99％、甚至更优选至少大约80％至大约99％、最优选至少大约90％至大约99％、特别是至少大约95％至大约99％，以及特别是至少大约97％至大约99％的氨基酸序列同源性。本领域技术人员已知的计算机算法如Gap或者Bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以进行对比以及明确相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过使用本领域已知的普通分子生物学方法改变亲代结合分子或其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错PCR、寡核苷酸指导的诱变、定点诱变以及重链和/或轻链改组法。所述中和活性与亲代结合分子相比可以相同或者更高或更低。此后，当使用术语(人)结合分子时，其也涵盖所述(人)结合分子的功能变体。

作为本发明的优选方式，所述的结合分子是单克隆抗体，优选它包括人源的恒定区(如人源恒定区IgH序列和IgKappa序列)。所述的抗狂犬病毒单克隆抗体的重链可变区、轻链可变区以及位于重链可变区和轻链可变区的互补决定区(CDR)均具有独特的不同于现有技术的结构，且它们是全人源的。

本发明包括：具有所述单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体，具有所述单克隆抗体可变区链的单克隆抗体。本发明还包括具有含所述的互补决定区(CDR)的轻链和重链的任何抗体，以及CDR区与本发明的单克隆抗体的CDR具有90％以上(较佳地95％以上)的同源性的任何抗体。

抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，所述的CDR区将可变区间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

对于本发明的单克隆抗体重链和轻链序列，可以用常规方法测定。经验证，本发明的抗狂犬病毒单克隆抗体的CDR区是全新的，技术构思不同于现有的抗狂犬病毒抗体。

本发明的单克隆抗体是全人源的，其重链、轻链可变区以及恒定区均来源于人抗体。因此，其在具有特别优异的识别和中和狂犬病毒的作用的同时，还具有免疫原性低、安全性高的特点。

另一方面，本发明包括免疫缀合物，即包含本文所述至少一个结合分子以及进一步包含至少一个标记如可检测的部分/物质的分子。本发明还涉及本发明免疫缀合物的混合物或者至少一种本发明免疫缀合物与另一分子的混合物，所述另一分子如治疗剂或者另一结合分子或免疫缀合物。本发明的免疫缀合物可包含一个以上的标记。这些标记可以彼此相同或不同，并且可以与结合分子非共价地结合/缀合。所述标记也可以通过共价键与人结合分子直接结合/缀合。或者，所述标记可以通过一或多种连接化合物与所述结合分子结合/缀合。标记与结合分子的缀合技术为本领域技术人员所熟知。

本发明的免疫缀合物的标记可以是治疗剂，但是它们也可以是可检测的部分/物质。适于治疗和/或预防的标记可以是毒素或者其功能部分、抗生素、酶、增强吞噬作用或者免疫刺激作用的其它结合分子。包含可检测物质的免疫缀合物可诊断性地用于例如评定对象是否已经感染狂犬病毒毒株或者作为临床实验程序的一部分监测狂犬病毒感染的发生或进展以例如确定指定治疗方案的功效。然而，它们也可以用于其它检测和/或分析和/或诊断目的。可检测的部分/物质包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记结合分子的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术、激光扫描细胞计量术检测、荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、生物测定(例如吞噬作用测定)、蛋白质印迹应用等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。

此外，本发明的人结合分子或者免疫缀合物也可以附着于固体支持物上，其特别用于狂犬病毒包膜蛋白G蛋白或其片段的体外免疫测定或者纯化。这种固体支持物可以是多孔或者无孔的、平面或非平面的。本发明的结合分子可以与标记序列如肤融合以便于纯化。所述标记序列的例子包括但不限于六组氨酸标记、血凝素(HA)标记、myc标记或者flag标记。或者，一种抗体可以与另一种抗体缀合形成抗体异源缀合物(heteroconjugate)。

另一方面，本发明的结合分子可以与一或多个抗原缀合/附着。优选地，这些抗原是由给予了结合分子-抗原缀合物的对象的免疫系统识别的抗原。所述抗原可以彼此相同，但也可以是不同的。使附着抗原和结合分子的缀合方法为本领域所熟知，包括但不限于使用交联剂。本发明的结合分子结合狂犬病毒并且附着于结合分子的抗原将引发对于所述缀合物的有力T细胞攻击，最终导致狂犬病毒的破坏。

