CN107074936A - 抗半乳糖凝集素9并且是调节性t细胞抑制活性的抑制剂的抗体 - Google Patents
抗半乳糖凝集素9并且是调节性t细胞抑制活性的抑制剂的抗体 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及到一种抗半乳糖凝集素9并且是调节性T细胞抑制活性的抑制剂的抗体，还涉及到把这种抗体用于治疗与调节性T细胞的抑制活性相关的疾病,尤其是癌症的治疗。
Description
本发明涉及到一种抗半乳糖凝集素9的抗体，并且是一种调节性T细胞抑制活性的抑制剂，还涉及到把这种抗体用于治疗与调节性T细胞的抑制活性相关的疾病。
人T淋巴细胞的特征在于被称为CD3的膜标记的表达以及特异性受体，即直接参与抗原特异性识别的TCR(T细胞受体)。通过初始T淋巴细胞进行的这种抗原识别导致激活初次免疫反应，其结果是修改了表型以及T淋巴细胞的活性。
例如，各类型的T淋巴细胞群培养“效应”或效应T淋巴细胞，由此完成保护机体的特殊功能。因此，CD4+T淋巴细胞，也被称为辅助T淋巴细胞，分泌主要细胞因子，所述主要细胞因子尤其是协助B淋巴细胞的体液功能(生成特异性抗体)以及CD8+T淋巴细胞的细胞毒素活性。
另一群CD4+T淋巴细胞是由自然调节性T细胞构成的，在下文中将其更简单地称为“调节性T细胞”。它们结构性地连续表达CD25分子(调节性T淋巴细胞也可称为“CD4+CD25+”)以及Foxp3转录因子。这一少部分CD4+CD25+T淋巴细胞具有负调控免疫反应参与者的特殊性，所述免疫反应参与者会通过其TCR识别各种自身抗原。调节性T淋巴细胞还完成免疫系统生理机能方面的主要任务，尤其是保护机体避免出现自身免疫性疾病。
但是，已经提出，在病理情况下，调节性T细胞会导致不适当的免疫抑制，这促进肿瘤生长或者协助传染性病原体(病毒、细菌、寄生虫等)的持久性。大量研究表明调节性T细胞降低抗肿瘤或抗病毒的免疫反应，尤其是通过不是当地抑制效应T淋巴细胞的活性，因此协助大多数癌症病毒和肿瘤进展的持久性。
关于调节性T细胞在效应T淋巴细胞上发挥其抑制作用的机理所知甚少。但是，大量研究表明了调节性T细胞会抑制免疫反应的各种机理。在各种可能的解释中，例如，研究表明Foxp3+调节性淋巴细胞会通过生成颗粒酶/穿孔素(1)、或者通过使效应T淋巴细胞失去IL-2、或者通过抑制效应T淋巴细胞增殖，尤其是通过表达诸如半乳糖凝集素1这样的表面分子破坏效应T淋巴细胞，所述半乳糖凝集素1与在效应T淋巴细胞上表达的受体相互作用，并导致效应T淋巴细胞(2)细胞周期停止。
调节性T细胞在癌症中的病理生理学作用因此鼓励一种新的抗肿瘤治疗策略的出现。它包括使抑制免疫反应的因子无效，尤其是调节性T细胞，或者，换言之，包括破坏关于肿瘤抗原的耐受性。
这是因为，为了在抗肿瘤免疫力的控制下扭转调节性T细胞与效应T淋巴细胞之间的平衡性的目的，很多团队曾试图开发以抑制CD4+CD25+调节性T淋巴细胞为目的的治疗策略，尤其是通过单克隆抗体把通过这些调节性T细胞表达的表面分子作为目标，而且特别是作用于调节性T细胞抑制活性的那些表面分子。
例如，在啮齿类动物上进行的分析已经表明通过抗IL-2(CD25)α受体的单克隆抗体抑制CD4+CD25+调节性T细胞促进激活和扩增效应T细胞，因此抑制肿瘤生长(3)。但是，CD25也是通过激活的效应T细胞表达的。因此，必须小心地采用这一策略，因为它也促进消除效应T淋巴细胞。
还证明经由抗GITR抗体通过GITR激活信号能够抑制调节性T细胞(4)的抑制活性。就此而论，在治疗鼠类肿瘤过程中使用抗GITR抗体有可能增加CD4+和CD8+T淋巴细胞的抗肿瘤反应，而且，在已经装入肿瘤的情况下，这一点更加有效。但是，激活的效应T淋巴细胞也表达GITR。因此，在使用抗GITR抗体过程中，还有抑制效应T淋巴细胞的风险。
通过利用抗CTLA4抗体，还设想了以抑制调节性T细胞为目的的策略，所述抗CTLA4抗体是通过调节性T淋巴细胞表达的标记。因此，在调节性T细胞中KO(敲除)CTLA-4的小鼠模型中，或者在使用抗CTLA-4抗体过程中，表明效应T淋巴细胞的活性增加，以及由调节性T淋巴细胞介导的抑制减少，其结果是抑制肿瘤生长(5)。但是，激活的效应T淋巴细胞也表达了CRLA-4标记。因此，利用抗GITR抗体还有抑制效应T淋巴细胞的风险。
因此，尽管这些分子具有不错的作用，但是调节性T细胞特异性耗竭的一个障碍是缺乏其表面标记的特异性。这是因为由调节性T细胞表达的表面蛋白CD25、CTLA-4或GITR也是效应T淋巴细胞激活的标记。因此，把这些蛋白用作调节性T细胞耗竭的靶标的不良影响是消除很多对于肿瘤消退而言必不可少的CD4+和CD8+效应T淋巴细胞。就此而论，在治疗方案中仍然难以特异性地靶定调节性T细胞。
因此，仍需要选择性地、有效地抑制调节性T细胞的抑制活性的化合物。
因此，本发明的一个目的是提供一种抗体，所述抗体针对调节性T细胞的一个特异标记，并且足以抑制调节性T细胞的抑制活性，而不改变效应T淋巴细胞的功能。
发明者已表明了优点，所述优点表明，在激活过程中通过调节性T细胞特异性表达分子，即半乳糖凝集素9，而且针对该分子的抗体使之能够抑制调节性T细胞的抑制活性，而且这是通过特殊方式进行的，换言之，并不抑制效应T淋巴细胞。此外，还表明，这种抗体能够使由半乳糖凝集素9诱导的从传统CD4+T淋巴细胞到免疫抑制剂CD4+T淋巴细胞的转化无效，因此，促使在根据本发明所关注的患者体内维持抗肿瘤的免疫反应。
刚刚发现，可以把这种抗半乳糖凝集素9并抑制调节性T细胞的抑制活性的抗体用于治疗与调节性T细胞的抑制活性有关的疾病。
在此，“与调节性T细胞的抑制活性有关的疾病”是指调节性T细胞的抑制活性在其中起作用，尤其是通过促进疾病的发展或持久性起作用的所有疾病(非自身免疫性)。尤其是，已经表明，调节性T细胞的抑制活性促进肿瘤的发展。因此，更具体而言，本发明的目的在于T淋巴细胞的抑制活性在其中起作用的癌症。
半乳糖凝集素9，可以更简洁地称为“Gal9”，构成半乳糖凝集素家族中的一部分。半乳糖凝集素，或者S型凝集素，构成一个家族，该家族包括脊椎动物中的十五种成份，其中包括人的十种成份。半乳糖凝集素9优先地与糖蛋白和糖脂的β半乳糖苷剩余物相互作用。在人体中，半乳糖凝集素9以长、中和短三种形式存在。
为了确定癌症发展与半乳糖凝集素，尤其是与半乳糖凝集素9之间存在的联系，已经进行了几项研究。但是，这些研究中的大多数认为半乳糖凝集素9对于激活的T淋巴细胞(无论是CD4+或者是CD8+)具有细胞毒活性，而对未激活的T淋巴细胞不均有任何细胞毒活性。
例如，专利申请EP 1586325开始假设，“在体外”，半乳糖凝集素9引起肿瘤细胞的细胞凋亡，尤其是恶性细胞或转移性细胞，而非正常细胞。申请EP 1586325因此涉及到一种药物，该药物包含半乳糖凝集素9或者导致生成和/或释放半乳糖凝集素9的分子等。
所以，目的是利用半乳糖凝集素9或者使之能够增加半乳糖凝集素9的因子，同时，本发明相反地倾向于对其进行抑制。
因此，本发明的主题是抗半乳糖凝集素9并抑制调节性T细胞的抑制活性的抗体。
换言之，本发明涉及到一种抗半乳糖凝集素9的抗体，特征在于它是一种调节性T细胞抑制活性的抑制剂。
这是因为本发明以发明者意外发现为基础，所述发明者观察到(i)一方面，半乳糖凝集素9是由调节性T细胞直接表达的，而且在其激活过程中其表达增加，以及(ii)其次，由效应T淋巴细胞非常微弱地表达半乳糖凝集素9，而且在激活过程中，这种表达消失。此外，发明者观察到通过抗体抑制半乳糖凝集素9使之能够抑制调节性T细胞的抑制活性。
“调节性T细胞”的意思是天然调节性T细胞亚群，也被称为Treg，特征在于表达由CD25、CTLA-4和GITR构成，特征还在于转录因子Foxp3的特异表达。更具体而言，本发明所指的调节性T细胞因此是天然调节性T细胞，或者nTreg。
“调节性T细胞的抑制活性”是指调节性T细胞施加在效应T淋巴细胞上的免疫抑制剂活性，一旦被激活，在病理情况下，所述免疫抑制剂活性特别促进肿瘤生长。更可取的是，调节性T细胞的抑制活性可理解为通过抑制效应T淋巴细胞的活性降低抗肿瘤免疫反应的活性。可以按照本领域技术人员已知的各种技术分析调节性T细胞的抑制活性，例如，可以实施MLR(混合淋巴细胞反应)方法，该方法采用Treg淋巴细胞与自体或异种免疫细胞(统称为PBMC或T CD4+)的共同培养。通过增殖实验可以完成该方法，所述增殖实验的基础是(i)包含比如氚化胸腺嘧啶这样的放射性元素或者(ii)包含EdU(5-乙炔基-2’-脱氧尿苷)，在合成DNA过程中将其包含在内，在酶反应之后，使之能够放射荧光(点击EdU增殖实验)或者(iii)流式细胞术(CSFE)。
例如，因此可以通过MLR方法分析根据本发明的抗体的抑制作用，所述MLR方法是在有测试抗体存在的情况下进行的。
关于应用这种分析方法的详细信息可以参考“实例”以及“设备和方法”部分。
不加区分地使用术语“抗体”和“免疫球蛋白”指代免疫球蛋白分子或者免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含指定抗原特殊固定部位的分子。抗体一词不仅包含整个抗体分子，而且包含抗体片段以及抗体和抗体片段的变异型(包括比如人性化抗体这样的衍生物。
免疫球蛋白是本领域技术人员所熟知的，并由通过双硫键彼此相连的两个重链构成，每个重链都通过一个双硫键连接到一个轻链。有两种轻链，即拉姆达(λ)链和卡帕(K)链。确定抗体功能活性的重链有五大类：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。
每个链都包含不同的序域。轻链包括两个域，即可变域(或区)(VL)和恒定域(CR)。重链根据抗体类别包括四个或五个域，即一个可变域(VH)以及三个或四个恒定域(CH1、CH2、CH3以及选择性的CH4)。轻链的可变区(VL)和重链的可变区(VH)决定抗原的特异性以及该抗原的固定部位。
轻链的恒定域(CL)和重链的恒定域(CH)赋予抗体以重要的生物学特征，比如抗体链的相互关联、通过胎盘的流动性、补体的固定和/或固定到Fc受体(FcR)。Fv段与下文所述的免疫球蛋白的Fab段的V端部分相对应，并包括轻链和重链的可变部分(VL和VH)。抗体的特异性在于抗体识别部位与抗原决定基之间的结构互补性。抗体的识别部位本质上是由来自高变区或者决定互补性的区域(“互补决定区”或CDR)的残留物构成的。偶尔，来自非高变区或者框架区(FR)的残留物影响域的总体结构，并因此影响识别部位。术语“互补决定区”(CDR)涉及到共同定义天然免疫球蛋白固定部位的天然Fv区的固定和特异性的亲和力的氨基酸序列。免疫球蛋白的每个轻链和每个重链都有三个CDR区，分别被称为L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3和H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。因此抗原的结合部位包括六个CDR。框架区(FR)涉及到施置在CDR之间的氨基酸序列，即分别保存在同一种类的各个免疫球蛋白之间的免疫球蛋白的轻链可变区和重链可变区的部分。
根据本发明的一种抗体可以是单克隆抗体或者多克隆抗体。最好，根据本发明的抗体是单克隆抗体。
