JP2017521485A - ガレクチン−9に対して方向づけられ、制御性tリンパ球の抑制活性の阻害剤である抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
- 領域H-CDR1におけるアミノ酸配列 配列番号2
- 領域H-CDR2におけるアミノ酸配列 配列番号3
- 領域H-CDR3におけるアミノ酸配列 配列番号4
- 領域L-CDR1におけるアミノ酸配列 配列番号6
- 領域L-CDR2におけるアミノ酸配列 配列番号7
- 領域L-CDR3におけるアミノ酸配列 配列番号8によって定義された6つのCDRを有する1G3抗体と同じ固着ゾーンを有する、ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する抗体に関する。
- 領域H-CDR1におけるアミノ酸配列 配列番号2
- 領域H-CDR2におけるアミノ酸配列 配列番号3
- 領域H-CDR3におけるアミノ酸配列 配列番号4
- 領域L-CDR1におけるアミノ酸配列 配列番号6
- 領域L-CDR2におけるアミノ酸配列 配列番号7
- 領域L-CDR3におけるアミノ酸配列 配列番号8によって定義された6つのCDRを有する、ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する抗体に関する。
- 領域H-CDR1におけるアミノ酸配列 配列番号11
- 領域H-CDR2におけるアミノ酸配列 配列番号12
- 領域H-CDR3におけるアミノ酸配列 配列番号13
- 領域L-CDR1におけるアミノ酸配列 配列番号15
- 領域L-CDR2におけるアミノ酸配列 配列番号16
- 領域L-CDR3におけるアミノ酸配列 配列番号17により定義された6つのCDRを有する2E12抗体と同じ固着ゾーンを有する、ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する抗体に関する。
- 領域H-CDR1におけるアミノ酸配列 配列番号11
- 領域H-CDR2におけるアミノ酸配列 配列番号12
- 領域H-CDR3におけるアミノ酸配列 配列番号13
- 領域L-CDR1におけるアミノ酸配列 配列番号15
- 領域L-CDR2におけるアミノ酸配列 配列番号16
- 領域L-CDR3におけるアミノ酸配列 配列番号17によって定義された6つのCDRを有する、ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する抗体に関する。
本発明の抗体は、当業者に知られた任意の技術、例えば、非限定的に、単独で、又は組み合わせて採用される、任意の化学的、生物学的、遺伝的、又は酵素的技術により産生することができる。
- 配列番号2により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するH-CDR1
- 配列番号3により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するH-CDR2
- 配列番号4により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するH-CDR3
- 配列番号6により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するL-CDR1
- 配列番号7により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するL-CDR2
- 配列番号8により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するL-CDR3。
- 配列番号11により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するH-CDR1
- 配列番号12により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するH-CDR2
- 配列番号13により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するH-CDR3
- 配列番号15により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するL-CDR1
- 配列番号16により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するL-CDR2
- 配列番号17により定義された配列と比較して1個又は2個の異なるアミノ酸を有するL-CDR3。
