JP7307443B2 - 抗ガレクチン-9抗体及びその使用 - Google Patents
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(d)配列番号361、427、428、431、436、437に示されるVH CDR1アミノ酸配列に対して少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するVH CDR1アミノ酸配列;(e)配列番号362~366及び438~445から選択されるVH CDR2アミノ酸配列に対して少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するVH CDR2アミノ酸配列;(f)配列番号367~386から選択されるVH CDR3アミノ酸配列に対して少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するVH CDR3アミノ酸配列を含む。従って、いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体又はその抗原結合部分は、(a)配列番号328に示されるVL CDR1アミノ酸配列に対して少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するVL CDR1アミノ酸配列;(b)配列番号329に示されるVL CDR2アミノ酸配列に対して少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するVL CDR2アミノ酸配列;(c)配列番号341~360から選択されるVL CDR3アミノ酸配列に対して少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するVL CDR3アミノ酸配列;(d)配列番号361、424~434に示されるVH CDR1アミノ酸配列に対して少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するVH CDR1アミノ酸配列;(d)配列番号362、363、387~389及び446~466から選択されるVH CDR2アミノ酸配列に対して少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するVH CDR2アミノ酸配列;(e)配列番号390~417から選択されるVH CDR3アミノ酸配列に対して少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するVH CDR3アミノ酸配列を含む。
図1A~1Bは、ファージELISAを用いた、ガレクチン-9 CRD2についてのFabの結合特性を示すチャートを含む。図1A:ファージELISAによって示されるヒト及びマウスガレクチン-9への結合。図1B:競合ファージELISAによって決定されるガレクチン-9 CRD2に対するFabsクローンの親和性。
図2A~2Bは、ファージELISAを用いた、ガレクチン-9 CRD1についてのFabの結合特性を示すチャートを含む。図2A:ファージELISAによって示される、ヒト及びマウスのガレクチン-9 CRD1へのFabクローンの結合。図2B:競合ファージELISAによって決定されるガレクチン-9 CRD1に対するFabsクローンの親和性。
図3A~3Bは、競合ファージELISAを用いた、G.9-2 Fabクローンのエピトープ結合(CRD2への結合)を示すチャートを含む。図3A:ファージディスプレイ・ガレクチン-9 CRD2結合Fabクローンを追加する前に、精製されたG9.2-1又はG9.2-3 Fabでプレインキュベートされたマウスガレクチン-9 CRD2-コーティングウェル。図3B:ファージディスプレイ・ガレクチン-9 CRD2結合Fabクローンを追加する前に、精製されたG9.2-15又はG9.2-17 Fabでプレインキュベートされたヒトガレクチン-9 CRD2-コーティングウェル。
図4は、ビーズベースの結合アッセイを用いて特徴付けられた、精製されたG9.2 Fabのガレクチン-9 CRD2に対する親和性を示す図を含む。曲線は、1対1結合モデルの最良適合を示す。左上:G9.2-1 Fab 右上:G9.2-3 Fab 左下:G9.2-15 Fab 右下:G9.2-17 Fab 見かけのKd値を表に示す。
図5は、ビーズベースの結合アッセイを用いて特徴付けられた、精製されたG9.1 Fabのガレクチン-9 CRD1に対する親和性を示す図を含む。実験は、図4と同様に行った。左上:G9.1-6 Fab 右上:G9.1-5 Fab 左下:G9.1-8 Fab 右下:G9.1-11 Fab 見かけのKd値を表に示す。
図6は、ヒト(上部)及びマウス(下部)ガレクチン-9のCRD2に結合するFab G9.2-15及びFab G9.2-17の表面プラズモン共鳴分析を示す図を含む。実験の結合相及び解離相は、上部パネルに記載されている。左:G9.2-15 Fab 右:G9.2-17 Fab
図7は、ヒト(上部)及びマウス(下部)ガレクチン-9のCRD2に結合するG9.2-17ヒトIgG4のSPR分析を示す図を含む。灰色の線は、非結合陰性対照であるG9.2-isoヒトIgG4についてのセンサーグラムを示す。
図8には、ガレクチン-9 CRD2用のFabを用いた細胞株サンプルの染色を示す図が含まれる。フローサイトメトリーデータのヒストグラムが示される。左上:G9.2-1 Fab 右上:G9.2-3 Fab 左下:G9.2-15 Fab 右下:G9.2-17 Fab。
図9は、デクチン-1シグナル伝達のガレクチン-9媒介活性化に対するG9.2-17及びG9.1-8の阻害効果を示すチャートである。
図10A~10Bは、系統的突然変異誘発によるヒトガレクチン-9 CRD2上のG.9-2.17のエピトープマッピングを示す図を含む。図10A:ファージELISAによって決定された、G9.2-17のガレクチン-9 CRD2変異体への結合活性を示す図。ELISAシグナルの減少は、G9.2-17結合に重要なガレクチン-9 CRD2上の部位を示す。図10Bは、ヒトガレクチン-9 CRD2(PDB ID 3NV2)の結晶構造上にマッピングされたW309の位置を示す図であり、これは、結晶構造上にマッピングされた糖リガンドの結合部位とは反対である(W309は、UniProt ID 000182-2中のW277に対応する;PDB ID 3NV2)。
図11は、Fab G9.2-17(上部)、Fab G9.2-17mut6(中央)及びFab G9.2-Iso(下部)のサイズ排除クロマトグラフィー分析を示すチャートを含む。精製したFabサンプルを、PBS中のTOSOH TSK Bioassist G2WXLカラム上で泳動し、280nmでの吸光度を使用して検出した。
図12は、ヒト(左)及びマウス(右)ガレクチン-9のCRD2に結合するFab G9.2-17(上部)及びFab G9.2.17mut6(下部)の表面プラズモン共鳴分析を示すチャートを含む。ヒト又はマウスのガレクチン-9 CRD2を、Pall ForteBio Pioneer機器上にニュートラアビジンを予め装填したAvicapチップ上に固定した。次いで、OneStep方法を用いてFabサンプルを流した。実験の結合相及び解離相は、上部パネルに記載されている。
図13は、ファージELISAを用いた、野生型ガレクチン-9 CRD2又はW3039K変異体についてのG9.2 Fabクローンの結合特性を示すグラフである。ファージELISAを用いて分析したヒトガレクチン-9 CRD2に対するFabクローンの結合。ビオチン化野生型ヒトガレクチン-9 CRD2、W309Kガレクチン-9 CRD2変異体、又はG9.2-17 IgGと共にプレインキュベートしたガレクチン-9 CRD2のいずれかをニュートラアビジン被覆ウェルに固定化し、個々のファージディスプレイFabクローンと共にインキュベートした。
図14は、ガレクチン-9のブロックが、膵臓癌の動物モデル(KPCマウス)において生存の有意な延長をもたらすことを示すKaplan-Meierプロットである。
図15は、ガレクチン-9及び抗PD1のブロックが、優れた応答を生じることを示すマウス腫瘍の写真である。
図16は、G9.2-17 mIgG1で処置したマウスの腫瘍質量を示す棒グラフである。同所移植したKPC腫瘍を有するマウス(n=10/群)を、市販のアイソタイプ(200μg)又は市販のαGal9(200μg)mAb又はG9.2-Iso mIgG1(200μg)又はG9.2-17 mIgG1で、週1回、3週間、2用量(200μg又は400μg)で処置した。腫瘍を除去し、秤量し、続いて処理し、フローサイトメトリーのために染色した。
図17は、G9.2-17 mIgG2a単独又はαPD1 mAbと組み合わせて処置したマウスの腫瘍重量を示す棒グラフを示す。同所移植したKPC腫瘍を有するマウス(n=10/群)を、市販のαPD-1(200μg)mAbもしくはG9.2-17 mIg2a(200μg)、又はG9.2-17とαPD-1の組合せ、又はマッチしたアイソタイプで週1回3週間処置した。腫瘍を除去し、秤量し、続いて処理し、フローサイトメトリーのために染色した。それぞれの点は1匹のマウスを表す;*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001;独立スチューデントt検定による。
図18A~18Cは、精製G9.1-8m1-5 mIgG1のヒトガレクチン-9 CRD1への結合を示すグラフを、ビーズベースの結合アッセイを用いて特徴づけたものとして示す。
図19A~19Gは、精製G9.1-8m6-11 Fabのヒトガレクチン-9 CRD1への結合を示すグラフを、ビーズベースの結合アッセイを用いて特徴づけたものとして示す。
図20A~20Cは、精製G9.1-8m8, 9、11 mIgG2a抗体のヒトガレクチン-9 CRD1への親和性を示すグラフを、ビーズベースの結合アッセイを用いて特徴づけたものとして示す。
図21A~21Dは、精製G9.1-8m11-14 Fabのヒトガレクチン-9 CRD1への結合を示すグラフを、ビーズベースの結合アッセイを用いて特徴づけたものとして示す。
図22A~22Dは、精製G9.1-8m12-14 mIgG2a抗体のヒトガレクチン-9 CRD1への結合を示すグラフを、ビーズベースの結合アッセイを用いて特徴づけたものとして示す。
図23は、Gal-9抗体が、Jurkat細胞のガレクチン-9誘発アポトーシスを阻害することを実証するアポトーシスアッセイの結果を示すグラフである。Jurkat細胞を、ガレクチン-9(280 nM)、G9.2-17 IgG(1μM)、及び/又はG9.1-8m13 IgG(1μM)を用いて、又は用いずに、6時間処理した(図23)。次いで、細胞をアネキシン-V及びPIで染色し、続いてフローサイトメトリーで分析した。アネキシンV陽性細胞は、初期及び後期の両方のアポトーシス細胞を表す。バーは3つの反復の平均を表し、個々のデータポイントとして表される。独立スチューデントt検定によって行われた統計分析(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)