除了通过直接或间接(例如通过接头)缀合而化学产生免疫缀合物之外，所述免疫缀合物可以作为融合蛋白而产生，所述融合蛋白包含本发明的结合分子及合适的标记。融合蛋白可以通过本领域已知方法产生，例如通过构建核酸分子以及随后表达所述核酸分子而重组产生，所述核酸分子包含符合读框的编码结合分子的核苷酸序列以及编码合适标记的核苷酸序列。

本发明另一方面提供了编码本发明的至少一种结合分子、其功能变体或者免疫缀合物的核酸分子。这种核酸分子可以用作中间物以进行克隆，例如用于如上述的亲和力成熟方法中。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子是分离或纯化的。DNA分子的序列可以用常规技术，或利用杂交瘤技术获得。

本领域技术人员将意识到这些核酸分子的功能变体也是本发明的一部分。功能变体是这样的核酸序列，通过使用标准遗传密码可以将其直接翻译以提供与从亲代核酸分子中翻译的序列相同的氨基酸序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的结合分子(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的结合分子的序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。优选的，本发明的载体是例如含病毒启动子的质粒表达载体，且在所述表达载体中分别插入了抗狂犬病毒单克隆抗体重链可变区(VH)与恒定区的IgH(来自人源IgH的恒定区)融合序列和轻链可变区VL与人体Igkappa(来自人源Igkappa的恒定区)融合序列。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：细菌细胞如大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS7、NSO或Bowes黑素瘤细胞等。特别适用于本发明的宿主细胞是真核宿主细胞，尤其是哺乳动物细胞，如293细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，或常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的结合分子。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

本发明的结合分子优选的是采用哺乳动物细胞来生产，哺乳动物细胞通常需要在含血清的培养基中进行培养。需要对细胞进行无血清的适应过程后，方可让细胞在无血清培养基中正常的生长。

如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的结合分子也可以在转基因非人哺乳动物如兔、山羊或者牛中产生，并且分泌进例如其乳中。

药物组合物

本发明的结合分子可用于制备抑制狂犬病毒的组合物。

基于本发明的新发现，还提供了一种可抑制狂犬病毒或狂犬病毒感染相关疾病的组合物，其包含：有效量的本发明所述的结合分子；以及药学上可接受的载体。

本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的结合分子相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低组合物的效果。

可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。

本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。

本发明的结合分子可以以未分离的或者分离的形式使用。此外，本发明的结合分子可以单独应用或者于包含至少一种本发明的结合分子(或其变体或片段)的混合物中应用。换句话说，所述结合分子可以组合应用，例如作为包含两或更多种本发明的结合分子、其变体或片段的药物组合物。例如，具有不同但互补活性的结合分子可以组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用，但是或者也可以将具有相同活性的结合分子组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用。任选地，所述混合物进一步包含至少一种其它治疗剂。优选地，所述治疗剂如MZ抑制剂(例如amantidine、金刚乙胺(rimantadine))和/或神经氨酸酶抑制剂(例如扎那米韦((zanamivir)、奥司他韦(oseltamivir))可用于预防和/或治疗狂犬病毒感染。

所述药物组合物可包含两或多个对于狂犬病毒具有中和活性的结合分子。在一个实施方案中，当组合应用时，所述结合分子呈现协同中和活性。换句话说，所述组合物包含至少两种具有中和活性的结合分子，特征在于所述结合分子在中和狂犬病毒中起协同作用。如本文所用，术语“协同”是指当组合应用时，结合分子的组合作用高于单独应用时的加合作用。所述协同作用的结合分子可以结合狂犬病毒的相同或不同片段上的不同结构。计算协同作用的方式是通过组合指数计算。组合指数(CI)的概念已经由Chou and Talalay(1984)描述。所述组合物也可包含具有中和活性的一种结合分子以及一种非中和性狂犬病毒特异性结合分子。

本发明的结合分子或药物组合在用于人体之前可以在合适的动物模型系统中检测。这种动物模型系统包括但不限于小鼠、雪貂(ferret)和猴。感病毒狂犬病毒中也可以协同作用。

可以调整给药方案以提供最佳的所需应答(例如治疗应答)。合适的剂量范围可例如是0.1-100mg/kg体重，优选0.5-15mg/kg体重。此外，例如可以给予一次推注、随时间给予多次分开剂量或者根据治疗情况的紧急性而可以按比例降低或增加剂量。本发明的分子和组合物优选是无菌的。使得这些分子和组合物无菌的方法为本领域所熟知。用于诊断、预防和/或治疗的其它分子可以以与本发明的结合分子相似的给药方案给予。如果单独给予其它分子，则可以在给予本发明的一或多种人结合分子或药物组合物之前、同时或者之后给予患者。对于人患者的精确给药方案通常在临床实验期间挑选出。

