CN116390939A - 多重特异性结合剂及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开提供了多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)及其用途，其具有结合至CD47，包括人CD47的第一结合域，和结合至一个或多个非CD47的靶标(如PD‑L1)的一个或多个其它结合域。
Description
相关申请
本发明申请主张2020年8月4日提交的美国临时专利申请No.63/061,112的权益，该专利申请的公开内容以其全部作为参考并入本文。
序列表
本发明申请作为参考并入了作为文本文件与本发明申请一起提交的序列表，该序列表于2021年7月30日创建，名称为14529-008-228_SEQ_LISTING.txt且大小为172,431字节。
技术领域
本发明公开一般地涉及具有结合至CD47，包括人CD47的第一结合域和结合至一个或多个非CD47的靶标，如PD-L1的一个或多个其它结合域的多重特异性结合剂，如双重特异性抗体以及它们的使用方法。
背景技术
肿瘤细胞已显示使用先天和适应性检查点来逃避抗-肿瘤免疫应答。CD47和PD-L1是两种在肿瘤细胞的细胞表面上广泛表达的靶标，它们分别可以协同抑制先天和适应性传感以逃避免疫控制。
D47是细胞表面糖蛋白，其起到天然免疫系统细胞介导的吞噬的调节剂的作用。CD47与多种配体相互作用，如整合素、信号调节蛋白α(SIRPα)、信号调节蛋白γ(SIRPγ)和血小板反应蛋白。CD47通过与巨噬细胞和树突状细胞表面上的SIRPa相互作用抑制吞噬，从而引发“不要吃我”的信号。
表达CD47能够使肿瘤细胞逃避吞噬和逃脱先天免疫监视。因此，CD47已成为可能的治疗剂的靶标。然而，CD47在正常细胞，如造血细胞、红细胞(RBC)和血小板上广泛表达。健康细胞对CD47的广泛表达提供了安全性和效力问题，因为用中和抗体靶向CD47可以影响健康细胞，从而可能导致毒性作用。另外，CD47的广泛表达还可以导致CD47结合剂快速消除，从而导致不良的药物动力学和降低的效力。
另外，CD47的激活或失去可以以细胞类型依赖性方式导致增殖增强。例如，星形细胞瘤细胞已显示在CD47和TSP-1激活后具有提高的增殖，尽管正常星形胶质细胞没有。目前还提出CD47可以通过PI3K/Akt通路辅助癌细胞增殖。
已知一旦阻断CD47与SIRPα的结合，已报道的多种抗-CD47抗体引起RBC凝集，这显著降低了这些抗体的治疗效果。
程序死亡配体1(PD-L1)是特异性结合至作为关键免疫检查点受体的程序死亡受体1(PD-1)的细胞表面糖蛋白配体。通过激活的T细胞、B细胞和单核细胞上调PD-1并且PD-1介导免疫抑制。而另一个PD-1配体，PD-L2主要在激活的抗原-递呈细胞(APC)上表达，PD-L1广泛表达，包括在造血系细胞，如激活的T细胞、B细胞、单核细胞、树突状细胞和巨噬细胞以及在外周组织，如心脏、骨胳、肌肉、胎盘、肺、肾和肝脏组织中。
PD-L1与PD-1的结合是可以激活T细胞中的PD-1受体的下游信号转导的阴性检查点，因此抑制T细胞的增殖、细胞因子产生和释放和细胞毒性。T细胞激活和效应因子细胞因子分泌的这种抑制可以防止自体免疫和慢性感染。
然而，多种肿瘤细胞使用这种机制来保护它们避免免疫攻击，从而导致肿瘤免疫逃避。多种癌症过表达PD-L1，并且其过表达通常与不良预后相关。在癌症中，PD-l/PD-L1相互作用刺激下游信号来抑制T细胞激活，从而导致肿瘤细胞存活。
已将PD-1与其配体的相互作用的阻断剂建议作为增强T细胞对肿瘤细胞的免疫应答的免疫治疗方法。当前PD-1/PD-L1基免疫疗法的策略已在治疗一些晚期癌瘤中显示出效力，但是对多种实体瘤和某些PD-L1功能具有有限影响。因此，本领域仍急需可以阻断或防止PD-1/PD-L1相互作用的试剂。
因此，本领域仍需克服这些问题并且靶向CD47及其它靶标，如PD-L1来治疗、预防或减轻免疫细胞功能障碍疾病、病症或病况，包括涉及表达CD47和/或PD-L1的肿瘤细胞的那些的试剂。本文所提供的多重特异性结合剂、组合物和方法满足这种需要并且提供了相关优势。
发明概述
本发明公开提供了多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，其具有结合至CD47，包括人CD47的第一结合域，和结合至一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1)的一个或多个其它结合域。这些试剂包括结合至CD47和一个或多个其它非CD47的靶标(例如，PD-L1)的多重特异性抗体(例如，抗体，如双重特异性抗体)，例如，具有结合至CD47，包括人CD47的第一结合域和结合至一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1)的一个或多个其它结合域的多重特异性抗体。在一些实施方式中，这些试剂包括结合至CD47和一个或多个其它非CD47的靶标(例如，PD-L1)的多重特异性抗体(例如，双重特异性抗体)，例如，具有结合至CD47，包括人CD47的第一结合域和结合至一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1)的一个或多个其它结合域并且与具有本文(例如，表1-3)所描述的重链可变区和轻链可变区的抗体竞争对人CD47的结合的多重特异性抗体。
本发明公开还提供了包含本文所描述的多重特异性结合剂的组合物。在一些实施方式中，这些组合物包括结合至CD47和一个或多个其它非CD47的靶标(例如，PD-L1)的多重特异性抗体(例如，抗体，如双重特异性抗体)，例如，具有结合至CD47，包括人CD47的第一结合域和结合至一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1)的一个或多个其它结合域的多重特异性抗体。在一些实施方式中，这些组合物包括结合至CD47和一个或多个其它非CD47的靶标(例如，PD-L1)的多重特异性抗体(例如，抗体，如双重特异性抗体)，例如，具有结合至CD47，包括人CD47的第一结合域和结合至一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1)的一个或多个其它结合域并且与具有本文(例如，表1-3)所描述的重链可变区和轻链可变区的抗体竞争对人CD47的结合的多重特异性抗体。
本发明公开还提供了用如本文所描述的多重特异性结合剂或者包含所述多重特异性结合剂，包括双重特异性抗体的组合物或者包含所述双重特异性抗体的组合物治疗、预防或减轻免疫细胞功能障碍疾病、病症或病况(例如，吞噬细胞功能障碍疾病、病症或病况或者T细胞功能障碍疾病、病症或病况)，包括免疫细胞功能障碍疾病、病症或病况的一种或多种症状的方法。这些组合物包括结合至CD47和一个或多个其它非CD47的靶标(例如，PD-L1)的多重特异性抗体(例如，抗体，如双重特异性抗体)，例如，具有结合至CD47，包括人CD47的第一结合域和结合至一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1)的一个或多个其它结合域的多重特异性抗体。在一些实施方式中，这些组合物包括结合至CD47和一个或多个其它非CD47的靶标(例如，PD-L1)的多重特异性抗体(例如，抗体，如双重特异性抗体)，例如，具有结合至CD47，包括人CD47的第一结合域和结合至一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1)的一个或多个其它结合域并且与具有本文(例如，表1-3)所描述的重链可变区和轻链可变区的抗体竞争对人CD47的结合的多重特异性抗体。
附图文字
图1A-1D.显示了实施例3中进一步描述的细胞结合测定的示例性结果。
图2A-2E.显示了实施例3中进一步描述的其它细胞结合测定的示例性结果。
图3.显示了实施例4中进一步描述的CD47/SIRPα抑制测定的示例性结果。
图4.显示了实施例4中进一步描述的PD-L1/PD-1抑制测定的示例性结果。
图5A-5G.显示了实施例5中进一步描述的吞噬测定的示例性结果。
图6A-6G.显示了实施例5中进一步描述的其它吞噬测定的示例性结果。
图7.显示了实施例7中进一步描述的与肿瘤体积有关的体内动物研究的示例性结果。
图8.显示了实施例7中进一步描述的与体重有关的体内动物研究的示例性结粟。
图9A-9E.显示了实施例7中进一步描述的与血液参数有关的体内动物研究的示例性结果。
图10A-10G.显示了实施例7中进一步描述的与其它血液参数有关的体内动物研究的示例性结果。
图11.显示了实施例7中进一步描述的与血液中抗体浓度有关的体内动物研究的示例性结果。
图12A-12E.显示了实施例7中进一步描述的与肿瘤体积和体重有关的其它体内动物研究的示例性结果。
图13A-13D.显示了实施例7中进一步描述的与肿瘤浸润白细胞有关的其它体内动物研究的示例性结果。
图14.显示了实施例7中进一步描述的与血液中抗体浓度有关的其它体内动物研究的示例性结果。
图15A-15H.显示了实施例7中进一步描述的与肿瘤体积和体重有关的其它体内动物研究的示例性结果。
图16A-16B.显示了实施例7中进一步描述的与肿瘤体积和体重有关的其它体内动物研究的示例性结果。
图17.显示了实施例7中进一步描述的与巨噬细胞向肿瘤的浸润有关的其它体内动物研究的示例性结果。
图18A-18B.显示了实施例7中进一步描述的与肿瘤体积和体重有关的其它体内动物研究的示例性结果。
图19A-19C.显示了实施例8中进一步描述的SEC色谱法的示例性结果。
图20A-20D.显示了实施例8中进一步描述的HIC色谱法的示例性结果。
图21A-21D.显示了实施例8中进一步描述的SMAC色谱法的示例性结果。
图22A-22B显示了C40、C56和C59的重链可变区和轻链可变区，包括VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的共有序列的序列比对。通过Kabat、AbM、Chothia、Contact、IMGT和AHon编号表示CDR的边界。
图23A-23B显示了P22、P24和P31.2的重链可变区和轻链可变区，包括VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的共有序列的序列比对。通过Kabat、AbM、Chothia、Contact和IMGT编号表示CDR的边界。
发明详述
本发明公开提供了结合至CD47和一个或多个其它非CD47的靶标(例如，PD-L1)的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)。这些多重特异性结合剂包括结合至CD47的抗体(例如，抗体，如双重特异性抗体)，其包括结合至人CD47和一个或多个其它非CD47的靶标(例如，PD-L1)的抗体。这些多重特异性结合剂在组合物中和在治疗、预防或减轻免疫细胞功能障碍疾病、病症或病况(例如，吞噬细胞功能障碍疾病、病症或病况或者T细胞功能障碍疾病、病症或病况)，包括所述疾病、病症或病况的一种或多种症状的方法中有用。吞噬细胞功能障碍疾病、病症和病况包括肿瘤免疫和相关癌症，其包括(但不限于)其中所述肿瘤细胞表达或过表达CD47的任何癌症。T细胞功能障碍疾病、病症和病况包括肿瘤免疫和相关癌症，其包括(但不限于)其中所述肿瘤细胞表达或过表达PD-L1的任何癌症。这些CD47和/或PD-L1表达肿瘤细胞可以帮助肿瘤细胞逃逸免疫监视和清除(例如，肿瘤免疫)。另外，本文所描述的结合至CD47和一个或多个其它非CD47的靶标(例如，PD-L1)的多重特异性结合剂，如多重特异性抗体(例如，抗体，如双重特异性抗体)对于抑制SIRPα信号转导和/或PD-1信号转导，增强吞噬细胞功能和/或免疫监视以及增强肿瘤细胞去除有用。本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，如多重特异性结合抗体(例如，双重特异性抗体)在组合物中和在增强吞噬细胞功能和T细胞功能，包括细胞-介导的免疫应答的上调的方法中有用。
除非另外说明，否则术语“CD47”、“分化簇47”或“CD47多肽”和类似术语是指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物，如灵长类动物(例如，人、食蟹猴(cyno))、狗和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)的多肽(在本文中“多肽”和“蛋白”是可互换使用的)或任何天然CD47。在本领域中还已知作为整合素相关蛋白(IAP)的CD47具有胞外N末端IgV结构域、5个跨膜结构域和短C末端胞内尾。术语CD47涵盖了“全长”未处理的CD47，以及从细胞中的加工所产生的任何形式的CD47或其任何片段，包括4个已知在胞内尾长度方面不同的CD47的替代剪接同工型。术语CD47还涵盖了CD47的天然存在的变体，如SNP变体、剪接变体和等位变体。CD47在本领域中已知与SIRPa相互作用并且这种相互作用导致细胞信号转导，包括通过巨噬细胞的吞噬的抑制等。以下提供了人CD47的全长氨基酸序列(示例性胞外域＝加下划线的文本)：
术语CD47还涵盖的其它相关CD47多肽包括保留CD47活性和/或足以产生抗-CD47免疫应答的片段、衍生物(例如，替换、缺失、截短和插入变体)、融合多肽和种间同源物。如本领域技术人员将理解的，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)可以结合至CD47多肽、CD47多肽片段、CD47抗原和/或CD47表位。表位可以是较大的CD47抗原的一部分，其可以是较大的CD47多肽片段的一部分，其反过来可以是较大的CD47多肽的一部分。CD47可以以天然或变性形式存在。本文所描述的CD47多肽可以分离自多种来源，如人组织类型或另一种来源，或者通过重组或合成方法制备。CD47多肽可以包含具有与天然来源的相应CD47多肽相同的氨基酸序列的多肽。CD47多肽的直系同源物在本领域中也是熟知的。
除非另外说明，否则术语“SIRPa”、“信号调节蛋白alpha”或“信号调节蛋白α”和类似术语是指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物，如灵长类动物(例如，人、食蟹猴(cyno))、狗和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)的多肽(在本文中“多肽”和“蛋白”是可互换使用的)或任何天然SIRPa。SIRPa具有胞外区，其包括3个免疫球蛋白超家族结构域——单一V-set和两个C1-set IgSF结构域、跨膜结构域和含有免疫受体酪氨酸-基抑制基序(ITIM)的胞质区。术语SIRPa还涵盖了SIRPa天然存在的变体，如SNP变体、剪接变体和等位变体。SIRPa在本领域中已知与CD47相互作用，从而导致ITIM磷化，这介导它与含有磷酸酶SH2-结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)的结合。以下提供了人SIRPα的全长氨基酸序列：
除非另外说明，否则术语“程序细胞死亡配体-1(PD-L1)”、“程序死亡配体-1”、“PD-1配体1”或类似术语是指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物，如灵长类动物(例如，人、食蟹猴(cyno))、狗和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)的多肽(在本文中“多肽”和“蛋白”是可互换使用的)或任何天然PD-L1。PD-L1，也称为分化簇274(CD274)或者B7同源物1(B7-H1)，是在人中通过CD274基因编码的蛋白。PD-L1是PD-1的两个天然存在的细胞表面糖蛋白配体之一(另一个是PD-L2)。像PD-1一样，PD-L1属于免疫球蛋白超家族并且由两个胞外Ig结构域、N末端V结构域和C末端恒定域组成。在本领域中，已知一旦结合至PD-1，PD-L1下调T细胞激活和细胞因子分泌。术语PD-L1涵盖了“全长”PD-L1，以及任何形式的PD-L1或者其由在细胞中的加工所产生的任何片段。术语PD-L1还涵盖了PD-L1的天然存在的变体，如SNP变体、剪接变体和等位变体。以下提供了人PD-L1的全长氨基酸序列(示例性胞外域＝加下划线的文本)：
术语PD-L1还涵盖的其它相关PD-L1多肽包括保留PD-L1活性和/或足以产生抗-PD-L1免疫应答的片段、衍生物(例如，替换、缺失、截短和插入变体)、融合多肽和种间同源物。如本领域技术人员将理解的，本文所描述的PD-L1结合剂(例如，抗体)可以结合至PD-L1多肽、PD-L1多肽片段、PD-L1抗原和/或PD-L1表位。表位可以是较大的PD-L1抗原的一部分，其可以是较大的PD-L1多肽片段的一部分，其反过来可以是较大的PD-L1多肽的一部分。PD-L1可以以天然或变性形式存在。本文所描述的PD-L1多肽可以分离自多种来源，如人组织类型或另一种来源，或者通过重组或合成方法制备。PD-L1多肽可以包含具有与天然来源的相应PD-L1多肽相同的氨基酸序列的多肽。PD-L1多肽的直系同源物在本领域中也是熟知的。
除非另外说明，否则术语“程序细胞死亡-1(PD-1)”、“程序死亡-1”、“PD-1受体”或类似术语是指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物，如灵长类动物(例如，人、食蟹猴(cyno))、狗和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)的多肽(在本文中“多肽”和“蛋白”是可互换使用的)或任何天然PD-1。PD-1，也称为CD279(分化簇279)，是属于CD28家族的免疫抑制受体。PD-1主要在先前激活的T细胞上体内表达并且结合至两个配体PD-L1和PD-L2。PD-1属于免疫球蛋白超家族并且由两个胞外Ig结构域、N末端V结构域和C末端恒定域组成。PD-1含有两个胞质酪氨酸-基信号转导基序、免疫受体酪氨酸-基抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸-基转换基序(ITSM)。术语PD-1涵盖了“全长”PD-1以及任何形式的PD-1或者其由在细胞中的加工所产生的任何片段。术语PD-1还涵盖了PD-1的天然存在的变体，如SNP变体、剪接变体和等位变体。在T细胞刺激后，在本领域中已知PD-1将酪氨酸磷酸酶SHP-2招募至胞质尾内的ITSM基序，从而尤其导致了参与CD3T细胞信号转导级联的效应分子，如CD3ζ、PKCθ和ZAP70的去磷酸化(Carter等人(2002)Eur J Immunol 32：634-43)。以下提供了人PD-1的全长氨基酸序列：
如本文所使用的，术语“结合剂”或其语法等价形式是指具有结合抗原的一个或多个抗原结合位点的分子(例如，抗体，如双重特异性抗体)。在一些实施方式中，如本文所描述的多重特异性结合剂是结合至CD47，如人CD47的抗体、抗体片段或其它肽-基分子。
术语“抗体”、“免疫球蛋白”或“Ig”在本文中是可互换使用的并且以最广泛的含义使用并且具体地覆盖(例如)多克隆抗体、单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长单克隆抗体)、具有多表位或单表位特异性的抗体组合物、重组产生的抗体、单特异性抗体、多重特异性抗体(包括双重特异性抗体)、合成抗体、嵌合抗体、人源化抗体或者具有全长重链和/或轻链的抗体的人形式。本发明公开还包括保留CD47结合特征的抗体片段(和/或包含抗体片段的多肽)。抗体片段的非限制性实例包括抗体的抗原-结合区和/或效应区，例如，Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、scFv、(scFv)2、单链抗体分子、双重可变区抗体、单可变区抗体、线性抗体、V区、由抗体片段形成的多重特异性抗体、F(ab)2、Fd、Fc、双链抗体、二-双链抗体、二硫键连接的Fvs(dsFv)、单域抗体(例如，纳米抗体)或其它片段(例如，由非共价键偶联的重链和轻链的可变区组成的片段)。一般来说，可变(V)区结构域可以是免疫球蛋白重(VH)和/或轻(VL)链可变域的任何适合的布置。例如，本发明公开还包括包含两个重链和两个轻链分子，抗体轻链单体和抗体重链单体的四聚体抗体。因此，例如，V区结构域可以是二聚的并且含有结合CD47的VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。如果需要，VH和VL链可以直接或通过接头共价偶联以形成单链Fv(scFv)。为了便于提及，在本文中将scFv蛋白称为包括在“抗体片段”类中。抗体片段的另一种形式是包含抗体的一个或多个互补决定区(CDR)的肽。可以通过构建编码所关心的CDR的多核苷酸获得CDR(也称为“最小识别单元”或“高变区”)。例如，使用产生抗体的细胞的mRNA作为模板，通过使用聚合酶链反应合成可变区来制备这些多核苷酸(参见，例如，Larrick等人，Methods：A Companion to Methods in Enzymology，2：106(1991)；Courtenay-Luck，“Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies，”inMonoclonal Antibodies Production，Engineering and Clinical Application，Ritter等人(主编)，第166页，Cambridge University Press(1995)；和Ward等人，“GeneticManipulation and Expression of Antibodies，”in Monoclonal Antibodies：Principles and Applications，Birch等人，(主编)，第137页，Wiley-Liss，Inc.(1995))。可以将抗体片段引入单域抗体、大抗体(maxibody)、微抗体、胞内抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、新抗原受体的可变域(v-NAR)和双-单链Fv区(参见，例如，Hollinger andHudson，Nature Biotechnology，23(9)：1126-1136，2005)。在一些实施方式中，所示结合剂含有轻链和/或重链恒定区，如一个或多个恒定区，包括一个或多个IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4恒定区。在一些实施方式中，抗体可以包括任何上述的表位-结合片段。本文所述的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。抗体可以是激动性抗体或拮抗性抗体。
当用于表示结合剂(例如，抗体)时，如本文所使用的术语“单特异性”是指具有分别结合至相同抗原的相同表位的一个或多个结合位点的结合剂。
当用于表示结合剂(例如，抗体)时，术语“多重特异性”表示所述结合剂对于至少两个不同抗原或者相同抗原上至少两个不同的表位具有结合特异性(例如，双重特异性抗体通过CD47的第一表位的第一结合位点和CD47的第二表位的第二结合位点抗CD47)。
当用于表示结合剂(例如，抗体)时，术语“双重特异性”表示所述结合剂能够特异性结合至两种不同的抗原决定簇，例如，分别通过结合至不同抗原或结合至相同抗原上的不同表位的一对抗体重链可变域(VH)和抗体轻链可变域(VL)所形成的两个结合位点。这种双重特异性结合剂可以具有1+1形式。其它双重特异性结合剂(例如，抗体)形式可以是2+1或1+2形式(包含第一抗原或表位的两个结合位点和第二抗原或表位的一个结合位点)或者2+2形式(包含第一抗原或表位的两个结合位点和第二抗原或表位的两个结合位点)。当双重特异性结合剂(例如，抗体)包含两个抗原结合位点时，每个可以结合至不同的抗原决定簇。这种双重特异性结合剂(例如，抗体)可以结合至相同抗原上的两个不同的表位(例如，CD47上的表位)。
在两条或更多条核酸或多肽的背景中，术语“同一的”或百分比“同一性”是指当出于最大对应性进行比较和比对(如有必要，引入缺口)时，不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守氨基酸替换，相同或具有所指明的百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的两条或更多条序列或子序列。可以使用序列比较软件或算法或者通过目视检查测量百分比同一性。可以用于获得氨基酸或核苷酸序列比对的多种算法和软件在本领域中是熟知的。这些包括(但不限于)BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin软件包及其变化形式。在一些实施方式中，两条核酸或多肽基本相同，这表示如使用序列比较算法或通过目视检查所测量的，当出于最大对应性进行比较和比对时，它们具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，并且在一些实施方式中，至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸残基同一性。在一些实施方式中，在长度至少约10个残基，至少约20个残基，至少约40-60个残基，至少约60-860个残基或它们之间的任何整数值的氨基酸序列区域内存在同一性。在一些实施方式中，在大于60-80个残基，如至少约80-100个残基的区域内存在同一性，并且在一些实施方式中，序列在所比较的序列全长(如靶标蛋白或抗体的编码区)上基本相同。在一些实施方式中，在长度至少约10个碱基，至少约20个碱基，至少约40-60个碱基，至少约60-80个碱基或它们之间的任何整数值的核苷酸序列区域内存在同一性。在一些实施方式中，在大于60-80个碱基，如至少约80-1000个碱基或更多个碱基的区域内存在同一性，并且在一些实施方式中，序列在所比较的序列全长(如编码所关心的蛋白的核苷酸序列)上基本相同。
“保守氨基酸替换”是其中一个氨基酸残基被具有带类似化学特性的侧链的另一个氨基酸残基替换的替换。在本领域中一般地定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，所述侧链包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，门冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、beta-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳烃侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，酪氨酸对苯丙氨酸的替换是保守替换。一般地，本发明公开的多肽、可溶性蛋白和/或抗体序列中的保守替换不消除含有所述氨基酸序列的多肽、可溶性蛋白和/或抗体与靶标结合位点的结合。识别不消除结合的氨基酸保守替换的方法在本领域中是熟知的。
术语“多肽”是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。所述聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以包括非氨基酸(例如，被非氨基酸中断)。该术语还涵盖已天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或者任何其它操作或修饰，如(直接或间接)连接至或缀合至部分，如标签组分。例如，含有氨基酸的一种或多种类似物(包括，例如，非天然氨基酸)以及本领域中已知的其它修饰的多肽也包括在该定义内。应理解由于本发明公开的多肽可以基于抗体或免疫球蛋白超家族的其它成员，因此在一些实施方式中，所述多肽可以作为单链存在。
如本文所使用的，“抗原”是含有结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)可以结合的表位的部分或分子。照此，可以通过抗体结合抗原。在一些实施方式中，本文所描述的结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)结合的抗原是CD47(例如，人CD47)或其片段。
如本文所使用的，“表位”是本领域中的术语并且是指抗体可以与之结合的抗原的局部区域。表位可以是线性表位或构象、非线性或不连续的表位。就多肽抗原来说，例如，表位可以是多肽的邻接氨基酸(“线性”表位)或者表位可以包含来自多肽的两个或更多个邻接区域的氨基酸(“构象”、“非线性”或“不连续”表位)，例如，人CD47。本领域技术人员将理解通常，线性表位可以或可以不依赖于二级、三级或四级结构。例如，在一些实施方式中，抗体结合至一组氨基酸，而不考虑它们是否以天然立体蛋白质结构折叠。在其它实施方式中，为了识别和结合所述表位，抗体需要氨基酸残基组成表位以显示出具体构象(例如，弯曲、扭转、转角或折叠)。
当两个抗体识别三维空间中相同、重叠或相邻的表位时，抗体结合“表位”或与参考抗体“基本相同的表位”或“相同的表位”。用于确定两个抗体是否结合至三维空间中相同、重叠或相邻表位的最广泛使用且快速的方法是竞争测定，其可以以一些不同形式配置，例如，使用标记抗原或标记抗体。在一些测定中，将抗原固定化在96-孔板上，或者在细胞表面上表达，并且使用放射性、荧光或酶标签测量未标记抗体阻断标记抗体的结合的能力。
“表位框并法(epitope binning)”是基于它们所识别的表位对抗体分组的方法。更具体地，表位框并法包括使用竞争测定结合计算过程来基于它们的表位识别性质对抗体聚类并识别具有不同结合特异性的抗体，用于区分不同抗体的表位识别性质的方法和系统。
在抗体背景中，如本文所使用的，术语“特异性结合”、“特异性识别”、“免疫特异性结合”、“选择性结合”、“免疫特异性识别”和“免疫特异的”是类似术语，并且表示结合至抗原(例如，表位)的分子，照此本领域技术人员理解结合。在一些实施方式中，“特异性结合”表示，例如，多肽或分子以比替代物质，包括相关或无关蛋白更频繁、更快速、以更长持续时间、以更大亲和力或者以上述一些组合与表位、蛋白或靶标分子相互作用。例如，特异性结合至抗原的分子可以结合至其它肽或多肽，一般地以较低的亲和力，如通过(例如)免疫测定、BiacoreTM、KinExA 3000仪(Sapidyne Instruments，Boise，ID)或者本领域中已知的其它测定所确定的。在一些实施方式中，如使用实验技术，如放射免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)所确定的，当它以高于任何可交叉反应的抗原的亲和力结合至抗原时，抗体或抗原结合结构域结合至或特异性结合至抗原。通常，特异性或选择性反应将是背景信号或噪音的至少两倍并且可以是背景的大于10倍。有关结合特异性的讨论，参见，例如，Fundamental Immunology 332-36(Paul主编，第2版，1989)。在一些实施方式中，抗体或抗原结合结构域与“非靶标”蛋白的结合程度是所述抗体或抗原结合结构域与其特定靶标抗原的结合的小于约10％，例如，如通过荧光激活细胞分选术(FACS)分析或RIA所确定的。在一些实施方式中，特异性结合至抗原的分子以比当所述分子结合至另一种抗原时的Ka大至少2log、2.5log、3log、4log或以上的Ka结合至所述抗原。在一些实施方式中，特异性结合至抗原的分子不与其它蛋白交叉反应。在另一个具体的实施方式中，特异性结合至抗原的分子不与其它非CD47蛋白交叉反应。在一些实施方式中，“特异性结合”是指(例如)多肽或分子以约0.1mM或以下的KD，但是更通常小于约1μM的KD结合蛋白或靶标。在一些实施方式中，“特异性结合”是指多肽或分子以至少约0.1μM或以下，至少约0.01μM或以下或者至少约1nM或以下的KD结合靶标。由于不同物种中同源蛋白之间的序列同一性，特异性结合可以包括识别不止一种物种中的蛋白或靶标的多肽或分子。同样地，由于不同蛋白的多肽序列的某些区域内的同源性，特异性结合可以包括识别不止一种蛋白或靶标的多肽或分子。应理解，在一些实施方式中，特异性结合第一靶标的多肽或分子可以或可以不特异性结合第二靶标。照此，“特异性结合”不必须要求(尽管它可以包括)排他的结合，例如，结合至单个靶标。因此，在一些实施方式中，多肽或分子可以特异性结合不止一种靶标。在一些实施方式中，可以通过多肽或分子上的相同抗原结合位点结合多个靶标。例如，在某些情况下，抗体可以包含两个相同的抗原结合位点，它们中的每一个特异性结合两种或更多种蛋白上的相同表位。在某些替代实施方式中，抗体可以是双重特异性的并且包含至少两个具有不同特异性的抗原结合位点。一般地，但不必需，提及“结合”表示“特异性结合”。
“结合亲和力”一般地表示分子单一结合位点(例如，结合蛋白，如抗体)及其结合伴侣(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和强度。除非另外说明，否则如本文所使用的，“结合亲和力”是指固有结合亲和力，其反映结合对(例如，抗体和抗原)成员之间的1∶1相互作用。一般地，可以通过解离常数(KD)表示结合分子X对其结合伴侣Y的亲和力。可以通过本领域中已知的常见方法测量亲和力，包括本文所描述的那些方法。低-亲合力抗体通常缓慢结合抗原并且往往容易解离，然而高-亲合力抗体通常更快速结合抗原并且往往保持更长的结合。测量结合亲合力的多种方法在本领域中是已知的，它们中的任一种可以用于本发明公开的目的。在一个实施方式中，可以通过本领域中已知的测定，例如，通过结合测定测量“KD”或“KD值”。使用(例如)OctetQK384 sytem(ForteBio，Menlo Park，CA)通过生物膜干涉测量法(BLI)确定本文所报告的KD值。作为另外一种选择，还可以在放射性标记的抗原结合测定(RIA)中测量KD，例如，使用所关心的抗体的Fab形式及其抗原进行(Chen等人，(1999)J.Mol Biol 293：865-881)或者使用(例如)BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ，通过Biacore使用表面等离子共振(SPR)测定进行。还可以分别使用(例如)OctetQK384sytem(ForteBio，Menlo Park，CA)或者BIAcoreTM-2000或者BIAcoreTM-3000(BIAcore，Inc.，piscataway，NJ)，通过以上所描述的相同SPR或BLI技术确定“结合速率(on-rate、rate of association或association rate)或“kon”和“解离速率”(off-rate、rate of dissociation或dissociation rate)或“koff”。
当在多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)的背景中使用时，术语“竞争”表示竞争靶标上相同表位或结合位点的结合剂，其包括如通过其中所研究的结合剂防止或抑制参考分子(例如，参考配体，或参考抗原结合蛋白，如参考抗体)与共同抗原(例如，CD47)的特异性结合的测定所确定的这些结合剂之间的竞争。多种类型的竞争性结合测定可以用于确定测试结合剂是否与参考分子竞争与CD47(例如，人CD47)的结合。可以使用的测定的实例包括固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)，夹心竞争测定(参见，例如，Stahli等人，(1983)Methods in Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见，例如，Kirkland等人，(1986)J.Immunol.137：3614-3619)固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见，例如，Harlow and Lane，(1988)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress)；使用l-125标记的固相直接标记RIA(参见，例如，Morel等人，(1988)Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见，例如，Cheung等人，(1990)Virology 176：546-552)；和直接标记的RIA(Moldenhauer等人，(1990)Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常，这种测定包括结合至具有未标记的测试抗原结合蛋白(例如，测试CD47抗体)或者标记的参考抗原结合蛋白(例如，参考CD47抗体)中任一个的固体表面或细胞的纯化抗原(例如，CD47，如人CD47)的使用。可以在存在测试抗原结合蛋白的情况下，通过确定结合至固体表面或细胞的标记物的量来测量竞争性抑制。通常，测试抗原结合蛋白过量存在。通过竞争测定(竞争抗体)识别的抗体包括结合至与参考抗体相同的表位的抗体和/或结合至对于发生空间位阻来说，与参考抗体结合的表位足够邻近的相邻表位(例如，类似表位或者重叠表位)的抗体。通常，当竞争抗体过量存在时，它将参考抗体与共同抗原的特异性结合抑制至少20％，例如，至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。在一些实例中，将结合抑制了至少80％、85％、90％、95％、96％或97％、98％、99％或以上。
如本文所使用的，术语“恒定区”或“恒定域”是本领域熟知的抗体术语并且是指抗体部分，例如，不直接参与抗体与抗原的结合，但是可以显示出多种效应因子功能，如与Fc受体相互作用的轻链和/或重链的羧基末端部分。该术语包括通常相对于免疫球蛋白可变域具有更保守的氨基酸序列的免疫球蛋白分子的一部分。
抗体“效应因子功能”表示可归因于抗体Fc区(例如，天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)并且随抗体同种型改变的那些生物学活性。抗体效应因子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；细胞表面受体(例如，B细胞受体)下调；和B细胞激活。
在本文中，术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，其包括(例如)天然序列Fc区、重组Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能不同，但是通常定义人IgG重链Fc区以从位置Cys226(根据EU编号系统)或Pro230(根据EU编号系统)处的氨基酸残基延伸至其羧基末端。例如，可以在抗体的产生或纯化期间或者通过重组工程设计编码抗体重链的核酸来除去Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)。以下提供了示例性Fc区序列(CH2域＝加粗文本；CH3域＝加下划线文本)：
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应因子功能”。示例性“效应因子功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)下调等。这些效应因子功能通常需要Fc区与结合区或结合域(例如，抗体可变区或域)组合并且可以使用如所公开的多种测定评价。
“天然序列Fc区”包含与天然存在的Fc区的氨基酸序列相同，且未被人操纵、修饰和/或改变(例如，分离、纯化、选择、包括或与其它序列，如可变区序列组合)的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgGl Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；和天然序列人IgG4Fc区及其天然存在的变体。
“变体Fc区”包含借助于至少一种氨基酸修饰(例如，替换、添加或缺失)，优选地一种或多种氨基酸替换而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。在一些实施方式中，与天然序列Fc区或亲代多肽的Fc区相比，变体Fc区在天然序列Fc区中或者在亲代多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸替换，例如，约1至约10个氨基酸替换，并且优选地约1至约5个氨基酸替换。在本文中，变体Fc区可以与天然序列Fc区和/或亲代多肽的Fc区具有至少约80％的同源性，或者与之具有至少约90％的同源性，例如，与之具有至少约95％的同源性。在本文中，本文所描述的变体Fc区可以具有效应因子功能丧失(例如，沉默Fc)。以下提供了示例性变体Fc区(“沉默Fc”)序列(CH2域＝加粗文本，其中对氨基酸变化加下划线；CH3域＝加下划线文本)：
当用于表示抗体时，如本文所使用的，术语“重链”是指约50-70kD的多肽链，其中氨基-末端部分包括约120至130个或更多个氨基酸的可变区，并且羧基-末端部分包括一个或多个恒定区。基于恒定域氨基酸序列，“重链”可以表示任何不同类型，例如，α(α)、δ(δ)、ε(ε)、γ(γ)和μ(μ)，其分别产生了IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类抗体，包括IgG亚类，例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
当用于表示抗体时，如本文所使用的，术语“轻链”可以表示约25kDa的多肽链，其中氨基-末端部分包括约100至约110个或更多个氨基酸的可变区，并且羧基-末端部分包括恒定区。轻链的大致长度为211至217个氨基酸。基于恒定域的氨基酸序列，存在两种不同的类型，例如，κ(κ)或λ(λ)。轻链氨基酸序列在本领域中是熟知的。
术语“抗原结合片段”、“抗原结合域”、“抗原结合区”以及类似术语表示包含与抗原相互作用的氨基酸残基并且赋予结合片段、域或区对抗原的特异性和亲合力的抗体部分(例如，CDR)。如本文所使用的“抗原结合片段”包括“抗体片段”，其包含包括一个或多个CDR，如抗体的抗原结合或可变区的抗体部分。
本文所述的抗体包括(但不限于)合成抗体、单克隆抗体、重组产生的抗体、多重特异性抗体(例如，包括双重特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体、单-链Fvs(scFv)(例如，包括单特异性、双重特异性等)、骆驼化抗体、Fab片段、F(ab′)片段、二硫键-连接的Fv(sdFv)、抗-独特型(抗-Id)抗体和任何上述抗体的表位-结合片段。
在一些实施方式中，本文所述的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，包括含有结合至CD47抗原的一个或多个抗原结合域和结合至除CD47以外的一个或多个靶标(例如，PD-L1)的一个或多个抗原结合域的分子。
抗体可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a或IgG2b)的免疫球蛋白分子。在一些实施方式中，本文所述的抗体是IgG抗体(例如，人IgG)，或其类(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)或亚类。
在一些实施方式中，抗体是包含两条重(H)链/轻(L)链对的4-链抗体单元，其中H链的氨基酸序列是相同的并且L链的氨基酸序列是相同的。在一些实施方式中，H和L链包含恒定区，例如，人恒定区。在一些实施方式中，这些抗体的L链恒定区是kappa或lambda轻链恒定区，例如，人kappa或lambda轻链恒定区。在一些实施方式中，这些抗体的H链恒定区包含gamma重链恒定区，例如，人gamma重链恒定区。在一些实施方式中，这些抗体包含IgG恒定区，例如，人IgG恒定区(例如，IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4恒定区)。