术语“单克隆抗体”或“mAb”是指具有独特氨基酸成份的抗体，该抗体针对特定抗原，并且可以通过单B细胞克隆或杂交瘤生成。单克隆抗体还可以是重组体，换言之，可通过蛋白质工程技术生成所述单克隆抗体。
术语“Fab”是指分子质量约为50，000道尔顿的抗体片段，并且具有与抗原结合的活性。它大约包括重链n端侧的一半以及通过双硫键连接的整个轻链。具体而言，可以通过用一种蛋白酶，即木瓜蛋白酶处理免疫球蛋白得到Fab。
术语“F(ab’)2”是指约为100，000道尔顿的片段，并且具有与抗原结合的活性。该片段稍大于在铰链区通过双硫键相连的两个Fab片段。通过用一种蛋白酶，即胃蛋白酶处理免疫球蛋白得到这些片段。通过使铰链区的双硫键分开，从F(ab’)2片段得到Fab片段。
单Fv链“scFv”与VH：VL多肽相对应，所述VH：VL多肽是利用为VL域和VH域编码的基因以及为意在结合这些域的肽编码的序列合成的。根据本发明的scFv包括，例如，利用基因重组技术以适当结构保持的CDR。
“scFv”二聚物与通过肽键连接在一起的两个scFv分子相对应。该Fv链通常是的表达融合基因的结果，所述融合基因包括为通过连接序列相连的VH和VL编码的基因，所述连接序列给肽编码。人scFv片段可包括最好是利用基因重组技术保持在适当结构的CDR区。“dsFv”片段是通过双硫键稳定化的VH-VL异质二聚体；它可以是二价的(dsFV2)。二价Sc(Fv)2或多价抗体的片段可通过单价scFv联合自发地形成，或者通过用肽结合序列连接scFv片段制得。
Fc片段是抗体生物学特征的支持体，尤其是其被免疫效应识别或者激活补体的能力。它包括铰链区以外的重链的恒定片段。
术语“双体”表示具有两个抗原固定部位的小抗体片段。这些片段包括同一个VH-VL多肽链中连接到可变轻链域VL的可变重链域VH。利用过短的结合序列能够匹配同链的两个域，必然发生与另一个链的两个互补域的匹配，并因此形成两个抗原固定部位。
本发明的抗体因此可以是由两个重链以及两个完整轻链构成的免疫球蛋白，或者可以是根据本发明的免疫球蛋白的一个片段，例如F(ab’)2、Fab、Fv、scFv或Fc。最好，这种抗体片段是免疫球蛋白的Fab区，尤其是IgG1抗体的Fv区。
本发明中所述的抗体是分离纯化抗体，不同于天然抗体。在根据本发明的抗体或核苷酸序列的情况下，术语“分离”和“纯化”是指大量缺乏其它同种类型的生物大分子的情况下存在分子。
术语“嵌合抗体”涉及到一种抗体，其中构成所述抗体的每个轻链和/或重链的序列都包含或包括由至少两种不同动物发出的一个混合序列。最好，本发明的嵌合抗体是人/鼠杂合抗体。具体而言，本发明的嵌合抗体可包括来自于非人类动物，尤其是鼠类动物的抗体的VH域和VL域以及人源抗体的CH域和CL域。因此，最好，本发明的抗体包括来源于下文所定义的1G3抗体的VH域和VL域以及人源抗体的CH域和CL域。
根据本发明，术语“人性化抗体”涉及到生成于非人类动物的一种抗体，其中除CDR以外的重链和轻链的序列都被来自人类的一个或多个抗体的相应序列所代替。优先地，术语“人性化抗体”涉及到一种抗体，其中重链和轻链的序列来自于人类，其CDR是由1G3抗体生成的。
根据本发明的抗体最好是单克隆抗体，换言之，其只识别半乳糖凝集素9中的一个抗原决定基，这与多克隆抗体不同，所述多克隆抗体与单克隆抗体的混合物相对应，因此识别相同分子中的多个抗原决定基。
根据本领域技术人员熟知的技术可以得到根据本发明的单克隆抗体。例如，可以利用细胞融合技术、克隆重链和轻链序列技术、噬菌体或核糖体展示技术、具有人免疫球蛋白列表的小鼠免疫法以及用特定细胞或转基因动物表达。这些技术是本领域技术人员所熟知的。
本发明涉及到抗半乳糖凝集素9的抗体以及调节性T细胞的抑制活性的抑制剂。具体而言，发明者开发了生成鼠抗体IGg1、Kappa、1G3的一种杂交瘤，所述鼠抗体IGg1、Kappa、1G3抗半乳糖凝集素9并抑制调节性T细胞的抑制活性。发明者描述了这种单克隆抗体mAb1G3的轻链和重链的可变域的特征并因此确定了该抗体的CDR，如表1所示。
表1
因此，本发明的一个特殊实施例涉及到一种抗半乳糖凝集素9并抑制调节性T细胞的抑制活性的抗体，具有与1G3抗体相同的固定区，具有定义如下的六个CDR：
-H-CDR1区中的氨基酸序列SEQ ID NO：2
-H-CDR2区中的氨基酸序列SEQ ID NO：3
-H-CDR3区中的氨基酸序列SEQ ID NO：4
-L-CDR1区中的氨基酸序列SEQ ID NO：6
-L-CDR2区中的氨基酸序列SEQ ID NO：7
-L-CDR3区中的氨基酸序列SEQ ID NO：8
尤其是，本发明的一个主题涉及到一种抗半乳糖凝集素9并抑制调节性T细胞的抑制活性的抗体，具有定义如下的六个CDR：
-H-CDR1区中的氨基酸序列SEQ ID NO：2
-H-CDR2区中的氨基酸序列SEQ ID NO：3
-H-CDR3区中的氨基酸序列SEQ ID NO：4
-L-CDR1区中的氨基酸序列SEQ ID NO：6
-L-CDR2区中的氨基酸序列SEQ ID NO：7
-L-CDR3区中的氨基酸序列SEQ ID NO：8
在一个特殊实施例中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：5。
因此，根据本发明的一种抗体特异性地结合到半乳糖凝集素9并且是一种调节性T细胞抑制活性的抑制剂。
根据本发明另一个特殊实施例，根据本发明的一种抗体可以特异性地结合到半乳糖凝集素9的表位。有利的是，根据本发明的一种抗体能够特异性地结合到膜或细胞内的半乳糖凝集素9。
更具体而言，根据本发明的一种抗体可结合到通过上文所定义的1G3抗体识别的表位。
因此，根据本发明的一个特殊实施例，根据本发明的一种抗体可以特异性地结合到氨基酸序列为SEQ ID NO：9的表位，如表2所示。由氨基酸序列SED ID NO：9构成的该表位与P4肽相对应，并且覆盖结合肽的末端以及半乳糖凝集素9的C-端部分的开端。该序列存在于半乳糖凝集素9的三种异构体(S异构体的氨基酸166至178、M异构体的氨基酸178至190、L异构体的氨基酸210至222)。因此，这种抗体可以与半乳糖凝集素9的所有异构体反应。
| 半乳糖凝集素9的序列(表位) |
| TPAIPPMMYPHPA(SEQ ID NO：9) |
表2
根据另一个特殊实施例，根据本发明的抗体是一种嵌合抗体，最好是鼠/人嵌合抗体。尤其是，这种鼠/人嵌合抗体可包含如上所述的1G3抗体的可变域。
根据另一个特殊实施例，根据本发明的抗体是一种人性化抗体。尤其是，这种人性化抗体的可变域可包括人类受体的框架区，以及选择性地人类恒定域以及非人类供体的CDR，尤其是上文定义的CDR。
发明者还开发了一种生成鼠抗体IGg1、Kappa、2E12的杂交瘤，所述鼠抗体IGg1、Kappa、2E12抗半乳糖凝集素9和调节性T细胞抑制活性的抑制剂。发明者描述了这种单克隆抗体mAb 2E12的轻链和重链的可变域的特征，并因此确定该抗体的CDR，如表3所示。
表3
本发明的一个特殊实施例因此涉及到一种抗半乳糖凝集素9并抑制调节性T细胞的抑制活性的抗体，具有与2E12抗体相同的固定区，具有定义如下的六个CDR：
-H-CDR1区中的氨基酸序列SEQ ID NO：11
-H-CDR2区中的氨基酸序列SEQ ID NO：12
-H-CDR3区中的氨基酸序列SEQ ID NO：13
-L-CDR1区中的氨基酸序列SEQ ID NO：15
-L-CDR2区中的氨基酸序列SEQ ID NO：16
-L-CDR3区中的氨基酸序列SEQ ID NO：17
尤其是，本发明的一个主题涉及到一种抗半乳糖凝集素9并抑制调节性T细胞的抑制活性的抗体，具有定义如下的六个CDR：
-H-CDR1区中的氨基酸序列SEQ ID NO：11
-H-CDR2区中的氨基酸序列SEQ ID NO：12
-H-CDR3区中的氨基酸序列SEQ ID NO：13
-L-CDR1区中的氨基酸序列SEQ ID NO：15
-L-CDR2区中的氨基酸序列SEQ ID NO：16
-L-CDR3区中的氨基酸序列SEQ ID NO：17
在一个特殊实施例中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：10，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：14。
如前所述，根据本发明另一个特殊实施例，根据本发明的一种抗体特异性地与半乳糖凝集素9的表位结合。有利的是，根据本发明的一种抗体能够特异性地结合到膜或细胞内的半乳糖凝集素9。
更具体而言，根据本发明的一种抗体能够结合到由上文定义的2E12抗体识别的表位。
根据另一个特殊实施例，根据本发明的抗体是一种嵌合抗体，最好是一种鼠/人嵌合抗体。尤其是，该鼠/人嵌合抗体可包括如上文所定义的2E12抗体的可变域。
根据另一个特殊实施例，根据本发明的抗体是一种人性化抗体。尤其是，该人性化抗体的可变域可包括人类受体的框架区，以及选择性地人类恒定域以及非人类供体的CDR，尤其是上文定义的CDR。
生成抗体的方法
可以通过本领域技术人员已知的任何技术生成本发明的抗体，例如，单独采用的或者相结合的任何化学技术、生物技术、基因技术或酶技术，但不仅限于此。
例如，可利用下文所述的关于制造生成抗半乳糖凝集素9的单克隆抗体，1G3或2E12的杂交瘤的技术。
根据本发明，可以按照现有技术已知的任何方法分析抗半乳糖凝集素9的抗体的特异性结合。根据可以采用的免疫分析，例如，能够设置免疫印迹法、放射免疫测定法测试、ELISA、夹心免疫分析、免疫沉淀测试、沉淀素测试、凝胶扩散沉淀素试验、免疫放射测定测试、荧光免疫分析或补体结核性测试。这些测试是本领域技术人员所熟知的。
可以按照本领域技术人员熟知的各种技术分析根据本发明的一种抗体因此产生的抑制调节性T细胞的抑制活性的作用。例如，可以进行细胞增殖实验。因此可以参考下文采用的关于细胞增殖实验的技术，所述细胞增殖实验是对抗半乳糖凝集素9的抗体，1G3或2E12进行的。
在所需序列的氨基酸序列已知的情况下，本领域技术人员很容易通过标准多肽生产技术繁殖抗体。
例如，可以通过众所周知的固相法分析这种抗体，最好利用市售的肽合成装置，按照供应商的建议进行分析。
作为选择，可以通过本领域技术人员熟知的在适当的表达系统重组DNA的技术得到本发明的抗体。术语“表达系统”是指细胞宿主以及适当条件下相容的载体，换言之，所述条件为允许表达通过外源DNA编码的蛋白质的条件，所述外源DNA是由载体携带的，并被引入宿主细胞中。通常，给抗体编码的核酸序列可以插入适当表达载体中，然后将其引入将生成所需抗体的适当原核宿主或真核宿主中。
术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”涉及到把给抗体编码的DNA或RNA序列引入宿主细胞，从而使其转化并使之能够表达所引入的序列(换言之，转录和翻译)的运载工具。表达载体通常是质粒、粘粒、游离体、人工染色体、噬菌体或病毒载体。