前に述べられているように、病理学的状況において、制御性Tリンパ球は、不適切な免疫抑制を引き起こす場合があり、その後、そのことは腫瘍増殖を促進することが知られている。制御性Tリンパ球が、特にエフェクターTリンパ球の活性を不適切に阻害することにより、抗腫瘍免疫応答を低下させ、それに従って、癌型の病態の発生を促進することが多数の研究により示されている。
投与のために、抗体は、一般的に、薬学的組成物の形に製剤化される。本発明による抗体を含む薬学的組成物は、先行技術の知られた方法により製剤化することができ、その方法において、治療用分子は、少なくとも1つの賦形剤と組み合わされる。
ドナー、細胞株、及び培養条件
ドナー細胞
健康なドナー細胞を、Etablissement Francais du Sang - Nord de France (EFS)から来た血液から、後者とCentre National de la Recherche Scientifique (CNRS) - Delegation Nord Pas-de-Calais et Picardieとの間の公式な倫理合意書に従って、単離した。研究は、Institut de Biologie de Lille(CNRS)及びEFSのInstitutional Committeeにより承認され、各ドナーは前もって、説明を受けた同意書にサインした。
C15腫瘍細胞株は、SCIDマウスにおいて6〜7週間ごとに皮下に異種移植され、かつ連続的に増殖したEBV陽性NPC(上咽頭癌)に由来する。全ての動物実験は、Institut Pasteur de Lille(France)の飼育場において、フランス及びヨーロッパ法令に従って、有資格者によって行われた。C15細胞を、異種移植された腫瘍から回収し、その後、腫瘍状況を刺激する免疫細胞とプレインキュベートする前に、照射した(5000ラド)。
ジャーカット細胞株を、ヒトTリンパ球白血病から樹立した。それは、CD4+リンパ球の表現型を有する。
用いられる標準培地は、10% ABヒト血清(BioWest、Nuaille、France)、2mMのL-グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、10mMの非必須アミノ酸、10mMのHEPES、50μg/mlのストレプトマイシン、50μg/ml のゲンタマイシン、及び50μM βメルカプトエタノールを追加されたRPMI 1640 (Invitrogen、Paisley、UK)である。細胞を、Hera Cell 150インキュベータ(Thermo Electron、Cergy Pontoise、France)において制御雰囲気(5% CO2及び95%湿度)下、37℃でインキュベートした。適切な場合、PBMC及びCD4+T細胞を、培養前、37℃で2時間のインキュベーション後プレートに固定している抗CD3抗体(1μg/ml)(Clinisciences、Montrouge、France)、及び即席で加えられる抗CD28可溶性抗体(100ng/ml)(Clinisciences)で活性化した。
PBMCの単離
健康なドナーの末梢血単核球(PBMC)を、Ficoll Paque PLUS(Amersham Biosciences、Uppsala、Sweden)を用いる標準密度勾配遠心分離により単離した。
CD4+T細胞を、製造会社(Miltenyi Biotec、Berlin、Germany)の使用説明書に従ってネガティブセレクションプロトコールを用いてPBMCから単離した。簡単に述べれば、PBMCを、CD8、CD14、CD16、CD19、CD36、CD56、CD123、TCRγ/δ、及びグリコホリンAに対して方向づけられたビオチン化抗体のカクテルと10分間、インキュベートする。その後、抗ビオチン磁気ボールを15分間、加えた。除去されるべき細胞は、磁気活性化細胞ソーティングカラム(MACS(登録商標))分離器内に置かれたMACS(登録商標)カラム中に磁気的に保持される。単離されるべき細胞は、カラムを通過し、収集され、非標的細胞が枯渇し、非マーキング化細胞が濃縮されている。フローサイトメトリー分析は、単離された細胞の98%より多くがCD4+細胞であることを示している。
成人ドナーPBMCからのヒト制御性Tリンパ球の単離を、CD4+CD25+制御性Tリンパ球の単離用キット(Miltenyi Biotech、Germany)を用いて、製造会社の使用説明書に従い、行った。CD4+CD25-T細胞の画分を、フローサイトメトリー及び化学誘引実験のために保存した。フローサイトメトリー分析は、常に、CD4+CD25+画分の95%より多い濃縮を示している。