检测试剂和试剂盒

本发明的结合分子可用于制备检测狂犬病毒的试剂或试剂盒。

如本文所用，术语“待测样品”涵盖了多种样品类型，包括生物学来源的血液及其它体液样品，实体组织样品如活检组织样品或者组织培养物，或者衍生自其中的细胞或者其后代。该术语还包括在获得后已经通过任何方式处理的样品，例如用试剂处理、溶解、或者富集某些成分如蛋白质或者多核苷酸。该术语涵盖了得自任何物种的各种临床样品，也包括培养的细胞、细胞上清和细胞溶解产物“待测样品”也包括分离自疑似携带狂犬病毒的场所(如公共区域，车辆，家具等)。

在获得了本发明提供的结合分子后，可以方便地制备出用于特异性检测狂犬病毒的检测试剂盒。

作为本发明的一种检测方式，采用间接ELISA法，将待测的抗原包被于固相载体上，利用本发明的结合分子进行检测。

作为本发明的一种优选方式，所述的结合分子是抗体，可根据双抗夹心法的原理来检测。双抗夹心法常规的做法是将一抗(如本发明的单克隆抗体)固定于载体，然后使一抗与抗原反应，洗涤后再与二抗反应(所述的二抗携带可检测信号，或可与携带可检测信号的物质结合)，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。双抗夹心法特别适用于具有两个或两个以上表位的抗原的检测。

为了在检测时更方便，所述试剂盒中除了含有本发明的结合分子以外，还可以包含其它检测试剂或辅助试剂，所述的辅助试剂例如是ELISA试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的，如显色剂、标记物、二抗、抗抗体、增敏剂等。本领域人员应理解，各种变化形式的检测试剂盒均是包含在本发明中的，只要在其中利用了本发明的结合分子作为识别狂犬病毒的试剂。

此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。

在获得了本发明提供的结合分子和/或试剂盒后，可以利用多种免疫学相关方法来检测样品中HA蛋白或其含量，从而得知待测样品的供体是否感染狂犬病毒，这些方法均被包含在本发明中。较佳地，所述的方法是以非疾病诊断为目的的。

作为一种优选方式，本发明提供一种体外(非诊断或治疗性地)检测狂犬病毒的方法，包括以下步骤：

(a1)将待测样品包被于固相载体；

(a2)将本发明的结合分子加样于(a1)的固相载体，从而使待测样品中的狂犬病毒与结合分子结合，形成带有“狂犬病毒-本发明的结合分子”二元复合物的固相载体；

(a3)将特异性结合本发明的结合分子的检测物加样于(a2)的固相载体，形成带有“狂犬病毒-本发明的结合分子-检测物”三元复合物的固相载体；所述的检测物上携带一标记物；

(a4)检测三元复合物中的标记物，确定待检测样品中狂犬病毒的存在与否以或存在的量。

按照上述方法，只要设置已知浓度的抗原对照，制作浓度标准曲线，通过比照浓度标准曲线就可以得出待测样品中的狂犬病毒含量。

本发明的主要优点在于：

提供了一种具有全新的结合分子，能够结合具有天然构象的狂犬病毒(RABV)的包膜蛋白(G蛋白)，从而阻止狂犬病毒与细胞受体结合而侵染易感细胞。本发明的结合分子是全人源的，与动物源性(如鼠源性)抗狂犬病毒的分子相比，免疫原性大大减少，且亲和性良好。不仅治疗效果好，而且副作用低。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、外周血单核细胞(PBMC)的获得

从已注射狂犬病毒疫苗的志愿者体内抽取外周血，采用常规Ficoll-Paque(厂家为(CEDARLANE)公司)密度梯度离心，得到10⁷以上个外周血单核细胞(PBMC)。

Ficoll分离方法：

(1)于50ml离心管(预含4％(w/v)柠檬酸钠1ml)，收集全血10ml，颠倒混匀8-10次(其中柠檬酸钠终浓度为0.4％)；

(2)加等体积RPMI 1640(含柠檬酸钠)，混匀；

(3)用15ml透明离心管，铺3ml淋巴细胞分离液，在其上小心加6ml血样。形成分离界面(或4ml分离液加8ml血样)B管：500μl Opti-MEM+20μlLipofectamine Reagent；

(4)室温离心800g，20min(2000rpm，20min)