図24は、本明細書中に開示される抗ガレクチン-9抗体が、ガレクチン-9とCD206との間の相互作用を破壊することを実証するアッセイの読み出しを示すグラフである。図24Aは、G9.1-8m13又はG9.2-17抗体の添加の非存在下及び存在下で、固定化ヒトガレクチン-9と可溶性CD206との間の相互作用を測定するELISAを示すグラフを示す。アイソタイプ抗体ウェルを対照とする。ガレクチン-9でコーティングしたウェルを、G9.1-8m13、G9.2-17、両方の抗体の組み合わせ、又はアイソタイプの存在下・非存在下で、CD206と共にインキュベートした(実験は三重で行った;*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001;非対スチューデントt検定による)。
これらの結果はG9.1-8m13及びG9.2-17抗体の両方が、ガレクチン-9とCD206との間の相互作用を阻害し、それらの効果が相加的であることを示す。
図25は、ビーズベースの結合アッセイを用いて特徴付けられた、G9.18(WT)と比較した、ヒトガレクチン-9 CRD2に対する精製G9.1-8m12-14 mIgG2a抗体の結合を示す線グラフである。
図26A及び26Bは、アイソタイプ対照(100 nM)と比較した、9.2-17 IgG4(100 nM)で処置した膵臓腺癌原発腫瘍サンプル患者由来の器官型腫瘍スフェロイド(PDOT)におけるCD3+T細胞中のTNF-α(図26A)及びIFNγ(図26B)発現を示す棒グラフである。
図27A~27Cは、IgG1又はIgG4アイソタイプ対照(100 nM)と比較した、9.2-17 IgG1(100 nM)又は9.2-17 IgG4(100 nM)で処置した膵臓腺癌原発腫瘍サンプル患者由来の器官型腫瘍スフェロイド(PDOTS)におけるCD3+T細胞中のCD44(図27A)、TNF-α(図27B)及びIFNγ(図27C)発現を示す棒グラフである。
図28A~28Fは、IgG4アイソタイプ対照(100 nM)と比較した、9.2-17 IgG4(100 nM)で処理された胆嚢癌腫瘍サンプル(PDOTS)における免疫プロファイル発現を示す棒グラフを示す;CD3+T細胞におけるCD44(図28A)、CD3+T細胞におけるTNF-α(図28B)、CD4+T細胞におけるCD44(図28C)、CD4+T細胞におけるTNF-α(図28D)、CD8+T細胞におけるCD44(図28E)、CD8+T細胞におけるTNF-α(図28F)を示す。
図29A~29Cは、9.2-17 IgG1(100 nM)又は9.2-17 IgG4(100 nM)で処置した結腸直腸癌患者(PDOT)からの肝転移サンプル中のCD3+T細胞におけるCD44(図29A)、TNF-α(図29B)及びIFNγ(図29C)発現を、IgG1(100 nM)又は未処置対照(Utx)と比較して示す棒グラフを示す。
図30は、B16F10皮下同系モデルにおける9.2-17の効果を示す線グラフを示す。腫瘍を皮下移植し、G9.2-17 IgG1マウスmAbで処置した。動物には、説明文に特に明記しない限り、0日目及び4日目に静脈内(i.v.)投与した。
図31は、B16F10皮下同系モデルにおける9.2-17の効果を示す線グラフを示す。腫瘍を皮下移植し、G9.2-17 IgG2aマウスmAbで処置した。動物に、実験の終わりまで、0日目及びその後4日毎に1回投与した。mAbは説明文に特に指定がない限り、i.v.で投与した。
図32は、細胞ベースの結合アッセイCRL-2134細胞株をビオチン化Fabと共にインキュベートし、結合FabをDyLight 650と結合したニュートラアビジンを用いて検出したことを示すグラフである。次いで、サンプルをフローサイトメトリーを用いて分析した。強いシグナルが、ガレクチン-9抗体9.2-17について観察されたが、アイソタイプ対照については観察されなかった。2つのフォーマットにおけるGal-9抗体のKD(nM)値は以下の通りであった:G9.2-17 hIgG1:0.41±0.07;G9.2-17 mIgG1:2.91±0.66。
図33A及び33Bは、抗ガレクチン-9抗体の熱安定性測定を示すグラフを示す。温度の関数としてプロットされた蛍光発光の一次導関数(-dF/dT)。融解温度は、ピークが観察される温度として表される。熱転移は本質的に「Vedadi et al., Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination; Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Oct 24; 103(43): 15835-40」に記載されている方法に従って、1℃/分の加熱速度でリアルタイムPCR装置を用いて、フルオロフォアSYPRO Orange(ThermoFisher)の結合の変化を使用して測定した。
本開示は、ガレクチン-9、例えばヒト及び/又はマウスガレクチン-9に結合する抗体を提供する。
CRD1に結合する本明細書に記載の例示的な抗ガレクチン-9抗体は、抗体G9.1-1、G9.1-2、G9.1-3、G9.1-4、G9.1-5、G9.1-6、G9.1-7、G9.1-8、G9.1-9、G9.1-10、G9.1-11、G9.1-8m1、G9.1-8m2、G9.1-8m3、G9.1-8m4、G9.1-8m5、G9.1-8m6,G9.1-8m7、G9.1-8m8、G9.1-8m9、G9.1-8m10、G9.1-8m11、G9.1-8m12、G9.1-8m13、及びG9.1-8m14のCDR及び/又は可変領域配列を有する抗体、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、及び/又はヒト抗体である。CRD2に結合する本明細書に記載の例示的な抗ガレクチン-9抗体は、抗体G9.2-1、G9.2-2、G9.2-3、G9.2-4、G9.2-5、G9.2-6、G9.2-7、G9.2-8、G9.2-9、G9.2-10、G9.2-11、G9.2-12、G9.2-13、G9.2-14、G9.2-15、G9.2-16、G9.2-17、G9.2-17mut6 、G9.2-18、G9.2-19、G9.2-20、G9.2-21、G9.2-22、G9.2-23、G9.2-24、G9.2-25、G9.2-26、及びG9.2-低親和性バインダーのCDR及び/又は可変領域配列を有する抗体、例えばモノクローナル抗体、組換え抗体、及び/又はヒト抗体である。例示的な配列及び配列番号を、表1及び2に列挙する。Kabat方法論を用いて決定したCDRを太字で示す。表3は、Kabat方法論を用いて決定された、選択されたクローンのCDRを示す。本明細書では「m」及び「mut」という用語、例えば、「9.1-8m」及び「9.1-8mut」は互換的に使用される。例えば、「G9.1-8m1」、「G9.1-8m2」、「G9.1-8m3」、「G9.1-8m4」、「G9.1-8m5」、「G9.1-8m6」、「G9.1-8m7」、「G9.1-8m8」、「G9.1-8m9」、「G9.1-8m10」、「G9.1-8m11」、「G9.1-8m12」、「G9.1-8m13」及び「G9.1-8m14」はそれぞれ、「G9.1-8mut1」、「G9.1-8mut2」、「G9.1-8mut3」、「G9.1-8mut4」、「G9.1-8mut5」、「G9.1-8mut6」、「G9.1-8mut7」、「G9.1-8mut8」、「G9.1-8mut9」、「G9.1-8mut10」、「G9.1-8mut11」、「G9.1-8mut12」、「G9.1-8mut13」及び「G9.1-8mut14」と互換的に使用される。
抗ガレクチン-9抗体(例えば、CRD1に結合する)は、G9.1-1、G9.1-2、G9.1-3、G9.1-4、G9.1-5、G9.1-6、G9.1-7、G9.1-8、G9.1-9、G9.1-10、G9.1-11、G9.1-8m1、G9.1-8m2、G9.1-8m3、G9.1-8m4、G9.1-8m5、G9.1-8m6,G9.1-8m7、G9.1-8m8、G9.1-8m9、G9.1-8m10、G9.1-8m11、G9.1-8m12、G9.1-8m13、及びG9.1-8m14の軽鎖及び重鎖CDR1、CDR2及びCDR3、又はそれらの組み合わせを含み得る。G9.1-1、G9.1-2、G9.1-3、G9.1-4、G9.1-5、G9.1-6、G9.1-7、G9.1-8、G9.1-9、G9.1-10、G9.1-11、G9.1-8m1、G9.1-8m2、G9.1-8m3、G9.1-8m4、G9.1-8m5、G9.1-8m6,G9.1-8m7、G9.1-8m8、G9.1-8m9、G9.1-8m10、G9.1-8m11、G9.1-8m12、G9.1-8m13、及びG9.1-8m14のVL CDR1のアミノ酸配列を、配列番号328に示す。G9.1-1、G9.1-2、G9.1-3、G9.1-4、G9.1-5、G9.1-6、G9.1-7、G9.1-8、G9.1-9、G9.1-10、G9.1-11、G9.1-8m1、G9.1-8m2、G9.1-8m3、G9.1-8m4、G9.1-8m5、G9.1-8m6,G9.1-8m7、G9.1-8m8、G9.1-8m9、G9.1-8m10、G9.1-8m11、G9.1-8m12、G9.1-8m13、及びG9.1-8m14のVL CDR2のアミノ酸配列を、配列番号329に示す。G9.1-1、G9.1-2、G9.1-3、G9.1-4、G9.1-5、G9.1-6、G9.1-7、G9.1-8、G9.1-9、G9.1-10、G9.1-11、G9.1-8m1、G9.1-8m2、G9.1-8m3、G9.1-8m4、G9.1-8m5、G9.1-8m6,G9.1-8m7、G9.1-8m8、G9.1-8m9、G9.1-8m10、G9.1-8m11、G9.1-8m12、G9.1-8m13、及びG9.1-8m14のVL CDR3のアミノ酸配列を、配列番号330~340に示す。G9.1-1、G9.1-2、G9.1-3、G9.1-4、G9.1-5、G9.1-6、G9.1-7、G9.1-8、G9.1-9、G9.1-10、G9.1-11、G9.1-8m1、G9.1-8m2、G9.1-8m3、G9.1-8m4、G9.1-8m5、G9.1-8m6,G9.1-8m7、G9.1-8m8、G9.1-8m9、G9.1-8m10、G9.1-8m11、G9.1-8m12、G9.1-8m13、及びG9.1-8m14のVH CDR1のアミノ酸配列を、配列番号361、427、428、431、435、436、437に記載する。G9.1-1、G9.1-2、G9.1-3、G9.1-4、G9.1-5、G9.1-6、G9.1-7、G9.1-8、G9.1-9、G9.1-10、G9.1-11、G9.1-8m1、G9.1-8m2、G9.1-8m3、G9.1-8m4、G9.1-8m5、G9.1-8m6,G9.1-8m7、G9.1-8m8、G9.1-8m9、G9.1-8m10、G9.1-8m11、G9.1-8m12、G9.1-8m13、及びG9.1-8m14のVH CDR2のアミノ酸配列を、配列番号362~366及び438~445に記載する。G9.1-1、G9.1-2、G9.1-3、G9.1-4、G9.1-5、G9.1-6、G9.1-7、G9.1-8、G9.1-9、G9.1-10、G9.1-11、G9.1-8m1、G9.1-8m2、G9.1-8m3、G9.1-8m4、G9.1-8m5、G9.1-8m6,G9.1-8m7、G9.1-8m8、G9.1-8m9、G9.1-8m10、G9.1-8m11、G9.1-8m12、G9.1-8m13、及びG9.1-8m14のVH CDR3のアミノ酸配列を、配列番号367~386に記載する。