1×105細胞(PBMC又はCD4+T細胞)を、[3Hメチル]チミジンと、培養の最後18時間の間、インキュベートし、Tomtecコレクター(Wallac)を用いてガラス繊維フィルター(Printed Filtermat A、Wallac、Turku、Finland)上に収集した。次に、フィルターを、乾燥及びシンチレーション液(Beckman Coulter、United States)の添加後、バッグ内に密封した。収集前の最後の18時間の[3H]チミジン(1μCi/ウェル)(PerkinElmer、Courtaboeuf、France)の存在下でのインキュベーション後、増殖を測定した。放射活性を、βメーター(1450 Trilux、Wallac、Finland)を用いて測定した。各増殖試験を、3つの試料において行い、1分あたりのカウント(cpm)で推定した。実験に従って、増殖試験を、Toshiro Niki(Galpharma、Japan)により供給された1μg/mlの組換えガレクチン-9の短いアイソフォーム(Gal9S)、1μg/ml又は一連の抗ガレクチン-9抗体1G3、陰性対照としての役割を果たす非関連性抗IGg1抗体(eBioscience、United Kingdom)、10μg/mlのC15エキソソーム、及び5mMのラクトース又はスクロース(Sigma Aldrich)の存在下で行った。
細胞溶解測定技術は、細胞溶解後に放出される細胞プロテアーゼに比例したルシフェラーゼ活性を測定する細胞傷害性測定キット(CytoTox-Glo Assay、Promega、USA)の使用に基づいている。試験を、6×105個のCD4+CD25+及び2×105個の自己PBMCを共培養に置くことにより、行う。細胞を、丸底96ウェルプレート(Maxisorb Nunc、Denmark)において200μlの培地(RPMI-1640、1% 2mM L-グルタミン、0.02mMのピルビン酸ナトリウム、100μg/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、10%の非働化(decomplemented)ABヒト血清)(GIBCO BRLTM、Invitrogen(登録商標)、GB)中、培養する。細胞を、プレート上にあらかじめコーティングされた(37℃で2時間)1μg/mlの抗CD3及び100ng/mlの抗CD28により活性化する。48時間の培養後、50μlの試薬(アミノルシフェリン-Glo)を各ウェル内に入れる。軽い撹拌後、培養プレートを、室温で光を避けて、15分間、インキュベートする。ルミネセンスの最初の測定はルミノメーター(Centro LB960、C Berthold Technologies、France)で行われ、制御性Tリンパ球により溶解した細胞の量と比例する。次に、細胞の全溶解を引き起こすために、50μlのデジトニン溶液を、各ウェル内に入れる。次に、2回目のルミネセンス測定を行う前に、プレートを撹拌し、その後、室温で暗所中、15分間、インキュベートする。試験を3連で実施し、結果を溶解パーセンテージとして表す。
溶解パーセンテージ=細胞生存度/平均全溶解-バックグランドノイズ
細胞生存度=平均全溶解-細胞溶解
細胞溶解=Tregリンパ球によって引き起こされた平均溶解-バックグランドノイズ
ウシ胎仔血清の5% RPMI中で培養されたジャーカット細胞を、無血清培地(ハイブリドーマSFM - Life Technologies)へ移し、その後、96ウェルプレートのウェルにおいて(100,000細胞/ウェル)、30nMガレクチン-9の存在下で24時間、インキュベートする。アポトーシス中の細胞の計数を、V-APCアネキシン(アロフィコシアニン)及びヨウ化プロピジウムでマーキングした後、フローサイトメトリーによって行う。モノクローナル抗体の保護作用を評価するために、ガレクチンを、その抗体の存在下で30分間、プレインキュベートし、24時間インキュベーションについてのそれの最終濃度は10μg/mlである。