抗体或其片段可以优先结合至CD47，如人CD47，这表示抗体或其片段以大于它结合至无关对照蛋白时的亲和力结合CD47，和/或以大于它结合至无关对照蛋白时的亲和力结合人CD47。例如，所述抗体或其片段可以特异性识别并结合CD47或其部分。“特异性结合”表示所述抗体或其片段以比对于无关对照蛋白(例如，鸡蛋清溶菌酶)的亲和力大至少5、10、15、20、25、50、100、250、500、1000或10,000倍的亲和力结合至CD47。在一些实施方式中，所述抗体或其片段可以基本仅结合CD47(例如，借助于(例如)结合亲和力可测量的差异，能够区分CD47和其它已知的多肽)。在一些实施方式中，多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)可以与除人CD47序列以外的CD47序列(例如，食蟹猴CD47序列)反应。
术语“可变区”或“可变域”是指通常位于轻链或重链的氨基-末端并且在重链中具有约120至130个氨基酸长度且在轻链中具有约100至110个氨基酸长度，并且在每个特定抗体对于其特定抗原的结合和特异性中使用的抗体的轻链或重链部分。重链可变区可以被称为“VH”。轻链可变区可以被称为“VL”。术语“可变”是指在抗体之间，可变区的某些节段在序列中广泛不同的事实。V区介导抗原结合并且定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，差异度不是在可变区的110个氨基酸区间内均匀分布的。相反，V区由通过被称为“高变区”或者作为另外一种选择被称为“互补决定区”的差异度较大(例如，极大差异度)的较短区域隔开的约15-30个氨基酸的被称为框架区(FR)的较少变化(例如，相对不变)的延伸组成。重链和轻链的可变区分别包含通过三个高变区连接的4个主要采用β-折叠构型的FR(FR1、FR2、FR3和FR4)，其形成了连接β-折叠结构并且在一些情况下构成β-折叠结构的一部分的环。每条链中的高变区通过FR紧邻地保持在一起，并且通过来自其它链的高变区，有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见，例如，Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是显示出多种效应因子功能，如抗体对抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)的参与。在不同抗体之间，可变区的序列广泛不同。序列的变化集中在CDR，而可变区中不太变化的部分被称为框架区(FR)。轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用。在具体的实施方式中，所述可变区是人可变区。
当在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”、“HV”、“互补决定区”或“CDR”是指序列高变且形成结构限定的环的抗体可变区的区域。通常，抗体包含6个高变区；VH中的3个(H1、H2、H3)和VL中的3个(L1、L2、L3)。使用了一些高变区示意图并且其涵盖在本文中。KabatCDR基于序列差异度并且是最常用的(参见，例如，Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))。作为替代，Chothia表示结构环的位置(参见，例如，Chothiaand Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。当使用Kabat编号惯例编号时，基于环的长度，Chothia CDR-H1环的末端在H32和H34之间变化(这是因为Kabat编号方案在H35A和H35B处放置了插入；如果既不存在35A也不存在35B，则环的末端位于32；如果只存在35A，则环的末端位于33；如果存在35A和35B两者，则环的末端位于34)。AbM高变区表示Kabat CDR和Chothia结构环之间的折中，并且由Oxford Molecular′s AbM抗体建模软件使用(参见，例如，Martin，in Antibody Engineering，第2卷，第3章，Springer Verlag)。“contact”高变区基于可得的复合物晶体结构的分析。以下指明了来自这些高变区或CDR中每一个的残基。
已开发并广泛使用了通用编号系统，ImMunoGeneTics(IMGT)Information
(Lefranc等人，Dev.Comp.Immunol.27(1)：55-77(2003))。IMGT是专门用于人及其它脊椎动物的免疫球蛋白(IG)、T细胞受体(TR)和主要组织相容性复合体(MHC)的综合信息系统。在本文中，就轻链或重链内的氨基酸序列和位置两者提及CDR。由于免疫球蛋白可变域结构内CDR的“位置”在物种间保守并且存在于被称为环的结构中，通过使用根据结构特征比对可变域序列的编号系统，容易地识别了CDR和框架残基。该信息可以用于来自一个物种的免疫球蛋白的CDR残基向通常来自人抗体的受体框架的移植和置换。已通过Honegger and Plückthun，J.Mol.Biol.309：657-670(2001)开发了其它编号系统(AHon)。编号系统，包括(例如)Kabat编号和IMGT唯一编号系统之间的对应是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Kabat，如上；Chothia and Lesk，如上；Martin，如上；Lefranc等人，如上)并且以下还说明了这种对应。本文所示的示例性系统组合了Kabat和Chothia。
| 示例性 | IMGT | Kabat | AbM | Chothia | Contact | |
| VH CDR1 | 26-35 | 27-38 | 31-35 | 26-35 | 26-32 | 30-35 |
| VH CDR2 | 50-65 | 56-65 | 50-65 | 50-58 | 52a/53-55 | 47-58 |
| VH CDR3 | 95-102 | 105-117 | 95-102 | 95-102 | 96-101 | 93-101 |
| VL CDR1 | 24-34 | 27-38 | 24-34 | 24-34 | 26-32 | 30-36 |
| VL CDR2 | 50-56 | 56-65 | 50-56 | 50-56 | 50-52 | 46-55 |
| VL CDR3 | 89-97 | 105-117 | 89-97 | 89-97 | 91-96 | 89-96 |
高变区可以包含如下所示的“延长的高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)，和VH中的26-35或26-35A(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。如本文所使用的，术语“高变区”、“HVR”、“HV”、“互补决定区”或“CDR”是可互换使用的。
术语“载体”是指用于携带或包括核酸序列，包括(例如)以将核酸序列引入宿主细胞的物质。适合使用的载体包括(例如)表达载体、质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人造染色体，其可以包括对于向宿主细胞染色体稳定整合可操作的选择序列或标志物。另外，所述载体可以包括一个或多个可选择标志物基因和适当的表达控制序列。可以包括的可选择标志物基因(例如)提供了抗生素或毒素抗性、补充营养缺陷或者提供培养基中不存在的关键营养物。表达控制序列可以包括在本领域中熟知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当共表达两种或更多种核酸分子(例如，抗体重链和轻链两者或者抗体VH和VL两者)时，可以将两个核酸分子插入(例如)到单一表达载体或者不同的表达载体中。对于单一载体表达，所述编码核酸可以操作性地连接至一个公共表达控制序列或者连接至不同的表达控制序列，如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。可以使用本领域中熟知的方法确认核酸分子向宿主细胞的引入。这些方法包括(例如)核酸分析，如mRNA的RNA印迹或聚合酶链反应(PCR)扩增，或者用于基因产物表达的免疫印迹法，或者其它适合的分析方法以测试所引入的核酸序列或其相应基因产物的表达。本领域技术人员应理解以足够的量表达所述核酸分子以产生所期望的产物(例如，如本文所描述的多重特异性结合剂)，并且还应理解可以使用本领域中熟知的方法优化表达水平以获得足够的表达。
“免疫细胞功能障碍疾病”和“免疫细胞功能障碍病症”和“免疫细胞功能障碍病况”是可互换使用的并且表示完全或部分由对免疫细胞的不正确信号转导所引起的或者作为它们的结果的任何疾病、病症或病况和/或作为另外一种选择，其中期望抑制免疫细胞受体(例如，SIRPα或PD-1)与其配体(例如，CD47或者PD-L1)的相互作用的体内影响的任何疾病、病症或病况。免疫细胞功能障碍疾病包括吞噬细胞功能障碍疾病和T细胞功能障碍疾病。
“噬菌细胞功能障碍疾病”和“噬菌细胞功能障碍病症”和“噬菌细胞功能障碍病况”是可互换使用的并且表示完全或部分由CD47或CD47与SIRPa的相互作用所引起的或者作为它们的结果的任何疾病、病症或病况和/或作为另外一种选择，其中期望抑制CD47与SIRPα的相互作用的体内影响的任何疾病、病症或病况。吞噬细胞功能障碍疾病包括以免疫细胞(例如，嗜中性白细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B淋巴细胞)的吞噬活性降低为特征或者与之相关的疾病、病症或病况。在一些实施方式中，吞噬细胞功能障碍疾病是具体地与通过SIRPα的不正确的升高的信号转导有关的疾病、病症或病况。在一些实施方式中，吞噬细胞功能障碍疾病是其中吞噬细胞(例如，巨噬细胞)摄取或吞没其它细胞(例如，肿瘤细胞)或颗粒的能力降低的疾病。在一些实施方式中，摄取或吞没其它细胞或颗粒的能力的降低导致对病原体或肿瘤，包括(但不限于)表达CD47的肿瘤的无效控制。以吞噬细胞功能障碍为特征的吞噬细胞功能障碍疾病的实例包括未解决的急性感染、慢性感染和肿瘤免疫(例如，任何癌症，包括(但不限于)表达或过表达CD47的癌症)。
“T细胞功能障碍疾病”和“T细胞功能障碍病症”和“T细胞功能障碍病况”是可互换使用的并且表示以对抗原刺激反应性降低为特征的T细胞的任何疾病、病症或病况。T细胞功能障碍疾病包括完全或部分由PD-L1或PD-L1与PD-1的相互作用所造成的或者是它们的结果的疾病、病症或病况，和/或作为另外一种选择，其中期望抑制PD-L1与PD-1的相互作用的体内影响的任何疾病、病症或病况。在一些实施方式中，T细胞功能障碍疾病是与通过PD-1的不正确的提高的信号转导具体相关的疾病、病症或病况。在一些实施方式中，T细胞功能障碍疾病是其中T细胞对分泌细胞因子、增殖或发挥溶胞活性无力或者具有降低的能力的一种疾病。在一些实施方式中，降低的反应性导致对病原体或肿瘤，包括(但不限于)表达PD-L1的肿瘤的无效控制。以T细胞功能障碍为特征的T细胞功能障碍疾病的实例包括未解决的急性感染、慢性感染和肿瘤免疫(例如，来自任何癌症，包括(但不限于)表达或过表达PD-L1的癌症)。
“肿瘤免疫”是指其中肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。因此，作为治疗概念，当这种逃避减弱并且通过免疫系统识别并攻击肿瘤时，“治疗”了肿瘤免疫。肿瘤识别的实例包括肿瘤结合、肿瘤收缩和肿瘤清除。
“增强T细胞功能”表示诱导、引起或刺激T细胞具有持续或提高的生物学功能，或者更新或重新激活耗竭或非活性T细胞。增强T细胞功能的实例包括：相对于干预前的这些水平，CD8+T细胞的细胞因子(例如，TNFα、IFNγ)分泌提高、增殖提高、抗原反应性(例如，肿瘤细胞去除)提高。在一些实施方式中，增强水平为至少50％，作为另外一种选择，60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％。测量这种增强的方式是本领域的技术人员已知的。
“有效的量”一般是足以降低症状的严重程度和/或频率，消除症状和/或潜在原因，防止症状和/或它们的潜在原因的发生，和/或改善或治疗由所述疾病、病症或病况所产生或与之有关的损害的量。在一些实施方式中，所述有效量是治疗有效量或预防有效量。
如本文所使用的术语“治疗有效量”是指足以降低和/或改善给定疾病、病症或病况和/或与之有关的症状的严重程度和/或持续时间的试剂(例如，本文所述的抗体或者本文所述的任何其它试剂)的量。试剂，包括治疗剂的治疗有效量可以是(i)给定疾病、病症或病况的进展或发展的降低或改善，(ii)给定疾病、病症或病况的复发、发展或发病的降低或改善，和/或(iii)改善或提高另一种疗法(例如，本为所述的抗体的施用以外的疗法)的预防或治疗效果所必需的量。可以根据下列因素改变本发明公开所述的物质/分子/试剂(例如，CD47抗体)的“治疗有效量”，所述因素如个体的疾病状况、年龄、性别和体重以及物质/分子/试剂在所述个体中引起所期望的反应的能力。治疗有效量涵盖了其中所述物质/分子/试剂的治疗有益效果大于任何毒性或不利影响的量。在某些实施方式中，术语“治疗有效量”是指对于“治疗”受试者或哺乳动物中疾病、病症或病况有效的抗体或其它试剂(例如，或者药物)的量。
“预防有效量”是当向受试者施用时，将具有预期预防作用，例如，预防或延迟疾病、病症或病况的发病(或复发)，或者降低疾病、病症或病况或相关症状的发病(或复发)的可能性的药物组合物的量。完全治疗或预防作用不必需通过一个剂量的施用发生，并且可以仅在一系列剂量施用后发生。因此，可以在一个或多个施用中施用治疗或预防有效量。
如本文所使用的，术语“药物可用的”表示由联邦或州政府的管理机构批准的或者美国药典、欧洲药典或其它通常承认的药典中所列的在动物，并且更具体地在人中使用的。
如本文所使用的“载体”包括在所使用的剂量和浓度下对向其暴露的细胞或哺乳动物无毒的载体、赋形剂或稳定剂。通常，载体是水性pH缓冲溶液。载体的实例包括缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量((例如，小于约10个氨基酸残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；盐-形成反离子，如钠；和/或非离子型表面活性剂，如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。术语“载体”还可以表示稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全和不完全))、赋形剂或通过其施用治疗剂的媒介物。这些载体可以是无菌液体，如水和油剂，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用组合物(例如，药物组合物)时，水是示例性载体。盐溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，具体地用于可注射溶液。适合的赋形剂(例如，药物赋形剂)包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述组合物还可以含有少量润湿剂或乳化剂，或者pH缓冲剂。组合物可以采取溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂等的形式。口服组合物，包括制剂可以包括标准载体，如药品级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的载体的实例描述于Remington′s Pharmaceutical Sciences(1990)MackPublishing Co.，Easton，PA。组合物，包括药物化合物可以含有预防或治疗有效量的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，例如，以分离或纯化形式，以及适合的量的载体，以提供向受试者(例如，患者)正确施用的形式。制剂应适合施用形式。
在一些实施方式中，本发明公开提供了可以在本文中作为治疗剂使用的多重特异性结合剂。这些试剂包括多重特异性抗体(例如，抗体，如双重特异性抗体)，其包含结合至CD47，包括人CD47的第一结合域和结合一个或多个其它非CD47的靶标(例如，PD-L1)的第二结合域。示例性抗体包括人源化、人、双重特异性和异源缀合物抗体，及其具有升高或降低的亲和力或其它性质的变体。
在一些实施方式中，本文描述了包含结合至CD47，包括CD47多肽、CD47多肽片段、CD47肽或CD47表位的第一结合域的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)。在一些实施方式中，所述多重特异性结合剂是人或人源化抗体(例如，包含人恒定区)，其包含结合CD47，包括CD47多肽、CD47多肽片段、CD47肽或CD27表位的第一结合域。在一些实施方式中，多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)可以结合至在哺乳动物(例如，人)细胞，包括CD47表达肿瘤细胞表面上表达的CD47。在一些实施方式中，多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)结合在细胞，如肿瘤细胞上暴露的CD47胞外表位(例如，CD47表位)。在一些实施方式中，本文描述了结合至CD47，如人CD47或其部分的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)。在一些实施方式中，CD47为人CD47。在一些实施方式中，多重特异性结合剂是结合至CD47(例如，结合至人CD47的抗体)的多重特异性结合剂。本文描述了人CD47的示例性氨基酸序列。
在一些实施方式中，本文描述了多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，其包含结合至PD-L1，包括PD-L1多肽、PD-L1多肽片段、PD-L1肽或PD-L1表位的第二结合域。在一些实施方式中，所述多重特异性结合剂是人源化抗体(例如，包含人恒定区)，其包含结合PD-L1，包括PD-L1多肽、PD-L1多肽片段、PD-L1肽或PD-L1表位的第二结合域。在一些实施方式中，多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)可以结合至在哺乳动物(例如，人)细胞，包括PD-L1表达抗原递呈细胞和肿瘤细胞表面上表达的PD-L1。在一些实施方式中，多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)结合在细胞，如肿瘤细胞上暴露的PD-L1胞外表位(例如，CD47表位)。在一些实施方式中，本文描述了多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，其包含结合至PD-L1，如人PD-L1或其部分的第二结合域。在一些实施方式中，PD-L1是人PD-L1。在一些实施方式中，多重特异性结合剂是结合至人PD-L1(例如，结合至人PD-L1的抗体)的多重特异性结合剂。本文描述了人PD-L1的示例性氨基酸序列。
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)与包含本文所述的抗体中任一种的VH区、VL区、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3，如表1-3中所示的VH区、VL区、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3的氨基酸序列的结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)竞争与CD47，如人CD47的结合。因此，在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)与包含来自下列的1、2和/或3个VH CDR和/或1、2和/或3个VL CDR的结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)竞争与CD47，如人CD47的结合：(a)表示为C40的抗体；(b)表示为C56的抗体；或者(c)表示为C59的抗体，如表1-3所示。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)与包含来自下列的1、2和/或3个VH CDR和1、2和/或3个VL CDR的结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)竞争与CD47，如人CD47的结合：(a)表示为C40的抗体；(b)表示为C56的抗体；或者(c)表示为C59的抗体，如表1-3所示。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)与包含来自下列的VH区和VL区的结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)竞争与CD47，如人CD47的结合：(a)表示为C40的抗体；(b)表示为C56的抗体；或者(c)表示为C59的抗体，如表1-3所示。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)与包含下列的结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)竞争与CD47，如人CD47的结合：(a)包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的VH区，和包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列的VL区；(b)包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列的VH区，和包含SEQ IDNO：52所示的氨基酸序列的VL区；或者(c)包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列的VH区，和包含SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列的VL区。
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含本文所述的抗体中任一种的VH区、VL区、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VLCDR2和/或VL CDR3，如表1-6中所示的VH区、VL区、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VLCDR2和/或VL CDR3的氨基酸序列。因此，在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含含有来自下列的1、2和/或3个重链CDR和/或1、2和/或3个轻链CDR的第一结合域：(a)表示为C40的抗体；(b)表示为C56的抗体；或者(c)表示为C59的抗体，如表1-3所示。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含含有来自下列的1、2和/或3个重链CDR和/或1、2和/或3个轻链CDR的第二结合域：(a)表示为P22的抗体；(b)表示为P24的抗体；或者(c)表示为P31.2的抗体，如表4-6所示。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含含有来自下列的1、2和/或3个重链CDR和/或1、2和/或3个轻链CDR的第一结合域：(a)表示为C40的抗体；(b)表示为C56的抗体；或者(c)表示为C59的抗体，如表1-3所示，和含有来自下列的1、2和/或3个重链CDR和/或1、2和/或3个轻链CDR的第二结合域：(a)表示为P22的抗体；(b)表示为P24的抗体；或者(c)表示为P31.2的抗体，如表4-6所示。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含含有来自下列的1、2和/或3个重链CDR和1、2和/或3个轻链CDR的第一结合域：(a)表示为C40的抗体；(b)表示为C56的抗体；或者(c)表示为C59的抗体，如表1-3所示，和含有来自下列的1、2和/或3个重链CDR和1、2和/或3个轻链CDR的第二结合域：(a)表示为P22的抗体；(b)表示为P24的抗体；或者(c)表示为P31.2的抗体，如表4-6所示。
在一些实施方式中，多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47的第一结合域并且包含表1、表2和表3所述的结合剂中任一种的VH区，其包含VHCDR1、VH CDR2和/或VH CDR3，和VL区，其包含VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3，和结合至PD-L1的第二结合域并且包含表4、表5和表6中所述的结合剂中任一种的VH区，其包含VH CDR1、VH CDR2和/或VH CDR3，和VL区，其包含VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。因此，在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含含有来自表1的1、2和/或3个重链CDR和/或1、2和/或3个轻链CDR的第一结合域。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂包含含有来自表2的1、2和/或3个重链CDR和/或1、2和/或3个轻链CDR的第一结合域。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含含有来自表3的1、2和/或3个重链CDR和/或1、2和/或3个轻链CDR的第一结合域。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含含有来自表4的1、2和/或3个重链CDR和/或1、2和/或3个轻链CDR的第二结合域。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含含有来自表5的1、2和/或3个重链CDR和/或1、2和/或3个轻链CDR的第二结合域。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含含有来自表6的1、2和/或3个重链CDR和/或1、2和/或3个轻链CDR的第二结合域。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)是双重特异性的并且包含第一结合域，其包含来自表1、表2或表3的1、2和/或3个重链CDR和/或1、2和/或3个轻链CDR，和第二结合域，其包含来自结合非CD47的第二靶标抗原的结合剂的1、2和/或3个重链CDR和/或1、2和/或3个轻链CDR。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)是双重特异性的并且包含第一结合域，其包含来自表1、表2或表3的1、2和3个重链CDR和1、2和3个轻链CDR，和第二结合域，其包含来自表4、表5或表6的1、2和/或3个重链CDR和1、2和/或3个轻链CDR。
表示为C40的抗体包含SEQ ID NO：25所示的VH序列和SEQ ID NO：26所示的VL序列。
表示为C56的抗体包含SEQ ID NO：51所示的VH序列和SEQ ID NO：52所示的VL序列。
表示为C59的抗体包含SEQ ID NO：77所示的VH序列和SEQ ID NO：78所示的VL序列。
表示为P22的抗体包含SEQ ID NO：103所示的VH序列和SEQ ID NO：104所示的VL序列。
表示为P24的抗体包含SEQ ID NO：129所示的VH序列和SEQ ID NO：130所示的VL序列。
表示为P31.2的抗体包含SEQ ID NO：155所示的VH序列和SEQ ID NO：156所示的VL序列。
在一些实施方式中，结合至CD47的多重特异性结合剂(例如，抗体)包含(i)VH域，其中所述VH域包含SEQ ID NO：26(C40VH)、SEQ ID NO：51(C56VH)或SEQ ID NO：77(C59VH)所示的VH序列，和(ii)VL域，其中所述VL域包含SEQ ID NO：26(C40VL)、SEQ ID NO：52(C56VL)或SEQ ID NO：78(C59VL)所示的VL序列。在一些实施方式中，这些VH和VL域用于构建双重特异性结合剂(例如，抗体)，其分别具有结合至CD47的第一结合域，包括其中所述第一结合域包含(i)C40VH和C40VL域、(ii)C56VH和C56VL域，或者(iii)C59VH和C59VL域。
在一些实施方式中，结合至PD-L1的多重特异性结合剂(例如，抗体)包括(i)VH域，其中所述VH域包括SEQ ID NO：103(P22VH)、SEQ ID NO：129(P24VH)或SEQ ID NO：155(P31.2VH)所示的VH序列，和(ii)VL域，其中所述VL域包括SEQ ID NO：104(P22VL)、SEQ IDNO：130(P24VL)或SEQ ID NO：156(P31.2VL)所示的VL序列。在一些实施方式中，将这些VH和VL域用于构建分别具有结合至PD-L1的第一结合域的双重特异性结合剂(例如，抗体)，包括其中所述第一结合域包含(i)P22VH和P22VL域、(ii)P24VH和P24VL域或者(iii)P31.2VH和P31.2VL域。
在一些实施方式中，将这些VH和VL域用于构建包含4条多肽链的双重特异性抗体，其中(i)多肽链1包含VL域(例如，C40VL、C56VL或C59VL)，多肽链2包含VH域(例如，C40VH、C56VH或C59VH)，其中所述VL和VH域形成结合至CD47的第一结合域，和(ii)多肽链3包含VL域(例如，P22VL、P24VL或P31.2VL)，多肽链4包含VH域(例如，P22VH、P24VH或P31.2VH)，其中所述VL和VH域形成结合至PD-L1的第二结合域。
在第一系列实施方式中，CD47×PD-L1结合剂(例如，抗体)具有第一、第二、第三和第四多肽链，其中(a)所述第一多肽链包含域A、域B、域D和域E，其中所述结构域从N-末端至C-末端以A-B-D-E取向布置，并且域A具有第一VL氨基酸序列(例如，C40VL的SEQ ID NO：26、C56VL的SEQ ID NO：52、C59VL的SEQ ID NO：78)，域B具有人IgG1 CH3氨基酸序列，该序列具有T366K突变和引入KSC三肽序列，之后是IgG1铰链区的DKTHT基序的C末端延伸，域D具有人IgG1 CH2氨基酸序列，且域E具有伴有S354C和T366W突变的人IgG1 CH3氨基酸；(b)所述第二多肽链具有域F和域G，其中所述结构域从N-末端至C-末端以F-G取向布置，并且其中域F具有第一VH氨基酸序列(例如，C40VH的SEQ ID NO：25、C56VH的SEQ ID NO：51、C59VH的SEQID NO：77)，和域G具有人IgG1 CH3氨基酸序列，该序列具有L351D突变和引入GEC氨基酸二硫键基序的C末端延伸；(c)所述第三多肽链具有域H、域I、域J和域K，其中所述结构域从N-末端至C-末端以H-I-J-K取向布置，并且其中域H具有第二VL氨基酸序列(例如，P22VL的SEQID NO：104、P24VL的SEQ ID NO：130、P31.2VL的SEQ ID NO：1 56)，域I具有人CLκ氨基酸序列，域J具有人IgG1 CH2氨基酸序列，且域K具有伴有Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A和Y407V突变的人IgG1 CH3氨基酸序列；(d)所述第四多肽链具有域L和域M，其中所述结构域从N-末端至C-末端以L-M取向布置，并且其中域L具有第二VH氨基酸序列(例如，P22VH的SEQID NO：103、P24VH的SEQ ID NO：129、P31.2VH的SEQ ID NO：155)，和域M具有人IgG1 CH1氨基酸序列；(e)所述第一和所述第二多肽通过A和F域之间的相互作用和B和G域之间的相互作用结合；(f)所述第三和所述第四多肽通过H和L域之间的相互作用和I和M域之间的相互作用结合；(g)所述第一和第三多肽通过D和J域之间的相互作用和E和K域之间的相互作用结合以形成双重特异性结合剂(例如，抗体)；(h)域A和域F形成结合至CD47的第一结合域；和(i)域H和域L形成结合至PD-L1的第二结合域。
将这4种多肽链形式表示为BC1 B-体形式：
第一多肽链：
域A＝靶标1(例如，CD47)VL
域B＝CH3(T366K；445K、446S、447C三肽插入)
域D＝CH2
域E＝CH3(T366W、S354C)
第二多肽链：
域F＝靶标1(例如，CD47)VH
域G＝CH3(L351D；445G、446E、447C三肽插入)
第三多肽链：
域H＝靶标2(例如，PD-L1)VL
域I＝CL
域J＝CH2
域K＝CH3(Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V)
第四多肽链：
域L＝靶标2(例如，PD-L1)VH
域M＝CH1。
＞BC1链1
域布置：
A- B- 铰链-D- E
VL-CH3- 铰链-CH2- CH3(杵)
第一CH3(域B)中的突变：
T366K；445K、446S、447C插入
第二CH3(域E)中的突变
S354C、T366W
＞BC1链2
域布置：
F- G
VH- CH3
CH3(域G)中的突变：
L351D；445G、446E、447C插入
＞BC1链3
域布置：
H- I- 铰链- J- K
VL- CL- 铰链- CH2- CH3(臼)
(域K)中的突变：
Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V
＞BC1链4
域布置：
M
VH- CH1
在双重特异性结合剂(例如，抗体)的示例性实施方式中，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：157，所述第二多肽链具有序列SEQ ID NO：158，所述第三多肽链具有序列SEQID NO：159，并且所述第四多肽链具有序列SEQ ID NO：160。作为另外一种选择，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：169，并且所述第三多肽链具有序列SEQ ID NO：170。
在双重特异性结合剂(例如，抗体)的示例性实施方式中，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：157，所述第二多肽链具有序列SEQ ID NO：158，所述第三多肽链具有序列SEQID NO：161，并且所述第四多肽链具有序列SEQ ID NO：162。作为另外一种选择，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：169，并且所述第三多肽链具有序列SEQ ID NO：171。
在双重特异性结合剂(例如，抗体)的示例性实施方式中，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：157，所述第二多肽链具有序列SEQ ID NO：158，所述第三多肽链具有序列SEQID NO：163，并且所述第四多肽链具有序列SEQ ID NO：164。作为另外一种选择，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：169，并且所述第三多肽链具有序列SEQ ID NO：172。
在双重特异性结合剂(例如，抗体)的示例性实施方式中，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：165，所述第二多肽链具有序列SEQ ID NO：166，所述第三多肽链具有序列SEQID NO：159，并且所述第四多肽链具有序列SEQ ID NO：160。作为另外一种选择，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：173，并且所述第三多肽链具有序列SEQ ID NO：170。
在双重特异性结合剂(例如，抗体)的示例性实施方式中，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：165，所述第二多肽链具有序列SEQ ID NO：166，所述第三多肽链具有序列SEQID NO：161，并且所述第四多肽链具有序列SEQ ID NO：162。作为另外一种选择，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：173，并且所述第三多肽链具有序列SEQ ID NO：171。
在双重特异性结合剂(例如，抗体)的示例性实施方式中，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：165，所述第二多肽链具有序列SEQ ID NO：166，所述第三多肽链具有序列SEQID NO：163，并且所述第四多肽链具有序列SEQ ID NO：164。作为另外一种选择，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：173，并且所述第三多肽链具有序列SEQ ID NO：172。
在双重特异性结合剂(例如，抗体)的示例性实施方式中，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：167，所述第二多肽链具有序列SEQ ID NO：168，所述第三多肽链具有序列SEQID NO：159，并且所述第四多肽链具有序列SEQ ID NO：160。作为另外一种选择，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：174，并且所述第三多肽链具有序列SEQ ID NO：170。
在双重特异性结合剂(例如，抗体)的示例性实施方式中，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：167，所述第二多肽链具有序列SEQ ID NO：168，所述第三多肽链具有序列SEQID NO：161，并且所述第四多肽链具有序列SEQ ID NO：162。作为另外一种选择，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：174，并且所述第三多肽链具有序列SEQ ID NO：171。
在双重特异性结合剂(例如，抗体)的示例性实施方式中，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：167，所述第二多肽链具有序列SEQ ID NO：168，所述第三多肽链具有序列SEQID NO：163，并且所述第四多肽链具有序列SEQ ID NO：164。作为另外一种选择，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：174，并且所述第三多肽链具有序列SEQ ID NO：172。
在第二系列实施方式中，CD47×PD-L1结合剂(例如，抗体)具有第一、第二、第三和第四多肽链，其中(a)所述第一多肽链包含域A、域B、域D和域E，其中所述结构域从N-末端至C-末端以A-B-D-E取向布置，并且域A具有第一VL氨基酸序列(例如，C40VL的SEQ ID NO：26、C56VL的SEQ ID NO：52、C59VL的SEQ ID NO：78)，域B具有人IgG1 CH3氨基酸序列，该序列具有Y349C突变、P343V突变和引入PGK三肽序列，之后是IgG1铰链区的DKTHT基序的C末端延伸，域D具有人IgG1 CH2氨基酸序列，且域E具有伴有S354C突变和T366W突变的人IgG1 CH3氨基酸；(b)所述第二多肽链具有域F和域G，其中所述结构域从N-末端至C-末端以F-G取向布置，并且其中域F具有第一VH氨基酸序列(例如，C40VH的SEQ ID NO：25、C56VH的SEQ IDNO：51、C59VH的SEQ ID NO：77)，和域G具有人IgG1 CH3氨基酸序列，该序列具有S354C突变和引入PGK三肽序列的C末端延伸；(c)所述第三多肽链具有域H、域I、域J和域K，其中所述结构域从N-末端至C-末端以H-I-J-K取向布置，并且其中域H具有第二VL氨基酸序列(例如，P22VL的SEQ ID NO：104、P24VL的SEQ ID NO：130、P31.2VL的SEQ ID NO：156)，域I具有人CLκ氨基酸序列，域J具有人IgG1 CH2氨基酸序列，且域K具有伴有Y349C、T366S、L368A和aY407V的人IgG1 CH3氨基酸序列；(d)所述第四多肽链具有域L和域M，其中所述结构域从N-末端至C-末端以L-M取向布置，并且其中域L具有第二VH氨基酸序列(例如，P22VH的SEQ IDNO：103、P24VH的SEQ ID NO：129、P31.2VH的SEQ ID NO：155)，和域M具有人IgG1氨基酸序列；(e)所述第一和所述第二多肽通过A和F域之间的相互作用和B和G域之间的相互作用结合；(f)所述第三和所述第四多肽通过H和L域之间的相互作用和I和M域之间的相互作用结合；和(g)所述第一和第三多肽通过D和J域之间的相互作用和E和K域之间的相互作用结合以形成双重特异性结合剂(例如，抗体)；(h)域A和域F形成结合至CD47的第一结合域；和(i)域H和域L形成结合至PD-L1的第二结合域。
将这4种多肽链形式表示为BC44B-体形式：
第一多肽链
域A＝靶标1(例如，CD47)VL
域B＝CH3(P343V；Y349C；445P、446G、447K插入)
域D＝CH2
域E＝CH3(S354C、T366W)
第二多肽链
域F＝靶标1(例如，CD47)VH
域G＝CH3(S354C；445P、446G、447K插入)
第三多肽链
域H＝靶标2(例如，PD-L1)VL
域I＝CL(κ)
域J＝CH2
域K＝CH3(Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V)
第四多肽链
域L＝靶标2(例如，PD-L1)VH
域M＝CH1。
＞BC44链1
域布置：
A- B- 铰链-D- E
VL- CH3- 铰链-CH2- CH3(杵)
第一CH3(域B)中的突变：
P343V；Y349C；445P、446G、447K插入
第二CH3(域E)中的突变：
S354C、T366W
＞BC44链2
域布置：
F- G
VH- CH3
CH3(域G)：中的突变
S354C；445P、446G、447K插入
＞BC44链3
域布置：
H- I- 铰链- J- K
VL- CL- 铰链- CH2- CH3(臼)
CH3(域K)中的突变：
Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V
＞BC44链4
域布置：
L- M
VH- CH1
在双重特异性结合剂(例如，抗体)的示例性实施方式中，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：175，所述第二多肽链具有序列SEQ ID NO：176，所述第三多肽链具有序列SEQID NO：159，并且所述第四多肽链具有序列SEQ ID NO：160。作为另外一种选择，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：181，并且所述第三多肽链具有序列SEQ ID NO：170。