病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒以及来源于腺病毒群(AAV)的载体。可以通过众所周知的技术制造这种重组病，比如通过细胞系转染，使其能够壳体化，或者通过表达必要缺失功能的质粒或互补病毒进行瞬时转染。例如，能够衣壳化的细胞系是PA317、PsiCRIP、GPenv+、293等。在WO 95/14785、WO 96/22378、US 5.882.877等专利申请中有制造这种供复制的缺陷型重组病毒的详细方案。
因此通过核酸或者如上所述的适当载体转染、传染或者转化宿主细胞。
术语“转化”在此是指把外源(外来的或细胞外的)基因或DNA或RNA序列引入宿主细胞，以便该宿主细胞表达所引入的基因或序列，从而生成所需物质，通常是由所引入的基因或序列编码的蛋白质。
这种普通表达系统包括，但不仅限于大肠杆菌的宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞、杆状病毒型的载体以及哺乳动物的细胞和载体。
通过表达根据本发明的一种抗体的宿主细胞进行的一种生成方法可包括如下步骤：(i)在体内或在体外把如上所述的重组核酸或载体引入感受态宿主细胞，(ii)在体内或在体外培养因此得到的重组宿主细胞，(iii)随机选择表达和/或分泌所述抗体或多肽的细胞。可将这种宿主细胞用于生成根据本发明的抗体。
根据一个特殊实施例，根据本发明的一种抗体的一种生成方法可包括如下步骤：(i)在适合表达抗体的条件下培养如上所述的转化细胞；以及(ii)恢复如此表达的抗体。
可以通过常规的免疫球蛋白纯化方法从培养基中分离出抗体，例如，通过羟基磷灰石层析法、凝胶电泳、渗析或者亲和色谱法对A-琼脂糖蛋白质进行纯化。
在本发明的一个特殊实施例中，可以通过下列步骤生成根据本发明的人嵌合抗体：取得给如前所述的VL域和VH域编码的核酸序列；通过把核酸序列插入动物细胞的表达载体，构成人嵌合抗体的表达载体，所述动物细胞具有给CH域和CL域编码的基因；以及通过把表达载体引入动物细胞表达所编码的序列。
人嵌合抗体的CH域可以是属于人免疫球蛋白的任何区域。最好，为IgG类，为IgG1更佳。同样，人嵌合抗体的CL域可以是属于人免疫球蛋白的任何区域。最好为Kappa类。
尤其是可以通过抗体基因工程得到根据本发明的嵌合抗体或人性化抗体。
例如，可以通过基因转染技术或者重组DNA技术构造嵌合抗体。
可以通过以下步骤生成根据本发明的人性化抗体：取得如前所述的CDR域；通过把核酸序列插入动物细胞的表达载体中构建人源抗体的表达载体，所述动物细胞具有的基因给下列区域编码：(i)与人源抗体相同的恒定重链区以及(ii)与人源抗体相同的恒定轻链区；以及通过把表达载体引入动物细胞表达所编码的序列。
关于人性化抗体的表达载体，它可以是如下类型：其中给抗体重链编码的基因域给抗体轻链编码的基因存在于单独的载体，换言之，其中基因存在于相同载体中(串联式)。对于构建表达载体的情况、引入动物细胞的情况等，优选串联式载体。可以引用pKANTEX93或pEE18作为串联式人性化抗体的表达载体的一个实例。
以基因或重组DNA技术为基础的人性化抗体的生成方法是现有技术众所周知的。可以通过现有技术已知的各种技术使抗体人性化，例如，通过CDR移植、胶合或重新，或者通过链替换。以重组DNA为基础制备这种抗体的技术也是已知的。
通过用蛋白酶，即木瓜蛋白酶处理抗体，尤其是抗半乳糖凝集素9并抑制调节性T细胞的抑制活性的抗体，可以得到根据本发明的Fab片段。还可以通过下列步骤生成该FAB片段：把给抗体FAB片段编码的DNA插入可用于原核或真核表达系统的载体中以及把该载体引入适合表达FAB片段的原核细胞或真核细胞中。
通过用蛋白酶，即胃蛋白酶处理抗体，尤其是抗半乳糖凝集素9并抑制调节性T细胞的抑制活性的抗体，可以得到根据本发明的F(ab’)2片段。还可以通过硫醚键或双硫键把如上所述的Fab’片段结合在一起，得到F(ab’)2片段。
通过用还原剂，即二硫苏糖醇处理抗体的F(ab’)2复合体，尤其是抗半乳糖凝集素9并抑制调节性T细胞的抑制活性的抗体，可以得到根据本发明的Fab’片段。还可以通过下列步骤制得Fab’片段：把给抗体的Fab’片段编码的DNA插入可用于原核或真核表达系统的载体中以及把该载体引入适合表达Fab’片段的原核细胞或真核细胞中。
可以通过下列步骤生成根据本发明的ScFv片段：取得给前文所述的VH域和VL域编码的DNA的序列，然后把该DNA插入可用于真核或原核表达系统的载体中，以及把该载体引入适合表达ScFv片段的真核细胞或原核细胞中。为了取得人性化ScFv片段，可以利用CDR移植技术。该技术涉及到选择供体cFv片段的互补决定区(CDR)并将其移植到具有已知的三维结构的人源ScFv片段的框架上(例如，参见WO 98/45322；EP 0173494)。
可以对根据本发明的抗体的氨基酸序列进行修改。例如，可能希望改进抗体的亲和力和/或生物学特征。众所周知，在通过简单地单独移植来源于人源抗体框架(FR)的非人类动物的抗体的VH和VL的CDR生成人性化抗体的情况下，与来源于非人类动物的原抗体相比，降低了与抗原的结合能力。认为不仅CDR中，而且FR中的非人类抗体的VH和VL的某些氨基酸残基直接或间接与抗原结合能力有关。用来源于FR的不同氨基酸残基代替这些氨基酸残基，人源抗体的VH和VL因此会降低结合能力。因此，为了解决这个问题，必须对人CDR的移植抗体进行测试，从而在人源抗体的FR、VH和VL氨基酸序列的中识别出直接与抗原的结合性相关的，或者与CDR氨基酸残基相互作用的，或者保持抗体的三维结构并直接与抗原的结合性相关的氨基酸残基。用来源于非人类抗体的原抗体的氨基酸残基代替识别出的氨基酸可以增加结合能力。对本发明的抗体结构以及对其进行编码的序列进行修改和变更，同时再次得到用所需特征给抗体编码的功能分子。
本发明的另一方面涉及到本发明抗体的保留功能的变体。
“保留功能的变体”是指其中已经改变了蛋白质中的指定氨基酸残基，而不改变总体结构以及抑制调节性T细胞的抑制活性的功能。因此，可以用另一个有相似属性(例如极性、氢键结合力等)的氨基酸代替氨基酸，只要保留抑制调节性T淋巴细胞的抑制活性的功能即可。
因此，根据本发明的一个特殊实施例，可具有前文定义的抗半乳糖凝集素9并抑制调节性T细胞的抑制活性的抗体，包括：
-H-CDR1，具有1或2个差异性氨基酸，所述氨基酸序列定义为SEQ ID NO：2，
-H-CDR2，具有1或2个差异性氨基酸，所述氨基酸序列定义为SEQ ID NO：3，
-H-CDR3，具有1或2个差异性氨基酸，所述氨基酸序列定义为SEQ ID NO：4，
-L-CDR1，具有1或2个差异性氨基酸，所述氨基酸序列定义为SEQ ID NO：6，
-L-CDR2，具有1或2个差异性氨基酸，所述氨基酸序列定义为SEQ ID NO：7，
-L-CDR3，具有1或2个差异性氨基酸，所述氨基酸序列定义为SEQ ID NO：8。
根据本发明另一个特殊实施例，前文定义的抗半乳糖凝集素9并抑制调节性T细胞的抑制活性的抗体具有1个、2个或3个差异性氨基酸，所述氨基酸具有序列为前文定义的所有六个CDR，换言之，序列为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8的CDR。
根据本发明另一个特殊实施例，可具有前文定义的抗半乳糖凝集素9并抑制调节性T细胞的抑制活性的抗体，包括：
-H-CDR1，具有1或2个差异性氨基酸，所述氨基酸序列定义为SEQ ID NO：11，
-H-CDR2，具有1或2个差异性氨基酸，所述氨基酸序列定义为SEQ ID NO：12，
-H-CDR3，具有1或2个差异性氨基酸，所述氨基酸序列定义为SEQ ID NO：13，
-L-CDR1，具有1或2个差异性氨基酸，所述氨基酸序列定义为SEQ ID NO：15，
-L-CDR2，具有1或2个差异性氨基酸，所述氨基酸序列定义为SEQ ID NO：16，
-L-CDR3，具有1或2个差异性氨基酸，所述氨基酸序列定义为SEQ ID NO：17。
根据本发明另一个特殊实施例，前文定义的抗半乳糖凝集素9并抑制调节性T细胞的抑制活性的抗体具有1个、2个或3个差异性氨基酸，所述氨基酸具有序列为前文定义的所有六个CDR，换言之，序列为SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的CDR。
治疗应用
如前所述，众所周知，在病理情况下，调节性T细胞可导致不适当的免疫抑制，由此促进肿瘤生长。因此，无数研究表明，调节性T细胞降低抗肿瘤的免疫反应，尤其是通过不适当地抑制效应T淋巴细胞的活性，因此促进癌症类型的病理学进展。
在此已经证明，首先，在激活过程中，由调节性T细胞直接表达半乳糖凝集素9，同时效应T淋巴细胞只是非常微弱地对其进行表达，或者根本不表达，靶定半乳糖凝集素9使其能够特异性地抑制调节性T细胞，而没有导致损耗效应T淋巴细胞的风险。此外，已经证明通过抗体抑制半乳糖凝集素9能够抑制调节性T细胞的抑制活性。根据本发明抗半乳糖凝集素9并抑制调节性T细胞的抑制活性的抗体因此可用于治疗与调节性T细胞的抑制活性有关的疾病，尤其是癌症的治疗。
因此，本发明的一个目的涉及到前文所述的用于治疗与调节性T细胞的抑制活性有关的疾病的一种抗体。
本发明的一个特殊实施例涉及到如前文所述的用于癌症治疗的一种抗体。
“癌症治疗”是指例如能够抑制肿瘤或转移瘤、降低复发风险、降低肿瘤或转移瘤的发展速度和/或治疗疾病症状的任何治疗。
本发明所针对的癌症是指调节性T细胞在其中发挥其抑制活性的癌症。有利的是，本发明所针对的癌症是指调节性T细胞在其中的肿瘤组织或循环中大量存在的癌症，调节性T细胞的扩增通常与增加其激活作用(6)有关。可以通过本领域技术人员已知的任何方法对调节性T细胞的频率进行评估，例如，通过瘤内淋巴细胞或循环淋巴细胞的流式细胞术(FACS)分析或者通过肿瘤组织的免疫组化标记进行评估。
一般而言，前文所述的抗体因此可用于治疗调节性T细胞在其中发挥其抑制活性的所有类型的癌症。治疗调节性T细胞在其中发挥其抑制活性的多种类型的癌症已经成为研究课题并且被本领域技术人员所熟知。
因此，众所周知，肿瘤中调节性T细胞的较高水平显然与慢性粒细胞白血病(7)、结肠癌(8)、黑色素瘤(9)、子宫癌(10)、乳腺癌(11)、胰腺癌(12)、胃癌(13)、卵巢癌(14)、中枢神经系统原发性淋巴瘤(15)、多发性骨髓瘤(16)、前列腺癌(17)、霍奇金淋巴瘤或肝癌(18、19)的不良预后有关。
因此，前文所述的抗体尤其可用于癌症的治疗，癌症选自慢性粒细胞白血病，结肠癌，黑色素瘤，子宫癌，乳腺癌，胰腺癌，胃癌，卵巢癌，中枢神经系统原发性淋巴瘤，多发性骨髓瘤，前列腺癌，霍奇金淋巴瘤和肝癌。
研究还表明，某些癌症产生大量携带半乳糖凝集素9的外来体，所述半乳糖凝集素9完成免疫抑制作用的，换言之，抑制免疫反应以及潜在的抗肿瘤反应。产生大量携带半乳糖凝集素9的外来体的癌症的非限制性实例是由病毒诱发的癌症，例如与EBV(爱泼斯坦-巴尔氏病毒)有关的鼻咽癌或者与HCV(丙型肝炎病毒)或HBV(乙型肝炎病毒)有关的肝细胞癌(CHC)(20、21)。
因此，前文定义的抗体尤其可用于癌症的治疗，癌症是病毒诱发的癌症，最好选自与爱泼斯坦-巴尔氏病毒有关的鼻咽癌以及与丙型肝炎病毒或乙型肝炎病毒有关的肝细胞癌。
还表明，增加调节性T细胞的频率是预测丙型肝炎(22、23)导致的纤维化复发的一个因素。
因此，根据本发明的一种抗体可用于预防由丙型肝炎导致的纤维化复发。