エキソソームを、20mM tris HCl、50mM NaCl、5mM EDTA、1% Triton X 100、0.02%アジ化ナトリウム、及びプロテアーゼ阻害剤のカクテル(Roche、Basle、Switzerland)で構成されるPYバッファー中に溶解させる(氷上で10分間)。遠心分離(20,000 g、15分間、+4℃)後、細胞片を除去し、上清を収集する。そのタンパク質濃度を、Bio Radタンパク質アッセイを用いて、製造会社(BioRad、Marnes la Coquette、France)の使用説明書に従い、測定した。その後、エキソソームをウェスタンブロットにより分析した。簡単に述べれば、そのタンパク質を、標準条件下で勾配にあらかじめ注がれたゲル(勾配4〜12%、Bis Tris、Invitrogen)を用いるSDS PAGE電気泳動により分離した。その後、そのタンパク質をニトロセルロース膜(Hybon dTM-C Extra、Amersham Biosciences、United Kingdom)上へ転写した。後者を、0.2% AuroraTNブロッキング試薬(MP Biomedicals、Illkirch Graffenstaden、France)、0.1% Tween20(Sigma Aldrich)、及びPBS(1×)を含有するブロッキングバッファー中、室温で1時間、ブロッキングし、その後、ガレクチン-9:ガレクチン-9-CT-L1に対して方向づけられた一次抗体 1:100(Galpharma、Japanにより供給された)と4℃で一晩、インキュベートした。膜をブロッキングバッファーで洗浄し、その後、ペルオキシダーゼとコンジュゲートされた二次抗体(抗マウス、1:10000)(GE Healthcare、Wauwatosa、United States)と室温で1時間、インキュベートし、もう一度、ブロッキングバッファーで洗浄した。そのタンパク質の特定シグナルを、Western Lightning(登録商標)Plus ECL(基質のケミルミネセンスを増幅するキット)(PerkinElmer、Boston、MA、USA)、及びLAS3000ルミネセンス画像アナライザー(Fujifilm)を用いて表示させた。
フローサイトメトリーによる細胞の免疫表現型試験を、「FACSCaliburフローサイトメーター」装置を用いて行った。それらを収集した後、細胞を「リン酸緩衝食塩水」(PBS)(GIBCO-Life Technologies)で洗浄し、蛍光色素とコンジュゲートされたモノクローナル抗体(1:10)でマーキングした。各試験について、適切な対照アイソタイプ(モノクローナル抗体)を、マーカーの調整のために用いた。最後に、データを、FlowJoソフトウェアで解析した。細胞の表面抗原を検出するために、CD4-フィコエリトリン(PE)-シアニン(Cy)5(BD Pharmingen、San Diego、United States)、CD25-PE(Miltenyi Biotech、Germany)、及びCD127-FITC(1:20)(Clinisciences、Montrouge、France)についての抗ヒトマウス抗体を、製造会社の使用説明書に従って用いた。
制御性Tリンパ球の全RNAを、「RNeasy Minikit II」キット(Qiagen)を用いて、製造会社の使用説明書に従い、単離した。RNAの濃度及び純度を、分光光度法(Ultrospec 3000、Pharmacia Biotec)により測定した。全RNAを、次の使用まで-80℃で保存した。
ヒトガレクチン-9のC末端部分(ガレクチン-9の長いアイソフォームの残基191〜355)を提示する組換えタンパク質を、免疫原として用いた。それは、大腸菌においてGST融合タンパク質の形をとって産生された。GST標識の分離後、そのタンパク質を排除クロマトグラフィーにより精製した。
免疫不全マウスは、第一に、脾臓摘出され、その後、ルシフェラーゼを発現するために改変CNPのC666-1細胞株を異種移植され、そのことは、意識のある動物上でバイオルミネセンスを画像化することにおいて腫瘍成長をモニターすることを可能にする。制御性Tリンパ球が多かれ少なかれ濃縮されたヒトPBMC(最初のPBMCにおいて2%制御性Tリンパ球、及びPBMCにおいて6%〜10%の制御性Tリンパ球の添加)の注射後、マウスの免疫系は再構成され、ヒト化される。PBMCは、腫瘍の成長をある程度まで制限する能力があること、及び制御性Tリンパ球の濃縮が、この効果に干渉しないことは、すでに示されている(Moralesら、Activation of a Helper and Not Regulatory Human CD4+ T Cell Response by Oncolytic H-1 Parvovirus; PLoS One. 2012; 7(2): e32197)。次に、抗Gal-9 1G3抗体を注射し、それの腫瘍成長への効果を評価した。
週齢6〜8週間のSCIDマウスは脾臓全摘出を受けた。7日後、これらの同じマウスに、上咽頭癌(NPC)に由来した(ルシフェラーゼを発現する)C666-luc腫瘍株の細胞を皮下に異種移植する。同じ日、マウスは、免疫系の再構成のために10%制御性Tリンパ球で濃縮された、又は濃縮されていない3千万〜5千万個のPBMCを腹腔内に受け、動物により、2μg、20μg、又は200μgのIgG1抗体又は1G3抗体を、以下のスキームに従って皮下に受けた(3匹のマウス/群):