在双重特异性结合剂(例如，抗体)的示例性实施方式中，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：175，所述第二多肽链具有序列SEQ ID NO：176，所述第三多肽链具有序列SEQID NO：161，并且所述第四多肽链具有序列SEQ ID NO：162。作为另外一种选择，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：181，并且所述第三多肽链具有序列SEQ ID NO：171。
在双重特异性结合剂(例如，抗体)的示例性实施方式中，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：175，所述第二多肽链具有序列SEQ ID NO：176，所述第三多肽链具有序列SEQID NO：163，并且所述第四多肽链具有序列SEQ ID NO：164。作为另外一种选择，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：181，并且所述第三多肽链具有序列SEQ ID NO：172。
在双重特异性结合剂(例如，抗体)的示例性实施方式中，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：177，所述第二多肽链具有序列SEQ ID NO：178，所述第三多肽链具有序列SEQID NO：159，并且所述第四多肽链具有序列SEQ ID NO：160。作为另外一种选择，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：182，并且所述第三多肽链具有序列SEQ ID NO：170。
在双重特异性结合剂(例如，抗体)的示例性实施方式中，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：177，所述第二多肽链具有序列SEQ ID NO：178，所述第三多肽链具有序列SEQID NO：161，并且所述第四多肽链具有序列SEQ ID NO：162。作为另外一种选择，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：182，并且所述第三多肽链具有序列SEQ ID NO：171。
在双重特异性结合剂(例如，抗体)的示例性实施方式中，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：177，所述第二多肽链具有序列SEQ ID NO：178，所述第三多肽链具有序列SEQID NO：163，并且所述第四多肽链具有序列SEQ ID NO：164。作为另外一种选择，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：182，并且所述第三多肽链具有序列SEQ ID NO：172。
在双重特异性结合剂(例如，抗体)的示例性实施方式中，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：179，所述第二多肽链具有序列SEQ ID NO：180，所述第三多肽链具有序列SEQID NO：159，并且所述第四多肽链具有序列SEQ ID NO：160。作为另外一种选择，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：183，并且所述第三多肽链具有序列SEQ ID NO：170。
在双重特异性结合剂(例如，抗体)的示例性实施方式中，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：179，所述第二多肽链具有序列SEQ ID NO：180，所述第三多肽链具有序列SEQID NO：161，并且所述第四多肽链具有序列SEQ ID NO：162。作为另外一种选择，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：183，并且所述第三多肽链具有序列SEQ ID NO：171。
在双重特异性结合剂(例如，抗体)的示例性实施方式中，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：179，所述第二多肽链具有序列SEQ ID NO：180，所述第三多肽链具有序列SEQID NO：163，并且所述第四多肽链具有序列SEQ ID NO：164。作为另外一种选择，所述第一多肽链具有序列SEQ ID NO：183，并且所述第三多肽链具有序列SEQ ID NO：172。
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47，包括人CD47的第一结合域，和结合至一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的第二结合域，其中所述第一结合域和/或所述第二结合域包含VH区或VH域。在其它实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47，包括人CD47的第一结合域，和结合至一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的第二结合域，其中所述第一结合域和/或所述第二结合域包含VL区或VL域。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47，包括人CD47的第一结合域，和结合至一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的第二结合域，其中所述第一结合域和/或所述第二结合域具有下列组合：(i)VH域或VH区；和/或(ii)VL域或VL区
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)具有下列组合：(i)VH域或VH区；和(ii)VL域或VL区。例如，示例性双重特异性IgG抗体包含(i)具有如本文所描述的VH域或VH区的组合的重链；和一个或多个重链恒定域或恒定区(例如，CH1、铰链、CH2和CH3)，和(ii)具有如本文所描述的VL域或VL区的组合的轻链，和轻链恒定域或恒定区(CL)。示例性IgG重链包含如本文所描述的任何VH域和随后的CH1、铰链、CH2和CH3氨基酸序列：
另一个示例性IgG重链包含如本文所描述的任何VH域和随后的CH1、铰链、CH2和CH3氨基酸序列：
示例性轻链(例如，用于与IgG重链配对)包含如本文所描述的任何VL域和随后的CL氨基酸序列：
在一些实施方式中，本文所描述的多重特并性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47，包括人CD47的第一结合域，和结合一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的第二结合域，其中所述第一结合域包含一个或多个CDR，包括表1中所识别的6个CDR，例如，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47，包括人CD47的第一结合域，和结合一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的第二结合域，其中所述第一结合域包含一个或多个，包括6个CDR，例如，表2中所识别的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47，包括人CD47的第一结合域，和结合一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的第二结合域，其中所述第一结合域包含一个或多个，包括6个CDR，例如，表3中所识别的VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47，包括人CD47的第一结合域，和结合一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的第二结合域，其中所述第一结合域包含一个或多个，包括6个CDR，例如，表1、2和/或3中所识别的VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂包含第一结合域，其包含一个或多个CDR，包括3个VH CDR，例如，表1所列的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3。在其它实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂包含第一结合域，其包含一个或多个CDR，包括3个CDR，例如，表1所列的VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。在其它实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂包含第一结合域，其包含一个或多个CDR，包括3个VH CDR，例如，表1所列的VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3，和一个或多个CDR，包括3个VL CDR，例如，表1所列的VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂包含第一结合域，其包含一个或多个CDR，包括3个VH CDR，例如，表2所列的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3。在其它实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂包含第一结合域，其包含一个或多个CDR，包括3个CDR，例如，表2所列的VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。在其它实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂包含第一结合域，其包含一个或多个CDR，包括3个VH CDR，例如，表2所列的VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3，和一个或多个CDR，包括3个VL CDR，例如，表2所列的VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂包含第一结合域，其包含一个或多个CDR，包括3个VH CDR，例如，表3所列的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3。在其它实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂包含第一结合域，其包含一个或多个CDR，包括3个CDR，例如，表3所列的VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。在其它实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂包含第一结合域，其包含一个或多个CDR，包括3个VH CDR，例如，表3所列的VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3，和一个或多个CDR，包括3个VL CDR，例如，表3所列的VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和PD-L1，包括人PD-L1的多重特异性结合剂包含第二结合域，其包含一个或多个CDR，包括3个VH CDR，例如，表4所列的VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3。在其它实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和PD-L1，包括人PD-L1的多重特异性结合剂包含第二结合域，其包含一个或多个CDR，包括3个CDR，例如，表4所列的VL CDR1、VL CDR2和/或VLCDR3。在其它实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和PD-L1，包括人PD-L1的多重特异性结合剂包含第二结合域，其包含一个或多个CDR，包括3个VH CDR，例如，表4所列的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3，和一个或多个CDR，包括3个VL CDR，例如，表4所列的VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和PD-L1，包括人PD-L1的多重特异性结合剂包含第二结合域，其包含一个或多个CDR，包括3个VH CDR，例如，表5所列的VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3。在其它实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和PD-L1，包括人PD-L1的多重特异性结合剂包含第二结合域，其包含一个或多个CDR，包括3个CDR，例如，表5所列的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3。在其它实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和PD-L1，包括人PD-L1的多重特异性结合剂包含第二结合域，其包含一个或多个CDR，包括3个VH CDR，例如，表5所列的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3，和一个或多个CDR，包括3个VL CDR，例如，表5所列的VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和PD-L1，包括人PD-L1的多重特异性结合剂包含第二结合域，其包含一个或多个CDR，包括3个VH CDR，例如，表6所列的VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3。在其它实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和PD-L1，包括人PD-L1的多重特异性结合剂包含第二结合域，其包含一个或多个CDR，包括3个CDR，例如，表6所列的VL CDR1、VL CDR2和/或VLCDR3。在其它实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和PD-L1，包括人PD-L1的多重特异性结合剂包含第二结合域，其包含一个或多个CDR，包括3个VH CDR，例如，表6所列的VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3，和一个或多个CDR，包括3个VL CDR，例如，表6所列的VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47的第一结合域并且包含一个或多个互补决定区(CDR)，所述互补决定区包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：1-24、27-50和53-76。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47的第一结合域并且包含两个或多个互补决定区(CDR)，所述互补决定区包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：1-24、27-50和53-76。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47的第一结合域并且包含三个或多个互补决定区(CDR)，所述互补决定区包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：1-24、27-50和53-76。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至PD-L1的第二结合域并且包含一个或多个互补决定区(CDR)，所述互补决定区包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：79-102、105-128和131-154。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至PD-L1的第二结合域并且包含两个或多个互补决定区(CDR)，所述互补决定区包含选自下列的氨基酸序列：SEQ IDNO：79-102、105-128和131-154。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至PD-L1的第二结合域并且包含三个或多个互补决定区(CDR)，所述互补决定区包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：79-102、105-128和131-154。
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47的第一结合域并且包含具有表1-3中所列的一个或多个(例如，1、2或3个)VH CDR的VH。在其它实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47的第一结合域并且包含具有表1-3中所列的一个或多个(例如，1、2或3个)VL CDR的VL。在其它实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47的第一结合域并且包含表1-3中所列的一个或多个(例如，1、2或3个)VH CDR和表1-3中所列的一个或多个VL CDR。因此，在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47的第一结合域并且包含具有以下中任一项所示的氨基酸序列的VH CDR1：SEQ ID NO：1、7、12、13、18、27、33、38、39、44、53、59、64、65和70。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47的第一结合域并且包含具有以下中任一项所示的氨基酸序列的VH CDR2：SEQ ID NO：2、8、14、19、24、28、34、40、45、50、54、60、66、71和76。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)结合至CD47的第一结合域并且包含具有以下中任一项所示的氨基酸序列的VH CDR3：SEQ ID NO：3、9、15、20、29、35、41、46、55、61、67和72。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47的第一结合域并且包含VH CDR1和/或VH CDR2和/或VH CDR3，其独立地选自如表1-3中所示的氨基酸序列中任一项所示的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47的第一结合域并且包含具有以下中任一项所示的氨基酸序列的VL CDR1：SEQ ID NO：4、10、16、21、30、36、42、47、56、62、68和73。在另一个实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47的第一结合域并且包含具有以下中任一项所示的氨基酸序列的VL CDR2：SEQID NO：5、11、22、31、37、48、57、63和74。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47的第一结合域并且包含具有以下中任一项所示的氨基酸序列的VL CDR3：SEQ ID NO：6、17、23、32、43、49、58、69和75。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47的第一结合域并且包含VL CDR1和/或VL CDR2和/或VL CDR3，其独立地选自如表1-3中所示的氨基酸序列中任一项所示的VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3。
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至PD-L1的第二结合域并且包含具有表4-6中所列的一个或多个(例如，1、2或3个)VH CDR的VH。在其它实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至PD-L1的第二结合域并且包含具有表4-6中所列的一个或多个(例如，1、2或3个)VL CDR的VL。在其它实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至PD-L1的第二结合域并且包含表4-6所列的一个或多个(例如，1、2或3个)VH CDR和表4-6所列的一个或多个VL CDR。因此，在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至PD-L1的第二结合域并且包含具有以下中任一项所示的氨基酸序列的VH CDR1：SEQ ID NO：79、85、90、91、96、105、11、116、117、122、131、137、142、143和148。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至PD-L1的第二结合域并且包含具有以下中任一项所示的氨基酸序列的VH CDR2：SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、44、149和154。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至PD-L1的第二结合域并且包含具有以下中任一项所示的氨基酸序列的VH CDR3：SEQ ID NO：81、87、93、98、107、113、119、124、133、139、145和150。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至PD-L1的第二结合域并且包含VH CDR1和/或VH CDR2和/或VH CDR3，其独立地选自如表4-6中所示的氨基酸序列中任一项所示的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至PD-L1的第二结合域并且包含具有以下中任一项所示的氨基酸序列的VL CDR1：SEQ ID NO：82、88、94、99、108、114、120、125、134、140、146和151。在另一个实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至PD-L1的第二结合域并且包含具有以下中任一项所示的氨基酸序列的VL CDR2：SEQ ID NO：83、89、100、109、115、126、135、141和152。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至PD-L1的第二结合域并且包含具有以下中任一项所示的氨基酸序列的VL CDR3：SEQ ID NO：84、95、101、110、121、127、136、147和153。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至PD-L1的第二结合域并且包含VL CDR1和/或VL CDR2和/或VL CDR3，其独立地选自如表4-6中所示的氨基酸序列中任一项所示的VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3。
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47的第一结合域并且包含重链可变(VH)区，其包含：(1)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR1：(i)SEQ ID NO：1、27或53、(ii)SEQ ID NO：7、33或59、(iii)SEQID NO：12、38或64、(iv)SEQ ID NO：13、39或65和(v)SEQ ID NO：18、44或70；(2)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR2：(i)SEQ ID NO：2、28或54、(ii)SEQ ID NO：8、34或60、(iii)SEQID NO：14、40或66、(iv)SEQ ID NO：19、45或71和(v)SEQ ID NO：24、50或76；和(3)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR3：(i)SEQ ID NO：3、29或55、(ii)SEQ ID NO：9、35或61、(iii)SEQ ID NO：15、41或67和(iv)SEQ ID NO：20、46或72；和/或轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR1：(i)SEQ ID NO：4、30或56、(ii)SEQ ID NO：10、36或62、(iii)SEQ ID NO：16、42或68和(iv)SEQ ID NO：21、47或73；(2)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR2：(i)SEQ ID NO：5、31或57、(ii)SEQ ID NO：11、37或63和(iii)SEQ ID NO：22、48或74；和(3)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR3：(i)SEQ ID NO：6、32或58、(ii)SEQ ID NO：17、43或69和(iii)SEQ ID NO：23、49或75。
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47的第一结合域并且包含重链可变(VH)区，其包含：(1)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR1：(i)SEQ ID NO：1、27或53、(ii)SEQ ID NO：7、33或59、(iii)SEQID NO：12、38或64、(iv)SEQ ID NO：13、39或65和(v)SEQ ID NO：18、44或70；(2)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR2：(i)SEQ ID NO：2、28或54、(ii)SEQ ID NO：8、34或60、(iii)SEQID NO：14、40或66、(iv)SEQ ID NO：19、45或71和(v)SEQ ID NO：24、50或76；和(3)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR3：(i)SEQ ID NO：3、29或55、(ii)SEQ ID NO：9、35或61、(iii)SEQ ID NO：15、41或67和(iv)SEQ ID NO：20、46或72。
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47的第一结合域并且包含轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR1：(i)SEQ ID NO：4、30或56、(ii)SEQ ID NO：10、36或62、(iii)SEQID NO：16、42或68和(iv)SEQ ID NO：21、47或73；(2)具有选自下列的氨基酸序列的VLCDR2：(i)SEQ ID NO：5、31或57、(ii)SEQ ID NO：11、37或63和(iii)SEQ ID NO：22、48或74；和(3)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR3：(i)SEQ ID NO：6、32或58、(ii)SEQ ID NO：17、43或69和(iii)SEQ ID NO：23、49或75。
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至PD-L1的第二结合域并且包含(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR1：(i)SEQ ID NO：79、105或131(ii)SEQ ID NO：85、111或137(iii)SEQ ID NO：90、116或142、(iv)SEQ ID NO：91、117或143(v)SEQ ID NO：96、122或148；(2)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR2：(i)SEQ ID NO：80、106或132、(ii)SEQ ID NO：86、112或138、(iii)SEQ ID NO：92、118或144、(iv)SEQ ID NO：97、123或149、(v)SEQ IDNO：102、128或159；和(3)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR3：(i)SEQ ID NO：81、107或133、(ii)SEQ ID NO：87、113或139、(iii)SEQ ID NO：93、119或145、(iv)SEQ ID NO：98、124或150；和/or(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR1：(i)SEQ ID NO：82、108或134、(ii)SEQ ID NO：88、114或140、(iii)SEQ ID NO：94、120或146、(iv)SEQ ID NO：99、125或151；(2)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR2：(i)SEQ ID NO：83、109或135、(ii)SEQ ID NO：89、115或141、(iii)SEQ ID NO：100、126或152；(3)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR3：(i)SEQ ID NO：84、110或136、(ii)SEQ ID NO：95、121或147、(iii)SEQ ID NO：101、127或153。
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至PD-L1的第二结合域并且包含重链可变(VH)区，其包含：(1)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR1：(i)SEQ ID NO：79、105或131(ii)SEQ ID NO：85、11、1或137(iii)SEQ ID NO：90、116或142、(iv)SEQ ID NO：91、117或143(v)SEQ ID NO：96、122或148；(2)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR2：(i)SEQ ID NO：80、106或132、(ii)SEQ ID NO：86、112或138、(iii)SEQ ID NO：92、118或144、(iv)SEQ ID NO：97、123或149、(v)SEQ ID NO：102、128或159；和(3)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR3：(i)SEQ ID NO：81、107或133、(ii)SEQ ID NO：87、113或139、(iii)SEQ ID NO：93、119或145、(iv)SEQ ID NO：98、124或150。
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至PD-L1的第二结合域并且包含轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR1：(i)SEQ ID NO：82、108或134、(ii)SEQ ID NO：88、114或140、(iii)SEQ ID NO：94、120或146、(iv)SEQ ID NO：99、125或151；(2)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR2：(i)SEQ ID NO：83、109或135、(ii)SEQ ID NO：89、115或141、(iii)SEQ IDNO：100、126或152；(3)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR3：(i)SEQ ID NO：84、110或136、(ii)SEQ ID NO：95、121或147、(iii)SEQ ID NO：101、127或153。
本文还描述了多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，其包含结合至CD47的第一结合域并且包含表1-3中所列的一个或多个(例如，1、2或3个)VH CDR和一个或多个(例如，1、2或3个)VL CDR。具体地，本文描述了多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，其包含：VH CDR1(SEQ ID NO：1、7、12、13、18、27、33、38、39、44、53、59、64、65和70)和VL CDR1(SEQ ID NO：4、10、16、21、30、36、42、47、56、62、68和73)；VH CDR1(SEQ IDNO：1、7、12、13、18、27、33、38、39、44、53、59、64、65和70)和VL CDR2(SEQ ID NO：5、11、22、31、37、48、57、63和74)；VH CDR1(SEQ ID NO：1、7、12、13、18、27、33、38、39、44、53、59、64、65和70)和VL CDR3(SEQ ID NO：6、17、23、32、43、49、58、69和75)；VH CDR2(SEQ ID NO：2、8、14、19、24、28、34、40、45、50、54、60、66、71和76)和VL CDR1(SEQ ID NO：4、10、16、21、30、36、42、47、56、62、68和73)；VH CDR2(SEQ ID NO：2、8、14、19、24、28、34、40、45、50、54、60、66、71和76)和VL CDR2(SEQ ID NO：5、11、22、31、37、48、57、63和74)；VH CDR2(SEQ ID NO：2、8、14、19、24、28、34、40、45、50、54、60、66、71和76)和VL CDR3(SEQ ID NO：6、17、23、32、43、49、58、69和75)；VH CDR3(SEQ ID NO：3、9、15、20、29、35、41、46、55、61、67和72)和VL CDR1(SEQID NO：4、10、16、21、30、36、42、47、56、62、68和73)；VH CDR3(SEQ ID NO：3、9、15、20、29、35、41、46、55、61、67和72)和VL CDR2(SEQ ID NO：5、11、22、31、37、48、57、63和74)；VH CDR3(SEQID NO：3、9、15、20、29、35、41、46、55、61、67和72)和VL CDR3(SEQ ID NO：6、17、23、32、43、49、58、69和75)；VH CDR1(SEQ ID NO：1、7、12、13、18、27、33、38、39、44、53、59、64、65和70)、VH CDR2(SEQ ID NO：2、8、14、19、24、28、34、40、45、50、54、60、66、71和76)和VL CDR1(SEQ ID NO：4、10、16、21、30、36、42、47、56、62、68和73)；VH CDR1(SEQ ID NO：1、7、12、13、18、27、33、38、39、44、53、59、64、65和70)、VH CDR2(SEQ ID NO：2、8、14、19、24、28、34、40、45、50、54、60、66、71和76)和VL CDR2(SEQ ID NO：5、11、22、31、37、48、57、63和74)；VH CDR1(SEQ ID NO：1、7、12、13、18、27、33、38、39、44、53、59、64、65和70)、VH CDR2(SEQ ID NO：2、8、14、19、24、28、34、40、45、50、54、60、66、71和76)和VL CDR3(SEQ ID NO：6、17、23、32、43、49、58、69和75)；VH CDR2(SEQ ID NO：2、8、14、19、24、28、34、40、45、50、54、60、66、71和76)、VH CDR3(SEQ ID NO：3、9、15、20、29、35、41、46、55、61、67和72)和VL CDR1(SEQ ID NO：4、10、16、21、30、36、42、47、56、62、68和73)、VH CDR2(SEQ ID NO：2、8、14、19、24、28、34、40、45、50、54、60、66、71和76)、VH CDR3(SEQ ID NO：3、9、15、20、29、35、41、46、55、61、67和72)和VL CDR2(SEQ ID NO：5、11、22、31、37、48、57、63和74)；VH CDR2(SEQ ID NO：2、8、14、19、24、28、34、40、45、50、54、60、66、71和76)、VH CDR3(SEQ ID NO：3、9、15、20、29、35、41、46、55、61、67和72)和VL CDR3(SEQ ID NO：6、17、23、32、43、49、58、69和75)；VH CDR1(SEQ IDNO：1、7、12、13、18、27、33、38、39、44、53、59、64、65和70)、VL CDR1(SEQ ID NO：4、10、16、21、30、36、42、47、56、62、68和73)和VL CDR2(SEQ ID NO：5、11、22、31、37、48、57、63和74)；VHCDR1(SEQ ID NO：1、7、12、13、18、27、33、38、39、44、53、59、64、65和70)、VL CDR1(SEQ IDNO：4、10、16、21、30、36、42、47、56、62、68和73)和VL CDR3(SEQ ID NO：6、17、23、32、43、49、58、69和75)；VH CDR1(SEQID NO：1、7、12、13、18、27、33、38、39、44、53、59、64、65和70)、VLCDR2(SEQ ID NO：5、11、22、31、37、48、57、63和74)和VL CDR3(SEQ ID NO：6、17、23、32、43、49、58、69和75)；VH CDR2(SEQ ID NO：2、8、14、19、24、28、34、40、45、50、54、60、66、71和76)、VL CDR1(SEQ ID NO：4、10、16、21、30、36、42、47、56、62、68和73)和VL CDR2(SEQ ID NO：5、11、22、31、37、48、57、63和74)；VH CDR2(SEQ ID NO：2、8、14、19、24、28、34、40、45、50、54、60、66、71和76)、VL CDR1(SEQ ID NO：4、10、16、21、30、36、42、47、56、62、68和73)和VL CDR3(SEQ ID NO：6、17、23、32、43、49、58、69和75)；VH CDR2(SEQ ID NO：2、8、14、19、24、28、34、40、45、50、54、60、66、71和76)、VL CDR2(SEQ ID NO：5、11、22、31、37、48、57、63和74)和VLCDR3(SEQ ID NO：6、17、23、32、43、49、58、69和75)；VH CDR3(SEQ ID NO：3、9、15、20、29、35、41、46、55、61、67和72)、VL CDR1(SEQ ID NO：4、10、16、21、30、36、42、47、56、62、68和73)和VL CDR2(SEQ ID NO：5、11、22、31、37、48、57、63和74)；VH CDR3(SEQ ID NO：3、9、15、20、29、35、41、46、55、61、67和72)、VL CDR1(SEQ ID NO：4、10、16、21、30、36、42、47、56、62、68和73)和VL CDR3(SEQ ID NO：6、17、23、32、43、49、58、69和75)；VH CDR3(SEQ ID NO：3、9、15、20、29、35、41、46、55、61、67和72)、VL CDR2(SEQ ID NO：5、11、22、31、37、48、57、63和74)和VLCDR3(SEQ ID NO：6、17、23、32、43、49、58、69和75)；VH CDR1(SEQ ID NO：1、7、12、13、18、27、33、38、39、44、53、59、64、65和70)、VH CDR2(SEQ ID NO：2、8、14、19、24、28、34、40、45、50、54、60、66、71和76)、VH CDR3(SEQ ID NO：3、9、15、20、29、35、41、46、55、61、67和72)和VLCDR1(SEQ ID NO：4、10、16、21、30、36、42、47、56、62、68和73)；VH CDR1(SEQ ID NO：1、7、12、13、18、27、33、38、39、44、53、59、64、65和70)、VH CDR2(SEQ ID NO：2、8、14、19、24、28、34、40、45、50、54、60、66、71和76)、VH CDR3(SEQ ID NO：3、9、15、20、29、35、41、46、55、61、67和72)和VL CDR2(SEQ ID NO：5、11、22、31、37、48、57、63和74)；VH CDR1(SEQ ID NO：1、7、12、13、18、27、33、38、39、44、53、59、64、65和70)、VH CDR2(SEQ ID NO：2、8、14、19、24、28、34、40、45、50、54、60、66、71和76)、VH CDR3(SEQ ID NO：3、9、15、20、29、35、41、46、55、61、67和72)和VL CDR3(SEQ ID NO：6、17、23、32、43、49、58、69和75)；VH CDR1(SEQ ID NO：1、7、12、13、18、27、33、38、39、44、53、59、64、65和70)、VH CDR2(SEQ ID NO：2、8、14、19、24、28、34、40、45、50、54、60、66、71和76)、VL CDR1(SEQ ID NO：4、10、16、21、30、36、42、47、56、62、68和73)和VL CDR2(SEQ ID NO：5、11、22、31、37、48、57、63和74)；VH CDR1(SEQ ID NO：1、7、12、13、18、27、33、38、39、44、53、59、64、65和70)、VH CDR2(SEQ ID NO：2、8、14、19、24、28、34、40、45、50、54、60、66、71和76)、VL CDR1(SEQ ID NO：4、10、16、21、30、36、42、47、56、62、68和73)和VL CDR3(SEQ ID NO：6、17、23、32、43、49、58、69和75)；VH CDR1(SEQ ID NO：1、7、12、13、18、27、33、38、39、44、53、59、64、65和70)、VH CDR2(SEQ ID NO：2、8、14、19、24、28、34、40、45、50、54、60、66、71和76)、VL CDR2(SEQ ID NO：5、11、22、31、37、48、57、63和74)和VLCDR3(SEQ ID NO：6、17、23、32、43、49、58、69和75)；VH CDR1(SEQ ID NO：1、7、12、13、18、27、33、38、39、44、53、59、64、65和70)、VH CDR3(SEQ ID NO：3、9、15、20、29、35、41、46、55、61、67和72)、VL CDR1(SEQ ID 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NO：1、7、12、13、18、27、33、38、39、44、53、59、64、65和70)、VH CDR2(SEQ ID NO：2、8、14、19、24、28、34、40、45、50、54、60、66、71和76)、VL CDR1(SEQ ID NO：4、10、16、21、30、36、42、47、56、62、68和73)、VLCDR2(SEQ ID NO：5、11、22、31、37、48、57、63和74)和VL CDR3(SEQ ID NO：6、17、23、32、43、49、58、69和75)；VH CDR1(SEQ ID NO：1、7、12、13、18、27、33、38、39、44、53、59、64、65和70)、VH CDR3(SEQ ID NO：3、9、15、20、29、35、41、46、55、61、67和72)、VL CDR1(SEQ ID NO：4、10、16、21、30、36、42、47、56、62、68和73)、VL CDR2(SEQ ID NO：5、11、22、31、37、48、57、63和74)和VL CDR3(SEQ ID NO：6、17、23、32、43、49、58、69和75)；VH CDR2(SEQ ID NO：2、8、14、19、24、28、34、40、45、50、54、60、66、71和76)、VH CDR3(SEQ ID NO：3、9、15、20、29、35、41、46、55、61、67和72)、VL CDR1(SEQ ID NO：4、10、16、21、30、36、42、47、56、62、68和73)、VL CDR2(SEQ ID NO：5、11、22、31、37、48、57、63和74)，和VL CDR3(SEQ ID NO：6、17、23、32、43、49、58、69和75)；或者其在表1-3中所列的VH CDRs(SEQ ID NO：1、7、12、13、18、27、33、38、39、44、53、59、64、65、70、2、8、14、19、24、28、34、40、45、50、54、60、66、71、76、3、9、15、20、29、35、41、46、55、61、67和72)和VL CDRs(SEQ ID NO：4、10、16、21、30、36、42、47、56、62、68、73、5、11、22、31、37、48、57、63、74、6、17、23、32、43、49、58、69和75)的任意组合。