在前文所述的每个实施例中，用适合于需要此项治疗的患者的方法施用抗半乳糖凝集素9并抑制调节性T细胞的抑制活性的抗体。
可单独使用或者与任何其它适当混合物组合使用根据本发明的抗体。
本发明的一个目的涉及到治疗癌症的一种方法，与半乳糖凝集素9的表达以及调节性T细胞的抑制活性有关，包括向患者施用治疗有效量的根据本发明的一种抗体。
术语“患者”的意思是患有或者遭受与调节性T细胞的抑制活性有关的疾病，尤其是癌症的人。
术语抗体的“治疗有效量”是指足以治疗这种癌症的抗体的量，具有关于药物治疗的可接受的收益/风险比率。根据本发明的抗体量和组分以及施用频率由临床研究、医生或者药剂师决定。针对每位患者的“治疗有效”量可取决于一定数量的因素，比如待治疗的疾病的性质和严重程度、所采用的抗体的活性、所采用的组分、患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食、施用方法、治疗时间(单剂量或多剂量)、组合使用的药物以及医学专家所熟知的其它因素。
根据本发明的一个特殊实施例，把前文定义的抗半乳糖凝集素9并抑制调节性T细胞的抑制活性的抗体与用于治疗与调节性T细胞的抑制活性有关的疾病的第二种药剂结合使用，例如，第二种药剂为抗癌剂。
因此，在用途是治疗癌症的情况下，抗体可以与已知的癌症治疗方法结合使用，例如，外科手术、放射治疗、化学治疗或者将其相结合。例如，抗体可与过继性免疫疗法结合使用，包括针对肿瘤抗原，尤其是针对EBV抗原一次或多次注射效应淋巴细胞。根据某些方面，与根据本发明的抗半乳糖凝集素9的抗体相结合，用于癌症治疗的其它抗癌剂包括抗血管生成的抗癌剂。根据某些方面，所述抗体与细胞因子联合施用，例如所述细胞因子是刺激抗肿瘤免疫反应的细胞因子。
本发明的一个主题因此涉及到一种组合产品，该组合产品包括前文定义的一种抗体以及一种抗癌剂。
一个特殊实施例涉及到这种组合产品，在癌症的治疗中同时使用、随着时间分开或散布。
药物成分
关于给药方式，抗体通常是以药物成分的形式按配方制成的。可用现有技术已知的方法按配方制成包括根据本发明的一种抗体的药物成分，其中，治疗分子与至少一种赋形剂相结合。
本发明的一个主题因此涉及到一种药物成分，包括如前文所述的抗体以及至少一种药物学上可接受的载体。
“药物学上可接受的载体”是指任何标准的药物载体，其给药方式能够被患者所接收。例如，无菌磷酸盐缓冲盐水溶液是药物学上可接受的。
药物学上可接受的载体通常可包括一种或两种化合物，例如，选自赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、白蛋白等。例如，已知的赋形剂是淀粉、明胶、硬脂酸、硬脂酸钙或硬脂酸镁等。本领域技术人员能够确定适合当前组分的混合物。
除其他事物外，药物成分的形式、给药方式、剂量和计量学当然取决于待治疗的疾病、其症状、其严重程度、以及患者的年龄、体重和性别。
非限制性地，可以按配方制成根据本发明的药物成分，以便能够外敷给药、非肠道给药、鼻腔给药、静脉注射给药、皮下/皮内给药、结膜给药或者通过肌肉内或者眼内的方法给药。
根据本发明的药物成分可选择性地包含适合注射的药物学上可接受的赋形剂。尤其是，所述赋形剂可以是等渗无菌盐溶液、磷酸二氢钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等，或者这些盐的混合物。这些组分还可以是干燥组分，尤其是冷冻、冻干或冷冻干燥组分，根据环境，加入无菌水或生理水之后，所述组分构成可注射溶液。
可以根据各个参数调整所采用的剂量，比如，所述参数尤其是根据病理学或者选择性地根据预期治疗时间的给药方式。
要制备药物成分，可以把足够数量的抗体溶于或分散在药物学上可接受的溶媒中或水介质中。
适合通过注射使用的剂型包括无菌水溶液、分散剂、含有香油的配方或者水相丙二醇以及用于临时制备无菌注射溶液的无菌粉剂。在所有情况下，所采用的形式必须是无菌的，而且必须有充分的流动性，以便能够通过注射器轻松地进行注射。在生产和存储调谐，所述剂型必须稳定，并且防止其被比如细菌或真菌这样的微生物污染。
活性成分的溶液，无论处于自由态或者作为从制药角度可接受的盐，都可以通过与表面活性剂混合的水制备，比如，所述表面活性剂为羟丙基纤维素。可以在甘油中、在液态聚乙二醇中、在两者的混合物中或者在油中进行分散这些制剂通常含有防腐剂，以防止微生物在正常存储和使用条件下生长。
可以用中性形式或盐的形式的组分按配方制成根据本发明的一种抗体。制药学上可接收的盐包括加酸盐，通过蛋白质的自由氨基形成的，以及通过无机酸或有机酸形成的，例如，所述无机酸为盐酸或磷酸，比如，所述有机酸为乙酸、草酸、扁桃酸等。通过自由羟基形成的盐也可以来源于无机碱和有机碱，比如无机碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，比如有机碱为异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。
形成药物形式之后，便可以通过与剂型的剂量匹配的方式，按照治疗有效量给药了。可以按照上文所述给药，但是也可以通过释放药物的胶囊的形式给药。
附图
图1：通过从人血样中分离的天然调节性T细胞的多参数流式细胞术进行的表型分析。
图2：关于在体外分离的天然调节性T细胞的抑制功能的分析。(A)关于按照每分钟计数由自体调节性T细胞激活的PBMC的增殖抑制的分析。(B)关于由自体调节性T细胞激活的PBMC的细胞溶解比例的分析。
图3：通过给人类调节性T细胞中的半乳糖凝集素9编码的基因表达的qPCR进行的分析(n＝12)。1)8、D1、D2、A1、A2代表血袋。CT代表循环阈值。它是平均阈值，从该平均阈值开始检测到半乳糖凝集素9基因扩增。在用四个管家基因(β-肌动蛋白、磷酸甘油醛脱氢酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、泛素)规范化之后，用△CT表达结果。
[△CT＝CT(样本)-CT(管家基因平均数)]
图4：通过人类调节性T细胞中半乳糖凝集素9的三个异构体的表达的免疫印迹技术(Western Blot)进行的分析。HeLa细胞用作负控制。
图5：通过在激活过程中给传统T淋巴细胞中的半乳糖凝集素9编码的基因的表达的qPCR进行的分析(n＝4)。
图6：通过在激活过程中给人类调节性T细胞中的半乳糖凝集素9编码的基因的表达的qPCR进行的分析(n＝4)。
图7：关于在1微克/毫升的浓度下，存在受辐射C15，存在或者不存在调节性T细胞，以及存在或者不存在1G3抗体的情况下，通过分析PBMC的增殖，通过抗Gal9的1G3抗体进行的调节性T细胞的抑制活性的抑制的分析。
图8：关于由半乳糖凝集素9导致的Jurkat细胞凋亡的抑制的分析。
对浓度为1微克/毫升的半乳糖凝集素9S以及浓度为5微克/毫升的抗体(9M1抗体(抗半乳糖凝集素9)、9S2-3(抗半乳糖凝集素9)、1G3(抗半乳糖凝集素9)、抗TIM3，2E12抗体(抗半乳糖凝集素9))进行1小时的预培养。
图9：关于恢复被激活细胞(“A”，通过抗CD3和抗CD28)以及未激活的(NA)，用半乳糖凝集素9处理之后(测试的抗体＝ECA-42(抗半乳糖凝集素9)，1G3(抗半乳糖凝集素9)，2E2(抗TIM3)和2E12(抗半乳糖凝集素9))的增殖的分析。控制与培养基相对应。
图10：关于通过流式细胞术(FACS)表达半乳糖凝集素9的分析。
A：来自调节性T细胞与新分离的CD4+Tconv细胞的半乳糖凝集素9的表达(n＝2个供体)。
B：激活24小时之后，从调节性T细胞和CD4+Tconv细胞提取的半乳糖凝集素9的表达(n＝5个供体)。
C：激活48小时之后，从调节性T细胞和CD4+Tconv细胞提取的半乳糖凝集素9的表达(n＝5个供体)。
D：激活72小时之后，从调节性T细胞和CD4+Tconv细胞提取的半乳糖凝集素9的表达(n＝5个供体)。
图11：培养3天之后，不同条件下Tconv淋巴细胞的相对增殖(细胞激活或未激活，在存在半乳糖凝集素9的情况下，并且具有1G3(“抗X”)、对照同种型(IgG1)、抑制剂(乳糖)以及参考抑制剂(蔗糖))。
图12：培养5天之后，不同条件下PBMC的增殖(细胞激活或未激活，存在1G3或对照同种型(IgG1)的情况下)。
图13：培养5天之后，不同条件下PBMC的生存能力(细胞激活或未激活，存在1G3或者对照同种型(IgG1)。
图14：通过传统CD4+T细胞(“Tconv”)和调节性T细胞(“Treg”)在未激活的条件下和激活的条件下对半乳糖凝集素9的分泌物进行的测量(培养48小时之后进行的试验)。
图15：通过在不同条件下(细胞激活，存在1G3(“抗X”)、对照同种型(IgG1)、抑制剂(乳糖)和/或参考抑制剂(蔗糖))与自体调节性T细胞共同培养，传统T淋巴细胞的相对增殖。
图16：在存在的条件下，在1G3的不同浓度(1μ/毫升，3μ/毫升，5μ/毫升)下，PBMC的相对增殖。
图17：不同治疗下的肿瘤体积：单独PBMC(控制)；PBMC+Treg+1G3(激活的)；PBMC+Treg+IgG1(激活的)；没有PBMC+1G3(激活的)；没有PBMC+IgG1(激活的)。
图18：根据天数的小鼠体重的图形表示。
A和B：对异种移植的SCID小鼠(50.106PBMC+6％Treg)进行的独立试验，并用1G3或对照同种型IgG1进行处理(20微克/鼠)。
图19：根据天数的小鼠体重的图形表示。
A：异种移植的SCID小鼠(20.106PBMC+10％Treg)，并用1G3或对照同种型IgG1进行处理(2微克/鼠)。
B：异种移植的SCID小鼠(50.106PBMC+6％Treg)，并用1G3或对照同种型IgG1进行处理(20微克/鼠)。
C：异种移植的SCID小鼠(50.106PBMC+6％Treg)，并用1G3或对照同种型IgG1进行处理(20微克/鼠)。
D：异种移植的SCID小鼠(50.106PBMC+6％Treg)，并用1G3或对照同种型IgG1进行处理(200微克/鼠)。
图20：6次独立试验中人工测量的肿瘤体积(mm3)的平均值(每只鼠20微克的1G3，50.106PBMC+6至8％Treg，与对照同种型IgG1比较)(人工测量值)。(*p<＝0.05，**p<＝0.001)。
图21：通过生物发光法测量的肿瘤体积的测量值。
A：异种移植的SCID小鼠(50.106PBMC+6％Treg)，并用1G3或对照同种型IgG1进行处理(2微克/鼠)。
B：异种移植的SCID小鼠(50.106PBMC+6％Treg)，并用1G3或对照同种型IgG1进行处理(20微克/鼠)。
C：异种移植的SCID小鼠(40.106PBMC+6％Treg)，并用1G3或对照同种型IgG1进行处理(20微克/鼠)。
D：异种移植的SCID小鼠(50.106PBMC+6％Treg)，并用1G3或对照同种型IgG1进行处理(200微克/鼠)。
图22：6次独立试验中通过生物发光法测量的肿瘤体积的平均值(每只鼠20微克的1G3或IgG1，50.106PBMC+6％至8％Treg)(总通量的测量值)(*p<＝0.05，**p<＝0.001)。
图23：经6次独立试验测量的，以克为单位的肿瘤质量(每只鼠20微克的1G3或IgG1，50.106PBMC+6％至8％Treg)。(*p<＝0.05，**p<＝0.001)。