- 群1: IgG1アイソタイプ(再構成されていない)
- 群2: 1G3 (再構成されていない)
- 群3: 再構成された+10% Treg+IgG1アイソタイプ
- 群4: 再構成された(未処理)
- 群5: 再構成された+10% Treg+1G3
入ってきたマウスの体重を定期的に測る[5日目から28日目まで]。
上記のプロトコールに従い、かつ注射される1G3及び1G1の濃度を変化させるいくつかの個々の実験を、ヒト化SCIDマウスに実施した。腫瘍の体積を手作業で測定した。
1G3又は対照アイソタイプIgG1で処理されたマウスの腫瘍の重量を、屠殺後、測った。その量はグラムで表される。
ガレクチン-9が、ナイーブCD4 T細胞のTregリンパ球への分化を誘導する能力があることは示されており(Seki、Oomizuら、2008)、そのことは、抗腫瘍免疫応答の疲弊の現象におけるこのレクチンの重要性を強固にしている。
死細胞を着色するための重要なアゾ色素(トリパンブルー)。計数は、細胞懸濁液の1体積について0.4%トリパンブルー溶液(Sigma、USA)の1体積の取り込みにより評価される。3分後、その混合物を、Thomasプレート上に置く。青色に表示される死細胞、及び屈折性生細胞をカウントする。測定は3連で行われ、結果は生細胞のパーセンテージとして表される。
抗Gal-9抗体(クローン:SEA309Hu- Uscn Life Science Inc、USA)の0.2μg/ml溶液の50μlを、96ウェルプレート(NUNC、Denmark)内に4℃で一晩、固定する。1×PBS(Euromedex、France)-Tween(Sigma Aldrich、USA)0.05%での4回の洗浄後、プレートを、3% PBS-BSA(Sigma Aldrich(登録商標)、USA)で、室温で2時間、飽和させる。その後、それらを0.05% PBS-Tweenで3回、洗浄する。活性化された、又は活性化されていないTregリンパ球の培養上清の100μl/ウェルを、2連に置き、室温で2時間、インキュベートする。Tregリンパ球は、通常に、プレート上にあらかじめコーティングされた(37℃で2時間)抗CD3(1μg/ml)(Anne Tsicopoulosチーム、CIILにより供給された)、及び抗CD28(100ng/ml)(Clinisciences、France)により活性化される。
生死判別試験を、CellTiter-Glo方法により直接的に実施し、その方法は、ミトコンドリア代謝を測定することを可能にする。同じプロトコールを、Tconvリンパ球の生存率を評価するために用いる。
用いられる抗体(Ac)
蛍光色素と連結された抗ヒトモノクローナル一次抗体、抗CD4-PE(フィコエリトリン)-C(シアニン)5(BD Pharmingen TM、USA)、抗CD25-PE(Miltenyi Biotech、France)、抗CD127-FITC(フルオレセインイソチオシアネート)(Clinisciences、France)。
100μlの体積の滅菌PBS(GIBCO BRL(商標)、Invitrogen(登録商標)、GB)中に細胞(2×105個)を採取し、10μlの抗CD4-PC、10μlの抗CD25-PE、及び4μlの抗CD127-FITCと、暗所中、室温で30分間、インキュベートする。次に、マーキングされた細胞を、400μlのPBSと共に採取し、蛍光を、Facscalibur(FACS Flow Supply System、Becton Dickinson、USA)によるフローサイトメトリーにより分析する。
増殖チェック
増殖試験を、48時間培養された105個のPBMCについて実施する。細胞を、96ウェル丸底プレート(Nunc、Denmark)において200μlの培地(RPMI-1640、1% 2mM L-グルタミン、0.02mMのピルビン酸ナトリウム、100U/mMのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、10%の非働化ヒトAB血清)(GibcoBRL(商標)、Invitrogen、GB)中、培養する。それらを、1G3又は2E12抗体の存在下又は非存在下で、プレート上にあらかじめコーティングされた(37℃で2時間)抗CD3(1μg/ml)(Ann Tsicopoulosチーム、CIILにより供給された)、及び抗CD28(100ng/ml)(Clinisciences、France)により活性化する。