本文还描述了多重特异性结合剂(例如，抗体)，其包含结合至PD-L1的第二结合域并且包含表4-6所列的一个或多个(例如，1、2或3个)VH CDR和一个或多个(例如，1、2或3个)VL CDR。具体地，本文描述了多重特异性结合剂(例如，抗体)，其包含：VH CDR1(SEQ ID NO：79、85、90、91、96、105、11、116、117、122、131、137、142、143或148)和VL CDR1(SEQ ID NO：82、88、94、99、108、114、120、125、134、140、146或151)；VH CDR1(SEQ ID NO：79、85、90、91、96、105、11、116、117、122、131、137、142、143或148)和VL CDR2(SEQ ID NO：83、89、100、109、115、126、135、141或152)；VH CDR1(SEQ ID NO：79、85、90、91、96、105、11、116、117、122、131、137、142、143或148)和VL CDR3(SEQ ID NO：84、95、101、110、121、127、136、147或153)；VH CDR2(SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)和VL CDR1(SEQ ID NO：82、88、94、99、108、114、120、125、134、140、146或151)；VH CDR2(SEQID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)和VL CDR2(SEQID NO：83、89、100、109、115、126、135、141或152)；VH CDR2(SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)和VL CDR3(SEQ ID NO：84、95、101、110、121、127、136、147或153)；VH CDR3(SEQ ID NO：81、87、93、98、107、113、119、124、133、139、145或150)和VL CDR1(SEQ ID NO：82、88、94、99、108、114、120、125、134、140、146或151)；VHCDR3(SEQ ID NO：81、87、93、98、107、113、119、124、133、139、145或150)和VL CDR2(SEQ IDNO：83、89、100、109、115、126、135、141或152)；VH CDR3(SEQ ID NO：81、87、93、98、107、113、119、124、133、139、145或150)和VL CDR3(SEQ ID NO：84、95、101、110、121、127、136、147或153)；VH CDR1(SEQ ID NO：79、85、90、91、96、105、11、116、117、122、131、137、142、143或148)、VH CDR2(SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)和VL CDR1(SEQ ID NO：82、88、94、99、108、114、120、125、134、140、146或151)；VH CDR1(SEQ ID NO：79、85、90、91、96、105、11、116、117、122、131、137、142、143或148)、VH CDR2(SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)和VL CDR2(SEQ ID NO：83、89、100、109、115、126、135、141或152)；VH CDR1(SEQ ID NO：79、85、90、91、96、105、11、116、117、122、131、137、142、143或148)、VH CDR2(SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)和VL CDR3(SEQ ID NO：84、95、101、110、121、127、136、147或153)；VH CDR2(SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)、VH CDR3(SEQ ID 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NO：83、89、100、109、115、126、135、141或152)和VLCDR3(SEQ ID NO：84、95、101、110、121、127、136、147或153)；VH CDR2(SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)、VL CDR1(SEQ ID NO：82、88、94、99、108、114、120、125、134、140、146或151)和VL CDR2(SEQ ID NO：83、89、100、109、115、126、135、141或152)；VH CDR2(SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)、VL CDR1(SEQ ID NO：82、88、94、99、108、114、120、125、134、140、146或151)和VL CDR3(SEQ ID NO：84、95、101、110、121、127、136、147或153)；VH CDR2(SEQ IDNO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)、VL CDR2(SEQ IDNO：83、89、100、109、115、126、135、141或152)和VL CDR3(SEQ ID NO：84、95、101、110、121、127、136、147或153)；VH CDR3(SEQ ID NO：81、87、93、98、107、113、119、124、133、139、145或150)、VL CDR1(SEQ ID NO：82、88、94、99、108、114、120、125、134、140、146或151)和VL CDR2(SEQ ID NO：83、89、100、109、115、126、135、141或152)；VH CDR3(SEQ ID NO：81、87、93、98、107、113、119、124、133、139、145或150)、VL CDR1(SEQ ID NO：82、88、94、99、108、114、120、125、134、140、146或151)和VL CDR3(SEQ ID NO：84、95、101、110、121、127、136、147或153)；VH CDR3(SEQ ID NO：81、87、93、98、107、113、119、124、133、139、145或150)、VL CDR2(SEQID NO：83、89、100、109、115、126、135、141或152)和VL CDR3(SEQ ID NO：84、95、101、110、121、127、136、147或153)；VH CDR1(SEQ ID NO：79、85、90、91、96、105、11、116、117、122、131、137、142、143或148)、VH CDR2(SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)、VH CDR3(SEQ ID NO：81、87、93、98、107、113、119、124、133、139、145或150)和VL CDR1(SEQ ID NO：82、88、94、99、108、114、120、125、134、140、146或151)；VHCDR1(SEQ ID NO：79、85、90、91、96、105、11、116、117、122、131、137、142、143或148)、VHCDR2(SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)、VHCDR3(SEQ ID NO：81、87、93、98、107、113、119、124、133、139、145或150)和VL CDR2(SEQ IDNO：83、89、100、109、115、126、135、141或152)；VH CDR1(SEQ ID NO：79、85、90、91、96、105、11、116、117、122、131、137、142、143或148)、VH CDR2(SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)、VH CDR3(SEQ ID NO：81、87、93、98、107、113、119、124、133、139、145或150)和VL CDR3(SEQ ID NO：84、95、101、110、121、127、136、147或153)；VH CDR1(SEQ ID NO：79、85、90、91、96、105、11、116、117、122、131、137、142、143或148)、VH CDR2(SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)、VL CDR1(SEQ ID NO：82、88、94、99、108、114、120、125、134、140、146或151)和VL CDR2(SEQ ID NO：83、89、100、109、115、126、135、141或152)；VH CDR1(SEQ ID NO：79、85、90、91、96、105、11、116、117、122、131、137、142、143或148)、VH CDR2(SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)、VL CDR1(SEQ ID NO：82、88、94、99、108、114、120、125、134、140、146或151)和VL CDR3(SEQ ID NO：84、95、101、110、121、127、136、147或153)；VH CDR1(SEQ ID NO：79、85、90、91、96、105、11、116、117、122、131、137、142、143或148)、VH CDR2(SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)、VL CDR2(SEQ ID NO：83、89、100、109、115、126、135、141或152)和VL CDR3(SEQ ID NO：84、95、101、110、121、127、136、147或153)；VH CDR1(SEQ ID NO：79、85、90、91、96、105、11、116、117、122、131、137、142、143或148)、VH CDR3(SEQ ID NO：81、87、93、98、107、113、119、124、133、139、145或150)、VL CDR1(SEQ ID NO：82、88、94、99、108、114、120、125、134、140、146或151)和VL CDR2(SEQ ID NO：83、89、100、109、115、126、135、141或152)；VH CDR1(SEQ ID NO：79、85、90、91、96、105、11、116、117、122、131、137、142、143或148)、VHCDR3(SEQ ID NO：81、87、93、98、107、113、119、124、133、139、145或150)、VL CDR1(SEQ IDNO：82、88、94、99、108、114、120、125、134、140、146或151)和VL CDR3(SEQ ID NO：84、95、101、110、121、127、136、147或153)；VH CDR1(SEQ ID NO：79、85、90、91、96、105、11、116、117、122、131、137、142、143或148)、VH CDR3(SEQ ID NO：81、87、93、98、107、113、119、124、133、139、145或150)、VL CDR2(SEQ ID NO：83、89、100、109、115、126、135、141或152)和VLCDR3(SEQ ID NO：84、95、101、110、121、127、136、147或153)；VH CDR2(SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)、VH CDR3(SEQ ID NO：81、87、93、98、107、113、119、124、133、139、145或150)、VL CDR1(SEQ ID NO：82、88、94、99、108、114、120、125、134、140、146或151)和VL CDR2(SEQ ID NO：83、89、100、109、115、126、135、141或152)；VH CDR2(SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)、VH CDR3(SEQ ID NO：81、87、93、98、107、113、119、124、133、139、145或150)、VLCDR1(SEQ ID NO：82、88、94、99、108、114、120、125、134、140、146或151)和VL CDR3(SEQ IDNO：84、95、101、110、121、127、136、147或153)；VH CDR2(SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)、VH CDR3(SEQ ID NO：81、87、93、98、107、113、119、124、133、139、145或150)、VL CDR2(SEQ ID NO：83、89、100、109、115、126、135、141或152)和VL CDR3(SEQ ID NO：84、95、101、110、121、127、136、147或153)；VH CDR1(SEQ IDNO：79、85、90、91、96、105、11、116、117、122、131、137、142、143或148)、VH CDR2(SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)、VH CDR3(SEQ ID NO：81、87、93、98、107、113、119、124、133、139、145或150)、VL CDR1(SEQ ID NO：82、88、94、99、108、114、120、125、134、140、146或151)和VL CDR2(SEQ ID NO：83、89、100、109、115、126、135、141或152)；VH CDR1(SEQ ID NO：79、85、90、91、96、105、11、116、117、122、131、137、142、143或148)、VH CDR2(SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)、VH CDR3(SEQ ID NO：81、87、93、98、107、113、119、124、133、139、145或150)、VL CDR1(SEQ ID NO：82、88、94、99、108、114、120、125、134、140、146或151)和VL CDR3(SEQ ID NO：84、95、101、110、121、127、136、147或153)；VH CDR1(SEQ ID NO：79、85、90、91、96、105、11、116、117、122、131、137、142、143或148)、VH CDR2(SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)、VH CDR3(SEQ ID NO：81、87、93、98、107、113、119、124、133、139、145或150)、VL CDR2(SEQ ID NO：83、89、100、109、115、126、135、141或152)和VL CDR3(SEQ ID NO：84、95、101、110、121、127、136、147或153)；VH CDR1(SEQ ID NO：79、85、90、91、96、105、11、116、117、122、131、137、142、143或148)、VH CDR2(SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)、VL CDR1(SEQ ID NO：82、88、94、99、108、114、120、125、134、140、146或151)、VL CDR2(SEQ ID NO：83、89、100、109、115、126、135、141或152)，和VL CDR3(SEQ ID NO：84、95、101、110、121、127、136、147或153)；VH CDR1(SEQ ID NO：79、85、90、91、96、105、11、116、117、122、131、137、142、143或148)、VH CDR3(SEQ ID NO：81、87、93、98、107、113、119、124、133、139、145或150)、VL CDR1(SEQ ID NO：82、88、94、99、108、114、120、125、134、140、146或151)、VL CDR2(SEQ ID NO：83、89、100、109、115、126、135、141或152)，和VL CDR3(SEQ ID NO：84、95、101、110、121、127、136、147或153)；VH CDR2(SEQ ID NO：80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149或154)、VH CDR3(SEQ ID NO：81、87、93、98、107、113、119、124、133、139、145或150)、VL CDR1(SEQ ID NO：82、88、94、99、108、114、120、125、134、140、146或151)、VL CDR2(SEQ ID NO：83、89、100、109、115、126、135、141或152)，和VL CDR3(SEQ IDNO：84、95、101、110、121、127、136、147或153)；或其在表4-6中所列的HCDRs(SEQ ID NO：79、85、90、91、96、105、11、116、117、122、131、137、142、143、148、80、86、92、97、102、106、112、118、123、128、132、138、144、149、154、81、87、93、98、107、113、119、124、133、139、145或150)和VL CDRs(SEQ ID NO：82、88、94、99、108、114、120、125、134、140、146、151、83、89、100、109、115、126、135、141、152、84、95、101、110、121、127、136、147或153)的任意组合。
在一些实施方式中，本文描述了具有结合至CD47的第一结合域的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR1：(i)SEQ ID NO：1、27或53、(ii)SEQ ID NO：7、33或59、(iii)SEQ IDNO：12、38或64、(iv)SEQ ID NO：13、39或65，和(v)SEQ ID NO：18、44或70；(2)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR2：(i)SEQ ID NO：2、28或54、(ii)SEQ ID NO：8、34或60、(iii)SEQID NO：14、40或66、(iv)SEQ ID NO：19、45或71，和(v)SEQ ID NO：24、50或76；和(3)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR3：(i)SEQ ID NO：3、29或55、(ii)SEQ ID NO：9、35或61、(iii)SEQ ID NO：15、41或67，和(iv)SEQ ID NO：20、46或72；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR1：(i)SEQ ID NO：4、30或56、(ii)SEQ ID NO：10、36或62、(iii)SEQ ID NO：16、42或68，和(iv)SEQ ID NO：21、47或73；(2)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR2：(i)SEQ ID NO：5、31或57、(ii)SEQ ID NO：11、37或63，和(iii)SEQ ID NO：22、48或74；和(3)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR3：(i)SEQ ID NO：6、32或58、(ii)SEQ ID NO：17、43或69，和(iii)SEQ ID NO：23、49或75。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体或片段是双重特异性抗体。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR1：(i)SEQ ID NO：79、105或131、(ii)SEQID NO：85、111或137、(iii)SEQ ID NO：90、116或142、(iv)SEQ ID NO：91、117或143，和(v)SEQ ID NO：96、122或148；(2)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR2：(i)SEQ ID NO：80、106或132、(ii)SEQ ID NO：86、112或138、(iii)SEQ ID NO：92、118或144、(iv)SEQ ID NO：97、123或149，和(v)SEQ ID NO：102、128或159；和(3)具有选自下列的氨基酸序列的VHCDR3：(i)SEQ ID NO：81、107或133、(ii)SEQ ID NO：87、113或139、(iii)SEQ ID NO：93、119或145、(iv)SEQ ID NO：98、124或150；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR1：(i)SEQ ID NO：82、108或134、(ii)SEQ ID NO：88、114或140、(iii)SEQ ID NO：94、120或146，和(iv)SEQ ID NO：99、125或151；(2)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR2：(i)SEQ ID NO：83、109或135、(ii)SEQ ID NO：89、115或141，和(iii)SEQ IDNO：100、126或152；和(3)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR3：(i)SEQ ID NO：84、110或136、(ii)SEQ ID NO：95、121或147、(iii)SEQ ID NO：101、127或153。在一些实施方式中，本文描述了具有结合至CD47的第一结合域的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含重链可变(VH)区，其包含：(1)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR1：(i)SEQ ID NO：1、27或53、(ii)SEQ ID NO：7、33或59、(iii)SEQ ID NO：12、38或64、(iv)SEQ ID NO：13、39或65，和(v)SEQ ID NO：18、44或70；(2)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR2：(i)SEQ IDNO：2、28或54、(ii)SEQ ID NO：8、34或60、(iii)SEQ ID NO：14、40或66、(iv)SEQ ID NO：19、45或71，和(v)SEQ ID NO：24、50或76；和(3)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR3：(i)SEQID NO：3、29或55、(ii)SEQ ID NO：9、35或61、(iii)SEQ ID NO：15、41或67，和(iv)SEQ IDNO：20、46或72。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体或其片段是双重特异性抗体。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有选自下列的氨基酸序列的VHCDR1：(i)SEQ ID NO：79、105或131、(ii)SEQ ID NO：85、111或137、(iii)SEQ ID NO：90、116或142、(iv)SEQ ID NO：91、117或143，和(v)SEQ ID NO：96、122或148；(2)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR2：(i)SEQ ID NO：80、106或132、(ii)SEQ ID NO：86、112或138、(iii)SEQ ID NO：92、118或144、(iv)SEQ ID NO：97、123或149，和(v)SEQ ID NO：102、128或159；和(3)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR3：(i)SEQ ID NO：81、107或133、(ii)SEQ IDNO：87、113或139、(iii)SEQ ID NO：93、119或145，和(iv)SEQ ID NO：98、124或150。
在一些实施方式中，本文描述了具有结合至CD47的第一结合域的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR1：(i)SEQ ID NO：4、30或56、(ii)SEQ ID NO：10、36或62、(iii)SEQ ID NO：16、42或68，和(iv)SEQ ID NO：21、47或73；(2)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR2：(i)SEQ ID NO：5、31或57、(ii)SEQ ID NO：11、37或63，和(iii)SEQ ID NO：22、48或74；(3)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR3：(i)SEQ ID NO：6、32或58、(ii)SEQ ID NO：17、43或69，和(iii)SEQ ID NO：23、49或75。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体或其片段是双重特异性抗体。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR1：(i)SEQ ID NO：82、108或134、(ii)SEQ ID NO：88、114或140、(iii)SEQID NO：94、120或146，和(iv)SEQ ID NO：99、125或151；(2)具有选自下列的氨基酸序列的VLCDR2：(i)SEQ ID NO：83、109或135、(ii)SEQ ID NO：89、115或141，和(iii)SEQ ID NO：100、126或152；和(3)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR3：(i)SEQ ID NO：84、110或136、(ii)SEQ ID NO：95、121或147、(iii)SEQ ID NO：101、127或153。
在一些实施方式中，本文描述了具有结合至CD47的第一结合域的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含全部3条重链互补决定区(CDR)或者全部3个轻链CDR，其来自：表示为C40的抗体，其包含作为SEQ ID NO：25的VH序列和作为SEQ ID NO：26的VL序列；表示为C56的抗体，其包含作为SEQ ID NO：51的VH序列和作为SEQ ID NO：52的VL序列；或者表示为C59的抗体，其包含作为SEQ ID NO：77的VH序列和作为SEQ ID NO：78的VL序列。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体是双重特异性抗体。在一些实施方式中，所述第二结合域包含全部3个重链互补决定区(CDR)或者全部3个轻链CDR，其来自：表示为P22的抗体，其包含作为SEQID NO：103的VH序列和作为SEQ ID NO：104的VL序列；表示为P24的抗体，其包含作为SEQ IDNO：129的VH序列和作为SEQ ID NO：130的VL序列；表示为P31.2的抗体，其包含作为SEQ IDNO：155的VH序列和作为SEQ ID NO：156的VL序列。
在一些实施方式中，本文描述了具有结合至CD47的第一结合域的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含来自表示为C40的抗体的全部3个重链CDR和/或全部3个轻链CDR。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体或其片段是双重特异性抗体。在一些实施方式中，所述第二结合域包含来自表示为P22的抗体的全部3个重链CDR和全部3个轻链CDR。在一些实施方式中，所述第二结合域包含来自表示为P24的抗体的全部3个重链CDR和全部3个轻链CDR。在一些实施方式中，所述第二结合域包含来自表示为P31.2的抗体的全部3个重链CDR和全部3个轻链CDR。
在一些实施方式中，本文描述了具有结合至CD47的第一结合域的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含来自表示为C56的抗体的全部3个重链CDR和全部3个轻链CDR。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体或其片段是双重特异性抗体。在一些实施方式中，所述第二结合域包含来自表示为P22的抗体的全部3个重链CDR和全部3个轻链CDR。在一些实施方式中，所述第二结合域包含来自表示为P24的抗体的全部3个重链CDR和全部3个轻链CDR。在一些实施方式中，所述第二结合域包含来自表示为P31.2的抗体的全部3个重链CDR和全部3个轻链CDR。
在一些实施方式中，本文描述了具有结合至CD47的第一结合域的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含来自表示为C59的抗体的全部3个重链CDR和全部3个轻链CDR。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体或其片段是双重特异性抗体。在一些实施方式中，所述第二结合域包含来自表示为P22的抗体的全部3个重链CDR和全部3个轻链CDR。在一些实施方式中，所述第二结合域包含来自表示为P24的抗体的全部3个重链CDR和全部3个轻链CDR。在一些实施方式中，所述第二结合域包含来自表示为P31.2的抗体的全部3个重链CDR和全部3个轻链CDR。
在一些实施方式中，本文描述了具有结合至CD47的第一结合域的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：表1-3中所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3氨基酸序列；或者(b)轻链可变(VL)区，其包含表1-3中所示的VLCDR1、VLCDR2和VL CDR3氨基酸序列。在一些实施方式中，所述第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：表1-3中所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3氨基酸序列；和(b)轻链可变(VL)区，其包含表1-3中所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体或其片段是双重特异性抗体。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：表4-6中所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3氨基酸序列；和/或(b)轻链可变(VL)区，其包含表4-6中所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列。在一些实施方式中，所述第一结合域包含重链可变(VH)区，其包含：表1-3中所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体或其片段是双重特异性抗体。在一些实施方式中，所述第二结合域包含重链可变(VH)区，其包含：表4-6中所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3氨基酸序列。在一些实施方式中，所述第一结合域包含含有表1-3中所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列的轻链可变(VL)区。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体或其片段是双重特异性抗体。在一些实施方式中，所述第二结合域包含含有表4-6中所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列的轻链可变(VL)区。
在一些实施方式中，本文描述了具有结合至CD47的第一结合域的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR1：SEQ ID NO：1、7、12、13和18；(2)具有选自下列的氨基酸序列的VHCDR2：SEQ ID NO：2、8、14、19和24；和(3)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR3：SEQ IDNO：3、9、15和20；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR1：SEQ ID NO：4、10、16和21；(2)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR2：SEQ ID NO：5、11和22；和(3)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR3：SEQ ID NO：6、17和23。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。在一些实施方式中，所述第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，其中所述第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的VLCDR1；(2)具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：85所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：86所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：87所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：88所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：89所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：112所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：115所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：137所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：138所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：139所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：140所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：141所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的VHCDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：90所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：116所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ IDNO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：142所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ IDNO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQID NO：11所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列的VLCDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQID NO：91所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列的VHCDR2；和(3)具有SEQ ID NO：93所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：94所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：89所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：95所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：117所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：118所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ IDNO：119所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：120所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：115所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：128所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：143所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：144所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：145所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：146所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：141所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ IDNO：147所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，第一结合域包含(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ IDNO：22所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ IDNO：96所示的氨基酸序列的VH CDRl；(2)具有SEQ ID NO：97所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：98所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：99所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：100所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：101所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：122所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：123所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：124所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：125所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：126所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：127所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：149所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：150所示的氨基酸序列的VHCDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：151所示的氨基酸序列的VLCDR1；(2)具有SEQ ID NO：152所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：153所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：102所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ IDNO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：128所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ IDNO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ IDNO：154所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VHCDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，以上所描述的多重特异性抗体或其片段是双重特异性抗体。