图24：调节5天之后，不同标记物的表达的比较式细胞仪分析。A：激活的Tconv(浅灰色)、以Gal-9M激活的Tconv(中灰色)或者以Gal-9-S激活的Tconv(黑色)之间的CD4的表达。B：激活的Tconv(浅灰色)、以Gal-9M激活的Tconv(中灰色)或者以Gal-9-S激活的Tconv(黑色)之间的CD4的表达。C：激活的Tconv(浅灰色)、以Gal-9M激活的Tconv(中灰色)或者以Gal-9-S激活的Tconv(黑色)之间的CD4的表达。
图25：通过受M或S型的Gal-9影响5天的Tconv培养3天之后，按照不同条件进行的PBMC的相对增殖。(*p<＝0.05，**p<＝0.001)。
图26：通过分析与调节性T细胞共同培养的PBMC的增殖，关于通过抗Gal9的抗体1G3和抗Gal9的抗体2E12(浓度为1微克/毫升)对调节性T细胞的抑制活性进行的抑制的分析。
实例
1.设备和方法
供体、细胞系和培养条件
供体细胞
健康的供体细胞是按照法国国家血液服务机构(EFS)与国家科学研究院(CNRS)之间的官方道德协议，从来自法国国家血液服务机构(EFS)的血液中分离出来的。该项研究经过了里尔巴斯德研究所(法国科学研究中心)以及法国国家血液服务机构委员会核准，而且每个供体都已经提前签署了一份经解释说明的同意书。
NPC细胞系
C15肿瘤细胞系来自每6-7周在小鼠皮下连续异种移植并繁殖的EBV-阳性的NPC(鼻咽癌)。所有动物实验都是由有资质的人员按照法国和欧洲法规在里尔巴斯德研究所(法国)的养殖场进行的。C15细胞是从异种移植的肿瘤恢复的，然后在通过刺激肿瘤环境的免疫细胞进行预培养之前，经过辐射(5000拉德)。
Jurkat人T淋巴细胞系
Jurkat细胞系是从人T淋巴细胞的白血病建立的。其表型为CD4+淋巴细胞。
细胞培养条件
所采用的标准培养基为RPMI 1640(英国佩斯得的Invitrogen)，辅以10％AB人血清(法国尼艾莱的BioWest)、2毫摩尔L-谷氨酰胺、1毫摩尔丙酮酸钠、10毫摩尔非必需的氨基酸、10毫摩尔羟乙基哌嗪乙硫磺酸，50μ/毫升的链霉素、50微克/毫升的庆大霉素和50μM的β巯基乙醇。在Hera细胞150恒温箱(法国塞尔吉蓬图瓦兹的Thermo Electron)中，在受控气氛(5％的CO2和95％的湿度)中，在37℃的温度下培养细胞。在适用的情况下，通过抗CD3抗体(1微克/毫升)(法国蒙鲁的Clinisciences)激活PBMC和CD4+T细胞，所述抗CD3抗体在培养之前，在37℃的温度下温育2小时之后，固定到板中，并临时加入抗CD28的可溶抗体(100纳克/毫升)(Clinisciences)。
人免疫细胞的分离
PBMC的分离
利用Ficoll Paque PLUS(瑞典乌普萨拉的Amersham Biosciences)通过标准的密度梯度离心法分离健康的供体的外周血单核细胞(PBMC)。
CD4+T细胞的分离
利用阴性选择方案按照制造商(德国柏林的Miltenyi Biotec)的指示从PBMC分离出CD4+T细胞。简言之，用生物素化的抗体的鸡尾酒式混合药培养PBMC10分钟，所述生物素化的抗体抗CD8、CD14、CD16、CD19、CD36、CD56、CD123、TCRγ/δ和血型糖蛋白A。然后加入抗生物素磁球15分钟。把要消除的细胞有磁力地保留在放入分离器中的磁性活化细胞分选柱中。要分离的细胞穿过该柱，然后收集并富含无标记细胞，几乎没有非目标细胞。流式细胞术分析表明98％以上的分离细胞为CD4+细胞。
调节性T细胞的分离
利用分离CD4+CD25+调节性T细胞的试剂盒(德国的Miltenyi Biotech)，按照制造商的指示，从成人供体PBMC分离出人类调节性T细胞。保留CD4+CD25-T细胞的馏分，用于流式细胞术实验和趋化实验。流式细胞术分析表明，不断地富集95％以上的CD4+CD25+馏分。
细胞增殖实验
在培养阶段的最后18小时用[3H甲基]胸苷培养1.105细胞(PBMC或CD4+T细胞)，并用Tomtec收集器(Wallac)将其收集在玻璃纤维滤器(芬兰图尔库的Printed Filtermat A，Wallac)上。经过干燥并加入闪烁液(美国的Beckman Coulter)之后，将滤器密封在袋子中。在收集之前的最后18小时，在存在[3H]胸苷(1μCi/孔)(法国的PerkinElmer，Courtaboeuf)的情况下进行培养之后，对增殖进行测定。用β仪(1450Trilux，Wallac，芬兰)测定放射性。每次增殖实验都以三个实例进行，并按每分钟计数(cpm)估算。根据实验，在有由Dr.Toshiro Niki(Galpharma，日本)提供的1微克/毫升的重组半乳糖凝集素9(Gal9S)的短型异构体、1微克/毫升或一定范围内的抗半乳糖凝集素9的抗体1G3、用作负控制的非相关的抗IGg1抗体(eBioscience，英国)、10微克/毫升的C15外来体以及5毫摩尔乳糖或蔗糖(Sigma Aldrich)情况下，进行增殖实验。
细胞溶解
细胞溶解测量技术基于细胞毒性测定套件(CytoTox-Glo测定，普洛麦格，美国)的使用，所述细胞毒性测定套件测定与细胞溶解之后释放的细胞蛋白酶成比例的荧光素酶的活性。通过在共同培养中加入6.105CD4+CD25+和2.105自体PBMC进行试验。在200微升培养基(RPMI-1640，1％的2毫摩尔L-谷氨酰胺、0.02毫摩尔丙酮酸钠、100μ/毫升的盘尼西林、100微克/毫升的链霉素、10％的脱补体AB人血清)(GIBCO BRLTM，英国)中，在圆底96孔板(Maxisorb Nunc，丹麦)中培养细胞。用提前在板上包被(2小时，在37℃温度下)的1微克/毫升的抗CD3以及100纳克/毫升的抗CD28激活细胞。培养48小时之后，在每个孔中沉淀50微升试剂(氨基虫荧光素-Glo)。轻微搅拌之后，在室温下，避光温育培养板15分钟。第一个发光测量值是用光度计(Centro LB960，C Berthold Technologies，法国)测得的，并且与通过调节性T细胞进行细胞溶解的细胞数量成比例。然后，在每个孔中沉淀50微升洋地黄皂苷溶液，以便引起全部细胞溶解。然后，在进行第二次发光检测之前，搅动板，并在室温下，在黑暗处将其温育15分钟。进行三重测试，结果用溶解比例表示。
溶解比例＝细胞生存能力/溶解总量平均数-背景噪声
细胞生存能力＝溶解总量平均数-细胞溶解
细胞溶解＝由Treg淋巴细胞引起的溶解平均数-背景噪声
Jurket细胞中细胞凋亡的诱导测试
把在5％RPMI的胎牛血清中培养的Jurkat细胞转移到无血清培养皿(HybridomaSFM–生命技术公司)中，然后在有30nM半乳糖凝集素9的情况下在96孔板的一个孔中温育24小时(100，000个细胞/孔)。用V-APC膜联蛋白(别藻蓝蛋白)和碘化丙啶标记之后，通过流式细胞术为细胞凋亡的细胞计数。为了评估单克隆抗体的保护作用，在有抗体的情况下，预培养半乳糖凝集素30分钟，经24-小时温育之后，其最终浓度为10微克/毫升。
蛋白质印迹法(Western Blot)
在PY缓冲液中对外来体进行溶解(10分钟，暂缓地进行)，所述PY缓冲液是由20毫摩尔三氨基甲烷盐酸盐、50毫摩尔氯化钠、5毫摩尔乙二胺四乙酸、1％曲拉通X 100、0.02％叠氮化钠以及的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒式混合药(瑞士巴塞尔的罗氏)构成的。离心分离(20，000g，15分钟，+4℃)之后，消除细胞碎片，并收集上清液。按照制造商(BioRad，Marnesla Coquette，法国)的指示，利用Bio Rad蛋白质浓度测定法测定蛋白质浓度。然后用蛋白质印迹法分析外来体。简言之，在标准条件下，通过SDS PAGE电泳，利用按照一定梯度(梯度4，12％，Bis Tris，Invitrogen)预浇的凝胶剂分离蛋白质。然后把蛋白质转移到硝酸纤维膜(Hybon dTM-C Extra，Amersham Biosciences，英国)上。在含有0.2％AuroraTN封闭液(MP Biomedicals，Illkirch Graffenstaden，法国)、0.1％吐温20(Sigma Aldrich)和PBS(1X)的封闭缓冲液中，在室温下，封闭硝酸纤维膜1小时，然后在4℃的温度下通过抗半乳糖凝集素9：半乳糖凝集素9-CT-L11：100的第一抗体(由日本的Galpharma提供)将其温育一夜。用封闭缓冲液冲洗膜，然后通过与过氧化酶共轭的第二抗体(抗鼠，1：10000)(美国沃瓦托萨的通用电气医疗基团)在室温下将所述膜温育1小时，并用封闭缓冲液再次冲洗。通过Western LightniPlus ECL以及LAS3000发光图像分析仪(富士胶片)展示蛋白质的特异性信号，所述Western LightniPlus ECL是扩增基质化学发光的工具包(美国马萨诸塞州波士顿的PerkinElmer)。
FACS分析
利用仪器“FACS Calibur流式细胞仪”通过流式细胞术进行细胞免疫表型。将其收集之后，用“磷酸盐缓冲盐水”(PBS)(GIBCO-生命技术公司)冲洗细胞，并用与荧光剂共轭的单克隆抗体(1：10)标记所述细胞。对于每次测试，都采用适当的对照同种型(单克隆抗体)调整标记物。最后，用FlowJo软件分析数据。为了检测细胞的表面抗原，按照制造商的指示采用了抗人鼠的抗体：CD4-藻红蛋白(PE)-花色素苷(Cy)5(美国圣地亚哥的BDPharmingen)、-CD25-PE(Miltenyi Biotech，德国)以及-CD127-FITC(1：20)(法国蒙鲁的Clinisciences)。
实时定量PCR
按照制造商的指示利用“RNeasy Minikit II”试剂盒(Qiagen)分离调节性T细胞的总RNA。用分光光度法(Ultrospec 3000，Pharmacia Biotec)测定RNA的浓度和纯度。在后续使用之前，把总RNA储存在-80℃的温度下。
按如下步骤进行了mRNA的反转录：把2微克的总RNA与5微升主混合物混合，所述主混合物是由1微升脱氧胸苷酸(Roche Diagnostic，法国梅郎)和0.1微升RNA酶抑制剂(40U/微升，普洛麦格，Charbonnieres，法国)组成的，然后在70℃温度下将其温育5至10分钟。在室温下，5分钟之后，加入10微升第二种混合物：6微升5X缓冲液(Invitrogen)+1微升0.1MDTT(Invitrogen)+2微升10毫摩尔dNTP(Amersham)+0.1微升RNA酶抑制剂40U/微升(普洛麦格)+1微升超级反转录酶(Invitrogen)。反应之后，在45℃进行初次温育45至60分钟，在95℃进行二次温育5分钟，然后用核糖核酸酶H(普洛麦格)处理20分钟。最后，加入超纯蒸馏水(GIBCO-生命技术公司)，以便得到的最终浓度为10纳克总DNA/微升。在后续使用之前，把DNA存储在-20℃的温度下。