クローン9.1由来の軽鎖可変領域
いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体又はその抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域CDR1、CDR2、及びCDR3はそれぞれ、配列番号328、329、及び330を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域CDR1、CDR2、及びCDR3はそれぞれ、配列番号328、329、及び330からなる。いくつかの実施形態において、抗体は、G9.1-1と同じVL CDRを含む。
いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体又はその抗原結合部分は、重鎖及び軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域CDR1、CDR2、及びCDR3はそれぞれ、配列番号431、438、及び367を含む。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域CDR1、CDR2、及びCDR3はそれぞれ、配列番号431、438、及び367からなる。いくつかの実施形態において、抗体は、G9.1-1と同じVH CDRを含む。
1つの特定の実施形態において、抗ガレクチン-9抗体又はその抗原結合部分は、重鎖及び軽鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域CDR1、CDR2、及びCDR3はそれぞれ、配列番号328、329、及び330を含み、重鎖可変領域CDR1、CDR2、及びCDR3はそれぞれ、配列番号431、438、及び367を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖及び重鎖可変領域CDR1、CDR2、及びCDR3はそれぞれ、配列番号328、329、及び330、並びに配列番号431、438、及び367からなる。いくつかの実施形態において、抗体は、G9.1-1と同じVL及びVH CDRを含む。
いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体(例えば、CRD1及び/又はCRD2に特異的)は、本明細書に記載の例示的な抗体の対応VL CDRと比較して、個々に又は全体として、少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有する軽鎖CDRを含んでもよい。代わりに、又はそれに加えて、抗ガレクチン-9抗体(例えば、CRD1又はCRD2に特異的)は、本明細書に記載の例示的な抗体のVH CDRと比較して、個々に又は全体として、少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有する重鎖CDRを含んでもよい。
(d)配列番号361、427、428、431、435、436、437に示されるVH CDR1アミノ酸配列に対して少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するVH CDR1アミノ酸配列;(e)配列番号362~366及び438~445から選択されるVH CDR2アミノ酸配列に対して少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するVH CDR2アミノ酸配列;(f)配列番号367~386から選択されるVH CDR3アミノ酸配列に対して少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するVH CDR3アミノ酸配列を含む。
クローン9.2由来の軽鎖可変領域
いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体又はその結合部分は、重鎖及び軽鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域CDR1、CDR2、及びCDR3領域はそれぞれ、配列番号328、329、及び341を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域CDR1、CDR2、及びCDR3領域はそれぞれ、配列番号328、329、及び341からなる。いくつかの実施形態において、抗体は、G9.2-1と同じVL CDRを含む。
いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体又はその結合部分は、重鎖及び軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域CDR1、CDR2、及びCDR3領域はそれぞれ、配列番号424、446、及び390を含む。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域CDR1、CDR2、及びCDR3領域はそれぞれ、配列番号424、446、及び390からなる。いくつかの実施形態において、抗体は、G9.2-1と同じVH CDRを含む。
いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体又はその結合部分は、重鎖及び軽鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域CDR1、CDR2、及びCDR3領域はそれぞれ、配列番号328、329、及び341を含み、重鎖可変領域CDR1、CDR2、及びCDR3はそれぞれ、配列番号424、446、及び390を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖及び重鎖可変領域CDR1、CDR2、及びCDR3領域は、配列番号328、329、及び341、及び配列番号424、446、及び390からなる。1つの特定の実施形態において、抗体は、G9.2-1と同じVL及びVH CDRを含む。
いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体(例えば、CRD1及び/又はCRD2に特異的)は、G9.2-1、G9.2-2、G9.2-3、G9.2-4、G9.2-5、G9.2-6、G9.2-7、G9.2-8、G9.2-9、G9.2-10、G9.2-11、G9.2-12、G9.2-13、G9.2-14、G9.2-15、G9.2-16、G9.2-17、G9.2-17mut6 、G9.2-18、G9.2-19、G9.2-20、G9.2-21、G9.2-22、G9.2-23、G9.2-24、G9.2-25、G9.2-26、及びG9.2-低親和性バインダーから選択される抗体又はその抗原結合部分の対応VL CDRと比較して、個々に又は全体として、少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有する軽鎖CDRを含んでもよい。いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体(例えば、CRD1及び/又はCRD2に特異的)は、G9.2-1、G9.2-2、G9.2-3、G9.2-4、G9.2-5、G9.2-6、G9.2-7、G9.2-8、G9.2-9、G9.2-10、G9.2-11、G9.2-12、G9.2-13、G9.2-14、G9.2-15、G9.2-16、G9.2-17、G9.2-17mut6 、G9.2-18、G9.2-19、G9.2-20、G9.2-21、G9.2-22、G9.2-23、G9.2-24、G9.2-25、G9.2-26、及びG9.2-低親和性バインダーから選択される抗体又はその抗原結合部分の対応VH CDRと比較して、個々に又は全体として、少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有する重鎖CDRを含んでもよい。
(d)配列番号361、424~434に示されるVH CDR1アミノ酸配列に対して少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するVH CDR1アミノ酸配列;(e)配列番号362、363、387~389及び446~466から選択されるVH CDR2アミノ酸配列に対して少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するVH CDR2アミノ酸配列;(f)配列番号390~417から選択されるVH CDR3アミノ酸配列に対して少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するVH CDR3アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗ガレクチン-9抗体は、本明細書に記載される例示的な抗体(例えば、配列番号7~87のいずれか、又はそのCDRを含む抗体)のいずれかと同じエピトープに結合するか、又は前記例示的な抗体に対して、ガレクチン-9抗原への結合を競合する。「エピトープ」とは、抗体によって認識され結合される標的抗原上の部位を指す。前記部位は、完全にアミノ酸成分から構成されてもよく、完全にタンパク質のアミノ酸の化学修飾(例えば、グリコシル部分)から構成されてもよく、又はそれらの組合せから構成されてもよい。重複するエピトープは、少なくとも1つの共通のアミノ酸残基を含む。エピトープは、典型的には6~15アミノ酸長の直鎖状であり得る。あるいは、エピトープは立体構造であり得る。抗体が結合するエピトープは、日常的な技術、例えばエピトープマッピング法(例えば、以下の記載を参照のこと)によって決定できる。本明細書中に記載される例示的な抗体と同じエピトープに結合する抗体は、例示的な抗体と全く同じエピトープ又は実質的に重複するエピトープ(例えば、3未満の非重複アミノ酸残基、2未満の非重複アミノ酸残基、又は1のみの非重複アミノ酸残基を含む)に結合してもよい。2つの抗体が、同族抗原への結合について互いに競合するかどうかは、当技術分野で周知の競合アッセイによって決定することができる。
いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体の軽鎖は、本明細書に示される軽鎖(又はそれらの可変領域)(例えば、配列番号88~98に示される軽鎖配列)のいずれかに対して、少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体の軽鎖は、本明細書に示される軽鎖(例えば、配列番号88~98に示される軽鎖配列)のいずれかに対して、少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体の軽鎖は、配列番号88~98に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体の軽鎖は、配列番号88~98に示されるアミノ酸配列からなる。