(5)小心吸取界面层细胞，转移至新管；

(6)加RPMI1640(含柠檬酸钠)，稀释减小液体密度；离心，800g/2000rpm，10min；去上清；

(7)RPMI1640洗细胞2-3次，备用。

实施例2、G蛋白特异性记忆B细胞分选

使用FITC-CD19/APC-IgG/Cy3-RV-G为标志物，经流式细胞仪获得特异性B细胞至96孔RT-PCR板，每孔一个细胞，获得G蛋白特异性记忆B细胞。

1)狂犬病毒包膜蛋白G蛋白(RV-G)(Rabies virus strain SRV9的G蛋白，GenBank：AF499686.2，complete genome序列中的3317位-4894位)由哺乳动物细胞CHO表达系统表达(购自Invitrogen公司，按照实验说明书制备)；

2)G蛋白进行生物素(Biotin)标记：No-Weigh Sulfo-NHS-LC-Biotin(购自PIERCE)10mM试剂；另两个标志物FITC-CD19A和APC-IgG均购自BDBioscience公司；

3)分选细胞的标记：PBMC细胞分组，实验组+对照组，按细胞数加入标志物，避光染色，进行标记，用PBS重悬后，使用40μm BD falcon滤膜过滤；

4)特异性B细胞的分选：使用BD FACS ARIA II筛选，根据前向角和侧向角从PBMC中筛选到淋巴细胞，然后通过不同对照组的调节补偿，获得狂犬G蛋白的特异性记忆B细胞，将其分选到96孔板中进行RT-PCT(反转录PCR)，每孔一个细胞，板置于干冰上。

结果，使用FITC-CD 19/APC-IgG/Cy3-RV-G为特异性标志物，获得了若干个RV-G蛋白的特异性B细胞，见图1流式细胞技术分选细胞的分群图。根据分选到的单个细胞位于96孔板的位置，对于分泌抗体的B细胞命名为1A6、1B4、1D6、1G5、2E1、2G2、3G5等。

实施例3、抗体基因

针对B细胞2E1分泌的抗体，根据文献中(Journal ofImmunological Methods329(2008)112-124)报道的方法开展实验，即通过RT和Nested-PCR法获得抗体重轻链可变区基因，分子量为400bp左右，β-actin作为内参(343bp)，β-actin、重链基因和轻链基因的电泳图谱分别见图2、图3和图4。将来源于同一个B细胞抗体重轻链基因可变区连接pGEMT载体(购自Invitrogen公司)，测序验证抗体基因。获得的2E1全人抗体基因序列如下：

2E1重链可变区基因序列(SEQ ID NO：1)(5’→3’)：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGA AGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGACTCCATCAGG TGGCTCCGGCAGCCCCCGGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGG CGAGTCACCCTATCATTAGACATGTCCAAGAACGAATTCTCCCTGAAGCTGACCTCTGTGACCGCAGCGGACACGGCCGTGTATTACTGT TGGGGCCAGGGAACCCGGGTCACCGTCTCCTCAG

备注：其中使用双下划线标注的依次为重链基因可变区中的高变区及CDR区编码序列，由5’端起始依次为CDR1(SEQ ID NO：5)、CDR2(SEQ ID NO：6)、CDR3(SEQ ID NO：7)。

2E1重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：2)(N’→C’)：

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSIRWLRQPPGKGLEWIGRVTLSLDMSKNEFSLKLTSVTAADTAVYYC WGQGTRVTVSS

备注：其中使用的依次为重链基因可变区中的高变区及CDR序列，由N端起始依次为CDR1(SEQ ID NO：8)、CDR2(SEQ ID NO：9)、CDR3(SEQ ID NO：10)。

2E1轻链可变区基因序列(SEQ ID NO：3)(5’→3’)：

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGC TGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTAT GGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGGTCAAAC

备注：其中红色字体并且使用双下划线标注的依次为轻链基因可变区中的高变区及CDR区编码序列，由5’端起始依次为CDR1(SEQ ID NO：11)、CDR2(SEQ ID NO：12)、CDR3(SEQ ID NO：13)。

2E1轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：4)(N’→C’)：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCWYQQKPGKAPKLLIYGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLTFGGGTKVEVK

备注：其中使用的依次为轻链基因可变区中的高变区及CDR序列，由N端起始依次为CDR1(SEQ ID NO：14)、CDR2(SEQ ID NO：15)、CDR3(SEQ ID NO：16)。