1G3又は2E12抗体の存在下又は非存在下で、6×104個のTregを105個の自己PBMCとの共培養に置くことにより、抑制試験をMLR(混合リンパ球培養反応)により実施する。細胞は、プレート上にあらかじめコーティングされた(37℃で2時間)1μg/mlの抗CD3、及び抗CD28(100ng/ml)で活性化される。
PBMC及び制御性Tリンパ球の表現型分析
PBMCのフローサイトメトリー(FACS)における分析は、制御性Tリンパ球CD4+CD25+CD127-が、総PBMCの1%に相当することを示している(結果未呈示)。
健康なドナー血液からエキソビボで単離されたヒト制御性Tリンパ球の抑制活性を、2つの補完的機能分析:自己制御性Tリンパ球による、活性化されたPBMCの増殖の抑制の試験、及び自己制御性Tリンパ球による、活性化されたPBMCの細胞溶解の試験により特徴づけた(図2)。
リアルタイム定量的PCR(図3)及びウェスタンブロット(図4)による分析は、ガレクチン-9が、エキソビボで単離されたヒト制御性Tリンパ球上に存在すること、及び後者がガレクチン-9を発現することを示しており、制御性Tリンパ球が、ガレクチン-9チャネルを用いて、エフェクターTリンパ球の増殖を阻害することを示唆している。
図14は、Tconvリンパ球及び非活性化制御性Tリンパ球が、非常に少量のガレクチン-9(<10pg/ml:すなわち、ELISA試験の検出閾値より低い)を産生するが、活性化ヒト制御性Tリンパ球は、ガレクチン-9を合成し、かつ細胞外環境において分泌する能力があることを示している。更に、このガレクチン-9の分泌は、制御性Tリンパ球が活性化されている場合、有意に多く、そのことにより、この分泌をそれらの抑制機能に結びつけられる。
1G3抗体の制御性Tリンパ球の活性への影響をインビトロで評価するために、トリチウム標識されたチミジンの取り込みに基づいた細胞増殖試験を用いた。
1G3抗体の制御性Tリンパ球の抑制活性の阻害への効果を他の抗ガレクチン-9抗体と、又は更に抗TIM3抗体と比較するために、いくつかの試験を実施した。
図8は、組換えガレクチン-9により引き起こされるジャーカットのアポトーシスへの、試験された抗体の効果に関する試験の結果を示す。
図9は、あらかじめガレクチン-9で処理されたヒトPBMCの増殖への、試験された抗体の効果に関する試験の結果を示す。
図11は、新鮮に単離された細胞に関する増殖を、培養の最後の18時間の間のトリチウム標識されたチミジンの取り込みにより測定することによる、ガレクチン-9及び1G3のTconvリンパ球(T CD4+)への効果に関する試験の結果を示す。結果はまた、1分あたりのカウント(cpm)で示されている。
1G3抗体又はその対照アイソタイプ(IgG1)の増加性用量の効果を、3人のドナーの血液から抽出された新鮮に単離される細胞に関する増殖を、培養の最後の18時間の間のトリチウム標識されたチミジンの取り込みにより測定することにより、PBMCに関して分析した。結果は、CPMで得られた。
mAb 1G3及びその対照アイソタイプ(1G1)の用量の増加を、3人のドナーから新鮮に単離されたPBMCの生存率を発光分析により測定することにより分析した。ミトコンドリア代謝を、5日間の活性化の間、測定した。結果はRLUで得られた。
1G3抗体による制御性Tリンパ球の機能の阻害についての可能性を、制御性Tリンパ球及び通常のTリンパ球の混合白血球培養反応の増殖に関する試験により分析した。
様々な濃度[2μg/ml、20μg/ml、及び200μg/ml]の1G3及びIgG1アイソタイプの影響を、(i)マウスの体重、(ii)腫瘍体積、及び(iii)屠殺時の腫瘍質量に関して評価した。
図18A及びBを見ればわかるように、1G3で処理されたマウスは、対照アイソタイプにより処理されたものと比較してより軽い。これらの結果は、処理されたマウスの体重の減少が腫瘍の減少と関係し得ることを示唆している。
図19A〜Dに示された、得られた結果は、1G3のポジティブな結果を示し、1G3は、対照アイソタイプと比較して、腫瘍成長の有意な制限を引き起こしている。
腫瘍の質量に関する結果(図23)もまた、1G3の、その対照アイソタイプと比較しての有益な効果を確認している。
ガレクチン-9が、ナイーブCD4 Tリンパ球のTregリンパ球への分化を誘導する能力があることは示されており(Sekiら、「Galectin-9 suppresses the generation of Th17, promotes the induction of regulatory T cells, and regulates experimental autoimmune arthritis」; Clin Immunol. 2008年4月; 127(1):78〜88頁. doi:10.1016/j.clim.2008.01.006.電子出版2月20日)、そのことは、抗腫瘍免疫応答の疲弊の現象におけるこのレクチンの重要性を強固なものにしている。