いくつかの実施形態において、例示的な抗ガレクチン抗体の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号116~140(hIgG1);169~193(hIgG1 LALA);222~246(hIgG4);275~299 (hIgG4交換変異体)(CRD1に結合する抗ガレクチン-9抗体)に示される配列に対応する。いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体の重鎖は、本明細書に示される重鎖(又はそれらの可変領域)、例えば、配列番号116~140;169~193;222~246;275~299(CRD1に結合する抗ガレクチン-9抗体)に示される配列のいずれかに対して、少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体の重鎖は、本明細書に示される重鎖、例えば、配列番号116~140;169~193;222~246;275~299(CRD1に結合する抗ガレクチン-9抗体)に示される配列のいずれかに対して、少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
VHドメインは、ヒトIgG、例えばIgG1、定常領域、例えばヒトIgG1定常ドメインアミノ酸配列、hIgG LALA、hIgG4、又はIgG4mutに融合された、本明細書に記載の任意のVHドメインのアミノ酸配列を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体の軽鎖は、本明細書に示される軽鎖(又はそれらの可変領域)(例えば、配列番号99~115に示される軽鎖配列)のいずれかに対して、少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体の軽鎖は、本明細書に示される軽鎖(例えば、配列番号99~115に示される軽鎖配列)のいずれかに対して、少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
いくつかの実施形態において、例示的な抗ガレクチン抗体の重鎖のアミノ酸配列は、重鎖に関して、配列番号141~168(hIgG1);194~221(hIgG1 LALA);247~274(hIgG4);300~327(hIgG4交換変異体)(CRD2に結合する抗ガレクチン-9抗体)に示される配列に対応する。
いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体の重鎖は、配列番号263に示される重鎖配列(又はその可変領域)に対して、少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体の重鎖は、配列番号263に示される重鎖配列に対して、少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
いくつかの実施形態において、例示的な抗ガレクチン抗体の軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号99~108に対応し、又は、例示的な抗ガレクチン抗体の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号141~168;194~221;249~274;300~327に対応する。
いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体の軽鎖は、配列番号108に記載の軽鎖配列に対して少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、抗ガレクチン-9抗体の重鎖は、配列番号316に記載の重鎖配列に対して少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、及びその中の任意の増分)の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体の軽鎖は、配列番号108(又はその可変領域)に示されるアミノ酸配列を含み、抗ガレクチン-9抗体の重鎖は、配列番号316に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体の軽鎖は、配列番号108に示されるアミノ酸配列からなり、抗ガレクチン-9抗体の重鎖は、配列番号316に示されるアミノ酸配列からなる。
本明細書中に記載される、ガレクチン-9に結合する能力のある抗体は、当該分野で公知の任意の方法によって作製できる。例えば、「Harlow and Lane, (1998) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York」参照。
本開示は、本明細書中に記載される少なくとも1つの抗ガレクチン-9抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、ならびにガレクチン-9によって媒介されるシグナル伝達を阻害又は減少させるための、又はガレクチン-9陽性細胞を排除又は減少させるためのその使用を提供する。本明細書中に記載される抗ガレクチン-9抗体のいずれもが、本明細書中に記載される方法のいずれかにおいて使用され得る。いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体は、G9.1-1、G9.1-2、G9.1-3、G9.1-4、G9.1-5、G9.1-6、G9.1-7、G9.1-8、G9.1-9、G9.1-10、G9.1-11、G9.1-8m1、G9.1-8m2、G9.1-8m3、G9.1-8m4、G9.1-8m5、G9.1-8m6,G9.1-8m7、G9.1-8m8、G9.1-8m9、G9.1-8m10、G9.1-8m11、G9.1-8m12、G9.1-8m13、及びG9.1-8m14、又はそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、抗ガレクチン-9抗体は、G9.2-1、G9.2-2、G9.2-3、G9.2-4、G9.2-5、G9.2-6、G9.2-7、G9.2-8、G9.2-9、G9.2-10、G9.2-11、G9.2-12、G9.2-13、G9.2-14、G9.2-15、G9.2-16、G9.2-17、G9.2-17mut6 、G9.2-18、G9.2-19、G9.2-20、G9.2-21、G9.2-22、G9.2-23、G9.2-24、G9.2-25、G9.2-26、及びG9.2-低親和性バインダー、又はそれらの組み合わせから選択される。そのような抗体の非限定的な例には、例えば、抗体9.2-17又は9.1-8mut13が含まれる。そのような抗体は、ガレクチン-9に関連する疾患を治療するために使用できる。いくつかの局面において、本発明は、癌を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本願は、癌に関連する1つ以上の症状を、軽減、寛解、又は削減するための方法を開示する。
抗ガレクチン-9抗体、ならびにコード核酸又は核酸セット、そのようなものを含むベクター、又はベクターを含む宿主細胞は、本明細書に記載されるように、薬学的に受容可能なキャリア(賦形剤)と混合されて、標的とする疾患を治療する際に使用するための医薬組成物を形成することができる。「受容可能である」とは、キャリアが組成物の活性成分と適合性でなければならず(そして好ましくは、活性成分を安定化することができる)、そして治療される被験体にとって有害ではないことを意味する。薬学的に受容可能な賦形剤(キャリア)は、当技術分野で周知の緩衝剤を含む;例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover」を参照。
本開示は、ガレクチン-9を発現する病的細胞を排除する方法を提供し、この方法は、ガレクチン-9を発現する病的細胞を有する被験体に、本明細書中に記載される抗ガレクチン-9抗体を含む医薬組成物の有効量を投与する工程を含む。本開示はまた、被験体においてガレクチン-9媒介細胞シグナル伝達を阻害する方法を提供し、この方法は、それを必要とする被験体に、本明細書中に記載される抗ガレクチン-9抗体を含む医薬組成物の有効量を投与する工程を含む。
本明細書に記載されたいずれの抗ガレクチン-9抗体も、化学療法、手術、放射線療法、遺伝子療法などの癌又は自己免疫疾患に対する他のタイプの治療法と併用して、又は免疫抑制媒介、ホルモン補充療法、輸血、抗炎症薬、及び/又は疼痛薬などの他のタイプの自己免疫疾患に対する治療法と併用して利用することができる。このような治療は、本開示による免疫療法と同時に、又は連続して(任意の順序で)行われてもよい。
(i)抗血管新生剤(例えば、TNP-470、血小板第4因子、トロンボスポンジン-1、メタロプロテアーゼの組織阻害剤(TIMP1及びTIMP2)、プロラクチン(16-Kd断片)、アンジオスタチン(プラスミノーゲンの38-Kd断片)、エンドスタチン、bFGF可溶性受容体、形質転換増殖因子β、インターフェロンα、可溶性KDR及びFLT-1受容体、胎盤プロリフェリン-関連タンパク質、ならびにCarmeliet及びJain(2000)に挙げられているもの;
(ii)VEGFアンタゴニスト又はVEGF受容体アンタゴニスト、例えば、抗-VEGF抗体、VEGF変異体、可溶性VEGF受容体断片、VEGF又はVEGFRを遮断することができるアプタマー、抗-VEGFR抗体を中和することができるアプタマー、VEGFRチロシンキナーゼの阻害剤及びその任意の組合せ;及び、
(iii)化学療法剤、例えば、ピリミジン類似体(5-フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビン及びシタラビン)、プリン類似体、葉酸類似体及び関連阻害剤(メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン及び2-クロロデオキシアデノシン(クラドリビン));抗増殖性/抗有糸分裂剤、例えば、天然物、例えば、ビンカアルカロイド(ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン)、微小管破壊剤、例えば、タキサン(パクリタキセル、ドセタキセル)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エポチロン類、及びナベルビン、エピジポドフィロトキシン類(エトポシド、テニポシド)、DNA傷害剤(アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン類、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミド及びエトポシド(VP16);抗生物質、例えば、ダクチノマイシン(アクチノマイシンD)、ダウノルビシン、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、イダルビシン、アントラサイクリン類、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン(ミトラマイシン)及びマイトマイシン;酵素類(L-アスパラギンを全身的に代謝し、自身のアスパラギンを合成する能力をもたない細胞を欠乏させるL-アスパラギナーゼ);抗血小板薬;抗増殖性/抗有糸分裂性アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード類(メクロレタミン、シクロホスファミド及び類似体、メルファラン、クロラムブシル)、エチレンイミン類及びメチルメラミン類(ヘキサメチルメラミン及びチオテパ)、アルキルスルホン酸ブスルファン、ニトロソ尿素類(カルムスチン(BCNU)及び類似体、ストレプトゾシン)、トラゼン-ダカルバジニン(DTIC);抗増殖性/抗有糸分裂性代謝拮抗物質、例えば、葉酸類似体(メトトレキサート);白金配位化合物(シスプラチン、カルボプラチン);プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、アミノグルテチミド;ホルモン、ホルモン類似体(エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド)及びアロマターゼ阻害剤(レトロゾール、アナストロゾール);抗凝固剤(ヘパリン、合成ヘパリン塩及びトロンビンの他の阻害剤);線維素溶解剤(例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼ)、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ;遊走阻止剤;分泌抑制剤(ブレフェルジン);免疫抑制剤(シクロスポリン、タクロリム(FK-506)、シロリムス(ラパマイシン)、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル);抗血管新生化合物(例えば、TNP-470、ゲニステイン、ベバシズマブ)及び成長因子阻害剤(例えば、線維芽細胞増殖因子(FGF)阻害剤);アンジオテンシン受容体拮抗剤;一酸化窒素供与体;アンチセンス オリゴヌクレオチド;抗体(トラスツズマブ);細胞周期阻害薬及び分化誘導薬(トレチノイン);mTOR阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤(ドキソルビシン(アドリアマイシン));アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エピポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、ミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン)、コルチコステロイド(コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン);成長因子シグナル伝達キナーゼ阻害薬;ミトコンドリア機能不全誘導薬及びカスパーゼ活性化剤;及びクロマチン破壊薬。
本開示はまた、ガレクチン-9に関連する疾患、例えば、細胞表面糖タンパク質(例えば、デクチン-1、TIM3など)へ結合するガレクチン-9に関連する疾患、又はガレクチン-9を発現する病的細胞(例えば、癌細胞)に関連する疾患を治療又は軽減する際に使用するためのキットを提供する。例としては、固形腫瘍(例えば、PDA及び本明細書に記載の他のもの)、ならびに自己免疫疾患(例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(SLE)、自己免疫内分泌障害、自己免疫血液障害、及び本明細書に記載の他のもの)が挙げられる。このようなキットは、抗ガレクチン-9抗体(例えば、)を含む1つ以上の容器、及び任意に、抗ガレクチン-9抗体と共使用される第2の治療剤(これもまた、本明細書中に記載される)を含んでもよい。
本発明の実施は、特に断らない限り、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生物化学及び免疫学の従来の技術を使用し、これらは当業者の技術の範囲内である。このような技術は、例えば以下の文献において十分に説明されている:Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press;Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984);Methods in Molecular Biology, Humana Press;Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press;Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987);Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press;Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons;Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.);Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987);Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987);PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994);Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991);Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999);Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997);Antibodies (P. Finch, 1997);Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989);Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000);Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999);The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)
実施例1:抗ガレクチン-9抗体の生成
ヒトガレクチン-9 CRD1(残基1~148;配列番号3)及びマウスガレクチン-9 CRD1(残基1~147;配列番号5)をコードするコドン最適化遺伝子を、トロンビン切断部位及びAvitag(クローン化遺伝子の上流)を含むpGEXベクターを用いてGST融合体としてクローン化した。ヒトガレクチン-9 CRD2(残基218~355;配列番号4)及びマウスガレクチン-9 CRD2(残基226~353;配列番号6)を、ヘキサヒスタジンタグ、Avitag及びTEV切断部位(クローン化遺伝子の上流)を含むIPTG誘導性発現ベクターであるpHBTベクターにクローニングした(Sha et al., Proc Natl Acad Sci USA,2013,110:14924-14929)。次いで、ヒト及びマウスのガレクチン-9 CRD2サンプルを、Ni-Sepharoseカラムを介して精製し、続いてゲル濾過して、見かけ上均一にし、そして組換えBirAを使用してインビトロでビオチン化した。ヒト及びマウスガレクチン-9 CRD1サンプルを、GSTアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、続いてトロンビン切断した。ゲル濾過クロマトグラフィーを用いてサンプルをさらに精製し、ガレクチン-9 CRD2と同様の方法でビオチン化した。組換え全長マウスガレクチン-9(R&D Systems)を、必要に応じて対照として使用した。
エピトープ・ビニング
抗体クローンが、ガレクチン-9の異なる(重複しない)エピトープに結合するかどうかを、競合ファージELISAを用いて調べた。すべてのCRD2結合クローンの結合は、精製G9.2-1、G9.2-3、G9.2-15又はG9.2-17 Fabクローンのプレインキュベーションによって有意に阻害され(図3A-3B)、単離されたクローンが、CRD2内の重複エピトープに結合することを示唆した。クローンG9.2-15及びG9.2-17を、それらの強力な結合活性及びヒトとマウスのガレクチン-9との間の良好な交差反応性のために、さらなる特徴付けのための代表的なクローンとして選択した(図1A-1B)。
G9.2-17クローンを、さらなるエピトープ分析のために選択した。ガレクチン-9 CRD2上のそのエピトープを決定するために、一連の点突然変異体を構築した。G9.2-17に結合するそれらの能力を、図10Aに示すように、ファージELISAを用いて分析した。ELISAシグナルの減少は、G9.2-17結合に重要なガレクチン-9 CRD2上の部位を示す。特に、W309K突然変異(残基番号はアイソフォーム1に従う、NCBI GenBank受付番号BAB83625.1)は、結合を劇的に減少させたが、他の突然変異はわずかな効果を有し、G9.2-17がW309を含む領域に結合することを示唆した。この領域の結晶構造分析は、それが糖結合部位の反対側に位置することを示した(図10B)。「W309」又は「残基W309」という用語は、配列番号1(ガレクチン-9)のポジション309に見出されるトリプトファン残基、又はガレクチン-9アイソフォーム2、UniProt ID O00182-2の配列中のポジション277に位置するトリプトファン残基、又は配列番号1のポジション309又はUniProt ID O00182-2のアイソフォーム配列のポジション277に見出される残基に対応するガレクチン-9のCDR2内の残基を指す。「R253」、「R271」、「R334」、及び「R341」という用語はそれぞれ、配列番号1のポジション253、271、334、及び341に見出されるアルギニン残基、又はガレクチン-9アイソフォーム2、UniProt ID O00182-2の配列中のポジション221、239、302、309に見出されるアルギニン残基を指す。用語「Y330」及び「Y236」はそれぞれ、配列番号1のポジション330及び236に見出されるチロシン残基、又はガレクチン-9アイソフォーム2、UniProt ID O00182-2の配列中のポジション298及び204に見出されるチロシン残基を指す。
精製した抗体(Fab又はIgG)サンプルを、PBS中のTOSOH TSKgel Bioassist G2WXLカラム上で泳動し、280nmでの吸光度を用いて検出した。G9.2-17のFabサンプルは、そのサイズについて予想されるよりも長い保持時間を示すことが見出され、これは、それがクロマトグラフィーカラム材と相互作用することを示唆する(図11)。比較として、G9.2-IsoのFabサンプルは、予想される時間で溶出した。G9.2.17mut6と呼ばれるG9.2-17の点突然変異体は、ヒト及びマウスのガレクチン-9 CRD2に対する親和性を保持しながら、向上したクロマトグラフィープロファイルを有することがわかり(図12)、この突然変異体はオフターゲット結合のレベルが低下していることが示唆された。