抗体的重链、轻链表达载体分别为ABVec-hIgG1、ABVec-hIgKappa。(Cloning vector AbVec-hIgG1，complete sequence  GenBank：FJ475055.1；Cloning vector AbVec-hIgKappa，complete sequence  GenBank：FJ475056.1)

两个载体均含有氨苄抗性基因，可在大肠杆菌中进行克隆抗性筛选。载体采用CMV作为启动子序列，SV40和polyA结尾信号作为抗体基因的转录终止信号。表达载体的多克隆位点前均有一段信号肽序列，引导抗体的分泌出膜；多克隆位点后含有抗体的恒定区序列。

利用分子克隆技术，需要在AbVec-hIgG1的酶切位点AgeI/SalI之间插入重链可变区序列；在AbVec-hIgKappa的酶切位点AgeI/BsiWI之间插入轻链可变区序列，即可完成表达载体构建。

实施例4、抗体表达及抗体浓度测定

脂质体法瞬时转染293T细胞，进行全人抗体表达：

(1)在转染前一天将1.0×10⁶细胞接种到6孔细胞培养板中；

(2)A管：500μl Opti-MEM+4μg IgG+4μg IgL；

(3)B管：500μl Opti-MEM+20μl Lipofectamine Reagent；

(4)静置5分钟后，将A管与B管混合，在室温静置20min；

(5)A、B管混合物加入细胞培养盘中，37℃孵育6h；

(6)6h后，吸除含有Lipofectamine Reagent DNA的培养液，每孔加入2mlFreeStyle^TM 293Expression Medium；

(7)72h后，收集细胞上清，4℃，3000rpm，5min。

ELISA方法测定全人抗体浓度：

(1)包被Goat Anti-Human IgG(Fab Specific)Antibody于ELISA板，10μg/ml，每孔100μl，4℃过夜；

(2)PBST洗板，3次；

(3)封闭：1％(w/v)BSA，每孔200μl，37℃，2h；

(4)PBST洗板，3次；

(5)使用倍比稀释的人IgG做标准曲线，浓度400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、0ng/ml，100μl/孔；全人抗体细胞(1A6、1B4、1D6、1G5、2E1、2G2、3G5)上清稀释5000倍，每孔100μl，37℃，2h；

(6)PBST洗板，3次；

(7)Goat Anti-Human IgG(Fc specific)-Peroxidase antibody，1∶10000稀释，每孔100μl，37℃，1h；

(8)PBST洗板，3次；

(9)底物A液∶B液＝1∶1，每孔100μl，37℃，15min，避光反应；

(10)加入2M H₂SO₄，每孔50μl；

(11)测定OD450，并进行数据处理。

ELISA结果表明，成功表达了全人抗体，并且其浓度为100μg/ml左右。因表达载体中含有重轻链的恒定区，因此空载体也能表达不完整的抗体，见图5。

实施例5、抗原特异性检测

检测表达的全人抗体是否识别灭活狂犬病毒疫苗(购自诺华公司)，以及与抗原的结合能力。

(1)包被灭活狂犬病毒疫苗(SRV9疫苗株，购自诺华公司)于ELISA板，10μg/ml，每个样品两个复孔，每孔100μl，4℃过夜；

(2)PBST洗板，3次；

(3)封闭：1％BSA，每孔200μl，37℃，2h；

(4)PBST洗板，3次；

(5)根据测定浓度，调整全人抗体细胞上清至相同浓度，每孔100μl，人多抗(H.Ab，制备方法为：抽取狂犬疫苗免疫后的人的血，将全血放置37℃使其凝后，放置4℃过夜，离心后取上清即为人血清；将人血清用硫酸铵沉淀或Protein G纯化均可马上得到多抗)和鼠血清(M.Ab，制备方法同人血清制备法)为阳性对照，37℃，2h；

(6)PBST洗板，3次；

(7)Goat Anti-Human IgG(Fc specific)-Peroxidase antibody，1∶10000稀释，每孔100μl，加到样品(1A6、2E1、H.Ab、M.Ab)和全人抗体SO57的ELISA板中；Goat Anti-Mouse IgG(Fab specific)-Peroxidase antibody，1∶10000稀释，每孔100μl，加到鼠血清的ELISA板，37℃，1h；

(8)PBST洗板，3次；

(9)底物A液∶B液＝1∶1，底物为TMB，3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(购自Sigma，使用方法按产品说明)。每孔100μl，37℃，15min，避光反应；