在一些实施方式中，本文描述了具有结合至CD47的第一结合域的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR1：SEQ ID NO：27、33、38、39和44；(2)具有选自下列的氨基酸序列的VHCDR2：SEQ ID NO：28、34、40、45和50；和(3)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR3：SEQ IDNO：29、35、41和46；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有选自下列的氨基酸序列的VLCDR1：SEQ ID NO：30、36、42和47；(2)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR2：SEQ ID NO：31、37和48和(3)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR3：SEQ ID NO：32、43和49。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。在一些实施方式中，所述第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ IDNO：32所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ IDNO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列的VLCDR1；(2)具有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列的VLCDR1；(2)具有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列的VLCDR1；(2)具有SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列的VLCDR1；(2)具有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，以上所描述的多重特异性抗体或其片段是双重特异性抗体。
在一些实施方式中，本文描述了具有结合至CD47的第一结合域的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR1：SEQ ID NO：53、59、64、65和70；(2)具有选自下列的氨基酸序列的VHCDR2：SEQ ID NO：54、60、66、71和76；和(3)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR3：SEQ IDNO：55、61、67和72；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有选自下列的氨基酸序列的VLCDR1：SEQ ID NO：56、62、68和73；(2)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR2：SEQ ID NO：57、63和74；和(3)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR3：SEQ ID NO：58、69和75。在一些实施方式中，所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。在一些实施方式中，所述第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ IDNO：58所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ IDNO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDRl；(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQID NO：54所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列的VHCDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VLCDR2；和(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VHCDR1；(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ IDNO：66所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VHCDR2；和(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ IDNO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ IDNO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：73所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：74所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VHCDR2；和(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ IDNO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；并且在一些实施方式中，所述第一结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：76所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ IDNO：55所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VLCDR1；(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ IDNO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VLCDR3。在一些实施方式中，所述第二结合域包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有SEQID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VHCDR2；和(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方式中，以上所描述的多重特异性抗体或其片段是双重特异性抗体。
在一些实施方式中，本文描述了包含本文所描述的VH区和/或VL区的多重特异性抗体，其还包含人框架序列。在一些实施方式中，所述VH区和/或VL区还包含框架1(FR1)、框架2(FR2)、框架3(FR3)和/或框架4(FR4)序列。
在一些实施方式中，本文所述的多重特异性抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，所述单克隆抗体是人源化抗体、人抗体或嵌合抗体。在一些实施方式中，本文所述的多重特异性抗体是Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、scFv、(scFv)2、单链抗体分子、双重可变区抗体、单可变区抗体、线性抗体、V区或者由抗体片段形成的多重特异性抗体。在一些实施方式中，本文所述的多重特异性抗体是重组抗体，其任选地是人源化、人或嵌合抗体。
在一些实施方式中，本文所公开的结合至CD47的第一结合域的CDR包括来源于相关抗体组(参见，例如，表1-3)的共有序列。如本文所描述的，“共有序列”是指具有在一些序列中常见的保守氨基酸和在给定氨基酸序列内改变的可变氨基酸的氨基酸序列。所提供的CDR共有序列包括对应于CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和/或CDRL3的CDR。多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)的结合至CD47的第一结合域的CDR的共有序列如图16A和16B所示。因此，在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至CD47的第一结合域并且包含(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有氨基酸序列GFTFX1X2YYIH(SEQ ID NO：194)的VH CDR1，其中X1和X2分别独立地为天然存在的氨基酸；(2)具有X1IDX2X3X4X5X6TX7YADSVKG(SEQ ID NO：195)所示的氨基酸序列的VHCDR2，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7分别独立地为天然存在的氨基酸；和(3)具有GGX1X2AX3DY(SEQ ID NO：196)所示的氨基酸序列的VH CDR3，其中X1、X2和X3分别独立地为天然存在的氨基酸，和/或(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有氨基酸序列RASQSVSSAVA(SEQ ID NO：197)的VL CDR1；(2)具有氨基酸序列SASSLYS(SEQ ID NO：198)的VL CDR2；和(3)具有氨基酸序列QQX1X2X3X4LX5T(SEQ ID NO：199)的VL CDR3，其中X1、X2、X3、X4和X5分别独立地为天然存在的氨基酸。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂的VH CDR1具有GFTFX1X2YYIH(SEQ ID NO：216)所示的氨基酸序列，其中X1为S或T，并且X2为Y或S。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂的VH CDR2具有X1IDX2X3X4X5X6TX7YADSVKG(SEQID NO：206)所示的氨基酸序列，其中X1为W、F或Y，X2为P或S，X3为Y或K，X4为G、S或H，X5为H或G，X6为S或T并且X7为T、E或Q。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂的VHCDR3具有GGX1X2AX3DY(SEQ ID NO：207)所示的氨基酸序列，其中X1为R或L，X2为G、Y或S并且X3为M或L。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂的VL CDR1具有RASQSVSSAVA(SEQ ID NO：197)所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂的VL CDR2具有SASSLYS(SEQ ID NO：198)所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂的VL CDR3具有QQX1X2X3X4LX5T(SEQ ID NO：208)所示的氨基酸序列，其中X1为R或G，X2为Y、R或T，X3为S或T，X4为S或D并且X5为L或R。
在一些实施方式中，多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)的结合至PD-L1的第二结合域的CDR的共有序列如图17A和17B所示。因此，在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)包含结合至PD-L1的第二结合域并且包含：(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)具有氨基酸序列GFTFX1X2YYIH(SEQ ID NO：200)的VH CDR1，其中X1和X2分别独立地为天然存在的氨基酸；(2)具有X1IX2X3X4GX5X6TX7YADSVKG(SEQ ID NO：201)所示的氨基酸序列的VH CDR2，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7分别独立地为天然存在的氨基酸；和(3)具有X1X2X3X4X5X6X7X8LDY(SEQ ID NO：202)所示的氨基酸序列的VHCDR3，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7和X8分别独立地为天然存在的氨基酸，和/或(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)具有氨基酸序列RASQSVSSAVA(SEQ ID NO：197)的VL CDR1；(2)具有氨基酸序列SASSLYS(SEQ ID NO：198)的VL CDR2；和和(3)具有氨基酸序列QQX1X2X3X4PX5T(SEQID NO：203)的VL CDR3，其中X1、X2、X3、X4和X5分别独立地为天然存在的氨基酸。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂的VH CDR1具有GFTFX1X2YYIH(SEQ ID NO：217)所示的氨基酸序列，其中X1为D或S，X2为Q或S。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂的VH CDR2具有X1IX2X3X4GX5X6TX7YADSVKG(SEQ ID NO：209)所示的氨基酸序列，其中X1是E、W或T，X2是Y、T或S，X3是P或S，X4是A、H或G，X5是S、Y或G，X6是Y、S或F，并且X7是Y或K。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂的VH CDR3具有X1X2X3X4X5X6X7X8LDY(SEQ IDNO：210)所示的氨基酸序列，其中X1是G或D，X2是P、S或Y，X3是Y、V或T，X4是S、I或L，X5是V、Y或T，X6是R、G或P，X7是Y或V(或不存在)，并且X8是A(或不存在)。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂的VL CDR1具有RASQSVSSAVA(SEQ ID NO：197)所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂的VL CDR2具有SASSLYS(SEQ ID NO：198)所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂的VL CDR3具有QQX1X2X3X4PX5T(SEQ ID NO：211)所示的氨基酸序列，其中X1是V、Y或F，X2是S、Y或G，X3是Y、T或A，X4是S或E，并且X5是Y或I。
在一些实施方式中，本文描述了结合至与本文所述抗体中任一种的抗体或其片段基本相同的表位的结合剂。在一些实施方式中，本文描述了与本文所描述的任一种的抗体或其片段竞争与人PD-L1的结合的结合剂。在一些实施方式中，所述结合剂是抗体或其片段。
在某些方面，可以根据Kabat系统确定多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂的CDR(Kabat等人(1971)Ann.NY Acad.Sci.190：382-391和Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)。
在某些方面，可以根据Chothia系统确定多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂的CDR，其在本文中将被称为“Chothia CDR”(参见，例如，Chothia and Lesk，1987，J.Mol.Biol.，196：901-917；Al-Lazikani等人，1997，J.Mol.Biol.，273：927-948；Chothia等人，1992，J.Mol.Biol.，227：799-817；Tramontano A等人，1990，J.Mol.Biol.215(1)：175-82；和美国专利No.7,709,226)。
在某些方面，可以根据ImMunoGeneTics(IMGT)系统确定多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂的CDR，例如，如Lefranc，M.-P.，1999，TheImmunologist，7：132-136和Lefranc，M.-P.等人，1999，Nucleic Acids Res.，27：209-212中所述(“IMGT CDR”)。
在某些方面，可以根据AbM系统确定多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂的CDR，其在本文中将被称为“AbM CDR”，例如，如MacCallum等人，1996，J.Mol.Biol.，262：732-745中所述。还参见，例如Martin，A.，“Protein Sequence andStructure Analysis of Antibody Variable Domains，”in Antibody Engineering，Kontermann and Dübel主编，第31章，第422-439页，Springer-Verlag，Berlin(2001)。
在某些方面，可以根据Contact系统确定多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂的CDR，其在本文中将被称为“Contact CDR”(参见，例如，MacCallum RM等人，1996，J Mol Biol 5：732-745)。Contact CDR基于可得的复合物晶体结构的分析。
在一些实施方式中，一个或多个CDR沿本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂的第一结合域的VH(例如，CDR1、CDR2或CDR3)和/或VL(例如，CDR1、CDR2或CDR3)区的位置可以改变1、2、3、4、5或6个氨基酸位置，只要维持与CD47(例如，人CD47)的结合(例如，基本维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。例如，在一些实施方式中，可以通过相对于当前CDR位置，将CDR的N末端和/或C末端边界迁移1、2、3、4、5或6个氨基酸来改变限定表1、2或3中任一个的CDR的位置，只要维持与CD47(例如，人CD47)的结合(例如，基本维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在其它实施方式中，一个或多个CDR沿本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂的第一结合域的VH(例如，CDR1、CDR2或CDR3)和/或VL(例如，CDR1、CDR2或CDR3)区的长度可以改变1、2、3、4、5或更多个氨基酸(例如，更短或更长)，只要维持与CD47(例如，人CD47)的结合(例如，基本维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。例如，在一些实施方式中，本文所描述的VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3可以比SEQ ID NO：1-24、27-50或53-76所描述的一个或多个CDR短1、2、3、4、5或更多个氨基酸，只要维持与CD47(例如，人CD47)的结合(例如，基本维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在其它实施方式中，本文所描述的VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3可以比SEQ ID NO：1-24、27-50或53-76所描述的一个或多个CDR长1、2、3、4、5或更多个氨基酸，只要维持与CD47(例如，人CD47)的结合(例如，基本维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在其它实施方式中，与SEQ ID NO：1-24、27-50或53-76所描述的一个或多个CDR相比，本文所描述的第一结合域的VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3的氨基末端可以延长1、2、3、4、5或更多个氨基酸，只要维持与CD47(例如，人CD47)的结合(例如，基本维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在其它实施方式中，与SEQ ID NO：1-24、27-50或53-76所描述的一个或多个CDR相比，本文所描述的第一结合域的VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3的羧基末端可以延长1、2、3、4、5或更多个氨基酸，只要维持与CD47(例如，人CD47)的结合(例如，基本维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在其它实施方式中，与SEQ IDNO：1-24、27-50或53-76所描述的一个或多个CDR相比，本文所描述的第一结合域的VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3的氨基末端可以缩短1、2、3、4、5或更多个氨基酸，只要维持与CD47(例如，人CD47)的结合(例如，基本维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在一些实施方式中，与SEQ ID NO：1-24、27-50或53-76所描述的一个或多个CDR相比，本文所描述的第一结合域的VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3的羧基末端可以缩短1、2、3、4、5或更多个氨基酸，只要维持与CD47(例如，人CD47)的结合(例如，基本维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。本领域中己知的任何方法可以用于确定是否维持与CD47(例如，人CD47)的结合，例如，本文所描述的“实施例”节中所描述的结合测定和条件。
在一些实施方式中，一个或多个CDR沿本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和PD-L1，包括人PD-L1的多重特异性结合剂的第二结合域的VH(例如，CDR1、CDR2或CDR3)和/或VL(例如，CDR1、CDR2或CDR3)区的位置可以改变1、2、3、4、5或6个氨基酸位置，只要维持与PD-L1(例如，人PD-L1)的结合(例如，基本维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。例如，在一些实施方式中，可以通过相对于当前CDR位置，将CDR的N末端和/或C末端边界迁移1、2、3、4、5或6个氨基酸来改变限定表4、5或6中任一个的CDR的位置，只要维持与PD-L1(例如，人PD-L1)的结合(例如，基本维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在其它实施方式中，一个或多个CDR沿本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和PD-L1，包括人PD-L1的多重特异性结合剂的第二结合域的VH(例如，CDR1、CDR2或CDR3)和/或VL(例如，CDR1、CDR2或CDR3)区的长度可以改变1、2、3、4、5或更多个氨基酸(例如，更短或更长)，只要维持与PD-L1(例如，人PD-L1)的结合(例如，基本维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。例如，在一些实施方式中，本文所描述的VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3可以比SEQ ID NO：79-102、105-128或131-154所描述的一个或多个CDR短1、2、3、4、5或更多个氨基酸，只要维持与PD-L1(例如，人PD-L1)的结合(例如，基本维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在其它实施方式中，本文所描述的VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3可以比SEQ ID NO：79-102、105-128或131-154所描述的一个或多个CDR长1、2、3、4、5或更多个氨基酸，只要维持与PD-L1(例如，人PD-L1)的结合(例如，基本维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在其它实施方式中，与SEQ ID NO：79-102、105-128或131-154所描述的一个或多个CDR相比，本文所描述的第二结合域的VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3的氨基末端可以延长1、2、3、4、5或更多个氨基酸，只要维持与PD-L1(例如，人PD-L1)的结合(例如，基本维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在其它实施方式中，与SEQ ID NO：79-102、105-128或131-154所描述的一个或多个CDR相比，本文所描述的第二结合域的VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3的羧基末端可以延长1、2、3、4、5或更多个氨基酸，只要维持与PD-L1(例如，人PD-L1)的结合(例如，基本维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在其它实施方式中，与SEQ ID NO：79-102、105-128或131-154所描述的一个或多个CDR相比，本文所描述的第二结合域的VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3的氨基末端可以缩短1、2、3、4、5或更多个氨基酸，只要维持与PD-L1(例如，人PD-L1)的结合(例如，基本维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。在一些实施方式中，与SEQ ID NO：79-102、105-128或131-154所描述的一个或多个CDR相比，本文所描述的第二结合域的VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3的羧基末端可以缩短1、2、3、4、5或更多个氨基酸，只要维持与PD-L1(例如，人PD-L1)的结合(例如，基本维持，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％)。本领域中己知的任何方法可以用于确定是否维持与PD-L1(例如，人PD-L1)的结合，例如，本文所描述的“实施例”节中所描述的结合测定和条件。
在其它实施方式中，本文所提供的结合至CD47的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂包含保守序列修饰。对于作为多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，如结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂的多肽，保守序列修饰包括保守氨基酸替换，其包括其中所述氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换的那些替换。在本领域中定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，门冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、beta-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳烃侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，在一些实施方式中，用来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基替换CD47或PD-L1中预测的非必需氨基酸残基。识别不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守替换的方法在本领域中是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi等人ProteinEng.12(10)：879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：412-417(1997))。在一些实施方式中，本文所描述的保守序列修饰将多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂的氨基酸序列修饰了50％，或者55％，或者60％，或者65％，或者70％，或者75％，或者80％，或者85％，或者90％，或者95％，或者98％，或者99％。在一些实施方式中，核苷酸和氨基酸序列修饰是指对表1、表2、表3、表4、表5或表6中所述的CDR的至多1、2、3、4、5或6个氨基酸替换。因此，例如，每种这种CDR可以含有至多5个保守氨基酸替换，例如，至多(不超过)4个保守氨基酸替换，例如，至多(不超过)3个保守氨基酸替换，例如，至多(不超过)2个保守氨基酸替换，或者不超过1个保守氨基酸替换。
本发明公开提供了具有掩盖部分和/或可切割部分的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂，其中所述多重特异性结合剂(例如，抗体)的CD47和/或另一个靶标结合域中的一个或多个被掩盖(例如，经由掩盖部分)和/或是可激活的(例如，经由可切割部分)。掩盖多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)的技术在本领域中是熟知的，包括SAFE body掩盖技术(参见，例如，美国专利申请公开No.2019/0241886)和Probody掩盖技术(参见，例如，美国专利申请公开No.2015/0079088)。这些技术可以用于产生掩盖和/或可激活的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)。这种掩盖和/或可激活的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂对于缀合物制备是有用的，包括免疫缀合物、抗体-药物缀合物(ADC)、掩盖的ADC和可激活的抗体-药物缀合物(AADC)，其包含本发明公开所述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂，如人CD47结合剂中的任一种，包括直接或间接连接另一种试剂，如药物的那些。例如，本发明公开的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂，如人CD47结合剂可以通过合成接头共价结合至一种或多种试剂，如药物。
如果需要，将多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)(直接或间接)连接或缀合至具有效应因子功能，如细胞毒活性(例如，化疗部分或放射性同位素)或免疫招募活性的部分。连接或缀合(直接或间接)的部分包括处于掩盖的缀合物形式的细胞毒(例如，毒素，如奥瑞他汀(aurostatins))或非细胞毒(例如，信号转导调节剂，如激酶或者掩盖多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)的一个或多个结合域的掩盖部分，或者使得能够通过切割可切割部分，从而在肿瘤微环境中暴露多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)的一个或多个结合域来激活多重特异性结合剂的可切割部分)药物。促进免疫招募的部分可以包括其它抗原-结合试剂，如选择性结合至天然免疫系统细胞的病毒蛋白质。作为另外一种选择或另外，任选地将多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)连接或缀合(直接或间接)至辅助从混合物分离的部分(例如，标签)或者具有报告分子活性的部分(例如，检测标记物或报告蛋白)。将理解本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)的特征还延伸至包含结合剂片段的多肽。
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂可以(直接或间接)连接或缀合至多肽，其可以导致可激活抗体的产生。在一些实施方式中，将多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)连接或缀合(直接或间接)至试剂。在一些实施方式中，所述试剂是药物，当ADC的抗体包含掩盖部分和可切割部分时，其导致产生ADC或AADC。
在一些实施方式中，将本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂缀合或重组连接(直接或间接)至治疗剂(例如，细胞毒性剂)或者至诊断试剂或可检测试剂。所述缀合或重组连接的抗体，包括掩盖或可激活的缀合物，对于(例如)治疗或预防疾病或病症，如免疫细胞功能障碍疾病、病症或病况可以是有用的。所述缀合或重组连接的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂，包括掩盖或可激活的缀合物，对于(例如)监测或预后免疫细胞功能障碍疾病的发病、进展、发展和/或严重程度可以是有用的。
例如，可以通过将多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)偶联至可检测物质实现这种诊断和检测，所述可检测物质包括(例如)酶，包括(但不限于)辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、beta-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，包括(但不限于)抗生蛋白链菌素/生物素或抗生物素蛋白/生物素；荧光物质，包括(但不限于)伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，包括(但不限于)鲁米诺；生物发光材料，包括(但不限于)荧光素酶、萤光素或水母发光蛋白；化学发光材料，包括(但不限于)吖啶鎓基化合物或HALOTAG；放射性物质，包括(但不限于)碘(131I、125I、123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In和111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga和67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn或117Sn；使用多种正电子发射断层扫描术的正电子发射金属；和非放射性顺磁性金属离子。
本文还描述了重组连接或缀合(共价或非共价缀合，直接或间接)至异源蛋白质或多肽(或其片段，例如，至多肽(例如，约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90或约100个氨基酸)以产生融合蛋白的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)及其用途。具体地，本文描述了融合蛋白，其包含本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂的抗原-结合片段(例如，包含VH和/或VL的CDR1、CDR2和/或CDR3)和异源蛋白质、多肽或肽。在一些实施方式中，多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)所连接至的异源蛋白质、多肽或肽对于将所述多重特异性结合剂靶向特定细胞(例如，CD47表达细胞和/或PD-L1表达细胞，包括肿瘤细胞)是有用的。
此外，可以将本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂(直接或间接)连接至标志物或“标签”序列，如肽，以辅助纯化。在一些实施方式中，所述标志物或标签氨基酸序列是六组氨酸肽，如pQE载体(参见，例如，QIAGEN，Inc.)中所提供的标签等，它们中的多个是可商购的。例如，如Gentz等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-24，六组氨酸提供了方便的融合蛋白的纯化。用于纯化的其它肽标签包括(但不限于)血球凝集素(“HA”)标签，其对应于来源于流感血球凝集素蛋白的表位(Wilson等人，1984，Cell 37：767-78)，和“FLAG”标签。
用于将部分(包括多肽)(直接或间接)连接或缀合至抗体的方法在本领域中是熟知的，所述方法中的任一种可以用于制备本文所描述的抗体-药物缀合物或融合蛋白。
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体)是融合蛋白。如本文所使用的术语“融合蛋白”是指包含结合剂(例如，抗体)的氨基酸序列的异源多肽或蛋白(例如，通常不是抗体(例如，非CD47结合抗体或非PD-L1结合抗体)的一部分的多肽或蛋白)的氨基酸序列的多肽。在某些实施方式中，融合蛋白保留了多重特异性结合剂的生物活性。在某些实施方式中，融合蛋白包含含有CD47抗体VH区、VL区、VH CDR(1、2或3个VH CDR)和/或VL CDR(1、2或3个VL CDR)的第一结合域，其中所述融合蛋白结合至CD47表位、CD47片段和/或CD47多肽。在某些实施方式中，融合蛋白包含含有PD-L1抗体VH区、VL区、VH CDR(1、2或3个VH CDR)和/或VL CDR(1、2或3个VL CDR)的第二结合域，其中所述融合蛋白结合至PD-L1表位、PD-L1片段和/或PD-L1多肽。