潜在的な追加のエピトープを、ガレクチン-9 CRD2に結合する追加のクローンを用いて調査した。G9.2-17のエピトープとは異なるエピトープに結合するクローンを濃縮するように改変されたスキームを使用して、ファージディスプレイライブラリー選択を行った。野生型ヒトビオチン化ガレクチン-9 CRD2、W309K ガレクチン-9 CRD2変異体、又はG9.2-17 IgGと共にプレインキュベートしたガレクチン-9 CRD2を、ニュートラアビジン被覆ウェルに固定化し、個々のファージディスプレイFabクローンと共にインキュベートした。その結果を図13に示す。3つのクローン(G9.2-24、G9.2-25、及びG9.2-26)は、試験した3つの標的、野生型ガレクチン-9 CRD2、W309K変異体、及び野生型CRD2とG9.2-17との複合体に対して同様のレベルの結合を示した。それらの結合プロファイルは、それらがG9.2-17のエピトープとは異なるエピトープに結合することを示唆する。
抗体の親和性は、以前に報告されたビーズベースのアッセイ(Nishikori et al., J Mol Biol, 2012, 424, 391-399)及び表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて評価した。ビーズベースのアッセイにおいて、ビオチン化タンパク質(ガレクチン-9サンプル又はFabサンプルのいずれか)を、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用を介してストレプトアビジン被覆Dynabeads M280上に固定化した。結合していないビオチンを用いてビーズ上の過剰のビオチン結合部位をブロックした後、第2成分(すなわち、固定化ガレクチン-9についてはFab、又はその逆)をインキュベートし、続いて色素標識ニュートラアビジン(ThermoFisher)及びフローサイトメトリー分析を用いて定量することによって、結合滴定を行った。この実験から得られた結果を図4及び5に示す。第2成分がIgGである実験では、色素標識抗ヒトIgG又は抗マウスIgG抗体を、検出に使用した。
抗体が、ヒト細胞において産生された内因性ガレクチン-9に結合することを確認するために、HEK293T及びCRL-2134細胞株を、ビオチン化Fabと共にインキュベートし、結合したFabを、DyLight 650と結合したニュートラアビジンを用いて検出した。次いで、サンプルをフローサイトメトリーを用いて分析した。強いシグナルがガレクチン-9を発現するCRL-2134について観察されたが、ガレクチン-9を発現しないHEK293Tについては観察されなかった(Lahm et al., J Cancer Res Clin Oncol, 2001, 127, 375-386)(図8)。
ヒトデクチン-1シグナル伝達(Invivogen)のためのレポーター細胞株を用いて、ガレクチン-9によって媒介されるシグナル伝達活性化に対する、抗ガレクチン-9抗体の効果を調べた。このアッセイにおいて、デクチン-1シグナル伝達経路の活性化は、細胞培地へのアルカリホスファターゼの分泌をもたらし、これは、定量可能な比色変化として検出される。細胞株を、示された分子と共に16時間インキュベートした。図9に示すように、抗体が存在しない場合、ガレクチン-9(R&D Systems)は、枯渇したザイモサン(デクチン-1の既知のリガンド)と同等に、レポーターを強く活性化した。予想通り、ガレクチン-9は、デクチン-1を発現しない適合細胞株上で活性化を示さなかった。
膵管腺癌(PDA)に対する抗Gal9抗体による治療の効果を検証するために、次の2つのPDAマウスモデルを用いることができる:マウスが膵臓前駆細胞において発癌性Krasを発現する緩徐進行性PDAモデルp48Cre;LSL-KrasG12D(KC)、及び、変異Kras及びp53を発現するPdx1Cre;LSL-KrasG12D;Tp53R172H(KPC)マウス由来の腫瘍細胞を利用する、より侵攻性の同所性PDAモデル(ヒトPDA42,43におけるのと同様に)。免疫組織化学分析、フローサイトメトリー、又は免疫蛍光顕微鏡法の組合せを使用して、免疫プロファイリングを行い、アイソタイプ対照と比較して、抗ガレクチン抗体での治療の効果を評価することが可能である。PDA患者由来のヒトサンプルの研究にも同様の技術が用いられる。
新鮮な腫瘍標本(ヒト患者)を氷上の培地(DMEM)に入れ、滅菌鉗子及びメスを用いて10cm皿(氷上)内で細かく刻む。刻んだ腫瘍を、DMEM(4.5mmol/Lのグルコース、100mmol/Lのピルビン酸ナトリウム、1:100のペニシリン-ストレプトマイシン;Corning CellGro)+10%のFBS(Gemini BioProducts)、100 U/mLのコラゲナーゼIV型(Life Technologies)、及び15mmol/LのHEPES(Life Technologies)に再懸濁する。サンプルをペレット化し、10~20mLの培地に再懸濁する。赤血球細胞(RBC)を、RBC溶解バッファー(Boston Bio-Products)を使用して、可視的に血性サンプルから除去する。サンプルをペレット化し、次いで、新鮮なDMEM+10%FBS中に再懸濁し、そして100μmフィルター及び40μmフィルター上で歪ませて、S1(>100μm)、S2(40~100μm)、及びS3(<40μm)スフェロイド画分を生成し、これらを続いて超低付着組織培養プレート中で維持する。S2画分をex vivo培養に使用する。S2画分のアリコートをペレット化し、2.5mg/mLの濃度でI型ラット尾部コラーゲン(Corning)に再懸濁し、その後、NaOHを使用してpHを調整したフェノールレッドを含む10×PBSを添加する。pH 7.0~7.5はPANPEHA Whatman paper(Sigma-Aldrich)を用いて確認する。次いで、このスフェロイド-コラーゲン混合物を、「Jenkins et al., Cancer Discov. 2018 Feb;8(2):196-215; Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids」(その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるように、3-Dマイクロ流体培養デバイスの中心ゲル領域に注入する。患者由来の器官型腫瘍スフェロイド(PDOTS)を含有するコラーゲンハイドロゲルを、37℃で30分後に、抗Gal-9モノクローナル抗体を含む又は含まない培地で水和する。
クローンG9.1-8の突然変異体を、CDR残基をSerで置換することによって、又はCDR領域のトランケーションによって設計した。突然変異遺伝子を、標準的な部位特異的突然変異誘発法を用いて構築し、実施例1に記載のように産生した。合計14の変異体を、G9.1-8m1~G9.1-8m14と命名した(表4~9参照)。G9.1-8m1及びG9.1-8m2は、CDR-H2に変異を有する。G9.1-8m3、G9.1-8m4及びG9.1-8m5は、CDR-H3に変異を有する。G9.1-8m6、G9.1-8m7、G9.1-8m8、G9.1-8m8、G9.1-8m10、及びG9.1-8m11は、CDR-H3にトランケーションを有する。G9.1-8m12、G9.1-8m13、及びG9.1-8m14は、CDR-H2及びCDR-H3中に変異を有する。G9.1-8m12は、G9.1-8m2及びG9.1-8m8変異の組み合わせを含む;G9.1-8m13は、G9.1-8m2及びG9.1-8m9変異の組み合わせを含む;G9.1-m14は、G9.1-8m2及びG9.1-8m11変異の組み合わせを含む。
新鮮なPDA腫瘍を、コラゲナーゼIV(1mg/mL; Worthington Biochemical、Lakewood、NJ)、トリプシン阻害剤(1mg/mL;EMD Millipore、Billerica、MA)及びDNase I(2U/mL; Promega、Madison、WI)を含む冷FACSバッファー(2% FBSを含むPBS)中に置き、はさみでミリメートル未満の断片に細かく刻んだ。次いで、組織を、5分毎に穏やかに振盪しながら、37℃で20分間インキュベートした。サンプルを70μmメッシュに通し、350gで5分間遠心分離した。細胞ペレットをFACSバッファーに再懸濁し、1×106細胞を最初にゾンビイエロー(BioLegend)で染色して、死細胞を排除した。バイアビリティ染色後、細胞を、抗CD16/CD32 mAb(eBiosciences、San Diego、CA)と共にインキュベートしてFcγRIII/IIをブロックし、続いて1μgの蛍光結合細胞外mAbで抗体染色した。サイトカイン及び転写因子の細胞内染色は、固定化/透過溶液キット(eBiosciences)を用いて行った。マウス検体のために、マウスCD44(IM7)、PD-1(29F.1A12)、CD3(17A2)、CD4(RM4-5)、CD8(53-6.7)、CD45(30-F11)、CD11b(M1/70)、Gr1(RB6-8C5)、MHC II(M5/114.15.2)、IL-10(JES5-16E3)、IFNγ(XMG1.2)、TNFα(MP6-XT22)、ICOS(15F9)、CD69(H1.2F3)、IL-17A(TC11-18H10.1)、TGFα(TW7-16B4)、LFA-1(H155-78)、T-bet(eBio4B10)、RORγt(AFKJS-9)、及びFoxP3(FJK-16s;すべてeBiosciences)を用いた。抗体は特に断らない限り、BioLegendから得た。ヒトフローサイトメトリー抗体には、CD45(HI30)、CD3(UCHT1)、CD4(A161A1)、CD8(HIT8a)、CD44(BJ18)、TNFα(MAb11)、IFNγ(4S.B3;すべてBiolegend)が含まれた。LSR-IIフローサイトメーター(BD Biosciences)でフローサイトメトリーを行った。データは、FlowJo v.10.1(Treestar、Ashland、OR)を用いて分析した。
腫瘍重量及び免疫プロファイルに対するG9.2-17 mIgG1の影響を、膵臓癌のマウスモデルで評価した。8週齢のC57BL/6雄(Jackson Laboratory、Bar Harbor、ME)マウスに、Pdx1Cre; KrasG12D; Trp53R172H(KPC)マウスに由来するFC1242 PDA細胞を膵臓内注射した(Zambirinis CP, et al., TLR9 ligation in pancreatic stellate cells promotes tumorigenesis. J Exp Med. 2015;212:2077-94)。腫瘍細胞を、50%Matrigel(BD Biosciences、Franklin Lakes、NJ)を含むPBSに懸濁し、1×105の腫瘍細胞を、開腹術により膵臓の体部に注射した。マウス(n=10/グループ)に、1回の処置前用量をi.p.で、続いて3用量(q.w.)の市販のαガレクチン 9 mAb(RG9-1、200ug、BioXcell、Lebanon、NH)又はG9.2-17 mIgG1(200μg)、又は対アイソタイプ(paired isotype)、G9.2-Iso又はラットIgG2a(LTF-2、BioXcell、Lebanon、NH)(200μg)(週1用量、3週間)を投与した。マウスを3週間後に屠殺し、腫瘍をフローサイトメトリーによる分析のために採取した。組織を処理し、調製し、フローサイトメトリー分析を実施例5に記載のように行った。