通过Mx3005PTM序列监测系统(法国安捷伦科技公司)，在96孔光学板(EurogentecS.A.，比利时)中利用实时PCR(RT-PCR)对转录进行量化在每个孔中，以10微微克/毫升的最终浓度处置为RT-PCR设计的，从MWG-Biotech(德国)购入的10微升特异引物组合，然后将其储存在-20℃的温度下。把β-肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)、泛素蛋白和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)管家基因用作每个板中的对照物。PCR反应是按照制造商的指示，以20微升最终体积针对1微升cDNA(相当于10纳克总RNA/微升)，利用258试验(Eurogentech)的2X MESA GREEN qPCR MasterMix Plus进行的，包含Meteor Taq DNA聚合酶、氯化镁MgCl2(最终浓度为4毫摩尔)、dNTPs(含有dUTP)、260Green I、信号规范化所需的稳定剂和被动参照以及优化组分的缓冲液。
PCR程序导致Meteor Taq在95℃温度下初始变性和激活5分钟，随后是如下的40个标准扩增循环：在95℃下进行15秒(变性)，在60℃下进行1分钟(合成和伸长)。在每个循环的最后一步检测到荧光产物。扩增之后立即按照制造商的指示对融合曲线进行分析。
定量PCR反应用于通过调节性T细胞表达半乳糖凝集素9基因的数量。β-肌动蛋白、G3PDH、泛素蛋白和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)管家基因用作对照物。所有引物都是为RT-PCT设计的，采购于MWG-Biotech(德国)。定量分析是以每个孔的循环阈值(CT)为基础进行的，并且是利用MxPro软件计算的。按照标准方法△CT：△CT＝CT-CT管家基因，利用四个管家基因的平均值使每个值规范化。对于各组之间的比较，基因的相对表达用为参考样本给出任意值1的表示。
生成抗半乳糖凝集素9、1G3和2E12的单克隆抗体的杂交瘤的制造
代表人半乳糖凝集素9的C端部分的重组蛋白质用作免疫原(半乳糖凝集素9长异构体的残基191至355)。它是在大肠杆菌中以GST融合蛋白质的形式生成的。分离GST标签之后，通过排阻色谱法使蛋白质纯化。
通过公司PX疗法(Grenoble，法国)进行免疫。用上文提及的半乳糖凝集素9的C端部分使五只八周大的雌性BALB-c小鼠免疫。为了免疫，在第0、22、37和54日向腹膜内注入40微克蛋白质，初次注射与完全弗氏佐剂联合，或者以后注射与不完全弗氏佐剂联合。通过下文所述的关于来自免疫小鼠的血清样本的ELISA试验对免疫质量进行评估。把重组C端半乳糖凝集素9的相同制剂方法一方面用于免疫，另一方面用于ELISA试验。这些试验表明五只接受治疗的小鼠免疫良好。
最后一次重复之后的三天，呈现最适反应的两只小鼠牺牲了，获得其脾细胞。把这些脾细胞用于在液体介质中或者在半固态介质中，分别按照5：1和2：1的比率，与Sp2/O小鼠骨髓瘤细胞融合。然后通过对上文提及的重组半乳糖凝集素9制剂进行ELISA试验评估杂交瘤上清液，所述ELISA试验是按照前文所述以及下文所述的内容进行的。
半固态融合取得成功，得到39个杂交瘤，所述杂交瘤分泌在ELISA中与半乳糖凝集素9反应的抗体。选择其中七个，因为特别丰富的免疫球蛋白分泌物以及在ELISA中的高度活性。然后，这七个杂交瘤经过新功能筛选，从而研究所生成的抗体的抗半乳糖凝集素9的中和性能。
ELISA试验按如下步骤进行。在以下融合过程中，把呈现半乳糖凝集素9的C端部分的重组蛋白质吸附在96孔微量滴定板(50纳克/孔)(Greiner Bio-One，Courtaboeuf，法国)的孔中：溶入pH值为9.6的0.05M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中，然后在室温下在孔内温育1小鼠。用含有0.1％吐温-20的PBS冲洗之后，在室温下，把各孔浸在PBS中溶解状态的3％的牛血清蛋白(BSA)中1小时。然后用待测试的小鼠血清或杂交瘤上清液对其进行温育。在PBS中用1％的BSA稀释血清和杂交瘤上清液，然后在室温下在各孔中将其温育2小时。用0.1％的PBS-吐温-20清洗步骤之后，用通过过氧化酶标记的第二抗体(抗鼠羊)处理板。加入基质(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺或TMB；赛默飞世尔科技)并在Multiskan Ex酶标仪(赛默飞世尔科技)上测量405和620纳米的吸光度之后，发生最后的启示。
对转基因小鼠进行的体内试验
首先切除免疫缺陷小鼠的脾，然后通过改良CNP的C666-1细胞系进行异种移植，从而表达荧光素酶，这样使之能够在对清醒动物进行生物发光成像过程中监测肿瘤生长。注射人PBMC之后，对鼠免疫系统进行重组和人性化，所述人PBMC或多或少地富集了调节性T细胞(原始PBMC中2％的调节性T细胞，并在PBMC中加入6％至10％调节性T细胞)。已经表明，PBMC在一定程度上能够限制肿瘤生长，而且富集调节性T细胞对该作用没有影响(Moralès等人编写的《通过溶瘤细胞H-1的细小病毒激活辅助而非调节性人CD4+T细胞应答》；PLoSOne.2012；7(2)：e32197)。然后注射抗Gal-9的1G3抗体，并评估其对肿瘤生长的影响。
然后是以下实验方案：
6至8周大的SCID小鼠经受全脾切除。7天之后，通过由鼻咽癌(NPC)产生的C666-luc肿瘤系的细胞(表达荧光素酶)对这些小鼠进行皮下异种移植。同一天，小鼠在腹腔内接受3至5千万PBMC，以便重构免疫系统，富集或者不富集10％调节性T细胞，并且，根据动物，按照以下方案在皮下接受2微克、20微克或200微克的IgG1抗体或1G3抗体(3只小鼠/组)：
-第1组：IgG1同种型(未重组的)
-第2组：1G3(未重组的)
-第3组：重组的+10％Treg+IgG1同种型
-第4组：重组的(未处理的)
-第5组：重组的+10％Treg+1G3
所有小鼠都接受3微克(用Miltenyi Biotech标记的)CPG-ODN2216，以便激活免疫反应。
在四周内，通过小动物成像平台(Lumina XRMS，PerkinElmer)上的发光读数以及通过肿瘤的体积和质量的人工测量值每周进行三次监测。在移植后的第7日、第14日和第21日，小鼠接受重复的(用Miltenyi Biotech标记的)CPG-ODN2216，并且，根据前文所示组别，接受重复的1G3或IgG1抗体。第一次重复之前，取血液样本，以便通过流式细胞术对重构进行验证(参考治疗方案第58页)。测定28天之后，小鼠牺牲，肿瘤恢复并低温存储，以期制备免疫组化板或免疫荧光板，并且再次取血液样本，以便通过流式细胞术进行分析。
评估了不同浓度[2微克/毫升、20微克/毫升和200微克/毫升]的1G3和IgG1同种型对牺牲时(i)小鼠的体重、(ii)肿瘤体积以及(iii)肿瘤质量的影响。
(i)关于注射1G3抗体对小鼠体重的影响的分析
受入的小鼠定期称重[从第5天至第28天]。
(ii)关于1G3对肿瘤体积(人工测量)的影响的分析
按照上文所述的治疗方案，并改变注射的1G3和1G1的浓度，对人性化SCID小鼠进行了几次独立实验。人工测量了肿瘤体积。
此外，为了得到显示1G3对肿瘤体积的影响的图表，通过1G3抗体或对照同种型(20微克)产生包含6次独立体内实验的平均结果。
通过Rank Sum Mann Whitney试验进行统计分析(*p<＝0.05，**p<＝0.001)。
注射荧光素之后，还通过分析由肿瘤细胞发出的生物性光测量肿瘤体积，所述肿瘤细胞表达荧光素酶的基因。利用小鼠生物性光测量系统(IVIS LUMINA)测量生物性光。按照上文所述的治疗方案，并改变注射的1G3和1G1的浓度，对人性化SCID小鼠进行六次独立实验。
此外，为了得到显示1G3对肿瘤体积的影响的图表，通过1G3抗体或对照同种型(20微克)产生6次独立体内实验的平均结果。
最后，在毫米纸上给经1G3或对照同种型IgG1治疗的小鼠肿瘤拍照，以便测量安乐死时的肿瘤大小。
(iii)关于1G3对肿瘤质量的影响的分析
牺牲后，给经1G3或对照同种型IgG1治疗的小鼠肿瘤称重。以克为单位表达质量。
通过Rank Sum Mann Whitney试验进行统计分析(*p<＝0.05，**p<＝0.001)(图22)。
关于1G3抑制通过半乳糖凝集素9诱导调节性T细胞的能力的分析
已经表明，半乳糖凝集素9能够把天然CD4T细胞的分化诱导到Treg淋巴细胞中(Seki，Oomizu等人，2008年)，由此增加了该凝集素在抗肿瘤免疫反应的力竭现象中的重要性。
首先，检查半乳糖凝集素9是否能够把Tconv细胞转化为调节性T细胞。在激活或非激活条件下，在有或没有半乳糖凝集素9异构体(Gal-9S或Gal-9M)的情况下，有或没有1G3的情况下，培养Tconv细胞3天或5天。经过这些调节阶段之后，恢复、冲洗并通过流式细胞术分析细胞，并与PBMC或自体Tconv细胞进行共同培养。为了ELISA分析，还恢复培养基。
治疗方案如下：按照Ficoll梯度通过纯化分离出PBMC，按照供应商(MiltenyiBiotech，T细胞分离试剂盒)的治疗方案通过镁选柱分离出传统T淋巴细胞。在非激活的条件下保留一些PBMC，并在激活与非激活条件下培养自体Tconv细胞5天。通过提前在板上包被(2小时，处于37℃)的抗CD3(1微克/毫升)(由Anne Tsicopoulos团队提供，CIIL)以及抗CD28(100纳米/毫升)(Clinisciences，法国)进行激活。
这些T细胞在有或没有3微克/毫升的1G3抗体的情况下，经过或未经过2微克/毫升的Gal-9 S或M的异构体调节。5天后，冲洗经调节的Tconv，通过用台盼蓝*(参考下文)计数确定生存能力，以ELISA试验为目的恢复上清液，并通过流式细胞术分析105个细胞，从而测定表达CD4、CD25和CD127标记。其余传统细胞与为了MLR试验而保留的自体PBMC接触。
通过共同培养105个经调节的Tconv与105个自体PBMC(比例1：1)，在有或没有1G3或2E12抗体的情况下，通过MLR(混合淋巴细胞反应)进行抑制试验。用提前在板上包被(2小时，处于37℃)的1微克/毫升的抗CD3以及抗CD28(100纳克/毫升)激活细胞。
共同培养3天之后，在培养结束之前的18小时，通过参入1μCi/孔的氚化胸腺嘧啶(3H Th)(法国的通用电气医疗集团)对增殖进行评估。3天后，用玻璃纤维滤器(PerkinElmer，法国)过滤板。在闪烁液(贝克曼仪器公司，Ready Safe，美国)中温育滤器，并通过闪烁计数器(1450Trilux，Wallac，芬兰)读取滤器。最终按每分钟计数(cpm)表达结果。通过Rank Sum Mann Whitney试验进行统计分析(*p<＝0.05，**p<＝0.001)。
用台盼蓝计数
至关重要的偶氮染料(台盼蓝)用于给死细胞着色。为一份体积的细胞悬液参入一份体积的0.4％台盼蓝溶液(Sigma，美国)，由此对计数进行评估。3分钟后，在托马斯板上沉淀混合物。计算呈蓝色的死细胞以及屈光的活细胞的数量。一式三份地进行测量，结果表达为活细胞的百分比。
通过ELISA测定半乳糖凝集素9的分泌物