可以(例如)通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)的技术产生融合蛋白。可以使用DNA改组改变如本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂的活性，包括(例如)具有高亲和力和低解离速率的多重特异性结合剂(参见，例如，美国专利No.5,605,793；5,811,238；5,830,721；5,834,252；和5,837,458；Patten等人，1997，Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33；Harayama，1998，Trends Biotechnol.16(2)：76-82；Hansson等人，1999，J.Mol.Biol.287：265-76；和Lorenzo and Blasco，1998，Biotechniques 24(2)：308-13)。在一些实施方式中，可以在重组之前通过经由易错PCR、随机核苷酸插入或其它方法所进行的随机突变来改变多重特异性结合剂，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂。编码本文所描述的多重特异性结合剂的多核苷酸可以与一种或多种异源分子的一种或多种组分、基序、部分(section)、部分(part)、域、片段等重组。
本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂还可以附接至固体载体，其对于靶标抗原的免疫测定或纯化是有用的。这些固体载体包括(但不限于)玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂还可以(直接或间接)连接或缀合至第二抗体以形成抗体异源偶联物。
所述接头可以是“可切割部分”，其辅助连接或缀合的试剂在细胞中的释放，但是在本文中也考虑了不可切割接头。用于在本发明公开的缀合物(例如，抗体-药物缀合物)中使用的接头无限制地包括酸不稳定的接头(例如，腙接头)、含二硫键的接头、肽酶敏感接头(例如，包含氨基酸，例如，缬氨酸和/或瓜氨酸的肽接头，如瓜氨酸-缬氨酸或苯丙氨酸-赖氨酸)、对光不稳的接头、二甲基接头、硫醚接头或者设计以逃避多药转运体-介导的抗性的亲水性接头。
可以使用多种双官能蛋白偶联剂制备抗体和试剂的缀合物，包括其中所述试剂是制备ADC或AADC的药物的情况，所述偶联剂如BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SLAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。本发明公开还考虑可以使用如本领域所公开的任何适合的方法制备抗体和试剂的缀合物，包括其中所述试剂是用于制备ADC或AADC的药物的情况(参见，例如，Bioconjugate Techniques(Hermanson主编，第2版.2008))。
抗体和试剂的常规缀合策略，包括其中所述试剂是用于制备ADC或AADC的药物的情况，己基于涉及Lys残基的ε氨基或Cys残基的硫醇基团的随机缀合化学，其导致产生了不均一的缀合物。最近发展的技术允许位点-特异性缀合至抗体，其导致均一负载并且避免了具有改变的抗原-结合或药物动力学的缀合物亚组。这些包括“硫醇单抗(thiomabs)”的工程化，其在重链和轻链上提供反应性硫醇基团的位置处包含半胱氨酸替换，并且这些不破坏免疫球蛋白折叠和组装或者改变抗原结合(参见，例如，Junutula等人，2008，J.Immunol.Meth.332：41-52；和Junutula等人，2008，Nature Biotechnol.26：925-32)。在另一种方法中，通过从硒代半胱氨酸插入末端重编码终止密码子UGA将硒代半胱氨酸共翻译插入到抗体序列中，从而允许在存在其它天然氨基酸的情况下在硒代半胱氨酸的亲核硒醇基团处进行位点特异性共价缀合(参见，例如，Hofer等人，2008，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105：12451-56；和Hofer等人，2009，Biochemistry 48(50)：12047-57)。
在一些实施方式中，将本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂缀合至细胞毒性剂。在一些实施方式中，可以任选地将本文所公开的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂与本文所公开的或本领域中己知的一种或多种细胞毒性剂缀合以产生ADC或AADC。在一些实施方式中，所述细胞毒性剂是化疗剂，其包括(但不限于)甲氨蝶呤、亚德里亚霉素、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其它插入剂。在一些实施方式中，所述细胞毒性剂是细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或其片段，其包括(但不限于)白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链、篦麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲素(modeccin)A链、alpha-八叠球菌素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、泻果素、巴豆毒蛋白、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、丝裂吉菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯。在一些实施方式中，所述细胞毒性剂是放射性同位素以生产放射性缀合物或放射性缀合的试剂。多种放射性核素对于放射性缀合的试剂的产生是可用的，其包括(但不限于)90Y、125I、131I、123I、111In、131In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、188Re和212Bi。还可以使用多肽或分子和一种或多种小分子毒素，如卡里奇霉素(calicheamicin)、美登素、单端孢霉烯和CC1065的缀合物以及具有毒素活性的这些毒素的衍生物。使用多种双官能蛋白-偶联剂制备多肽或分子和细胞毒性剂的缀合物，所述偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(如二甲基己二亚酰胺化物HCL)、活性酯(如二琥珀酰亚胺基辛二酸)、醛(如戊二醛)、双叠氮基化合物(如双(p-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双-(p-二重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。
在一些实施方式中，将本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂缀合至药物，如信号转导调节剂、促凋亡试剂、有丝分裂抑制剂、抗-肿瘤抗生素、免疫调节剂、用于基因疗法的核酸、烷化剂、抗血管生成剂、抗代谢产物、含硼试剂、化学保护剂、激素试剂、抗激素试剂、皮质类固醇、光活性治疗剂、寡核苷酸、放射性核素试剂、放射致敏剂、局部异构酶抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂。在一些实施方式中，所述有丝分裂抑制剂是尾海兔素、奥瑞他汀、美登素和植物碱。在一些实施方式中，所述药物是尾海兔素、奥瑞他汀、美登素和植物碱。奥瑞他汀的实例是单甲基澳瑞他汀F(MMAF)或者单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。美登素的实例包括(但不限于)DM1、DM2、DM3和DM4。在一些实施方式中，抗肿瘤抗生素选自放线菌素、蒽环类抗生素、卡里奇霉素(calicheamicin)和倍癌毒素。在一些实施方式中，放线菌素是吡咯并苯二氮卓(PBD)。
本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂可以是单特异性、双重特异性、三重特异性或更大的多重特异性。这些试剂可以包括抗体。多重特异性抗体，如双重特异性抗体是对于至少2种不同靶标(例如，抗原)或者相同靶标上的2种不同表位具有结合特异性的单克隆抗体(例如，抗CD47的双重特异性抗体具有对于CD47的第一表位的第一结合域，和对于CD47的第二表位的第二结合域)。在一些实施方式中，可以基于本文所述的抗体的序列，例如，表1、表2和表3中所列的CDR序列构建本文所述的多重特异性(例如，双重特异性)抗体的第一结合域。在一些实施方式中，可以基于本文所述的抗体的序列，例如，表4、表5和表6中所列的CDR序列构建本文所述的多重特异性(例如，双重特异性)抗体的第二结合域。在一些实施方式中，本文所述的多重特异性抗体是双重特异性抗体。在一些实施方式中，双重特异性抗体是小鼠、嵌合、人或人源化抗体。在一些实施方式中，多重特异性抗体的结合特异性之一是对于CD47的并且其它对于任何其它靶标(例如，抗原)。在一些实施方式中，多重特异性(例如，双重特异性)抗体可以包含不止一种靶标结合域，其中不同的结构域对于不同靶标特异(例如，结合CD47的第一结合域和结合另一种靶标(例如，抗原)，如免疫检查点调节剂(例如，阴性检查点调节剂)的第二结合域)。在一些实施方式中，多重特异性(例如，双重特异性)抗体可以结合相同靶标(例如，抗原)上的不止一种(例如，两种或更多种)表位。在一些实施方式中，结合特异性之一对于CD47并且其它对于任何其它靶标(例如，抗原)。在一些实施方式中，结合特异性之一是CD47并且其它对于下列中的一种或多种：细胞毒T-淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、CD80、CD86、程序细胞死亡1(PD-1)、程序细胞死亡配体1(PD-L1)、程序细胞死亡配体2(PD-L2)、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3；也称为CD223)、半乳凝素-3、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、T细胞膜蛋白3(TIM3)、半乳凝素-9(GAL9)、B7-H1、B7-H3、B7-H4、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT/Vstm3/WUCAM/VSIG9)、T细胞激活的V-结构域Ig抑制剂(VISTA)、糖皮质激素-诱导的肿瘤坏死因子受体-相关(GITR)蛋白、疱疹病毒进入介导子(HVEM)、OX40、CD27、CD28、CD137、CGEN-15001T、CGEN-15022、CGEN-15027、CGEN-15049、CGEN-15052和CGEN-15092。
用于制备多重特异性抗体的方法在本领域中是己知的，如通过两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中2条重链具有不同的特异性(参见，例如，Milstein and Cuello，1983，Nature 305：537-40)。有关产生多重特异性抗体(例如，双重特异性抗体)的其它详细信息，参见，例如，Bispecific Antibodies(Kontermann主编，2011)。
多重特异性抗体的示例性结构在本领域中是己知的并且进一步描述于Weidle等人，2013，Cancer Genomics&Proteomics 10：1-18；Brinkman等人，2017，MABS，9：2，182-212；Godar等人，2018，Expert Opinion on Therapeutic Patents，28：3，251-276；和Spiess等人，2015，Mol.Immunol.67 95-106。
例如，双重特异性抗体分子可以分为不同的结构组：(i)双重特异性免疫球蛋白G(BsIgG)；(ii)附有其它抗原-结合部分的IgG；(iii)双重特异性抗体片段；(iv)双重特异性融合蛋白；和(v)双重特异性抗体缀合物。作为非限制性实例，BsIgG形式可以包括crossMab、DAF(二合一)、DAF(四合一)、DutaMab、DT-IgG、杵臼结构共有LC(knobs-in-holescommon LC)、杵臼结构组件(knobs-in-holes assembly)、电荷对、Fab-臂交换、seedbody、三功能抗体(triomab)、LUZ-Y、Fcab、κλ-体、正交Fab。
在一些实施方式中，BslgG包含对于杂二聚化工程化的重链。例如，可以使用“杵臼结构”策略、SEED平台、常见重链(例如，在κλ-体中)以及异源二聚Fc区的使用将重链对于异源二聚化进行工程化。避免BsIgG中同源二聚体重链配对的策略在本领域中是己知的，其包括杵臼结构、duobody、azymetric、电荷对、HA-TF、SEEDbody和差异蛋白A亲和力。
双重特异性抗体的另一种形式是附有其它抗原结合部分的IgG。例如，通过将其它抗原结合单元附加到单特异性IgG上(例如，在重链或轻链的N末端或C末端)可以将单特异性IgG工程化以具有双重特异性。示例性的其它抗原结合单元包括单结构域抗体(例如，可变重链或可变轻链)、工程化蛋白骨架和配对的抗体可变结构域(例如，单链可变片段或可变片段)。附加的IgG形式的非限制性实例包括双可变结构域IgG(DVD-Ig)、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L，H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、zybody和DVI-IgG(四合一)。参见Spiess等人Mol.Immunol.67(2015)：95-106。在一些实施方式中，示例性抗体形式是例如，国际专利申请公开No.WO 2018/075692和美国专利申请公开No.2018/0118811中所述的单特异性或多重特异性(例如，双重特异性抗体)的B-体形式。
双重特异性抗体片段(BsAb)是缺少一些或全部抗体恒定结构域的双重特异性抗体分子形式。例如，一些BsAb缺少Fc区。在实施例中，双重特异性抗体片段包括通过允许BsAb在单个宿主细胞中有效表达的肽接头连接的重链和轻链区。双重特异性抗体片段的非限制性实例包括(但不限于)纳米抗体、纳米抗体-HAS、BiTE、双链抗体、DART、TandAb、sc双链抗体、sc双链抗体-CH3、双链抗体-CH3、三抗体(triple body)、微型抗体、微抗体、TriBi微抗体、scFv-CH3KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab′)2、F(ab′)2-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCAb、sc双链抗体-Fc、双链抗体-Fc、串联scFv-Fc和胞内抗体。
双重特异性融合蛋白包括连接至其它蛋白的抗体片段。例如，双重特异性融合蛋白可以连接至其它蛋白以增加其它特异性和/或功能性。在一些实施方式中，对接锁定(dock-and-lock，DNL)方法可以用于产生具有更高效价的双重特异性抗体分子。此外，与白蛋白结合蛋白或人血清白蛋白的双重特异性抗体融合蛋白可以延长抗体片段的血清半衰期。在实施方式中，化学缀合，例如，抗体和/或抗体片段的化学缀合可以用于产生BsAb分子。示例性双重特异性抗体缀合物包括CovX体形式，其中低分子量药物与每个Fab臂或抗体或其片段中的单个反应性赖氨酸位点特异性缀合。在实施方式中，缀合改善了血清半衰期。
多重特异性抗体，包括双重特异性抗体的产生方法在本领域中是己知的。例如，可以通过组分抗体在不同宿主细胞中的单独表达以及后续纯化/组装或者通过组分抗体在单一宿主细胞中的表达来产生多重特异性抗体，包括双重特异性。多重特异性(例如，双重特异性)抗体分子的纯化的可以通过本领域中已知的多种方法，包括亲合色谱法进行。
在一些实施方式中，可以以本文所公开的或本领域中已知的任何抗体形式提供本文所公开的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂。作为非限制性实例，在一些实施方式中，所述多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂，可以选自Fab串联lg(FIT-lg)；DVD-lg；杂交杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma)或四体杂交瘤(tetradoma))；抗运载蛋白平台(Pieris)；双链抗体；单链双链抗体；串联单链Fv片段；TandAbs，三重特异性Ab(Affimed)；Darts双亲和力重靶向剂(Macrogenics)；双重特异性Xmabs(Xencor)；双重特异性T细胞接合剂(Bites；Amgen；55kDa)；三抗体；三抗体＝Fab-scFv融合蛋白多功能重组抗体衍生物(CreativeBiolabs)；Duobody平台(Genmab)；对接锁定平台；杵臼结构(KIH)平台；人源化双重特异性IgG抗体(REGN1979)(Regeneron)；Mab2双重特异性抗体(F-Star)；DVD-lg＝双可变域免疫球蛋白(Abbott)；kappa-lambda体；TBTI＝四价双重特异性串联Ig；和CrossMab(Roche)。
在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域和一个或多个其它结合至非CD47的一个或多个靶标的结合域。在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域，其包含表1所示的VH和/或VL氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域，其包含表2所示的VH和/或VL氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域，其包含表3所示的VH和/或VL氨基酸序列。
在一些实施方式中，本文描述了多重特异性(例如，双重特异性)抗体，其包含结合至包含如表1所示的VH和VL CDR的CD47的结合域。在一些实施方式中，本文描述了多重特异性(例如，双重特异性)抗体，其包含结合至包含如表2所示的VH和VL CDR的CD47的结合域。在一些实施方式中，本文描述了多重特异性(例如，双重特异性)抗体，其包含结合至包含如表3所示的VH和VL CDR的CD47的结合域。
在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域和PD-L1结合域。在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域，其包含表1所示的VH和/或VL氨基酸序列，和PD-L1结合域，其包含表4所示的VH和/或VL氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域，其包含表1所示的VH和/或VL氨基酸序列，和PD-L1结合域，其包含表5所示的VH和/或VL氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域，其包含表1所示的VH和/或VL氨基酸序列，和PD-L1结合域，其包含表6所示的VH和/或VL氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域，其包含表2所示的VH和/或VL氨基酸序列，和PD-L1结合域，其包含表4所示的VH和/或VL氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域，其包含表2所示的VH和/或VL氨基酸序列，和PD-L1结合域，其包含表5所示的VH和/或VL氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域，其包含表2所示的VH和/或VL氨基酸序列，和PD-L1结合域，其包含表6所示的VH和/或VL氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域，其包含表3所示的VH和/或VL氨基酸序列，和PD-L1结合域，其包含表4所示的VH和/或VL氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域，其包含表3所示的VH和/或VL氨基酸序列，和PD-L1结合域，其包含表5所示的VH和/或VL氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域，其包含表3所示的VH和/或VL氨基酸序列，和PD-L1结合域，其包含表6所示的VH和/或VL氨基酸序列。
在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域，其包含表1所示的VH和VL氨基酸序列，和PD-L1结合域，其包含表4所示的VH和VL氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域，其包含表1所示的VH和VL氨基酸序列，和PD-L1结合域，其包含表5所示的VH和VL氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域，其包含表1所示的VH和VL氨基酸序列，和PD-L1结合域，其包含表6所示的VH和VL氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域，其包含表2所示的VH和VL氨基酸序列，和PD-L1结合域，其包含表4所示的VH和VL氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域，其包含表2所示的VH和VL氨基酸序列，和PD-L1结合域，其包含表5所示的VH和VL氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域，其包含表2所示的VH和VL氨基酸序列，和PD-L1结合域，其包含表6所示的VH和VL氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域，其包含表3所示的VH和VL氨基酸序列，和PD-L1结合域，其包含表4所示的VH和VL氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域，其包含表3所示的VH和VL氨基酸序列，和PD-L1结合域，其包含表5所示的VH和VL氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所公开的多重特异性(例如，双重特异性)抗体包含CD47结合域，其包含表3所示的VH和VL氨基酸序列，和PD-L1结合域，其包含表6所示的VH和VL氨基酸序列。
可以通过任何适合的方法获得结合CD47和/或PD-L1的抗体，所述方法如(但不限于)用包含CD47和/或PD-L1和抗体集合的完整肿瘤细胞免疫、重组技术或者使用CD47胞外域表位或者PD-L1胞外域表位的抗体或抗体片段的筛选文库。可以使用多种己知的技术产生单克隆抗体(参见，例如，Coligan等人(主编)，Current Protocols in Immunology，1：2.5.12.6.7(John Wiley&Sons 1991)；Monoclonal Antibodies，Hybridomas：A NewDimension in Biological Analyses，Plenum Press，Kennett，McKearn，and Bechtol(主编)(1980)；Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow and Lane(主编)，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1988)；和Picksley等人，“Production of monoclonalantibodies against proteins expressed in E.coli，”in DNA Cloning 2：ExpressionSystems，第2版，Glover等人(主编)，第93页(Oxford University Press 1995))。用于产生单克隆抗体的一种示例性技术包括用人CD47抗原免疫动物并从采集自所述动物的脾脏细胞产生杂交瘤。杂交瘤可以产生结合CD47的单克隆抗体或抗体片段。用于产生单克隆抗体的一种示例性技术包括用人PD-L1抗原免疫动物并从采集自所述动物的脾脏细胞产生杂交瘤。杂交瘤可以产生结合PD-L1的单克隆抗体或抗体片段。
在其它实施方式中，可以从使用(例如)Antibody Phage Display：Methods andProtocols，P.M.O′Brien and R.Aitken，主编，Humana Press，Totawa N.J.，2002中所述的技术所产生的抗体噬菌体文库分离单克隆抗体或抗体片段。在原理上，通过含有展示融合至噬菌体外壳蛋白的抗体可变区(Fv)的多种片段的噬菌体的筛选噬菌体文库选择合成抗体克隆。对于所期望的抗原筛选这些噬菌体文库。将表达能够结合至所期望的抗原的Fv片段的克隆吸附至抗原，并因此从文库中的非结合克隆分离。然后，从抗原洗脱结合克隆，并通过其它抗原吸附/洗脱循环进一步富集。
可以在噬菌体上将可变域功能性地展示为单-链Fv(scFv)片段，其中VH和VL通过短、柔性肽共价连接，或者展示为Fab片段，其中它们分别融合至恒定域并且非共价相互作用，如(例如)Winter等人，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)中所述。
可以通过聚合酶链反应(PCR)单独克隆VH和VL基因组库，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对其搜索抗原-结合克隆，如Winter等人，如上中所述。来自免疫源的文库提供了对免疫原具有高亲和力的抗体，且不需要构建杂交瘤。作为另外一种选择，可以克隆天然组库，从而在无任何免疫的情况下提供抗广泛的非自体抗原以及自体抗原的人抗体的单一来源，如Griffiths等人，EMBO J，12：725-734(1993)所述。最终，还可以通过从干细胞克隆未重排的V-基因节段并使用含有编码高度可变的CDR3区并实现体外重排的随机序列的PCR引物来合成制备天然文库，如(例如)Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。
可以通过本领域中己知的多种技术实现文库筛选。例如，CD47(例如，CD47多肽、片段或表位)或者PD-L1(例如，PD-L1多肽、片段或表位)可以用于涂覆吸附板的孔，在固定至吸附板的宿主细胞上表达或者在细胞分选中使用，或者缀合至生物素用于被抗生蛋白链菌素-涂覆珠捕获，或者在任何其它淘选展示文库的方法中使用。可以通过使用如Bass等人，Proteins，8：309-314(1990)和WO 92/09690中所述的长清洗和一价噬菌体展示和如Marks等人，Biotechnol.，10：779-783(1992)中所述的低抗原涂覆密度来促进通过缓慢溶解动力学(例如，优良结合亲和力)的抗体选择。
可以通过设计适合的抗原筛选程序来选择所关心的噬菌体克隆，然后使用来自所关心的噬菌体克隆的VH和/或VL序列(例如，Fv序列)，或者来自VH和VL序列的多种CDR序列，和适合的恒定区(例如，Fc)序列构建全长多重特异性结合剂(例如，抗体)克隆来获得多重特异性结合剂，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publication 91：3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中所述。
同样地，可以通过一些技术中的任一种产生结合CD47和/或PD-L1的人抗体，所述技术包括(但不限于)人周围血液细胞(例如，含有B淋巴细胞)的爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)转化、人B细胞的体外免疫、来自携带插入的人免疫球蛋白基因的免疫的转基因小鼠的脾脏细胞的融合、从人免疫球蛋白V区噬菌体文库的分离，或者如本领域中己知且基于本文中的公开内容的其它程序。用于从转基因动物获得人抗体的方法进一步描述于，例如，Bruggemann等人，Curr.Opin.Biotechnol.，8：45558，1997；Jakobovits等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，764：525 35，1995；Green等人，Nature Genet.，7：13-21，1994；Lonberg等人，Nature，368：856-859，1994；Taylor等人，Int.Immun.6：579-591，1994；和美国专利No.5,877,397。
例如，结合CD47和/或PD-L1的人抗体可以得自已工程化从而对抗原性攻毒响应生产特异性人抗体的转基因动物。例如，国际专利公开No.WO 98/24893公开了具有人Ig基因座的转基因动物，其中由于内源重链和轻链基因座的失活，所述动物不产生功能性内源免疫球蛋白。还己描述了能够对免疫原产生免疫应答的转基因非灵长类哺乳动物宿主，其中所述抗体具有灵长类恒定区和/或可变区，并且其中替换或失活了内源免疫球蛋白编码基因座。国际专利公开No.WO 96/30498公开了在哺乳动物中使用Cre/Lox系统修饰免疫球蛋白基因座，从而替换所有或部分恒定区或可变区以形成修饰的抗体分子。国际专利公开No.WO 94/02602公开了具有失活的内源Ig基因座和功能性人Ig基因座的非人哺乳动物宿主。美国专利No.5,939,598公开了制备转基因小鼠的方法，其中所述小鼠缺少内源重链并且表达包含一个或多个异种恒定区的外源免疫球蛋白基因座。使用转基因动物，如本文所描述的转基因动物，可以对所选抗原性分子产生免疫应答，并且可以从动物除去抗体产生细胞并将其用于产生分泌人-来源的单克隆抗体的杂交瘤。免疫规程、佐剂等在本领域中是己知的并且用于(例如)转基因小鼠的免疫，如国际专利公开No.WO 96/33735中所述。可以测试单克隆抗体抑制或中和相应蛋白的生物活性或生理作用的能力。
本发明公开提供了人源化抗体，其结合CD47，包括人CD47，和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)。本发明公开的人源化抗体可以包含结合至CD47的第一结合域并且包含如表1-3所示的一个或多个CDR。本发明公开的人源化抗体可以包含结合至PD-L1的第二结合域并且包含如表4-6所示的一个或多个CDR。用于人源化非人抗体的多种方法在本领域中是己知的。例如，人源化抗体可以具有来自非人来源的引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常采集自“输入”可变域。可以使用本领域技术人员己知的技术产生结合CD47的人源化抗体(Zhang等人，Molecular Immunology，42(12)：1445-1451，2005；Hwang等人，Methods，36(1)：35-42，2005；Dall’Acqua等人，Methods，36(1)：43-60，2005；Clark，Immunology Today，21(8)：397-402，2000，和美国专利No.6,180,370；6,054,927；5,869,619；5,861,155；5,712,120；和4,816,567，以上所有文献全部明确作为参考并入本文)。
在一些情况下，通过CDR移植(CDR grafting)构建人源化抗体，其中将亲代非人抗体(例如，啮齿类)的6个互补决定区(CDR)的氨基酸序列移植到人抗体框架中。例如，Padlan等人(FASEB J.9：133-139，1995)确定CDR中仅约三分之一的残基实际接触抗原，并且将这些称为“特异性决定残基”或SDR。在SDR移植技术中，仅将SDR残基移植到人抗体框架中(参见，例如，Kashmiri等人，Methods36：25-34，2005)。
用于制备人源化抗体的人可变域(轻链和重链两者)的选择可以对于降低抗原性是重要的。例如，根据所谓的“最适(best-fit)”法，将非人(例如，啮齿类)抗体的可变域序列对己知的人可变域序列的整个文库进行筛选。可以将最接近啮齿类的人序列选择作为人源化抗体的人框架(Sims等人(1993)J.Immunol.151：2296；Chothia等人(1987)J.Mol.Biol.196：901)。另一种方法使用来源于轻链或重链的特定亚群的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同框架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285；Presta等人(1993)J.Immunol.，151：2623。在一些情况下，所述框架来源于丰度最高的人亚类，VL6亚组I(VL6I)和VH亚组III(VHIII)的共有序列。在另一种方法中，在框架区来源使用人种系基因。
在称为超人源化的基于CDR比较的替代范式中，FR同源性是不相关的。所述方法包括非人序列与功能性人种系基因组库的比较。然后，选择编码它们的那些基因或者与鼠科序列密切相关的典型结构。然后，在与非人抗体共有典型结构的基因内，将在CDR内具有最高同源性的那些选择作为FR供体。最终，将非人CDR移植到这些FR上(参见，例如，Tan等人，J.Immunol.169：1119-1125，2002)。
一般地，还期望将抗体人源化且保留它们对抗原的亲和力及其它良好的生物学性质。为了实现该目标，根据一种方法，通过亲代序列分析方法以及使用亲代和人源化序列的三维模型的多种概念性人源化产品，制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是通常可用的并且是本领域技术人员熟悉的。说明和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可用的。这些包括(例如)WAM(Whitelegg and Rees，Protein Eng.13：819-824，2000)、Modeller(Sali and Blundell，J.Mol.Biol.234：779-815，1993)和SwissPDB Viewer(Guex and Peitsch，Electrophoresis 18：2714-2713，1997)。对这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列中发挥功能的可能作用，例如，影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基的分析。以这种方式，可以从受体和输入序列选择FR残基并组合，从而实现所期望的抗体特征，如对靶标抗原提高的亲和力。通常，高变区残基直接并且最显著地参与影响抗原结合。
另一种抗体人源化的方法基于被称为人类序列含量(HSC)的抗体人性的度量。这种方法将小鼠序列与人种系基因组库相比较并将差异作为HSC打分。然后，通过将其HSC最大化，而不是使用全局同一性量度来使靶标序列人源化以产生多种不同的人源化变体。(Lazar等人，Mol.Immunol.44：1986-1998，2007)。
除以上所描述的方法外，经验方法可以用于产生和选择人源化抗体。这些方法包括基于大型人源化变体文库的产生和使用富集技术或高通量筛选技术的最佳克隆选择的那些方法。抗体变体可以分离自噬菌体、核糖体和酵母展示文库以及通过菌落筛选(参见，例如，Hoogenboom，Nat.Biotechnol.23：1105-1116，2005；Dufner等人，TrendsBiotechnol.24：523-529，2006；Feldhaus等人，Nat.Biotechnol.21：163-70，2003；Schlapschy等人，Protein Eng.Des.Sel.17：847-60，2004)。
在FR文库方法中，在FR中的特定位置引入一系列残基变体，然后选择文库以选择最佳支持移植的CDR的FR。要替换的残基可以包括鉴别为潜在有助于CDR结构的一些或全部“游标”残基(参见，例如，Foote and Winter，J.Mol.Biol.224：487-499，1992)或者来自Baca等人所鉴别的靶标残基的更有限的组(J.Biol.Chem.272：10678-10684，1997)。
在FR重排中，将完整FR与非人CDR组合，而不是产生所选残基变体的组合文库(参见，例如，Dall′Acqua等人，Methods 36：43-60，2005)。可以在两步选择方法中对于结合筛选文库，所述方法的第一步是将VL人源化，然后是VH。作为另外一种选择，可以使用一步FR重排法。己表明该方法比两步筛选更有效，因为所得抗体显示出改善的生物化学和理化性质，包括增强的表达、提高的亲和力和热稳定性(参见，例如，Damschroder等人，Mol.Immunol.44：3049-60，2007)。
“人源改造(humaneering)”方法基于必需最小特异性决定簇(MSD)的实验识别并且基于非人片段向人FR文库的顺序替换和结合评价。它起始于非人VH和VL链的CDR3的区域并且将非人抗体的其它区域逐渐替换为人FR，包括VH和VL两者的CDR1和CDR2。这种方法通常导致表位保留和抗体从具有不同人V-节段CDR的多个亚类的鉴别。人源改造允许与人种系基因抗体91-96％同源的抗体的分离。(参见，例如，Alfenito，Cambridge HealthtechInstitute’s Third Annual PEGS，The Protein Engineering Summit，2007)。
“人工程化”方法包括通过对抗体氨基酸序列做出特异性改变以产生在人中免疫原性降低同时仍然保留了原始非人抗体所期望的结合性质的修饰抗体，改变非人抗体或抗体片段，如小鼠或者嵌合抗体或抗体片段。通常，该技术包括将非人(例如，小鼠)抗体的氨基酸残基分类为“低风险”、“中风险”或“高风险”残基。使用相对于替换将影响所得抗体折叠和/或用人残基替换的风险评价做出特定替换的预测益处(例如，对于在人中的免疫原性)的全局风险/奖励计算来进行分类。可以通过将来自非人抗体可变区的氨基酸序列与特定或共有人抗体序列的相应区域进行比对来选择要在非人(例如，小鼠)抗体序列的给定位置(例如，低或中风险)处替换的特定人氨基酸残基。根据比对，非人序列中低或中风险位置处的氨基酸残基可以被替换为人抗体序列中的相应残基。制备人工程化蛋白的技术更详细地描述于Studnicka等人，Protein Engineering，7：805-814(1994)，美国专利5,766,886、5,770,196、5,821,123，和5,869,619，和PCT专利申请公开WO 93/11794。
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂包含非抗体蛋白质骨架。这种非抗体蛋白质骨架的非限制性实例包括纤连蛋白骨架、抗运载蛋白、纤连蛋白(adnectin)、亲和体(affibody)、DARPin、fynomer、affitin、affilin、高亲和性多聚体(avimer)、富含半胱氨酸的打结素(knottin)肽或者工程化Kunitz型抑制剂。产生这种非抗体蛋白质骨架的方法在本领域中是熟知的，其中任一种方法可以用于产生包含非抗体蛋白质骨架的多重特异性结合剂(参见，例如，Simeon and Chen，Protein Cell，9(1)：3-14(2018)；Yang等人，Annu Rev Anal Chem(Palo Alto Calif).10(1)：293-320(2017))。
还提供了用于产生多重特异性结合剂及其片段的材料。例如，分离的细胞(例如，杂交瘤)可以产生多重特异性结合剂(例如，抗体或抗体片段)。在这方面，细胞(例如，分离的细胞)可以产生包含含有分别如表1、2或3对于C40、C56或C59所示的VH和VL的第一结合域的抗体或其片段。作为另外一种选择或者另外，细胞(例如，分离的细胞)可以产生包含含有分别如表4、5或6对于P22、P24或P31.2所示的VH和VL的第二结合域的抗体或其片段。在一些实施方式中，本文所描述的多核苷酸可以包含编码所述多重特异性结合剂(例如，抗体或抗体片段)的一种或多种核酸序列。在一些实施方式中，所述多核苷酸是分离和/或重组多核苷酸。在多个方面，所述分离的多核苷酸包含编码抗体重链可变区(VH)和/或抗体轻链可变区(VL)的核苷酸序列，其中所述VH和所述VL包含与如表1所示的CDR、如表2所示的CDR或者如表3所示的CDR相同的互补决定区(CDR)。在多个方面，所述分离的多核苷酸包含编码抗体重链可变区(VH)和/或抗体轻链可变区(VL)的核苷酸序列，其中所述VH和所述VL包含与如表4所示的CDR、如表5所示的CDR或者如表6所示的CDR相同的互补决定区(CDR)。
在一些实施方式中，一个或多个载体(例如，表达载体)可以包含用于一个或多个多核苷酸在适合的宿主细胞中表达的一个或多个多核苷酸。这些载体(例如)对于在宿主细胞中扩增多核苷酸以产生其有用的量，和对于使用重组技术表达结合剂，如抗体或抗体片段是有用的。
在一些实施方式中，一个或多个载体是表达载体，其中一个或多个多核苷酸可操作性连接至一个或多个包含表达控制序列的多核苷酸。具体考虑了引入编码结合CD47的抗体序列的一个或多个多核苷酸的自主复制重组表达构建体，如质粒和病毒DNA载体。表达控制DNA序列包括启动子、增强子和操纵子，并且通常基于其中使用表达构建体的表达系统选择。通常对于提高基因表达的能力选择启动子和增强子序列，而通常对于调控基因表达的能力选择操纵子序列。表达构建体还可以包括编码允许鉴别具有所述构建体的宿主细胞的一个或多个可选择标志物的序列。表达构建体还可以包括有助于，并且优选地促进宿主细胞中同源重组的序列。在一些实施方式中，表达构建体还可以包括对于宿主细胞中的复制所必需的序列。
示例性表达控制序列包括启动子/增强子序列，例如，巨细胞病毒启动子/增强子(Lehner等人，J.Clin.Microbiol.，29：2494-2502，1991；Boshart等人，Cell，41：521-530，1985)；劳氏肉瘤病毒启动子(Davis等人，Hum.Gene Ther.，4：151，1993)；Tie启动子(Korhonen等人，Blood，86(5)：1828-1835，1995)；猿猴病毒40启动子；DRA(腺瘤中下调；Alrefai等人，Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.，293：G923-G934，2007)；MCT1(单羧酸转运体1；Cuff等人，Am.J.Physiol.Gastrointet.Liver Physiol.，G977-G979.2005)；和Math1(小鼠无调同源蛋白1；Shroyer等人，Gastroenterologgy，132：2477-2478，2007)，为了在哺乳动物细胞中表达，将所述启动子可操作性连接至多肽编码序列上游(例如，5′)。在另一个变化中，所述启动子是上皮细胞-特异性启动子或内皮细胞-特异性启动子。多核苷酸还可以任选地包括多肽编码序列下游(例如，3′)可操作性连接的适合的多腺苷酸化序列(例如，SV40或人生长激素基因多腺苷酸化序列)。
如果需要，所述一个或多个多核苷酸还任选地包含编码在框中与所述多肽序列融合的分泌性信号肽的核苷酸序列。所述分泌性信号肽指导通过表达一个或多个多核苷酸的细胞的抗体多肽的分泌并且被所述细胞从所述分泌的多肽上切割。所述一个或多个多核苷酸还可以任选地包含其仅有的预期功能将是辅助载体大规模生产的序列。可以使用己在文献中对于多种转基因描述的程序生产和施用用于基因疗法的多核苷酸。参见，例如，Isner等人，Circulation，91：2687-2692，1995；和Isner等人，Human Gene Therapy，7：989-1011，1996。
在一些实施方式中，多核苷酸还可以包含其它序列以帮助通过宿主细胞的吸收和所述抗体或其片段(和/或任何其它肽)的表达。在一些实施方式中，使用本文所描述的编码抗体或其片段的“裸”转基因(例如，无病毒、脂质体或其它载体辅助转染的转基因)。