G9.2-17 mIgG2aの腫瘍重量及び免疫プロファイルへの影響を、単独又は免疫療法と併用して、膵臓癌のマウスモデルで評価した。8週齢のC57BL/6雄マウス(Jackson Laboratory、Bar Harbor、ME)に、Pdx1Cre; KrasG12D; Trp53R172H(KPC)マウスに由来するFC1242 PDA細胞を膵臓内注射した。腫瘍細胞を50%Matrigel(BD Biosciences、Franklin Lakes、NJ)を含むPBSに懸濁し、1×105個の腫瘍細胞を開腹術により膵臓の体部に注射した。マウスに、1回の処置前用量をi.p.で、続いて3用量(q.w.)のG9.2-17 mIgG2a(200μg)又は中和αPD-1 mAb(29F.1A12、200μg、BioXcell、レバノン、NH)を、別々に又は組み合わせて、又は対アイソタイプ(LTF-2及びC1.18.4、BioXcell、レバノン、NH)を投与した。マウスを26日目に屠殺し、腫瘍を分析のために採取した。組織を処理し、調製し、フローサイトメトリー分析を実施例5に記載のように行った。結果を図17A~17Cに示す。それぞれの点は、一匹のマウスを表す;*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001;独立スチューデントt検定による。これらの結果は、G9.2-17 mIgG2aによる単剤処理が、両方の用量レベルで腫瘍増殖を低下させるが、抗PD-1単独は、腫瘍サイズに影響を及ぼさなかったことを示す。
新鮮な患者腫瘍標本(膵臓腺癌、胆嚢癌、結腸直腸癌からの肝転移)から、患者由来の器官型腫瘍スフェロイド(PDOTS)を調製した。簡単に述べると、検体を氷上の培地に入れ、10cmの皿内で細かく切り刻み、DMEM+10%FBS+100 U/mLコラゲナーゼIV型に再懸濁した。部分的に消化されたサンプルをペレット化し、再懸濁し、100μmフィルター及び40μmフィルター上で歪ませて、S1(>100μm)、S2(40~100μm)、及びS3(<40μm)スフェロイド画分を生成し、これを続いて低付着組織培養プレート中で維持した。S2画分のアリコートをペレット化し、2.5mg/mLの濃度でI型ラット尾部コラーゲンに再懸濁し、その後、NaOHを用いてpHを調整したフェノールレッドを含む10×PBSを添加した。スフェロイド-コラーゲン混合物を、DAX-1 3Dマイクロ流体細胞培養チップの中央ゲル領域に注入した。37℃で30分後、PDOTSを含むコラーゲンハイドロゲルを培地で水和し、Gal9抗体(G9.2-17)で処理した。3日後、PDOTSを回収し、免疫変化のために流した。単一の患者サンプルについての予備的な結果を図26~29に示す。100個より多くの細胞が得られた場合、次いで、細胞をCD3+、CD4+及びCD8+について選別し、そうでなければ、細胞はCD3+についてのみ選別した。
抗体依存性細胞傷害(ADCC)アッセイ
抗体依存性細胞傷害(ADCC)では、エフェクター細胞は、標的細胞膜上の特異抗原に抗体が結合した標的細胞を溶解する。開発されたADCCは、抗体のFcエフェクター機能を特徴付け、ADCC活性を測定するために設計される。開発された最初のアッセイは、標的細胞及びエフェクター細胞の両方に依存したが、このアッセイは標的細胞の必要性を省いて、プレート上の目的の抗原を直接コーティングすることによって、さらに改善される。ヒトFcγRIIIaの恒常的発現を伴うNFAT応答エレメントの制御下でホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現する組換えJurkat T細胞株を、エフェクター細胞株として用いる。滅菌ELISAプレート上にコーティングされた抗原を、標的として使用し、試験抗体を抗原と共にインキュベートして、Fabフラグメントを介して結合させる。次いで、正しい型のFcgRを提示するエフェクター細胞を、プレート上の抗原/抗体複合体と共にインキュベートする。抗体のFc部分がエフェクター細胞の表面上のFcgRIIIaに結合する場合、レセプター架橋結合は、NFAT経路の活性化を導き、ルシフェラーゼ発現をもたらす。遺伝子発現を5~6時間進行させ、ルシフェラーゼ活性をルミノメーターを用いて測定する。各抗体について用量-応答曲線を作成する。
抗体依存性細胞媒介食作用(ADCP)は、食作用を介してその作用の一部又は全部を媒介する抗体の重要な作用機序である。その場合、抗体は、抗原提示細胞により特定の抗原の取り込みを媒介する。ADCPは、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞によって媒介されることができ、FcγRIIa、FcγRI、及びFcγRIIIaを介し、そのうちマクロファージ上のFcγRIIa(CD32a)が主な経路である。採用されているADCPアッセイでは、THP-1細胞(急性単球性白血病患者由来のヒト単球細胞株)を用いてADCPを測定する。蛍光標識ビーズを標的抗原と結合させ、次いで試験抗体とインキュベートする。次いで、THP-1細胞をプレートに添加して、抗原被覆蛍光ビーズに結合した抗体のFc画分への、それらの結合を可能にする。ビーズへの抗体結合及びFc受容体の係合は、食作用機構を介してTHP-1細胞によるビーズの取り込みをもたらす。食作用事象をフローサイトメトリーを用いて分析する。各細胞における蛍光の総量(食作用を受けたビーズの数を表す)及び蛍光陽性細胞のパーセンテージ(食作用の頻度を表す)を測定する。用量依存性曲線を作成し、各試験抗体によって媒介されるADCP活性を評価する。
標的外毒性は、治療用モノクローナル抗体の薬物開発中に重大な問題を提起し得る。したがって、特異性は、任意の新しいモノクローナル候補の特性解析の一部として評価するための重要な因子であり、予測される安全性の重要な指標である。抗体特異性及び交差反応性を評価するために、試験抗体及び試験サンプルを、天然及び変性の両方のヒトタンパク質の広範なコレクションからなるヒトプロテオミクスアレイに対する結合について、2つの作用濃度で試験する。抗体特異性は、CDI's HuProt Human Proteome Microarray(~75%のヒトプロテオーム)を用いて評価する。マイクロアレイを一次抗体とインキュベートし、すすぎ、蛍光標識二次抗体とインキュベートし、続いて各標的タンパク質について検出された蛍光量について分析する。結果をマイクロアレイ画像としてまとめる。
抗薬物抗体の検出は、in vivoで抗Gal-9 mAbで処置した動物由来のマウス血清について行う。ADAアッセイは、標準的なELISA法よりも感度及びダイナミックレンジが増大するため、Mesoscale Discovery(MSD)プラットフォームで行う。ビオチン結合Gal9及びスルホタグ化抗Gal9抗体(薬物)を試験血清とインキュベートして、架橋複合体を形成する。ADA架橋複合体をストレプトアビジンプレートに結合させ、試験血清サンプル中のADAの存在を電気化学発光検出によって検出する。
ヒト化マウス(CTG-2243、Champions)の急性骨髄性白血病モデルにおいて、CRD2クローン17 IgG1及びIgG4ヒトガレクチン9モノクローナル抗体を評価する試験を実施する。試験プロトコルを表10に示す。
動物を亜致死的に照射し、尾静脈注射を介して1~500万個の初代AML細胞で再構成する。生体内血液採取を1ヶ月に1回行い、フローサイトメトリーを、以下のフローパネルを使用して行う: huCD45/muCD45/huCD3/huCD33(生着の決定のため)。ヒトCD33+レベルが20~1000カウント/ulに達したら、包括的な免疫表現型検査のために6匹の代理動物を安楽死させ、上記フローパネルによって脾臓、骨髄及び末梢血を分析する。動物を末梢血球数に基づいて治療グループに無作為に割り付ける。播種性腫瘍増殖/負荷分析は、42日間の投与及び観察まで実施する。末端半全血を処理し、そして免疫パラメータについて分析し、そして血清をGal9 ELISAのために使用する。
フローパネル:LD/huCD45/huCD3/huCD33/huガレクチン9/huTim9/huPD1/huCD34/huCD38/huCD117
動物毒性を評価するために、0日目から始めて、動物を毎日観察し、デジタルスケールを用いて週3回体重を測定し、個体及び平均グラム重量(Mean We±SEM)、0日目に対する平均体重変化パーセント(%vD0)を含むデータを、各グループについて記録し、研究完了時に%vD0をプロットする。いずれの動物死亡も毎日記録し、体重減少及び肉眼的観察に基づいて、薬物関連(D)、技術的(T)、腫瘍関連(B)、又は未知(U)と指定する;平均%vD0>20%及び/又は>10%死亡率を報告する単剤又は併用グループは、評価したレジメンでのその処置の最大耐用量(MTD)を超えると考えられる。各処置グループの最大平均%vD0(体重最低値)を、研究完了時に報告する。Gal-9抗体の有効性を評価するために、腫瘍増殖阻害を測定する。0日目に開始して、腫瘍寸法を、デジタルカリパスによって週3回測定し、個々の及び平均推定腫瘍体積(平均TV±SEM)を含むデータを、各群について記録する;腫瘍体積(TV)を、式TV=幅2×長さ×0.52を使用して計算する。研究完了時に、%TGI=1-(Tf-Ti)/(Cf-Ci)の公式により初期(i)及び最終(f)の腫瘍測定値を用いて、対照(C)に対する腫瘍増殖抑制パーセント(%TGI)値を計算し、それぞれの処置グループ(T)について報告する。2回の連続した測定で、0日目の測定値の30%以下の腫瘍体積を報告する個々のマウスは、部分応答者(PR)とみなされる。触知可能な腫瘍を欠く個々のマウス(2回の連続した測定において0.00 mm3)を完全応答者(CR)として分類する;研究完了まで持続するCRは、無腫瘍生存者(TFS)とみなされる。腫瘍倍加時間(DT)は、ビヒクル処置グループについて、DT=(Df―Di)*log2/(logTVf―logTVi)(式中D=日、TV=腫瘍体積)という公式を用いて決定される。この研究で収集されたすべてのデータは、電子的に管理され、冗長サーバシステム上に記憶される。
Gal-9抗体G9.2-17を、黒色腫免疫応答性マウスのB16F10同系マウスモデルで評価した。試験前の動物(雌C57BL/6、6~8週齢(Charles River Labs))に、100μlのPBS中の5e5 B16.F10を、左側腹部の皮下に片側移植した。試験前の腫瘍体積は、移植後2~3日で開始した各実験について記録した。腫瘍が50~100mm3(好ましくは50~75mm3)の平均腫瘍体積に達したとき、動物を、投薬のために使用されるべき処置グループ又は対照グループ(n=8)に腫瘍体積によって適合させ、そして投薬を0日目に開始した。動物に0日目及び4日目に静脈内投与した。抗Gal9 G9.2-17 IgG1及び抗Gal9 G9.2-17 IgG2の試験のための研究デザインを表11及び表12に要約する。