在4℃下，把50微升抗Gal-9抗体的0.2微克/毫升的溶液(克隆：SEA309Hu-Uscn生命科学公司，美国)固定在96孔板(NUNC，丹麦)中一夜。用0.05％的1X PBS(Euromedex，法国)-吐温(Sigma Aldrich，美国)冲洗4次之后，在室温下，把板浸在3％PBS-BSA(Sigma美国)中2小时。然后用0.05％的PBS-吐温将其冲洗3次。在激活或未激活的情况下，一式两份地沉淀100微升/孔的Treg淋巴细胞的培养上清液，并在室温下将为温育2小时。Treg淋巴细胞通常是由提前在板上包被(2小时，处于37℃)的抗CD3(1微克/毫升)(由Anne Tsicopoulos团队提供，CIIL)以及抗CD28(100纳克/毫升(Clinisciences，法国)激活的。
在每个板上，在1％PBS-BSA中，在2.5微微克/毫升的条件下，完成一定范围的重组半乳糖凝集素9(Uscn生命科学公司，美国)，其浓度为2.5纳克/m。
用PBS-吐温冲洗2次之后，100微升/孔的生物素化的第二抗体在1微克/毫升的浓度下在室温下温育1小时。再冲洗板3次，通过按照1/10000的比例加入100微升/孔的抗生蛋白链菌素-过氧化物酶，在室温下扩大反应30分钟。冲洗4次之后，通过的含有1mg/毫升的OPD(邻苯二胺二盐酸盐)(美国)的100微升/孔的显示液在黑暗条件下显示板10分钟。通过加入50微升/孔的2N盐酸(VWR，美国)终止该反应。
然后用分光光度计读取板，波长为492纳米(Multiskan Ex，ThermoLabsystems，法国)。
PBMC生存能力的测定
用CellTiter-Glo法直接进行生存能力试验，这样能够测定线粒体代谢。相同的治疗方案用于评估Tconv淋巴细胞的生存能力。
通过共同培养沉淀2.105个自体PBMC。根据条件激活或者不激活细胞[由提前在板上包被(2小时，处于37℃)的抗CD3(1微克/毫升)(由Anne Tsicopoulos团队提供，CIIL)以及抗CD28(100纳克/毫升)(Clinisciences，法国)激活]，并用浓度为3微克/毫升、6微克/毫升或12微克/毫升的1G3抗体或对照同种型1G1温育所述细胞。在具有透明“孔”的平底96孔板(Corning 3610，美国康宁公司)中，在100微升培养基(DMEM+4.5g/l的葡萄糖+L-谷氨酰胺、100U/毫摩尔的盘尼西林、100微克/毫升的链霉素、10％的脱补体人AB血清)(GibcoBRLTM，生命技术公司，英国)中进行培养。
试验采用普洛麦格CellTiter-Glo发光细胞生存能力测定试剂盒(美国普洛麦格公司)，在有氧条件，其利用荧光素酶的活性对作为一个细胞生存能力指标的细胞代谢(ATP)进行测定。培养48小时之后，把100微升试剂(荧光素、荧光素酶以及含镁的缓冲液)加入每个孔中；搅动板2分钟，然后在室温下避光温育15分钟。一式三份地进行试验，然后用光度计(Centro LB960，C Berthold Technologies，法国)读取板。按1秒/孔的速度读取。
通过流式细胞术(Facs)进行Tconv淋巴细胞的膜标记
所用抗体(Ac)
与荧光染料欧联的抗人单克隆第一抗体、抗CD4-PE(藻红蛋白)-C(青色素)5(BDPharmingen TM，美国)、抗CD25-PE(Miltenyi Biotech，法国)、抗CD127-FITC(异硫氰酸荧光素)(Clinisciences，法国)。
作为补偿，采用不同单克隆抗体的对照同种型。
直接标记协议
在体积为100微升无菌PBS(GIBCO BRLTM，英国)中取细胞(2.105)，并在10微升抗CD4-PC、10微升抗CD25-PE和4微升抗CD127-FITC中，在室温及黑暗条件下，将细胞温育30分钟。然后用标记的细胞吸收400微升PBS，并用Facscalibur(FACS流供应系统，Becton Dickinson，美国)通过流式细胞术分析荧光性。
通过Flow Jo软件(美国树星公司)分析血细胞计数结果。对于某些实验，加入标记的抗体之后，通过加入100微升4％FBA(Sigma-Aldrich，美国)固定细胞10分钟，然后在通过血细胞计数器分析之前，吸收200微升PBS。
增殖和抑制(MLR)(2E12)
增殖检查
在96孔圆底板(Nunc，丹麦)中，在200微升培养基(RPMI-1640，1％的2毫摩尔L-谷氨酰胺、0.02毫摩尔丙酮酸钠、100U/毫摩尔的盘尼西林、00微克/毫升的链霉素、10％的脱补体人AB血清)(GibcoBRLTM，Invitrogen，英国)中，对培育了48小时的105个PBMC进行增殖实验细胞。通过提前在板上包被(2小时，处于37℃)的抗CD3(1微克/毫升)(由AnnTsicopoulos团队提供，CIIL)以及抗CD28(100纳克/毫升)(Clinisciences，法国)，在有或没有1G3或2E12抗体的情况下激活所述细胞。
抑制
通过共同培养6.104个Treg与105个自体PBMC，在有或没有1G3或2E12抗体的情况下，通过MLR(混合淋巴细胞反应)进行抑制试验。用提前在板上包被(2小时，处于37℃)的1微克/毫升的抗CD3以及抗CD28(100纳克/毫升)激活细胞。
在培养结束前的18小时，通过参入1uCi/孔的氚化胸腺嘧啶(3H Th)(法国的通用电气医疗集团)对增殖进行评估。48小时之后，用玻璃纤维滤器(PerkinElmer，法国)过滤板。在闪烁液(贝克曼仪器公司，Ready Safe，美国)中温育滤器，并通过闪烁计数器(1450Trilux，Wallac，芬兰)读取滤器。最后，按每分钟计数(cpm)表达结果。
结果
PBMC与调节性T细胞的表型分析
用流式细胞术(FACS)分析PBMC表明，调节性T细胞CD4+CD25+CD127-占总PBMC的1％(结果未显示)。
此外，关于在体外分离的自体调节性T细胞的表型标记的FACS分析表明95％的调节性T细胞是CD4+CD25+，而且在这些细胞中，90％是CD127；或者CD127较少，FoxP3+占86％以上(图1)。
激活的调节性T细胞具有抑制活性
通过两项功能分析，描述了从健康的供体血液中在体外分离出来的人类调节性T细胞的抑制活性的特征：一项关于由自体调节性T细胞激活的PBMC的增殖的抑制的测试以及一项关于由自体调节性T细胞激活的PBMC的细胞溶解的测试(图2)。
图2A表明，激活的PBMC在体内单独增殖很好，而在体外分离的调节性T细胞是没有免疫性的，即便将其激活之后，亦是如此。但是，在有比例为4：2的激活的自体调节性T细胞的情况下，激活的PBMC增殖减少24％以上(参考图2A)。增殖实验(MLR)因此清楚地表明，在激活条件下，在体外分离的调节性T细胞具有免疫抑制活性。
细胞溶解试验的结果巩固了通过增殖实验得到的结果。实际上，在图2B中表明，PBMC：调节性T细胞的比率越低，激活的PBMC的溶解比例越高。调节性T细胞因此在不同比率下，在依赖剂量的融合过程中，诱导自体PBMC溶解。
半乳糖凝集素9分布于调节性T细胞，并由其表达
通过实时定量PCR(图3)和Western Blot(图4)分析表明，半乳糖凝集素9分布于在体外分离的人类调节性T细胞，而且所述人类调节性T细胞表达半乳糖凝集素9，表明调节性T细胞利用半乳糖凝集素9经络抑制效应T淋巴细胞的增殖。
激活时效应T淋巴细胞对半乳糖凝集素9的表达减少；激活时调节性T淋巴细胞对
半乳糖凝集素9的表达增加
图14显示，Tconv淋巴细胞和未激活的调节性T细胞反而产生非常少量的半乳糖凝集素9(<10微微克/毫升：换言之，低于ELISA试验的检测阈值)，激活的人类调节性T细胞能够在细胞外的环境中合成和分泌半乳糖凝集素9。此外，调节性T细胞被激活时，半乳糖凝集素9的这种分泌功能明显较强，把这种分泌功能与其抑制功能联系在一起。
图5显示激活过程中传统CD4+T淋巴细胞与5调节性T细胞的比率大大降低。
激活的传统CD4+T淋巴细胞仅表达一点给半乳糖凝集素9编码的基因，而且在激活过程中，该表达大大减少。
另一方面，通过调节性T细胞对给半乳糖凝集素9编码的基因的表达在激活过程中增加(参考图5和图6)。
因此，具有抗肿瘤作用的T淋巴细胞的结构性地激活作用并不是抗Gal-9抗体的靶标。另一方面，被激活并因此具有功能性的调节性T细胞是抗Gal-9抗体的理想靶标。
通过流式细胞术加强了对调节性T细胞和CD4+T细胞中半乳糖凝集素9的差异蛋白表达的分析。如图10中可见，基础表达较低，而且调节性T细胞与刚刚分离的CD4+T细胞之间的基础表达几乎相同。然而，据发现，激活TCR(抗CD3/抗CD28)之后，表达谱发生变化，在调节性T细胞中出现了非常强烈表达半乳糖凝集素9的群体。这种过度表达持续，并与时间成比例地增加，而半乳糖凝集素9的基础表达在CD4+Tconv细胞仍然较低，甚至激活之后，仍是如此(图10)。
因此表明，半乳糖凝集素9的过度表达是针对激活的调节性T细胞的，而且在基础条件下激活之后，CD4+Tconv细胞中半乳糖凝集素9的表达非常低。因此消除了靶定效应CD4+T淋巴细胞的风险，由此使得根据本发明所关注的患者能够维持其免疫功能。
调节性T细胞的抑制活性受到抗半乳糖凝集素9的1G3抗体的抑制
为了评估1G3抗体在体内对调节性T细胞的活性的影响，采用以参入氚化胸腺嘧啶为基础的细胞增殖实验。
图7展示了在存在经辐射C15、存在或者不存在调节性T细胞、以及存在或者不存在浓度为1微克/毫升的1G3抗体的情况下，关于PBMC增殖的测试结果。
首先，通过试验的阳性对照证实激活PBMC确实导致其增殖增加，而且调节性T细胞的出现确实导致PBMC细胞增殖的减少。
还表明，C15肿瘤细胞的辐射确实导致其增殖停止。C15细胞是无免疫性的。
C15肿瘤细胞的出现确实引起人PBMC的细胞增殖减少。
然后表明，在共同培养PBMC和C15过程中出现的调节性T细胞导致增殖明显额外减少约56％。
图7清楚地表明，出乎意料地，1G3抗体的出现使之能够恢复PBMC的增殖。因此提示1G3抗体中和了出现在调节性T细胞上，并由调节性T细胞表达的半乳糖凝集素9。因此，表明1G3抗体抑制了调节性T细胞的抑制活性。
1G3抗半乳糖凝集素9的抗体的功效优于其它抗半乳糖凝集素9的抗体
为了比较1G3抗体与其它抗半乳糖凝集素9的抗体乃至抗TIM3抗体对的调节性T细胞的抑制活性的抑制作用的影响，进行了几项检测。
因此，分析了不同抗半乳糖凝集素9的抗体对由半乳糖凝集素9导致的细胞凋亡的抑制的影响以及抗半乳糖凝集素9的抗体对在用半乳糖凝集素9处理人PBMC之后恢复增殖的影响。与1G3相比，抗半乳糖凝集素9受测抗体不识别与1G3抗体相同的半乳糖凝集素9的表位。
还对抗TIM3的抗体进行了检测。这是因为已经提出了关于会出现在T淋巴细胞上的Tim-3受体与半乳糖凝集素9的促凋亡作用之间的联系的某些理论。
抑制由半乳糖凝集素9引起的细胞凋亡
图8展示了关于由重组半乳糖凝集素9引起的受测抗体对Jurkat细胞凋亡的影响的测试的结果。
受测抗体是9M1(抗半乳糖凝集素9)、9S2-3(抗半乳糖凝集素9)和1G3(抗半乳糖凝集素9)抗体以及抗TIM3、2E12(抗半乳糖凝集素9)的抗体。
如图8中可见，1G3抗体比其它抗半乳糖凝集素9的抗体9S2-3和9M1或抗TIM3的抗体更好地防止Jurkat细胞凋亡。
用半乳糖凝集素9处理后增殖的恢复