任何适合的载体可以用于将编码抗体或其片段的一个或多个多核苷酸引入宿主中。已描述的示例性载体包括复制缺陷型反转录病毒载体，其包括(但不限于)慢病毒载体(Kim等人，J.Virol.，72(1)：811-816，1998；Kingsman&Johnson，Scrip Magazine，1998年10月，第43-46页)；细小病毒载体，如腺-相关病毒(AAV)载体(美国专利No.5,474,9351；5,139,941；5,622,856；5,658,776；5,773,289；5,789,390；5,834,441；5,863,541；5,851,521；5,252,479；Gnatenko等人，J.Invest.Med.，45：87-98，1997)；腺病毒(AV)载体(美国专利No.5,792,453；5,824,544；5,707,618；5,693,509；5,670,488；5,585,362；Quantin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：2581-2584，1992；Stratford Perricaudet等人，J.Clin.Invest.，90：626-630，1992；和Rosenfeld等人，Cell，68：143-155，1992)；腺病毒腺-相关病毒嵌合载体(美国专利No.5,856,152)或牛痘病毒或疱疹病毒载体(美国专利No.5,879,934；5,849,571；5,830,727；5,661,033；5,328,688)；lipofectin介导的基因转移(BRL)；脂质体载体(美国专利No.5,631,237)；及其组合。可以使用标准重组DNA技术制备任何这些表达载体，所述技术描述于(例如)Sambrook等人，Molecular Cloning，aLaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates and John Wiley&Sons，New York，N.Y.(1994)。任选地，通过(例如)缺失或破坏病毒复制所需的选择基因，使病毒载体成为复制-缺陷型。
其它所考虑的非病毒递送机制包括磷酸钙沉淀(Graham and Van Der Eb，Virology，52：456-467，1973；Chen and Okayama，Mol.Cell Biol.，7：2745-2752，1987；Rippe等人，Mol.Cell Biol.，10：689-695，1990)、DEAE-dextran(Gopal，Mol.Cell Biol.，5：1188-1190，1985)、电穿孔(Tur-Kaspa等人，Mol.Cell Biol.，6：716-718，1986；Potter等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，81：7161-7165，1984)、直接微注射(Harland and Weintraub，J.Cell Biol.，101：1094-1099，1985)、DNA负载的脂质体(Nicolau and Sene，Biochim.Biophys.Acta，721：185-190，1982；Fraley等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：3348-3352，1979；Felgher，Sci Am.，276(6)：102-6，1997；Felgher，Hum Gene Ther.，7(15)：1791-3，1996)、细胞超声处理(Fechheimer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：8463-8467，1987)、使用高速微弹的基因轰击(Yang等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA，87：9568-9572，1990)和受体-介导的转染(Wu and Wu，J.Biol.Chem.，262：4429-4432，1987；Wu andWu，Biochemistry，27：887-892，1988；Wu and Wu，Adv.Drug Delivery Rev.，12：159-167，1993)。
可以将表达载体(或本文所讨论的抗体或其片段)捕获在脂质体中。参见，例如，Ghosh and Bachhawat，In：Liver diseases，targeted diagnosis and therapy usingspecific receptors and ligands，Wu G，Wu C主编，New York：Marcel Dekker，第87-104页(1991)；Radler等人，Science，275(5301)：810-814，1997)。还考虑了多种商品化方法，包括“脂质转染”技术。在一些实施方式中，脂质体可以与血凝病毒(HVJ)复合。这己显示辅助与细胞膜融合和促进脂质体-包封的DNA的细胞进入(Kaneda等人，Science，243：375-378，1989)。在一些实施方式中，脂质体与核非组蛋白性染色体蛋白质(HMG-1)复合并结合其一起使用(Kato等人，J.Biol.Chem.，266：3361-3364，1991)。在一些实施方式中，脂质体与HVJ和HMG-1两者复合或结合两者一起使用。这些表达构建体己成功用于核酸的体外和体内转移和表达。在一些实施方式中，在脂质体中包括多重特异性结合剂(例如，抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂以将所述脂质体靶向在它们表面上表达CD47和/或PD-L1的细胞(如肿瘤细胞)。
细胞可以包含一个或多个多核苷酸或一个或多个载体，例如，用编码多重特异性结合剂(例如，抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂的一个或多个多核苷酸，或者包含所述一个或多个多核苷酸的一个或多个载体转化或转染所述细胞。在一些实施方式中，细胞表达多重特异性结合剂，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂，其与C40的CDR具有至少75％同一性(参见，例如，表1)。在一些实施方式中，细胞表达多重特异性结合剂，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂，其与C56的CDR具有至少75％同一性(参见，例如，表2)。在一些实施方式中，细胞表达多重特异性结合剂，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂，其与C59的CDR具有至少75％同一性(参见，例如，表3)。在一些实施方式中，细胞表达多重特异性结合剂，包括结合至CD47，包括人CD47和PD-L1，包括人PD-L1的多重特异性结合剂，其与P22的CDR具有至少75％同一性(参见，例如，表4)。在一些实施方式中，细胞表达多重特异性结合剂，包括结合至CD47，包括人CD47和PD-L1，包括人PD-L1的多重特异性结合剂，其与P24的CDR具有至少75％同一性(参见，例如，表5)。在一些实施方式中，细胞表达多重特异性结合剂，包括结合至CD47，包括人CD47和PD-L1，包括人PD-L1的多重特异性结合剂，其与P31.2的CDR具有至少75％同一性(参见，例如，表6)。所述细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌(Escherichia coli)(参见，例如，Pluckthun等人，Methods Enzymol.，178：497-515，1989)或者真核细胞，如动物细胞(例如，骨髓瘤细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或者杂交瘤细胞)、酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))或者植物细胞(例如，烟草、玉米、大豆或大米细胞)。哺乳动物宿主细胞的使用可以提供翻译修饰(例如，糖基化、截短、脂化和磷酸化)，这些修饰对于赋予重组表达产物最优生物活性可以是期望的。类似地，可以使多肽(例如，多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂)糖基化或非糖基化和/或己将所述多肽共价修饰以包括一个或多个水溶性聚合物连接，如聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。
将DNA或RNA引入宿主细胞的方法是熟知的，并且包括转化、转染、电穿孔、核注射或与载体，如脂质体、胶束、血影细胞和原生质体融合。这些宿主细胞对于扩增多核苷酸以及表达所述多核苷酸所编码的多肽是有用的。在这方面，生产多重特异性结合剂(例如，抗体)的方法可以包含培养宿主细胞并分离所述多重特异性结合剂。可以使用粒子轰击实现裸DNA表达构建体向细胞的转移，其基于将DNA涂覆的微弹加速至高速的能力，从而允许它们刺穿细胞膜并进入细胞而不杀死它们(Klein等人，Nature，327：70-73，1987)。己开发了一些用于加速小颗粒的装置。一种这种装置依赖于高压放电以产生电流，其反过来提供了动力(Yang等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA，87：9568-9572，1990)。所使用的微弹由生物学惰性物质，如钨或金珠组成。可以分离和/或纯化宿主细胞。宿主细胞还可以是体内转化以引起多肽体内瞬时或永久表达的细胞。宿主细胞还可以是离体转化并在转化后引入，例如，以体内产生用于治疗目的的多肽的分离的细胞。宿主细胞的定义明确排除了转基因人类。
用于从多核苷酸产生抗体的多种方法通常是熟知的。例如，Maniatis等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork，1989(还参见，Maniatis等人，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，2001)描述了基本分子生物学程序。另外，多种出版物描述了适合于通过DNA操纵、表达载体产生以及适合的细胞的转化和培养制备抗体的技术(参见，例如，Mountain and Adair，第1版，in Biotechnology and Genetic Engineering Reviews，Tombs主编，Intercept，Andover，UK，1992)；和Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel主编，WileyInterscience，New York，1999)。
使用任何适合的方法产生多重特异性结合剂(例如，抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂，例如，从免疫动物分离，重组或合成产生或基因工程，包括如以上所描述的。通过(例如)抗体的蛋白水解获得来源于抗体的抗体片段。例如，完整抗体的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化分别获得了被称为F(ab′)2的5S片段或者一价Fab片段和Fc片段。可以使用硫醇还原剂进一步切割F(ab)2以产生3.5S Fab一价片段。以下文献中进一步描述了产生抗体片段的方法，例如，Edelman等人，Methods in Enzymology，1：422Academic Press(1967)；Nisonoff等人，Arch.Biochem.Biophys.，89：230-244，1960；Porter，Biochem.J.，73：119-127，1959；美国专利No.4,331,647；和Andrews，S.M.and Titus，J.A.in Current Protocols inImmunology(Coligan等人主编)，John Wiley&Sons，New York(2003)，第2.8.12.8.10和2.10A.12.10A.5页。
可以将多重特异性结合剂(例如，抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂基因工程。例如，多重特异性结合剂(例如，抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂包含(例如)通过重组DNA工程技术产生的可变区结构域。在这方面，任选地通过抗体氨基酸序列中的插入、缺失或改变修饰可变区以产生所关心的抗体，包括如以上所描述的。例如，使用抗体产生细胞的mRNA作为模板，通过使用聚合酶链反应合成可变区来制备编码所关心的互补决定区(CDR)的多核苷酸(参见，例如，Courtenay Luck，“Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies，”in MonoclonalAntibodies：Production，Engineering and Clinical Application，Ritter等人(主编)，第166页(Cambridge University Press 1995)；Ward等人，“Genetic Manipulation andExpression of Antibodies，”in Monoclonal Antibodie：Principles andApplications，Birch等人，(主编)，第137页(Wiley Liss，Inc.1995)；和Larrick等人，Methods：A Companion to Methods in Enzymology，2：106-110，1991)。当前的抗体操纵技术允许构建含有至少一个CDR和任选地来自第一抗体的一个或多个框架氨基酸和来自第二抗体的剩余的可变区结构域的工程化可变区结构域。使用这些技术(例如)使抗体人源化或改善其对于结合靶标的亲和力。
“人源化抗体”是其中非人免疫球蛋白的可变重链和轻链的CDR被转移至人可变域的抗体。在一些实施方式中，恒定区不需要存在，但是如果它们存在，则它们任选地与人免疫球蛋白恒定区基本相同，例如，至少约85-90％、约95％、96％、97％、98％、99％或以上相同。因此，在一些情况下，除可能地CDR之外，人源化免疫球蛋白的所有部分与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。例如，人源化抗体是人免疫球蛋白(例如，宿主抗体)，其中宿主抗体的高变区残基被来自非人物种(供体抗体)，如小鼠、大鼠、兔或者具有所期望的特异性、亲和力和能力的非人灵长类动物的高变区残基替换。
在一些实施方式中，本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂在组合物中和在治疗、预防或减轻免疫细胞功能障碍疾病、病症或病况(例如，吞噬细胞功能障碍疾病、病症或病况或者T细胞功能障碍疾病、病症或病况)，包括所述疾病、病症或病况的一种或多种症状的方法中有用。吞噬细胞功能障碍疾病、病症和病况包括肿瘤免疫和相关癌症，其包括(但不限于)其中所述肿瘤细胞过表达CD47的任何癌症。T细胞功能障碍疾病、病症和病况包括肿瘤免疫和相关癌症，其包括(但不限于)其中所述肿瘤细胞表达或过表达PD-L1的任何癌症。这些CD47和/或PD-L1表达肿瘤细胞可以帮助肿瘤细胞逃逸免疫监视和清除(例如，肿瘤免疫)。另外，本文所描述的结合至CD47和一个或多个其它非CD47的靶标(例如，PD-L1)的多重特异性结合剂，如多重特异性抗体(例如，抗体，如双重特异性抗体)对于抑制SIRPα信号转导和/或PD-1信号转导，增强吞噬细胞功能和/或免疫监视以及增强肿瘤细胞去除有用。
在一些实施方式中，本文描述了治疗受试者中肿瘤免疫的方法，其包括向所述受试者施用本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂或其片段或者包含本文所描述的结合剂(例如，抗体)的药物组合物。
在一些实施方式中，本文描述了治疗受试者中癌症或肿瘤的方法，其包括向所述受试者施用本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂或其片段或者包含本文所描述的结合剂(例如，抗体)的药物组合物。
在一些实施方式中，本文描述了减轻受试者中与癌症或肿瘤相关的一种或多种症状的方法，其包括向所述受试者施用本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂或其片段或者包含本文所描述的结合剂(例如，抗体)的药物组合物。
在一些实施方式中，本文描述了降低具有肿瘤的受试者中肿瘤尺寸的方法，其包括向所述受试者施用本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂或其片段或者包含本文所描述的结合剂(例如，抗体)的药物组合物。
在一些实施方式中，本文描述了增强具有肿瘤的受试者中肿瘤细胞去除的方法，其包括向所述受试者施用本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂或其片段或者包含本文所描述的结合剂(例如，抗体)的药物组合物。
在一些实施方式中，本文描述了治疗受试者中吞噬细胞功能障碍疾病、病症或病况的方法，其包括向所述受试者施用本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂或其片段或者包含本文所描述的结合剂(例如，抗体)的药物组合物。
在一些实施方式中，本文描述了提高受试者中免疫细胞吞噬的方法，其包括向所述受试者施用本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂或其片段或者包含本文所描述的结合剂(例如，抗体)的药物组合物。在一些实施方式中，所述免疫细胞是巨噬细胞、嗜中性白细胞、树突状细胞或者B淋巴细胞。在一些实施方式中，所述受试者被诊断患有癌症或肿瘤。
在一些实施方式中，本文描述了治疗受试者中T细胞功能障碍疾病、病症或病况的方法，其包括向所述受试者施用本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂或其片段或者包含本文所描述的结合剂(例如，抗体)的药物组合物。在一些实施方式中，所述T细胞功能障碍疾病、病症或病况是肿瘤免疫。
在一些实施方式中，本文描述了增强受试者中T细胞功能的方法，其包括向所述受试者施用本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂或其片段或者包含本文所描述的结合剂(例如，抗体)的药物组合物。在一些实施方式中，所述T细胞功能是细胞因子分泌。在一些实施方式中，所述T细胞功能是肿瘤细胞去除。在一些实施方式中，所述受试者被诊断患有癌症或肿瘤。
可以结合本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂或其片段或者包含本文所描述的结合剂(例如，抗体)的药物组合物向以上所描述的方法的受试者施用一种或多种本文所描述的治疗剂。
在一些实施方式中，所述抗体是人抗体，其包括(但不限于)具有可变区的抗体，其中框架和CDR区两者来源于人种系免疫球蛋白序列，如(例如)Kabat等人(1991)Sequencesof proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health md HumanServices，NIH PublicationNo.91-3242。如果所述抗体含有恒定区，则所述恒定区还优选地来源于人种系免疫球蛋白序列。人抗体可以包含不被人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如，以增强抗体活性，但是不包含来源于其它物种的CDR(例如，置于人可变框架区内的小鼠CDR)。
在一些实施方式中，多重特异性结合剂(例如，抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂提高了吞噬和/或增强了细胞培养中细胞的吞噬活性。例如，这些细胞培养物可以包括表达或过表达CD47的肿瘤细胞。在一些实施方式中，多重特异性结合剂(例如，抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和PD-L1，包括人PD-L1的多重特异性结合剂，提高了T细胞功能和/或增强了细胞培养中细胞的溶胞活性。这些细胞培养物可以包括表达或过表达PD-L1的肿瘤细胞。在一些实施方式中，多重特异性结合剂(例如，抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和PD-L1，包括人PD-L1的多重特异性结合剂，提高吞噬，增强吞噬活性，提高T细胞功能和/或增强细胞培养中细胞的溶胞活性。这些细胞培养物可以包括表达或过表达CD47和PD-L1的肿瘤细胞。肿瘤细胞包括(但不限于)乳腺癌细胞、膀胱癌细胞、黑素瘤细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤细胞、肺癌细胞、睾丸癌细胞、甲状腺癌细胞、鳞状细胞癌细胞、成胶质细胞瘤细胞、成神经细胞瘤细胞、子宫癌细胞、结肠直肠癌细胞和胰腺癌细胞。
在一些实施方式中，本文描述了抑制受试者中肿瘤细胞增殖的方法。例如，所述方法包括施用对于抑制肿瘤细胞增殖有效的量的本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体)，如结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂。在一些实施方式中，所述方法包括施用与抗体C40、抗体C56和/或抗体C59(参见，例如，表1、2和/或3的CDR和VH/VL)竞争对于人CD47的结合并且结合抗体C40、抗体C56和/或抗体C59(参见，例如表1、2和/或3的CDR和VH/VL)所识别的CD47区，从而导致肿瘤细胞去除增强的多重特异性结合剂(例如，抗体)。在一些实施方式中，所述方法包括施用与抗体P22、抗体P24和/或抗体P31.2(参见，例如，表4、5和/或6的CDR和VH/VL)竞争对于人PD-L1的结合并且结合抗体P22、抗体P24和/或抗体P31.2(参见，例如，表4、5和/或6的CDR和VH/VL)所识别的PD-Ll区，从而导致肿瘤细胞去除增强的多重特异性结合剂(例如，抗体)。在一些实施方式中，如以上所描述的一种或多种多核苷酸、载体和/或细胞可以用于增强肿瘤细胞体内去除的方法(例如，治疗受试者中癌症的方法)。
还提供了调节(例如，抑制、降低、防止)受试者中肿瘤生长的方法。例如，所述方法包括以对于调节受试者中肿瘤生长有效的量向所述受试者施用包含多重特异性结合剂(例如，抗体)的组合物。“肿瘤”是指任何赘生性细胞生长或增殖，无论是恶性还是良性的，并且是指所有癌前和癌性细胞和组织。术语“癌症”或“癌性的”是指或描述通常以无限制的细胞生长为特征的哺乳动物中的生理状况。癌症的实例包括(但不限于)：乳腺癌、结肠癌、肾癌、肺癌、鳞状细胞骨髓性白血病、血管瘤、黑素瘤、星形细胞瘤和成胶质细胞瘤以及其它细胞-增殖性疾病状况，其包括(但不限于)：心脏：肉瘤(血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤)、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤；肺：支气管癌(鳞状细胞、未分化的小细胞、未分化的大细胞、腺癌)、肺泡(支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨瘤性错构瘤、中皮瘤；胃肠：食管(鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌瘤、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰脏(导管腺癌、胰岛瘤、胰升血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、舒血管肠肽瘤)、小肠(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波济氏肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、纤维神经瘤、纤维瘤)、大肠(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)；泌尿生殖道：肾(腺癌、胚胎性癌肉瘤(肾胚细胞瘤)、淋巴瘤、白血病、肾细胞癌)、膀胱和尿道(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺(前列腺的腺癌、肉瘤、小细胞癌)、睾丸(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤、脂肪瘤)；肝脏：肝癌(肝细胞癌)、肝胆管型肝癌、肝胚细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、血管瘤；骨：骨原性肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、恶性巨细胞瘤脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨性外生骨疣)、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨肌瘤样纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤；神经系统：颅骨(骨瘤、血管瘤、肉芽瘤、黄瘤、畸形性骨炎)、脑膜(脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经胶质过多)、脑(星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、胚组织瘤(松果体瘤)、多形性成胶质细胞瘤、寡枝神经胶质细胞瘤、许旺氏细胞瘤、成视网膜细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓纤维神经瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤)；妇科：子宫(子宫内膜癌)、宫颈(宫颈癌、肿瘤前子宫颈非典型增生)、卵巢(卵巢癌)浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、未分类癌、颗粒-卵泡膜细胞瘤、塞-莱细胞瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴(鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤)、阴道(明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄样肉瘤(胚胎性横纹肌肉瘤)、输卵管(癌瘤)；血液学：血液(骨髓性白血病(急性和慢性)、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓增殖性疾病、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良综合征)、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤(恶性淋巴瘤)；皮肤：恶性黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波济氏肉瘤、moles发育不良痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕瘤、银屑病；和肾上腺：成神经细胞瘤；以及甲状腺癌，包括髓样甲状腺癌。还提供了通过向对其有需要的受试者单独或与另一种试剂组合施用多重特异性结合剂(例如，抗体)，如结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂治疗癌症的方法。
“增强”肿瘤细胞去除不需要100％增强去除。考虑了去除率的任何增强。类似地，“调节”肿瘤生长是指降低肿瘤尺寸，减缓生长肿瘤或者抑制现有肿瘤的尺寸。不需要肿瘤完全消除；肿瘤尺寸的任何减少或者肿瘤生长的减缓构成了受试者中有益的生物作用。在这方面，与不存在所述方法的情况下所观察到的去除水平相比(例如，在未暴露于所述方法的试剂的生物学对比对照受试者或试样中)，可以将肿瘤细胞去除增强(例如)至少约5％、至少约10％或者至少约20％。例如，通过肿瘤尺寸减小、肿瘤标志物水平降低或维持或者肿瘤细胞群体的减小或维持检测效果。在一些实施方式中，与不存在所述方法的多重特异性结合剂(例如，抗体)的情况下的肿瘤细胞的去除相比，肿瘤细胞的去除增强了(例如)至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％或者以上(约100％)。
另外，多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)可以用于减轻或降低与癌症有关的副作用，例如，骨退化、脊椎塌陷和瘫痪。在一个方面，所述受试者患有骨转移或者具有患骨转移的风险，并且以减少周围骨的退化的量施用多重特异性结合剂(例如，抗体)。因此，在一些方面，多重特异性结合剂防止由于骨转移所造成的骨退化，其中减少或未减少肿瘤细胞增殖。在一些方面，多重特异性结合剂(例如，抗体)防止由于骨转移所造成的骨退化并且减少肿瘤细胞增殖。通常，对肿瘤细胞增殖的作用(例如，增殖抑制或对增殖无作用)取决于具体转移的微环境。例如，可以抑制位于具有显著的量的1型胶原蛋白的微环境中的转移增殖。相反，可以不抑制位于缺少显著的量的1型胶原蛋白的微环境中的转移的增殖，但是减少或防止了转移附近的骨退化。
特定受试者的多重特异性结合剂(例如，抗体)的特定施用方案将部分取决于所使用的试剂、所施用的试剂的量、施用途径和任何副作用的原因和程度。向受试者(例如，哺乳动物，如人)施用的试剂(例如，抗体)的量应足以在合理的时间框内产生所期望的反应。因此，在一些实施方式中，向受试者施用的本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体)或药物组合物的量是有效量。在一些实施方式中，向受试者施用的本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体)或药物组合物的量是治疗有效量。在一些方面，所述方法包括施用(例如)约0.1μg/kg至多至约100mg/kg或以上。在一些实施方式中，所述剂量在约1μg/kg多至约100mg/kg；或者约5μg/kg多至约100mg/kg；或者约10μg/kg多至约100mg/kg；或者约1mg/kg多至约50mg/kg；或者约2mg/kg多至约30mg/kg；或者约3mg/kg多至约25mg/kg；或者约3mg/kg多至约25mg/kg；或者约5mg/kg多至约10mg/kg；或者约10mg/kg多至约20mg/kg；或者约10mg/kg多至约30mg/kg的范围内。一些病况或疾病状态需要延长治疗，其可以或可以不需要在多次施用内(例如，对于3天、7天、2周、3周、1个月、3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、两年或者更长时间的治疗期每天、每周三次、每周一次、每两周一次或者每月一次)施用多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)，包括结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂(例如，抗体，如双重特异性抗体)的剂量。
适合的包含多重特异性结合剂(例如，抗体)，如结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂(例如，抗体)的组合物的施用途径在本领域中是熟知的。尽管可以使用不止一种途径来施用试剂(例如，抗体)，但是特定途径可以提供比另一种途径更快速且更有效的反应。根据情况，将包含多重特异性结合剂(例如，抗体)，如结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂的组合物应用或滴注至体腔中、通过皮肤或粘膜吸收、摄入、吸入和/或引入循环。例如，可以期望通过经由静脉内、皮下、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门静脉内、病灶内、髓内、鞘内、心室内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、尿道、阴道或直肠方式注射、通过缓释系统或者通过植入装置递送包含多重特异性结合剂(例如，抗体)，如结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂的组合物。如果需要，经由流向所关心的区域，例如，经由肝动脉向肝脏递送的动脉内或静脉内施用局部施用多重特异性结合剂(例如，抗体)，如结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂。作为另外一种选择，经由其上吸收或包封了所述结合剂的膜、海绵或另一种适合的材料的植入，局部施用多重特异性结合剂(例如，抗体)，如结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂。当使用植入装置时，在一个方面，将所述装置植入任何适合的组织或器官，并且多重特异性结合剂(例如，抗体)，如结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂的递送(例如)经由扩散、定时释放丸剂或连续施用。在其它方面，将所述多重特异性结合剂直接施用至肿瘤切除术或其它手术程序期间暴露的组织。
本发明公开提供了组合物，如药物组合物，其包含多重特异性结合剂(例如，抗体)，如结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂，和载体(例如，药物可用的载体)。所使用的具体载体可以取决于化学-物理考虑，如溶解度和与结合剂缺少反应性或者共疗法以及通过施用途径。药物可用的载体是本领域中熟知的，本文描述了它们的实例。适合于注射使用的说明性药物形式包括无菌水溶液或分散系和用于无菌可注射溶液或分散系的即时制备的无菌粉末。注射制剂进一步描述于，例如，Pharmaceutics and Pharmacy Practice，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia.Pa.，Banker and Chalmers主编，第238-250页(1982)和ASHP Handbook onInjectable Drugs，Toissel，第4版，第622-630页(1986))。在一个方面，将包含多重特异性结合剂(例如，抗体)，如结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂的药物组合物与提供有关这些药物组合物的使用的说明的包装材料一起置于容器内。通常，这些说明包括描述对于所述药物组合物复原可能是必需的试剂浓度，并且在一些实施方式中，赋形剂成分或稀释剂(例如，水、盐水或PBS)的相对量的明确表达。
在一些方面，本文所描述的方法还包括施用一种或多种其它试剂，包括治疗剂(例如，组合疗法)，其可以存在于组合物中或者可以与多重特异性结合剂(例如，抗体)，如结合至CD47，包括人CD47和一个或多个非CD47的靶标(例如，PD-L1，包括人PD-L1)的多重特异性结合剂一起施用，或者提供于使用相同或不同施用途径的单独组合物中。可以与多重特异性结合剂(例如，抗体)一起或单独(例如，同时、替代、顺序)施用一种或多种其它试剂，包括治疗剂。这些其它治疗剂包括(但不限于)治疗抗体、免疫疗法、细胞毒性剂、化疗剂和抑制剂。
可以使用的治疗抗体包括(但不限于)曲妥珠单抗；阿昔单抗；达昔单抗(daclizumab)；BEC2；IMC-C22；整合素拮抗剂(Vitaxin)；Campath 1H/LDP-03；Smart M195；依帕珠单抗；贝妥莫单抗；维西珠单抗；CM3、人源化抗-ICAM3抗体；IDEC-114；替伊莫单抗替坦(tiuxetan)；IDEC-131；IDEC-151；IDEC-152；SMART抗-CD3；依库珠单抗；阿达木单抗；赛妥珠单抗；IDEC-1 51；MDX-CD4；CD20-抗生蛋白链菌素；CDP571；LDP-02；OrthoCloneOKT4A；卢利珠单抗；那他珠单抗；和乐德木单抗。
可以使用的免疫疗法包括(但不限于)细胞因子，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒性白细胞-集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1-alpha、白介素(包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和IL-27)、肿瘤坏死因子(包括TNF-alpha)和干扰素(包括IFN-alpha、IFN-beta和IFN-gamma)；氢氧化铝(明矾)；卡介苗(BCG)；钥孔血蓝素(KLH)；弗氏不完全佐剂(IF A)；QS-21；DETOX；左旋咪唑；和二硝基苯基(DNP)，及其组合，如(例如)白介素，例如，IL-2与其它细胞因子，如IFN-α的组合。在一些实施方式中，所述免疫疗法包括调节免疫应答的免疫治疗剂，例如，检查点抑制剂或检查点激动剂。在一些实施方式中，所述免疫治疗剂是本领域中己知的靶向下列的抗体调节剂：PD-1、PD-L1、PD-L2、CEACAM(例如，CEACAM-1、-3和/或-5)、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGF beta、OX40、41BB、LIGHT、CD40、GITR、TGF-beta、TIM-3、SIRP-alpha、VSIG8、BTLA、SIGLEC7、SIGLEC9、ICOS、B7H3、B7H4、FAS和/或BTNL2等。在一些实施方式中，所述免疫治疗剂是提高自然杀伤(NK)细胞活性，抑制免疫应答抑制，抑制抑制性细胞或抑制性细胞活性，抑制Treg活性或者抑制抑制性免疫检查点受体活性的试剂。
在一些实施方式中，所述免疫治疗剂包括T细胞调节剂，其选自共刺激分子的激动剂或激活剂。在一个实施方式中，所述共刺激分子的激动剂选自GITR、OX40、ICOS、SLAM(例如，SLAMF7)、HVEM、LIGHT、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-l、LFA-l(CD1 la/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、CD30、CD40、BAFFR、CD7、NKG2C、NKp80、CD160、B7-H3或者CD83配体的激动剂(例如，激动性抗体或其抗原-结合片段，或者可溶性融合)。在其它实施方式中，效应细胞组合包括双重特异性T细胞接合剂(例如，结合至CD3和肿瘤抗原(例如，EGFR、PSCA、PSMA、EpCAM、HER2等)的双重特异性抗体分子)。
可以使用的细胞毒性剂包括抑制或防止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。示例性细胞毒性剂包括(但不限于)放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；生长抑制剂；酶及其片段，如溶核酶；和毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段和/或变体。其它示例性细胞毒性剂可以选自抗-微管剂、铂配位络合物、烷化剂、抗生素试剂、拓扑异构酶II抑制剂、抗代谢物、拓扑异构酶I抑制剂、激素和激素类似物、信号转导通路抑制剂、非受体酪氨酸激酶血管生成抑制剂、免疫治疗剂、促凋亡试剂、LDH-A抑制剂；脂肪酸生物合成抑制剂；细胞周期信号转导抑制剂；HDAC抑制剂、蛋白酶体抑制剂；和癌症代谢抑制剂。
可以使用的化疗剂包括在癌症治疗中有用的化合物。化疗剂的实例包括(但不限于)厄洛替尼、硼替佐米、双硫仑、表没食子儿茶素没食子酸酯、salinosporamide A、卡非佐米、17-AAG(格尔德霉素)、根赤壳菌素、乳酸脱氢酶A(LDH-A)、氟维司群、舒尼替尼、来曲唑、伊马替尼甲磺酸盐、氟马磺草酸、奥沙利铂、5-FET(5-氟尿嘧啶)、亚叶酸、雷帕霉素、拉帕替尼、Lonafamib(SCH 66336)、索拉非尼、Bayer Labs)、吉非替尼、AG1478；烷化剂，如塞替派和
；环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，如苯并多巴、卡波醌、米特多巴(meturedopa)和尤利多巴(uredopa)；氮丙啶和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺、三来乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；多聚乙酰(具体地，布拉他辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括拓扑替康和伊立替康)；苔藓抑素；海绵抑素；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(具体地，念珠藻素1和念珠藻素8)；肾上腺类固醇(包括泼尼松和泼尼松龙)；醋酸赛普罗特博；5alpha-还原酶，包括非那雄胺和度他雄胺)；伏立诺他、罗米地辛、帕比司他、丙戊酸、莫西司他尾海兔素；阿地白介素、滑石倍癌毒素(talc duocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素；水鬼蕉碱(pancrati statin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素；氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新恩比星、胆甾醇对苯乙酸氮芥、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀；亚硝基脲，如卡莫司汀、吡葡亚硝脲、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，如烯二炔抗生素(例如，卡里奇霉素(calicheamicin)，具体地，卡里奇霉素(calicheamicin)gamma II和卡里奇霉素(calicheamicin)omega I(AngewChem.Inti.Ed.Engl.199433：183-186)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素(dynemicin)A；二膦酸酯，如氯屈膦酸；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、安曲霉素(authrarnycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星、吗啉代-多柔比星，氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉并-多柔比星和脱氧多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素，如丝裂霉素C、麦考酚酸，诺加霉素(nogalarnycin)、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗-代谢产物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤胺、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如环胞苷、阿扎胞苷、氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氮尿苷；雄激素，如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酪；抗-肾上腺剂，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基-γ-酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；贝斯布西(bestrabucil)；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；elfomithine；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登素，如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙酰肼；丙卡巴肼；/>