ガレクチン-9 G9.2-17及びG9.1-8m9抗体について、Jurkat細胞のガレクチン-9誘導アポトーシスを防止する能力を評価した。Jurkat細胞(TIB-152、ATCC、Manassas、VA)を、10%FBS、100mU/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンを含む改変RPMI(2mM L-グルタミン、10mM HEPES、1mMピルビン酸ナトリウム、4.5g/Lグルコース、1.5g/L重炭酸ナトリウム)中、37℃、5%CO2で培養した。280 nMのガレクチン-9(2045-GA、RnD Systems、Minneapolis、MN)、1μMのG9.2-17IgG、及び/又は1μMのG9.1-8m9 IgGを加えて、又は加えずに、細胞(2×105細胞/ウェル)を96ウェル培養プレートのウェル中でインキュベートした。細胞を37℃、5%CO2で5時間インキュベートした後、アネキシンV結合バッファーに再懸濁した。次に、細胞を暗所で4℃にて30分間、AnnexinV-AlexaFluor488(Invitrogen、Carlsbad、CA)で染色した。フローサイトメトリーの前に、ヨウ化プロピジウム(PI)を添加した(1μg/mL)。細胞をGuava easyCyteフローサイトメーター(MilliporeSigma、Burlington、MA)で泳動し、FlowJo(Treestar、Ashland、OR)を用いて分析した。細胞集団は、前方及び側方散乱を介してゲート化され、次いで、すべてのアポトーシス細胞についてのAnnexinV、及び後期アポトーシス細胞集団についてのPIを分析した。結果を図23に示す。
Microlon高結合96ウェルプレート(Greiner Bio-One、Kremsmunster、Austria)を、hガレクチン-9(RnD Systems、Minneapolis、MN)( 50μL、TBS中4μg/mL)で、室温で1時間コーティングした。次に、プレートをTBS+0.5%BSA(150μL)で、室温にて1時間ブロックした。ウェルをTBS+0.1%BSAで3回洗浄した。G9.1-8m13及び/又はG9.2-17抗体を各ウェルに添加し(50μL、TBS中100nM+0.1%BSA)、室温で30分間インキュベートした。次いで、CD206-His(RnD Systems、Minneapolis、MN)を最終濃度13nMまで添加し、室温でさらに30分間インキュベートした。次に、ウェルをTBS+0.05%Tween20で3回洗浄した。aHis-HRP(ab1187、Abcam、Cambridge、MA)を各ウェルに添加し(50μL、TBS中1:2500+0.05%Tween20、0.1%BSA)、室温でさらに30分間インキュベートした。ウェルをTBS+0.05%Tween20で3回洗浄し、TBSで1回洗浄した。1Step TMB-Ultra ELISAサブプレート(Thermofisher、Waltham、MA)(50μL)を各ウェルに添加した。
9.1-8mut13及び9.2-17の補体誘導性細胞傷害活性を評価するために、補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイを行い、2つのマウスモノクローナル抗体(マウスモノクローナル型g9.2-17及びg9.1-8m9)と比較する。抗体を、gal-9のいずれかを発現する適切な標的細胞とインキュベートし、そして種特異的血清を、補体タンパク質の供給源として添加して、細胞結合モノクローナル抗体に結合させ、標的細胞の補体依存性細胞溶解を開始する。標的細胞の細胞死は、細胞生存判別蛍光色素とのインキュベーション後に、透過性膜を有する細胞-対-非透過性膜を有する細胞(すなわち、溶解細胞-対-非溶解細胞)において得られる分染によって決定され、フローサイトメトリーによって評価される。
Gal-9抗体であるG9.2-17及びG9.1-8m13が、免疫応答性マウスにおける結腸直腸癌及び黒色腫癌の同系モデルにおいて評価される。試験品は、表13に従って、試験期間中、毎週処方され、調製される。
試験前の動物(雌C57BL/6、6~8週齢(Charles River Labs))を3日間順応させ、次いで、100μlのPBSに再懸濁した5e5 B16.F10(黒色腫細胞株)又はMC38細胞(結腸直腸癌細胞株)を、左側腹部の皮下に片側移植する。試験前の腫瘍体積は、移植後2~3日目から各実験ごとに記録する。腫瘍が50~100mm3(好ましくは50~75mm3)の平均腫瘍体積に達したとき、動物を、投薬のために使用されるべき処置グループ又は対照グループに腫瘍体積によって適合させ、そして投薬を0日目に開始した。抗Gal9 IgG1及び抗Gal9 IgG2の試験のための研究デザインを表14及び表15に要約する。
Gal-9抗体の効力は、S. Rizvi, et al.(YAP-associated chromosomal instability and cholangiocarcinoma in mice, Oncotarget, 9 (2018) 5892-5905:その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるように、胆管癌のマウスモデルにおいて評価される。腫瘍遺伝子(AKT/YAP)を胆道系に直接注入するこの形質導入モデルでは、種が一致した腫瘍微小環境を有する免疫応答性宿主において、胆道から腫瘍が発生する。投与量を表17に記載する。
上記の説明から、当業者は本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明を様々な使用及び条件に適応させるために、本発明の様々な変更及び修正を行うことができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内である。
Claims (24)
- ヒトガレクチン-9に結合する抗体の重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子又は核酸分子のセットであって、
前記抗体が、
(a)配列番号361に記載の重鎖相補性決定領域1(CDR1)、配列番号388に記載の重鎖相補性決定領域2(CDR2)、及び配列番号406に記載の重鎖相補性決定領域3(CDR3)、及び、
(b)配列番号328に記載の軽鎖相補性決定領域1(CDR1)、配列番号329に記載の軽鎖相補性決定領域2(CDR2)、及び配列番号352に記載の軽鎖相補性決定領域3(CDR3)
を含むものである、単離核酸分子又は核酸分子のセット。 - 前記核酸配列が、配列番号55に記載のVH、及び、配列番号54に記載のVLをコードする、請求項1に記載の単離核酸分子又は核酸分子のセット。
- 前記核酸配列が、全長抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖(HC)及び軽鎖(LC)をコードする、請求項1又は2に記載の単離核酸分子又は核酸分子のセット。
- 前記核酸配列が、一本鎖抗体のVH領域及びVL領域をコードする、請求項1~3のいずれか1項に記載の単離核酸分子又は核酸分子のセット。
- 前記核酸配列が、ヒト抗体のHC及びLCをコードする、請求項1~4のいずれか1項に記載の単離核酸分子又は核酸分子のセット。
- 前記核酸配列が、IgG分子のHCをコードする、請求項1~5のいずれか1項に記載の単離核酸分子又は核酸分子のセット。
- 前記IgG分子が、IgG1又はIgG4分子である、請求項6に記載の単離核酸分子又は核酸分子のセット。
- 前記IgG分子がIgG4分子であり、当該IgG4がS228P変異を有する、請求項6又は7に記載の単離核酸分子又は核酸分子のセット。
- 前記核酸配列が、配列番号422に記載のHC定常領域、及び配列番号418に記載のLC定常領域をさらにコードする、請求項1~8のいずれか1項に記載の単離核酸分子又は核酸分子のセット。
- 前記核酸配列が、配列番号316に記載のHC、及び配列番号108に記載のLCをコードする、請求項1~9のいずれか1項に記載の単離核酸分子又は核酸分子のセット。
- 請求項1~10のいずれか1項に記載の単離核酸分子又は核酸分子のセットを含む、1つのベクター又は2つのベクター。
- 発現ベクターである、請求項11に記載の1つのベクター又は2つのベクター。
- 前記単離核酸分子又は前記核酸分子のセットが、配列番号55に記載のVH、及び、配列番号54に記載のVLをコードする核酸配列を含む、請求項11又は12に記載の1つのベクター又は2つのベクター。
- 前記単離核酸分子又は前記核酸分子のセットが、配列番号422に記載のHC定常領域、及び配列番号418に記載のLC定常領域をコードする核酸配列をさらに含む、請求項11~13のいずれか1項に記載の1つのベクター又は2つのベクター。
- 前記単離核酸分子又は前記核酸分子のセットが、配列番号316のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号108のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードする、請求項11~14のいずれか1項に記載の1つのベクター又は2つのベクター。
- 請求項11~15のいずれか1項に記載の1つのベクター又は2つのベクターを含む宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、及び骨髄腫細胞からなる群より選択される、請求項16に記載の宿主細胞。
- 前記1つのベクター又は前記2つのベクターが、配列番号55に記載のVH、及び、配列番号54に記載のVLをコードする、請求項16又は17に記載の宿主細胞。
- 前記1つのベクター又は前記2つのベクターが、配列番号422に記載のHC定常領域、及び配列番号418に記載のLC定常領域をさらにコードする、請求項16~18のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記1つのベクター又は前記2つのベクターが、配列番号316のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号108のアミノ酸配列を含む軽鎖をコードする、請求項16~19のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- ヒトガレクチン-9に結合する抗体を製造する方法であって、
(i)抗体の発現を可能にする条件下で、請求項16~20のいずれか1項に記載の宿主細胞を培養すること;及び
(ii)このようにして産生された抗体を、細胞培養物から収集すること
を含む方法。 - 前記抗体が、配列番号55に記載のVH、及び、配列番号54に記載のVLを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記抗体が、配列番号422に記載のHC定常領域、及び配列番号418に記載のLC定常領域をさらに含む、請求項21又は22に記載の方法。
- 前記抗体が、配列番号316のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号108のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項21~23のいずれか1項に記載の方法。
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