图9展示了关于受测抗体对提前用半乳糖凝集素9处理的人PBMC增殖的影响的测试的结果。
受测抗体是ECA-42(抗半乳糖凝集素9)、1G3(抗半乳糖凝集素9)、2E2(抗TIM3)和2E12(抗半乳糖凝集素9)抗体。
如图9中可见，通过1G3抗体比其它抗半乳糖凝集素9的抗体ECA-42和2E12或抗TIM3的抗体(2E2)更有效地恢复人PBMC的增殖。
对Tconv淋巴细胞(T CD4+)的影响
图11展示了关于通过在培养的最后18小时内参入氚化胸腺嘧啶测定刚刚分离的细胞的增殖，由此进行的半乳糖凝集素9和1G3对Tconv淋巴细胞(T CD4+)的影响的试验的结果。结果也是以每分钟计数(cpm)为单位展示的。
正如PBMC那样(图9)，在体外分离的Tconv淋巴细胞在激活条件下增殖。还表明，半乳糖凝集素9按照与PBMC相同的方式明显抑制Tconv淋巴细胞的增殖。
最后，应注意，在该图11中，抗半乳糖凝集素9(1G3)抗体对Tconv淋巴细胞的增殖没有影响。
关于对PBMC增殖的细胞毒作用及其对照同种型的分析
通过在培养的最后18小时内参入氚化胸腺嘧啶测定刚刚分离的从3个供体血液中提取的细胞的增殖，由此分析了1G3抗体或其对照同种型(IgG1)的剂量增加对PBMC的影响。得到的结果以CPM为单位。
在图12中观察到，在体外分离的PBMC在激活的条件下在体内增殖。还注意到，即便在高剂量单克隆抗体(3至12微克/毫升)的情况下，1G3抗体及其对照同种型IgG1也不影响PBMC的增殖。
关于1G3抗体及其对照同种型对PBMC生存能力的细胞毒作用的分析
通过测定刚刚从3个供体中分离出来的PBMC的生存能力，利用化学发光分析对mAb1G3及其对照同种型(1G1)的剂量增加进行了分析。在5天激活过程中，测定了线粒体代谢。得到的结果以RLU为单位。
图13显示了在体外分离的PBMC在激活条件下维持并增加其在体内的生存能力。这也表明，即使在高剂量抗体(3至12微克/毫升)的情况下，1G3和1G1同种型也不改变PBMC的生存能力。
因此表明，1G3抗体既不影响PBMC和人T CD4+的增殖，也不影响其生存能力。因此，降低了比如诱发利于癌症进展的免疫抑制这样的副作用的风险。作用能够更好地维持根据本发明所关注的患者的免疫功能，尤其是抗肿瘤的免疫功能。
关于1G3对的调节性T细胞的抑制活性的中和作用的分析
通过关于调节性T细胞与传统T淋巴细胞的混合白细胞反应的增殖的测试分析了由1G3抗体抑制调节性T细胞的抑制功能的潜能。
正如预期的那样，结果表明，调节性T细胞在共同培养过程中抑制细胞增殖(图15)。此外，通过1G3预培养2小时足以逆转这种抑制作用。采用对Treg淋巴细胞没有作用的1G3的对照同种型使之能够总结出，通过调节性T细胞产生的对抑制作用的逆转是特异性的，并且通过半乳糖凝集素9。
为了确定1G3是否通过作用于可溶的半乳糖凝集素9或者直接作用于调节性T细胞而抑制调节性T细胞，通过阻碍可溶的半乳糖凝集素9的抑制剂进行了一项试验，并把得到的结果与通过1G3抗体作比较。
结果清楚地表明，化学抑制剂对调节性T细胞的抑制活性没有明显作用。使用1G3抗体再次导致逆转由调节性T细胞诱发的抑制作用。该结果因此证实半乳糖凝集素9作用于由调节性T细胞诱发的抑制作用，而且1G3能够逆转该抑制作用。
体内中和调节性T细胞的抑制活性
评估了不同浓度[2微克/毫升、20微克/毫升和200微克/毫升]的1G3和IgG1同种型对牺牲时(i)小鼠的体重、(ii)肿瘤体积以及(iii)肿瘤质量的影响。
(i)关于1G3抗体注射剂对小鼠体重的影响的分析
如图18A和图B中可见，用1G3治疗的小鼠比用对照同种型治疗的小鼠轻。该结果提示经治疗的小鼠体重下降可能与肿瘤缩小有关。
(ii)关于1G3对肿瘤体积(人工测量)的影响的分析
图19A-D中显示的结果表明了1G3的积极作用，与对照同种型相比，这明显限制了肿瘤生长。
此外，图20中所示结果清楚地表明1G3与其对照同种型的免疫作用之间的显著差异，通过1G3大大限制了肿瘤生长。
通过生物发光法的测量值也证实了这些结果(图21A-D、图22)，与其对照同种型相比，1G3诱使限制肿瘤生长。
最后，肿瘤的照片(未显示)也表明了1G3的积极作用，与其对照同种型相比，致使限制肿瘤生长。
(iii)关于1G3对肿瘤大小的影响的分析
关于肿瘤质量的结果(图23)依次证实了与其对照同种型相比的1G3的有益效果。
关于1G3抑制通过半乳糖凝集素9诱导调节性T细胞的能力的分析
已经表明，半乳糖凝集素9能够把天然CD4T淋巴细胞的分化诱导到Treg淋巴细胞中(Seki等人，半乳糖凝集素9抑制Th17的生成，促进诱导调节性T细胞，并调节实验性自身免疫性关节炎；Clin Immunol，2008年4月；127(1)：78-88.doi：10.1016/j.clim.2008.01.006，电子版，2月20日)，由此增加了该凝集素在抗肿瘤免疫反应的力竭现象中的重要性。
图25中所示的结果清楚地表明，通过半乳糖凝集素9的每个异构体调节的CD4+Tconv淋巴细胞获得抑制表型并抑制PBMC增殖。S(短)型半乳糖凝集素9比M(中)型的这种抑制作用强。还发现，在调节过程中加入1G3抑制这种抑制表型的建立，并且通过中和半乳糖凝集素9显著地恢复增殖。
此外，如图24中所示，试验结束时的细胞FACS分析表明，半乳糖凝集素9的每个异构体都致使CD25的表达增加。但是，如图24所示，激活的细胞在正常情况下过度表达CD25。
结果清楚地表明，把半乳糖凝集素9加入Tconv淋巴细胞(i)导致与激活的Tconv淋巴细胞相比，通过S型或M型的半乳糖凝集素9少量增加CD4的表达；(ii)除了通过M或S型的半乳糖凝集素9进行调节的阶段外，对CD127的表达没有影响；(iii)导致与激活的Tconv淋巴细胞相比，通过M型和S型的半乳糖凝集素9显著增加CD25的表达。
图24因此表明，通过来自半乳糖凝集素9的M或S预培养Tconv淋巴细胞增加CD4和CD25标记的表达，因为可能更多地抑制表型。然而，只有与这些经调节的Tconv淋巴细胞的抑制活性相关的情况下，才能接受这一假设，使之能够使抑制表型生效就是这种情况下(参考图25)。
总之，表明半乳糖凝集素9导致传统CD4+T淋巴细胞转化为免疫抑制CD4+T淋巴细胞。1G3抗体能够使这种转化的诱导无效，并因此促使在根据本发明所关注的患者体内维持抗肿瘤的免疫反应。
关于2E12对Treg淋巴细胞的抑制活性的中和作用的分析
通过关于调节性T细胞与自体PBMC(2个独立供体)的混合白细胞反应的增殖的测试分析了由2E12抗体抑制的调节性T细胞的抑制功能的潜能。
图26中可见的结果表明，通过2E12预培养调节性T细胞2小时足以通过调节性T淋巴细胞逆转细胞增殖的抑制作用。利用对于调节性T细胞没有影响的这种对照同种型的2E12使我们能够再次总结出，如此逆转调节性T细胞的诱导抑制是特异性的，并且通过半乳糖凝集素9。
此外，据观察，就像1G3那样，2E12抗体能够逆转这种抑制作用。2E12的功效远不像1G3那么高，但是，与1G3不同的是，观察到PBMC增殖稍微减少。
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Claims (15)
1.抗半乳糖凝集素9并抑制调节性T细胞的抑制活性的抗体。
2.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体特异性地结合到氨基酸序列SEQ ID NO：9的表位。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其固定区与具有定义如下的六个CDR的抗体相同：
-H-CDR1区中的氨基酸序列SEQ ID NO：2
-H-CDR2区中的氨基酸序列SEQ ID NO：3
-H-CDR3区中的氨基酸序列SEQ ID NO：4
-L-CDR1区中的氨基酸序列SEQ ID NO：6
-L-CDR2区中的氨基酸序列SEQ ID NO：7
-L-CDR3区中的氨基酸序列SEQ ID NO：8
4.根据权利要求1或2所述的抗体，具有定义如下的六个CDR：
-H-CDR1区中的氨基酸序列SEQ ID NO：2
-H-CDR2区中的氨基酸序列SEQ ID NO：3
-H-CDR3区中的氨基酸序列SEQ ID NO：4
-L-CDR1区中的氨基酸序列SEQ ID NO：6
-L-CDR2区中的氨基酸序列SEQ ID NO：7
-L-CDR3区中的氨基酸序列SEQ ID NO：8
5.根据权利要求1至4所述的抗体，特征在于所述抗体的可变重链区的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，特征还在于所述抗体的可变轻链区的氨基酸序列为SEQ ID NO：5。
6.根据权利要求1所述的抗体，其固定区与具有定义如下的六个CDR的抗体相同：
-H-CDR1区中的氨基酸序列SEQ ID NO：11
-H-CDR2区中的氨基酸序列SEQ ID NO：12
-H-CDR3区中的氨基酸序列SEQ ID NO：13
-L-CDR1区中的氨基酸序列SEQ ID NO：15
-L-CDR2区中的氨基酸序列SEQ ID NO：16
-L-CDR3区中的氨基酸序列SEQ ID NO：17
7.根据权利要求1所述的抗体，具有定义如下的六个CDR：
-H-CDR1区中的氨基酸序列SEQ ID NO：11
-H-CDR2区中的氨基酸序列SEQ ID NO：12
-H-CDR3区中的氨基酸序列SEQ ID NO：13
-L-CDR1区中的氨基酸序列SEQ ID NO：15
-L-CDR2区中的氨基酸序列SEQ ID NO：16
-L-CDR3区中的氨基酸序列SEQ ID NO：17
8.根据权利要求1、6或7中任何一项权利要求所述的抗体，特征在于所述抗体的可变重链区的氨基酸序列为SEQ ID NO：10，特征还在于所述抗体的可变轻链区的氨基酸序列为SEQ ID NO：14。
9.根据权利要求1至8中任何一项权利要求的抗体，将其用于治疗与调节性T细胞的抑制活性有关的疾病。
10.根据权利要求9使用的抗体，特征在于把所述抗体用于癌症的治疗。
11.根据权利要求10使用的抗体，特征在于癌症选自慢性粒细胞白血病、结肠癌、黑色素瘤、子宫癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、中枢神经系统原发性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、前列腺癌、霍奇金淋巴瘤或肝癌。
12.根据权利要求10使用的抗体，特征在于，癌症是由病毒诱发的癌症，最好选自与爱泼斯坦-巴尔氏病毒有关的鼻咽癌以及与丙型肝炎病毒或乙型肝炎病毒有关的肝细胞癌。
13.药物成分，包括根据权利要求1至8中任何一项权利要求所述的抗体以及至少一种药学可接受的载体。以及至少一种药物学上可接受的载体。
14.组合产品包括：
-权利要求1至8中任何一项权利要求所定义的抗体，以及
-抗癌剂。
15.权利要求14中所定义的组合产品，在癌症的治疗中同时使用、分开使用或者随着时间散布使用。
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