2E12抗体による制御性Tリンパ球の抑制機能の阻害についての可能性を、制御性Tリンパ球の自己PBMC(2人の無関係のドナー)との混合白血球培養反応の増殖に関する試験により分析した。
Claims (15)
- ガレクチン-9に対して方向づけられ、かつ制御性Tリンパ球の抑制活性を阻害する抗体。
- アミノ酸配列 配列番号9のエピトープと特異的に結合する、請求項1に記載の抗体。
- CDRとして、
- 領域H-CDR1におけるアミノ酸配列 配列番号2
- 領域H-CDR2におけるアミノ酸配列 配列番号3
- 領域H-CDR3におけるアミノ酸配列 配列番号4
- 領域L-CDR1におけるアミノ酸配列 配列番号6
- 領域L-CDR2におけるアミノ酸配列 配列番号7
- 領域L-CDR3におけるアミノ酸配列 配列番号8により定義された6つのCDRを有する抗体と同じ固着ゾーンを有する、請求項1又は2に記載の抗体。 - CDRとして、
- 領域H-CDR1におけるアミノ酸配列 配列番号2
- 領域H-CDR2におけるアミノ酸配列 配列番号3
- 領域H-CDR3におけるアミノ酸配列 配列番号4
- 領域L-CDR1におけるアミノ酸配列 配列番号6
- 領域L-CDR2におけるアミノ酸配列 配列番号7
- 領域L-CDR3におけるアミノ酸配列 配列番号8により定義された6つのCDRを有する、請求項1又は2に記載の抗体。 - 前記抗体の重鎖可変領域がアミノ酸配列 配列番号1を有すること、及び前記抗体の軽鎖可変領域がアミノ酸配列 配列番号5を有することを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体。
- CDRとして、
- 領域H-CDR1におけるアミノ酸配列 配列番号11
- 領域H-CDR2におけるアミノ酸配列 配列番号12
- 領域H-CDR3におけるアミノ酸配列 配列番号13
- 領域L-CDR1におけるアミノ酸配列 配列番号15
- 領域L-CDR2におけるアミノ酸配列 配列番号16
- 領域L-CDR3におけるアミノ酸配列 配列番号17により定義された6つのCDRを有する抗体と同じ固着ゾーンを有する、請求項1に記載の抗体。 - CDRとして、
- 領域H-CDR1におけるアミノ酸配列 配列番号11
- 領域H-CDR2におけるアミノ酸配列 配列番号12
- 領域H-CDR3におけるアミノ酸配列 配列番号13
- 領域L-CDR1におけるアミノ酸配列 配列番号15
- 領域L-CDR2におけるアミノ酸配列 配列番号16
- 領域L-CDR3におけるアミノ酸配列 配列番号17により定義された6つのCDRを有する、請求項1に記載の抗体。 - 前記抗体の重鎖可変領域がアミノ酸配列 配列番号10を有すること、及び前記抗体の軽鎖可変領域がアミノ酸配列 配列番号14を有することを特徴とする、請求項1、6、又は7のいずれか一項に記載の抗体。
- 制御性Tリンパ球の抑制活性に関連した病気の処置における使用のための請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が癌の処置において用いられることを特徴とする、請求項9に記載の、使用のための抗体。
- 癌が、慢性骨髄性白血病、結腸癌、メラノーマ、子宮の癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、中枢神経系の原発性リンパ腫、多発性骨髄腫、前立腺癌、ホジキンリンパ腫、又は肝細胞癌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項10に記載の、使用のための抗体。
- 癌が、好ましくはエプスタイン・バーウイルスに関連した上咽頭癌、及びC型肝炎ウイルス又はB型肝炎ウイルスに関係した肝細胞癌からなる群から選択される、ウイルス誘発性癌であることを特徴とする、請求項10に記載の、使用のための抗体。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体、及び少なくとも1つの薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
- 請求項1から8のいずれか一項に定義されているような抗体、及び抗癌剤を含む、併用製造物。
- 癌の処置における、同時使用、別々の使用、又は時間と共に拡散される使用のための、請求項14に定義されているような併用製造物。
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