(10)加入2M H₂SO₄，每孔50μl；

(11)用分光光度计测定450nm波长下的吸光度(即OD450)，并进行数据处理。

ELISA结果表明，2E1全人抗体对于灭活狂犬病毒疫苗SRV9株具有特异性结合能力，该能力比同一批制备的其它全人抗体的能力显著要强。如图6所示，此实验，用接种过狂犬疫苗的人的多克隆抗体和狂犬疫苗免疫的老鼠血清作为阳性对照，用空表达载体表达的抗体重轻链恒定区Vector作为阴性对照。

实施例6、抗体中和活性测定——假病毒中和试验

(1)pcDNA3.1(-)-RV-G质粒构建：选取前述提到的SRV9狂犬病毒株的G蛋白全长(Rabies virus strain SRV9的G蛋白，GenBank：AF499686.2，complete genome序列中的3317位-4894位)，利用分子克隆技术将基因插入到pcDNA3.1(-)的EcoRI/Xho I多克隆位点之间，即可。

包装质粒pNL4-3Luc⁺Env^-Vpr^-构建：

该质粒是在HIV病毒颗粒的基础上缺失其编码包膜蛋白的基因Env-和复制酶基因Vpr-，使其无法翻译出HIV包膜蛋白从而可以与外源包膜蛋白结合，并且制备的假病毒无法复制可以保证实验操作的生物安全性。此外，还加上了用于后期检测的荧光酶素基因Luc+。该包装质粒购自上海中科英沐生物科技有限公司。

(2)包装RV-G假病毒：将pcDNA3.1(-)-RV-G质粒和包装质粒pNL4-3Luc⁺Env^-Vpr^-一起共转染293T细胞，37℃培养箱培养48-72h后，收取细胞培养上清，测定假病毒浓度后，调整至适当浓度；

(3)感染前一天，用生长状态良好的BHK-21细胞(购自ATCC)铺24孔板，密度为5×10⁴个/孔；

(4)感染当天，将调整至适当浓度的RV-G假病毒与前述制备的全人抗体(2E1)或SO57抗体(获自华北制药集团有限责任公司)孵育，1h后感染细胞，1ml/孔，置于37℃培养箱内；同时设置未孵育感染组，作为阴性对照；

(5)感染24h后，1ml/孔补液，同时也加入等比例稀释的全人抗体。

(6)感染48h后，裂解细胞，检测荧光素酶值，确定狂犬病毒与全人抗体孵育前后对于BHK-21细胞的感染力，计算出全人抗体对于病毒的抑制率。

全人单克隆抗体(2E1)使用293T细胞进行表达，将其浓度调整为0.5ug/ml、1ug/ml和2ug/ml进行假病毒中和试验测定其中和活性，即对狂犬假病毒的抑制率。如图7所示，2E1对于病毒具有超过98.5％的抑制率，并且抗体的浓度与对病毒的抑制率成正相关。

本发明获得的2E1对比现有SO57抗体的改进之处如下：

1、2E1是采用全新的单细胞RT-PCR全人抗体制备技术所制备。用传统的EBV病毒永生化技术制备的SO57抗体，具有该方法不仅效率较低，并且所制备的大部分抗体的缺点，即抗体亲和力较低，抗原抗体特异性易于丢失。而单细胞RT-PCR制备的全人抗体，不仅操作方便，利用常规实验条件即可完成，而且快速，全过程仅用30天，适用于抗病毒感染的抗体的前期研发。

2、2E1在低浓度时依然保持较优的作用。如图7所示，假病毒中和试验显示，在低浓度情况下(0.5ug/ml)，2E1对于狂犬病毒的抑制率强于对照SO57。这表示，2E1在低剂量情况下依然有效，可最大限度的降低药物的毒副作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种分离的单克隆抗体，其能识别并结合狂犬病毒包膜蛋白G蛋白，其特征在于，所述单克隆抗体包含重链可变区，所述的重链可变区具有SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列；和

所述单克隆抗体包含轻链可变区，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体是人单克隆抗体。

3.编码权利要求1-2任一所述的单克隆抗体的核酸分子。

4.权利要求1-2任一所述的单克隆抗体在制备用于诊断、治疗和/或预防狂犬病毒感染的药物中的用途。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体中含有编码权利要求1-2任一所述的单克隆抗体的DNA。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有权利要求5所述的表达载体。

7.一种组合物，其特征在于，它含有有效量的权利要求1-2任一所述的单克隆抗体，以及药学上可接受的载体。

8.一种检测狂犬病毒的试剂盒，其包括权利要求1-2任一所述的单克隆抗体。