多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，Ore.)；雷佐生；根霉素；西索菲兰；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯，具体地T-2毒素、疣孢霉素(verracurin)A、杆孢菌素A和蛇形菌素(anguidine)；氨基甲酸乙酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；类紫杉醇，例如，紫杉醇、/>
(无克列莫佛)、紫杉醇的白蛋白-工程化纳米颗粒制剂(AmericanPharmaceutical Partners，Schaumberg，Ill.)和多西他赛(docetaxel/doxetaxel)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺凡特龙(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；卡培他滨；伊班膦酸；CPT-II；局部异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，如视黄酸；和任何上述的药物可用的盐、酸和衍生物。化疗剂还包括(i)起作用以调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗-激素剂，如抗-雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括(例如)他莫昔芬(包括柠檬酸它莫西芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、iodoxyfene、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和柠檬酸托瑞米芬；(ii)抑制调节雌激素在肾上腺中产生的酶芳香酶的芳香酶抑制剂，如(例如)4(5)-咪唑、氨鲁米特、甲地孕酮、依西美坦、福美坦、法倔唑、伏氯唑、来曲唑和阿那曲唑；(iii)抗-雄激素，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮脯利特和戈舍瑞林；布舍瑞林、曲普瑞林、醋酸甲羟孕酮、己烯雌酚、普雷马林、氟甲睾酮、全反式视黄酸、芬维A胺以及曲沙他滨(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白激酶抑制剂；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，具体地抑制基因在涉及异常细胞增殖的信号转导通路中的表达的那些，如(例如)PKC-alpha、Ralf和H-Ras；(vii)核糖酶，如VEGF表达抑制剂(例如，
)和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗，如基因疗法疫苗，例如，
和/>
；/>
、rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂，如/>
；/>
；和(ix)任何上述的药物可用的盐、酸和衍生物。
化疗剂还包括如以上所描述的抗体，包括阿仑珠单抗、贝伐单抗；西妥昔单抗；帕尼单抗、利妥昔单抗、帕妥珠单抗、托西莫单抗和抗体药物缀合物，吉妥珠单抗奥唑米星。作为与如本文所描述的多重特异性结合剂(例如，抗体)组合的试剂的具有治疗潜力的其它人源化单克隆抗体包括：阿泊珠单抗(apolizumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、atlizumab、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、bivatuzumab mertansine、莫坎妥珠单抗(cantuzumabmertansine)、西利珠单抗(cedelizumab)、培舍珠单抗(certolizumab pegol)、cidfusituzumab、cidtuzumab、达克珠单抗(daclizumab)、依库珠单抗(eculizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、非维珠单抗(felvizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumabozOgamicin)、英妥珠单抗奥佐米星(inotuzumab ozogamicin)、伊匹木单抗(ipilimumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、莫维珠单抗(motavizumab)、motovizumab、那他珠单抗(natalizumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、纳武单抗(nivolumab)、nolovizumab、numavizumab、ocrelizumab、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕考珠单抗(pascolizumab)、pecfusituzumab、pectuzumab、培克珠单抗(pexelizumab)、ralivizumab、雷珠单抗(ranibizumab)、reslivizumab、瑞利珠单抗(reslizumab)、resyvizumab、罗维珠单抗(rovelizumab)、卢利珠单抗(ruplizumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、西利珠单抗(siplizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、tacatuzumab tetraxetan、tadocizumab、他利珠单抗(talizumab)、特非珠单抗(tefibazumab)、托珠单抗(tocilizumab)、托利珠单抗(toralizumab)、tucotuzumab西莫白介素(celmoleukin)、tucusituzumab、umavizumab、乌珠单抗(urtoxazumab)、优特克单抗(ustekinumab)、维西珠单抗(visilizumab)和抗白介素-12(ABT-8744695，Wyeth Research and Abbott Laboratories)，它是经遗传修饰以识别白介素-12p40蛋白的重组唯一人序列，全长IgGl gamma抗体。化疗剂还包括地塞米松、干扰素、秋水仙碱、氯苯氨啶、环胞霉素、两性霉素、甲硝唑、阿仑珠单抗、阿利维A酸、别嘌醇、氨磷汀、三氧化二砷、门冬酰胺酶、活卡介苗、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、克拉屈滨、氯法拉滨、达贝泊汀alfa、地尼白介素-2、右雷佐生、阿法依伯汀、厄洛替尼、非格司亭、组氨瑞林乙酸酯、替伊莫单抗、干扰素alfa-2a、干扰素alfa-2b、来那度胺、左旋咪唑、美司钠、甲氧沙林、诺龙、奈拉滨、诺菲妥珠单抗、奥普瑞白介素、帕利夫明、帕米膦酸、培加酶、培门冬酶、聚乙二醇化非格司亭、培美曲唑二钠、普卡霉素、卟吩姆钠、奎纳克林、拉布立酶、沙格司亭、替莫唑胺、VM-26、6-TG、托瑞米芬、维甲酸、ATRA、戊柔比星、唑来膦酸和唑来膦酸及其药物可用的盐。
化疗剂还包括氢化可的松、醋酸氢化可的松、醋酸可的松、替可的松新戊酸酯、曲安奈德、曲安西龙醇、莫米松、安西奈德、布地奈德、地奈德、醋酸氟轻松、氟轻松、倍他米松、倍他米松磷酸钠、地塞米松、地塞米松磷酸钠、氟可龙、氢化可的松-17-丁酸酯、氢化可的松-17-戊酸酯、二丙酸阿氯米松、倍他米松戊酸酯、倍他米松二丙酸酯、泼尼卡酯、氯倍他松-17-丁酸酯、氯倍他索-17-丙酸酯、氟可龙己酸酯、氟可龙新戊酸酯和氟泼尼定乙酸酯；免疫选择性抗炎肽(ImSAID)，如苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸(FEG)及其D-异构形成(feG)(IMULAN BioTherapeutics，LLC)；抗-风湿药物，如硫唑嘌呤、环孢素(环胞霉素A)、D-青霉胺、氯金酸钠、羟氯喹、来氟米特(leflunomide)、米诺环素(minocycline)、柳氮磺吡啶、肿瘤坏死因子alpha(TNF alpha)阻断剂，如依那西普、英利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、戈利木单抗(Simponi)、白介素1(IL-1)阻断剂，如阿那白滞素、T细胞共刺激阻断剂，如阿巴西普、白介素6(IL-6)阻断剂，如托珠单抗；白介素13(IL-L3)阻断剂，如雷贝珠单抗；干扰素alpha(IFN)阻断剂，如罗利珠单抗；Beta7整合素阻断剂，如rhuMAb Beta7；IgE途径阻断剂，如抗M1 prime；分泌型同三聚LTa3和膜结合型异三聚LTal/132阻断剂，如抗淋巴毒素alpha(LTa)；混杂调查性试剂，如thioplatin、PS-341、丁酸苯酯、ET-I8-OCH3或法尼基转移酶抑制剂(L-739749、L-744832)；多酚，如槲皮素、白藜芦醇、piceatannol、表没食子儿茶素没食子酸酯、茶黄素、黄烷醇、原花青素、桦木酸及其衍生物；自噬抑制剂，如氯喹；delta-9-四氢大麻酚(屈大麻酚)；beta-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙碱；桦木酸；乙酰喜树碱、东莨菪亭和9-氨基喜树碱)；鬼臼毒素；替加氟；贝沙罗汀；二膦酸盐类，如氯膦酸盐、羟乙二磷酸酯、NE-58095，唑来膦酸/唑来膦酸盐、胺丁羟磷酸盐、帕米膦酸盐、替鲁膦酸盐或利塞膦酸盐；和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，如
疫苗；哌立福辛、COX-2抑制剂(例如，塞来考昔或艾托考昔)、蛋白体抑制剂(例如，PS341)；CCI-779；tipifarnib(R11577)；orafenib、ABT510；Bcl-2抑制剂，如奥利默森钠匹克生琼(oblimersen sodium pixantrone)；法尼基转移酶抑制剂，如lonafamib(SCH 6636)；和任何上述药物可用的盐、酸或衍生物；以及上述两种或更多种的组合，如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙的组合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂与5-FU和亚叶酸组合的治疗方案的缩写)。化疗剂还包括多聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制剂：奥拉帕尼、卢卡帕尼、尼拉帕尼、他拉唑帕尼。
可以使用的抑制剂包括(但不限于)激酶抑制剂，如伊马替尼、巴瑞克替尼、吉非替尼、厄洛替尼、索拉非尼、达沙替尼、舒尼替尼、拉帕替尼、尼罗替尼、吡非尼酮、帕唑帕尼、克唑替尼(crizotinib)、威罗非尼、凡德他尼、鲁索替尼、阿西替尼、博舒替尼、瑞格菲尼、托法替尼、卡博替尼、普纳替尼、曲美替尼、达拉非尼、阿法替尼、依鲁替尼、色瑞替尼、艾代拉里斯、尼达尼布、帕博西尼(Palbociclib)、乐伐替尼、考比替尼、abemaciclib、阿卡替尼、艾乐替尼、比美替尼、布加替尼、恩科菲尼、厄达替尼、依维莫司、福他替尼(Fostamatinib)、gilter、拉罗替尼(Larotrectinib)、洛拉替尼(lorlatinib)、奈妥舒迪(netarsudil)、奥希替尼、培米加替尼(pemigatinib)、派西替尼(pexidartinib)、瑞博西尼(ribociclib)、替西罗莫司、XL-092、XL-147、XL-765、XL-499和XL-880。在一些实施方式中，如本文所描述的化合物可以与HSP90抑制剂(例如，XL888)、肝X受体(LXR)调节剂、类视黄醇-相关孤儿受体γ(RORy)调节剂、检查点抑制剂，如CK1抑制剂或aCK1α抑制剂、Wnt通路抑制剂(例如，SST-215)或盐皮质激素受体抑制剂(例如，艾沙利酮(esaxerenone))或者xL-888组合用于治疗本文所公开的疾病，如癌症。在一些实施方式中，如本文所公开的多重特异性结合剂(例如，抗体)可以与下列激酶中的一种或多种抑制剂组合用于治疗癌症：Akt1、Akt2、Akt3、TGF-βR、PKA、PKG、PKC、CaM-激酶、磷酸化酶激酶、MEKK、ERK、MAPK、mTOR、EGFR、HER2、HER3、HER4、1NS-R、IGF-1R、IR-R、PDGFαR、PDGFβ/R、CSFIR、KIT、FLK-II、KDR/FLK-1、FLK-4、flt-1、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、Ron、Sea、TRKA、TRKB、TRKC、FLT3、VEGFR/Flt2、Flt4、EphAl、EphA2、EphA3、EphB2、EphB4、Tie2、Src、Fyn、Lck、Fgr、Btk、Fak、SYR、FRK、JAK(JAK1和/或JAK2)、ABL、ALK、CDK7、CDK12、KRAS和B-Raf。
可以与本发明公开所述的多重特异性结合剂(例如，抗体)组合用于治疗癌症的抑制剂的其它非限制性实例包括FGFR抑制剂(FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4，例如，培米加替尼(pemigatinib)、EGFR抑制剂(也称为ErB-1或HER-1；例如，厄洛替尼、吉非替尼、凡德他尼、奥希替尼(orsimertinib)、西妥昔单抗、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)或帕尼单抗)、VEGFR抑制剂或通路阻断剂(例如，贝伐单抗、帕唑帕尼、舒尼替尼、索拉非尼、阿西替尼、瑞格菲尼、普纳替尼、凡德他尼、雷莫芦单抗、乐伐替尼、阿柏西普(ziv-aflibercept))、PARP抑制剂(例如，奥拉帕尼、rucaparib、维利帕尼或尼拉帕尼)、JAK抑制剂(例如，鲁索替尼、巴瑞克替尼、依他替尼(itacitinib))、IDO抑制剂(例如，爱帕司他(epacadostat)、NLG919或BMS-986205、MK7162)、LSD1抑制剂、TDO抑制剂、PI3K-delta抑制剂(例如，帕萨昔布(parsaclisib))、PI3K-gamma抑制剂，如PI3K-gamma选择性抑制剂、Pim抑制剂、CS F1R抑制剂、TAM受体酪氨酸激酶(Tyro-3、Ax1和Mer)、腺苷酸受体拮抗剂(例如，A2a/A2b受体拮抗剂)、HPK1抑制剂、趋化因子受体抑制剂(例如，CCR2或CCR5抑制剂)、SHP1/2磷酸酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC)，如HDAC8抑制剂、血管生成抑制剂、白介素受体抑制剂、溴区及额外末端家族成员抑制剂(bromo and extra terminal family membersinhibitors)(例如，溴结构域抑制剂或BET抑制剂或其组合)。
在一些实施方式中，如本文所公开的多重特异性结合剂可以与PD-1的抑制剂或者PD-L1的抑制剂，例如，抗-PD-1单克隆抗体或者抗-PD-L1单克隆抗体组合使用，例如，纳武单抗(Opdivo)、派姆单抗(可瑞达(Keytmda)、MK-3475)、阿特珠单抗、阿维鲁单抗(avelumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、斯巴达利珠单抗(spartalizumab)、坎立珠单抗(camrelizumab)、塞特瑞利单抗(cetrelimab)、特瑞普利单抗(toripalimab)、信迪利单抗(sintilimab)、AB122、JTX-4014、BGB-108、BCD-100、BAT1306、LZM009、AK105、HLX10和TSR-042、AMP-224、AMP-514、PDR001、德瓦鲁单抗、皮地利珠单抗(pidilizumab)(
，CT-011)、CK-301、BMS 936559、MPDL3280A、tislelizumab、BMS-935559、MEDI4736、FAZ053、KN035、CS1001、CBT-502、A167、STI-A101、BGB-A333、MSB-2311、HLX20、AUNP12、CA-170、BMS-986189、LY3300054和MSB0010718C。
在一些实施方式中，如本文所公开的多重特异性结合剂可以与CTLA-4抑制剂组合使用，例如，抗-CTLA-4抗体，例如，普利木单抗(Yervoy)、替西木单抗(tremelimumab)和AGEN1884，或者与磷脂酰丝氨酸抑制剂组合使用，例如，巴维昔单抗(bavituximab)(PGN401)，或者与细胞因子(IL-10、TGF-b等)的抗体组合使用，或者与结合至PD-L1和CTLA-4(例如，AK104)或者PD-1和CTLA-4的双重特异性抗体组合使用，或者与其它抗癌剂，如西米普利单抗(cemiplimab)组合使用。
所述其它试剂可以是以上所描述的任何这些治疗剂或其它试剂的药物可用的盐、酯、酰胺、水合物和/或前体药物。
应理解在本文所描述的定义和主题内还提供了不显著影响本文所描述的多个实施方式的活性的改变。因此，以下实施例旨在说明，但不限制本发明的公开内容。
实施例
实施例1.抗体产生
噬菌体展示
为了获得人CD47和PD-L1的结合剂，通过人Fab文库的噬菌体展示实施并且使用标准规程进行抗体发现。人CD47的胞外域购自Acro Biosystems(生物素化的人CD47His-Avitag Acro产品目录号No.CD7-H82E9和人CD47His-标签Acro产品目录号No.CD7-5227)。人PD-L1的胞外域购自Acro Biosystems(人PD-L1-His标签Acro产品目录号No.PD1H5229，生物素化的人PD-L1-His Avitag Acro产品目录号No.PDL-H82E4)。根据需要，使用标准规程，使用EZ-Link NHS-PEG12-生物素(ThermoScientific产品目录号No.21312)使CD47或PD-L1的非生物素化的胞外域生物素化。使用标准规程，通过噬菌体ELISA筛选噬菌体克隆结合至生物素化的人CD47或者生物素化的人PD-L1的能力。简要地，使用能够在噬菌体中复制和表达的表达载体(也称为噬粒)构建Fab-形式转化的噬菌体文库。在相同表达载体中编码重链和轻链两者，其中重链融合至噬菌体外壳蛋白pIII的截短变体中。作为单独多肽表达轻链和重链-pIII融合并在其中氧化还原电势能够使二硫键形成的细菌外周胞质中组装，以形成候选抗体的抗原结合域(Fab)。
使用来源于特异性人重链可变域(VH3-23)和特异性人轻链可变域(Vk-1)的序列产生文库。在筛选文库内产生轻链可变域，其中将多样性引入VL CDR3(L3)并且其中轻链VLCDR1(L1)和CDR2(L2)仍是人种系序列。对于筛选文库，使VH域的全部3个CDR多样化以通过人抗体库中存在的CDR长度匹配定位氨基酸频率。以下列出了在文库中使用的噬菌体展示重链(SEQ ID NO：204)和轻链(SEQ ID NO：205)骨架，其中小写“x”代表改变以产生所述文库的CDR氨基酸，粗斜体代表不变的CDR序列。
SEQ ID NO：204的序列为
通过诱变，使用简并DNA寡核苷酸引物产生多样性以将多样性引入VL CDR3和VHCDR1(H1)、CDR2(H2)和CDR3(H3)以模拟天然抗体组库中存在的多样性，如Kunkel，TA(PNAS1985年1月1日.82(2)488-492)中更详细地描述的，该文献以其全部内容作为参考并入本文。简要地，使用标准程序从分离的噬菌体制备掺入尿嘧啶的单链环状DNA并实施Kunkel诱变以将多样性引入4个CDR。然后，将化学合成的DNA电穿孔至TG1细胞，然后回收。将回收的细胞继代培养并用M13K07辅助噬菌体感染以产生噬菌体文库。
使用标准程序进行噬菌体淘选。简要地，使抗生蛋白链菌素磁珠在1mL体积中在PBST-2％BSA中经受来自制备的文库的约1×1012个噬菌体，通过固定至所述抗生蛋白链菌素磁珠上的靶标进行第一轮噬菌体淘选。培育1小时后，使用磁力支架，从上清液分离出所述珠-结合的噬菌体。清洗珠三次以除去非特异性结合的噬菌体，然后将其加入至OD600为约0.6的ER2738细胞(5mL)。在室温下培育20分钟后，将感染的细胞在25mL 2xYT+氨苄西林和M13K07辅助噬菌体(最终浓度为约1×1010pfu/ml)中继代培养并使其在强烈振荡下在37℃生长过夜。第二天，使用标准程序，通过PEG沉淀制备噬菌体。在淘选前，将对SAV-涂覆珠特异的噬菌体进行预清除(Pre-clearance)。使用标准程序(第3轮，100nM CD-47和50nM PD-L1，第4轮，50nM CD-47和25nM PD-L1)，使用KingFisher磁珠处理机，通过珠固定化的CD47或PD-L1靶标抗原进行第二轮淘选。总计，实施3-4轮噬菌体淘选以富集对靶标抗原特异的噬菌体展示Fab。使用多克隆ELISA确认靶标特异性富集并且分离单个克隆并通过实施单克隆噬菌体ELISA进一步验证。使用DNA测序确定含有候选抗体的分离的Fab克隆的CDR序列。
为了在CD47或PD-L1结合剂发现活动中测量结合亲合力，将如上所述的噬菌体筛选中鉴别的VL和VH域形式转化为二价单特异性天然人全长IgG1结构并固定至Octet(PallForteBio)生物膜干涉仪上的生物传感器，如实施例2所述。然后，将可溶性抗原(例如，CD47或PD-L1)添加至系统并测量结合。
对于如本文所描述的使用B-体形式的双重特异性抗体进行的实验，如本文所描述的BC1形式和/或BC44形式，将单个克隆的VL可变区形式转化为域A和/或H，并将VH区形式转化为二价B-体的域F和/或L。
使用抗-IgG10-CH1树脂，通过分批模式重力过滤亲合纯化抗体。使用CaptureSelectTM CH1-XLAffinity Matrix整体树脂(ThermoFisher PN 194346201L)亲合纯化从500mL或1000mL转染体积产生的澄清上清液。将来自1000mL转染的上清液分成500mL部分，并且将所有上清液转移到1L无菌摇瓶。使用一次性10mL柱(ThermoFisherScientific PN 29924)通过重力过滤使用达尔伯克氏PBS(pH 7.4，无Ca2+/Mg2+)清洗掉树脂的储存缓冲液，并作为50％浆液在PBS中再混悬。以6mL 50％树脂浆液/500mL上清液的规模，将树脂等份至摇瓶。将上清液在室温下，在以170RPM运行的摇瓶振荡器上与树脂培育1-2小时。将树脂捕获至配备有储罐接头的重力过滤柱(GE Hcalthcare Life Sciences PN18-3216-03)上并用30mL DPBS(10×沉降树脂床层体积)清洗。用30mL含有500mMNaCl的DPBS严格清洗树脂床。在洗脱之前，使用30mL DPBS进行另外的清洗以降低NaCl浓度。使用9mL 0.1M乙酸钠(pH 3.5)，将结合抗体从重力柱洗脱至2.25mL包含在50mL圆锥管中的中和缓冲液(2M Tris-HCl，pH 7.5；Sigma PN T2944)中。使用截留分子量3.5kDa的透析盒(Slide-A-Lyzer；ThermoFisher Scientific，PN 66110)，将中和洗脱缓冲液中的样品在4℃透析至DPBS过夜。
对于C40×P24、C40×P24和C56×P22抗体，在精制前将来自两个不同批次的亲和纯化的抗体混合。C40×P31.2、C59×P22和C59×P31.2抗体使用单一批次进行精制。使用运行GE Unicorn v7.2软件的AKTA pure fast蛋白液相色谱仪(FPLC，GE Healthcare LifeSciences)，通过强阳离子交换(SCx)精制每个单一或混合批次。始终使用无菌技术。在纯化当天之前，使用500mM NaOH在20％乙醇中的溶液，通过将清洁溶液缓慢泵送通过仪器(0.1mL/min，2小时)清洁整个流路(包括流动相储罐、进样环、柱和开关阀)。然后，用20％乙醇冲洗仪器并保存过夜。在精制前，将样品缓冲液交换成20mM MES缓冲液[pH 6.0，MES＝(2-(N-吗啉代)乙烷磺酸]。使用截留分子量(MWCO)过滤器，将缓冲液交换方法用于在精制1-2小时内进行的缓冲液交换，其在精制开始前在室温下储存。将约35mg抗体(～4mg/mL)在DPBS中的溶液加入至15mL，30kDa MWCO离心旋转过滤器(Amicon Ultra 30)并用MES缓冲液补齐体积。将样品以4k RPM离心15分钟或者直至达到原始样品体积。加入MES缓冲液使体积达到15mL，并将样品再次离心。将该过程再重复三次。使用12mL流动相A，在流动相A(20mMMES，pH 6.0)中，以0.5mL/min将10mL低内毒素样品(～35mg蛋白，3.5mg/mL)加载到MonoS5/50GL SCX柱(0.5cm×5cm，1mL，10μm粒径；GE Healthcare Life Sciences，PN17516801)上。以2.0mL/min的流速，使用另外2CV(柱体积)的流动相A除去未结合的样品。1.0CV为0.982mL，如GE Unicorn软件中对该具体的柱所定义的。使用在50CV内0至30％流动相B(20mM MES/1M NaCl，pH 6.0)的线性梯度以2.0mL/min洗脱样品，其中以1mL间隔收集馏分。以2.0mL/min，用7CV 100％B清洗系统。混合来自每个主峰的馏分并通过非还原SDS-PAGE评价。如以上程序所述，将混合样品缓冲液交换为1×DPBS，通过0.2μm过滤器无菌过滤，并使用来自GenScript的ToxinSensor Chromogenic LAL内毒素测定试剂盒(PN L00350)再次测试内毒素。
将该过程重复几次直至未精制的进料耗尽。从来自每次进样的纯化材料产生主混合物，并对其进行完整分析筛选和冻融分析。
实施例2.筛选和选择
通过噬菌体展示，例如，如实施例1所述，产生CD47或PD-L1抗体。例如，为了确定定性结合亲和力，将生物膜干涉技术(BLI)用于确认抗原对实施例1中获得的候选抗体的特异性相互作用。
使用Octet(Pall ForteBio)仪器监测结合剂与固定化在抗生蛋白链菌素生物传感器上的生物素化的人CD47或生物素化的人PD-L1(参见实施例1)的二价相互作用。为了监测一价相互作用，将全长IgG分子固定化至Fc捕获生物传感器并使用Octet仪监测其与可溶性抗原的相互作用。
简要地，以一价结合形式，使用Octet获得了排名靠前的PD-L1抗体的亲和力的准确测量(如KD值)。第一，将抗体固定化在Fc捕获传感器上。在下一个结合步骤中，测量抗原与固定化IgG的结合相互作用。为了获得准确的动力学常数，在结合步骤中测量包括至少7个分析物浓度的稀释系列(范围在约10至20×KD至0.1×KD值，2-倍稀释)。在下一个解离步骤中，将传感器浸入不含分析物的缓冲溶液中，其中使传感器表面上结合的分析物解离。使用Octet动力学分析软件计算夹自结合和解离曲线的速率的动力学和平衡结合常数。使用全局曲线拟合进行分析，其中动力学常数同时来源于包括在实验中的全部分析物浓度。
实施例3.其它筛选和选择
对于与表达CD47和/或PD-L1的多种细胞类型，包括TCA CHO细胞、MDA-MB-231细胞、Raji细胞和Jeko1细胞的结合，评价对于与CD47和PD-L1的结合所选择的双重特异性抗体，例如，如实施例1和2中所述的那些。
对于以多个表面拷贝数与表达CD47和PD-L1的细胞的结合，使用流式细胞术测试示例性双重特异性抗体C40×P24、C56×P22、C40×P31.2、C59×P22和C59×P31.2。在一些分析中，还测试了C40×P24。
在测定当天，收获70-90％汇合的细胞。通过以200×g离心5分钟收集细胞并除去培养基。将细胞以2×106个细胞每mL在冷PBS中再混悬。在PBS中制备8-点抗体稀释系列(2×浓度)以覆盖正在测试的抗体的预期结合亲和力。将50μL每孔的抗体稀释液在96孔V形底板(Costar 3897)中铺板。添加50μL每孔的细胞混悬液。将板在4℃放置45-60分钟。
通过以400×g离心7分钟收集细胞并除去一抗。以1∶100稀释添加50μL每孔AF488山羊抗人IgG Fab(Jackson Immuno Research 109-547-003)。将板在4℃放置30分钟。
通过以400×g离心7分钟收集细胞并除去二抗。将细胞在50μL每孔的PBS中再混悬并通过流式细胞术分析。使用细胞上FITC荧光信号的平均荧光强度(MFI)计算结合曲线。
将表达CD47和PD-L1的TCA CHO细胞(CD47PD-L1 TCA CHO细胞)用于筛选结合至CD47和PD-L1的抗体。这些细胞具有约612,000的CD47表面蛋白拷贝数和约674,000的PD-L1表面蛋白拷贝数。对于这些实验，所测试的双重特异性抗体处于BC1形式，每种抗体具有CD47的第一结合域和PD-L1的第二结合域。制备了其它单特异性抗体构建体，其分别具有CD47或PD-L1的第一结合域和不相关靶标的第二结合域(表示为“假”结合域或者“D”)。如以上所描述的，收获细胞并测定结合。图1A-1D中显示了示例性结合曲线。表7中还总结了所测定的抗体的细胞结合的半最大有效浓度(EC50)。还作为对照测定了仅具有一个能够靶向CD47(C40×D)或PD-L1(D×P24)的结合域的单特异性抗体，并且将仅第二抗体样品用作阴性对照。结果表明示例性双重特异性抗体对于与CD47 PD-L1TCA CHO细胞的结合的亲合力高于仅靶向CD47或PD-L1的抗体(图1A-1D)。
表7.结合至CD47 PD-L1 TCA CHO细胞的双重特异性抗体的EC50
| 抗体 | C40×P24 | C56×P22 | C40×P31.2 | C59×P22 |
| EC50(nM) | 1.3 | 1.1 | 0.13 | 2.3 |
在表达PD-L1的MDA-MB-231细胞(PD-L1 MDA-MB-231细胞)中测试了双重特异性抗体结合，其具有约500,000的CD47表面蛋白拷贝数和约1,500,000的PD-L1表面蛋白拷贝数。对于这些实验，如本文所描述的，所测试的双重特异性抗体处于BC44形式，每种抗体具有CD47的第一结合域和PD-L1的第二结合域。如以上所描述的，收获细胞并测定结合。图2A-2E显示了示例性结合曲线。表8列出了所指明的抗体的细胞结合的EC50。
表8.与PD-L1MDA-MB-231细胞结合的双重特异性抗体的EC50
| 抗体 | C40×P24 | C56×P22 | C40×P31.2 | C59×P22 | C59×P31.2 |
| EC50(nM) | 3.1 | 1.2 | 0.69 | 1.5 | 2.5 |
在表达PD-L1的Jekol细胞(Jeko-PD-L1细胞)中测试了双重特异性抗体结合。这些细胞具有约200,000至500,000的CD47表面蛋白拷贝数和约100,000至300,000的PD-L1表面蛋白拷贝数。对于这些实验，如本文所描述的，所测试的示例性双重特异性抗体处于BC44形式，每种抗体具有CD47的第一结合域和PD-L1的第二结合域。表9列出了所测定的抗体的细胞结合的EC50。
表9.与Jeko-PD-L1细胞结合的双重特异性抗体的EC50
| 抗体 | C40×P24 | C56×P22 | C40×P31.2 | C59×P31.2 |
| EC50(nM) | 0.703 | 0.218 | 0.227 | 0.256 |
实施例4.功能测定
对于表达CD47和/或PD-L1的细胞类型，包括TCA CHO细胞、MDA-MB-231细胞、Raii细胞和Jeko1细胞类型中CD47/SIPRα信号转导和PD-1/PD-L1信号转导的抑制，评价了对于与CD47和PD-L1的结合所选择的双重特异性抗体，例如，如实施例1-3中所述的那些。
为了测试双重特异性抗体抑制CD47/SIRPa信号转导的能力，使用生产商的规程，使用CD47/SIPRα信号转导生物测定试剂盒(93-1135C19，Eurofins DiscoverX)测定如本文所描述的BC44形式的双重特异性抗体。分别使用MDA-MB-231-PD-L1和Jeko-PD-L1靶细胞实施测定。
将信号转导测定工程化以共表达加ProLinkTM(PK)标签的免疫检查点受体和加Enzyme Acceptor(EA)标签的SH2结构域。配体接合导致受体激活和磷酸化，从而导致SH2-EA向受体招募，并且迫使两个β-半乳糖苷酶片段(EA和PK)互补。所产生的功能酶水解底物以产生化学发光信号。配体接合的阻断导致化学发光信号降低。
简要地，将30，000个靶细胞加入至白底96-孔板(Corning 3917)中的孔中的40μL细胞铺板试剂(Cell Plating Reagent)。在细胞铺板试剂中制备抗体稀释液并将20μL抗体稀释液加入至细胞。然后，将40μL细胞铺板试剂中的10，000个新融化的SIRPa Jurkat细胞加入至每个孔中。将板在37℃下培育24小时。在培育后，将10μL BioAssay Reagent 2加入至孔中并将板在室温下避光培育15分钟。然后，将40μL BioAssay Reagent 2加入至孔中并将板在室温下避光培育1小时。在ClarioStar酶标仪(BMG Labtech)上读板。
图3显示了CD47/SIPRα信号转导测定的示例性结果。作为对照测定了仅具有一个能够靶向CD47的结合位点的抗体(C40×D、C56×D和C59×D)并且所述抗体显示出最小抑制。MDA-MB-231-PD-L1中的测定的IC50值如表10所示。结果表明与仅靶向CD47的抗体相比，所有测试的示例性双重特异性抗体显示出化学发光信号的降低。因此，所测定的双重特异性抗体有效阻断CD47配体在SIRPa受体上的接合，从而抑制信号转导。
表10.PD-L1 MDA-MB-231细胞中的CD47/SIRPα抑制测定
| 双重特异性抗体 | IC50(nM) |
| C40×P24 | 0.112 |
| C56×P22 | 0.218 |
| C40×P31.2 | 0.108 |
| C59×P22 | 0.350 |
| C59×P31.2 | 0.266 |
还确定了双重特异性抗体在Jeko-PD-L1细胞中抑制CD47/SIPRα信号转导的能力。如以上所描述的，在这些细胞中实施了CD47/SIPRα信号转导测定。所述测定在Jeko靶细胞中的IC50值如表11所示。这些结果显示所测定的示例性双重特异性抗体抑制CD47/SIPRα信号转导，其中C40×P24(沉默Fc)双重特异性抗体显示出在这些测定中所测试的一些中最有效的CD47/SIPRα信号转导抑制。
表11.Jeko细胞和Jeko-PD-L1细胞中的CD47/SIRPα抑制测定
| 双重特异性抗体 | JeKo-PD-L1细胞IC50(nM) |
| C40×P24 | 1.26 |
| C40×P24s | 0.26 |
| C56×P22 | 1.20 |
s＝沉默Fc
为了测试双重特异性抗体阻断PD-1/PD-L1信号转导的能力，使用生产商的规程，使用PD-1/PD-L1信号转导生物测定试剂盒(93-1104Y19-00117，Eurofins DiscoverX)测定了双重特异性抗体。在PD-L1 MDA-MB-231细胞、PD-L1 Jeko细胞和Raji-PD-L1细胞中进行测定。
简要地，将40μL靶细胞(30,000个细胞每40μL)加入至白色96-孔板的每个孔中的细胞铺板试剂0(CP0)中。将板在37℃培育过夜。将PathHunter PD-1 Jurkat细胞融化过夜，通过添加9.6mL预加温的细胞铺板试剂(CP0)至T25烧瓶从融化液中回收，从液氮除去PD-1Jurkat细胞的两个冷冻管，并通过立即将1mL预加温的CP0从T25烧瓶添加至冷冻管来融化小粒。通过轻轻上下吸液几次混合细胞以破碎任何块。将细胞混悬液转移到含有剩余CP0的T25烧瓶，并移除保留在冷冻管中的任何媒介物/混悬液以确保所有细胞从小瓶的完全回收。将细胞在37℃培育过夜。
培育后，将20μL双重特异性抗体加入至每个孔中并将板在37℃培育1小时。将40μLCP0中的PathHunter PD-1 Jurkat细胞加入至96-孔板的每个孔中并将板在室温下避光培育1小时。然后，将10μL PathHunter Bioassay Detection Reagent 1添加至每个孔中并将板在室温下避光培育15分钟。然后，将40μL PathHunter Bioassay Detection Reagent 2添加至测定板的每个孔中并将板在室温下避光培育3小时。在ClarioStar酶标仪(BMGLabtech)上分析板。
PD-L1 MDA-MB-231细胞中的PD-1/PD-L1检查点信号转导测定的示例性结果如图4所示。在PD-L1 MDA-MB-231细胞和Jeko-PD-L1细胞中的测定的IC50值如表12所示。这些结果表明在Jeko-PD-L1细胞中，示例性双重特异性抗体C40×P31.2、C59×P22和C59×P31.2导致产生了低于其它测试双重特异性抗体的IC50值。在MDA-MB-231-PD-L1细胞中，双重特异性抗体C40×P24(沉默Fc)显示出高于所测试的其它双重特异性抗体的IC50。
表12.MDA-MB-231 PD-L1细胞和Jeko-PD-L1细胞中的PD-1/PD-L1抑制测定
s＝沉默Fc
为了确定PD-L1拷贝数对双重特异性抗体抑制PD-1/PD-L1信号转导的能力的影响，比较了Jeko细胞和Jeko-PD-L1细胞。如以上所描述的，在这些细胞中进行PD-1/PD-L1检查点信号转导测定。Jeko-PD-L1靶细胞中的测定的IC50值如以上表12所示。Jeko细胞中的测定的IC50值小于测量阈值，表明双重特异性抗体的抑制作用可以受细胞上可用的配体和受体的总数影响。
实施例5.其它功能测定
评价了选择结合至CD47的双重特异性抗体，例如，如实施例1-3中所述的那些在阻断CD47配体与SIRPα受体的相互作用和促进吞噬中的影响。例如，实施原代M2巨噬细胞吞噬测定以确定双重特异性抗体对吞噬的影响。根据生产商的规程，用pHrodo Red Cell标记试剂盒(A10026，ThermoFisher Scientific)标记Jeko-PD-L1靶细胞以用于流式细胞术，并通过流式细胞术分析。使用该方法，标记的靶细胞显示很少或不显示荧光，而凋亡细胞保持在pH 7.4的胞外环境中。在CD47受体激活后，通过形成吞噬杯起始吞噬。在通过夹断进行的标记细胞的吞噬后，所述细胞处于吞噬体的酸性环境(pH 4.5-5.5)内，这导致荧光升高。
在靶细胞标记后，将细胞与处于BC44形式的双重特异性抗体一起培育以允许结合至细胞表面CD47。然后，将双重特异性抗体-结合的标记的细胞与M2巨噬细胞一起在Incucyte活细胞成像系统(Satrotius)中共培养并且每30分钟采集相位图像和荧光图像，采集24小时。
图5A和5B显示了与M2巨噬细胞共培养后0小时和5小时，标记的JeKo-PD-L1细胞的示例性荧光显微镜图象。图5C-5G显示了5小时共培育之后的示例性双重特异性抗体C40×P24(图5C)、C56×P22(图5D)、C40×P31.2(图5E)、C59×P22(图5F)和C59×P31.2(图5G)的示例性结果。结果显示在共培育5小时后，在存在所有所测试的双重特异性抗体的情况下，与无抗体的对照相比，M2巨噬细胞对JeKo-PD-L1细胞的吞噬(例如，吞噬活性或功能)升高。
还使用A375靶细胞测试了双重特异性抗体对吞噬的影响，所述A375靶细胞具有约200,000的CD47表面拷贝数和约25,000的PD-L1表面拷贝数。如以上所描述的，使用用于流式细胞术的pHrodo Red Cell标记试剂盒标记细胞，并通过流式细胞术分析。
图6A和6B分别显示了与M2巨噬细胞共培养后0小时和48小时，标记的A375细胞的示例性荧光显微镜图象。图6C-6G显示了48小时共培育之后的示例性双重特异性抗体C40×P24(图6C)、C56×P22(图6D)、C40×P31.2(图6E)、C59×P22(图6F)和C59×P31.2(图6G)的示例性结果。结果显示在共培育48小时后，与无抗体的对照相比，对所有所测试的示例性双重特异性抗体响应，M2巨噬细胞对A375细胞的吞噬升高。
实施例6.红细胞结合测定
对于选择结合至CD47和PD-L1的双重特异性抗体，例如，如实施例1-3中所述的那些，评价它们与红细胞的结合。抗-CD47抗体可以引起红细胞凝集，这限制了它们的治疗应用。使用红细胞结合测定测试本文所公开的双重特异性抗体以确定对红细胞凝集的影响。
将100,000个新鲜的人红细胞(SER-10MLRBC-SDS，Zen-Bio)转移至V形底板的每个孔中。将板在室温下以500×g离心5分钟并弃去上清液。将如本文所描述的BC44形式的双重特异性抗体在BD染色缓冲液(BD Biosciences)中稀释并转移100μL至板的每个孔中。将板在4℃下培育45分钟。培育后，将100μL PBS加入至每个孔中，将板以500×g在室温下离心5分钟，并弃去上清液。
然后，将100μL在BD染色缓冲液中以1∶100稀释的抗-人IgG Fab Alexa Fluor 488(Jackson Immuno Research 109-547-003)加入至每个孔中。将板在4℃培育45分钟，在室温下以500×g离心5分钟并弃去上清液。用200μL/孔的PBS清洗细胞一次，并在50μL/孔的PBS中再混悬。在Sartorius iQue Screener Plus仪(Sartorius)上通过流式细胞术分析样品。
与阳性对照相比，所有测试的示例性双重特异性抗体导致无红细胞结合，其指示与红细胞的体内相互作用很少。
实施例7.体内试验
为了评价体内治疗效力，在雌性B-hPD-L1/hSIRa/hCD47小鼠中在同基因MC38-hPDL1/hCD47鼠科结肠癌模型中测试了双重特异性抗体。基于肿瘤体积(TV)变化评价治疗效力。还基于体重(BW)评价了动物的整体健康情况。
小鼠是处于C57BL/6背景的纯合B-hPD-L1/hSIRPa/hCD47(h/h；h/h；h/h)小鼠。株基因型是C57BL/6-Cd274tm1(CD274)Sirpatm1(SIRPA)CD47tm1(CD47)/Bcgen。这些小鼠是通过将3种基因工程小鼠系B-hPD-L1、B-hSIRPA和B-hCD47小鼠杂交至三重纯合性产生的三重敲入小鼠模型。己在C57BL/6小鼠中用各自人对应物替代内源PD-L1(外显子3)、Sirpα(外显子2)和CD47(外显子2)的胞外区。
将动物安放在单个通风笼中的无特定病原屏障设施内。在实验前，使动物适应7天。温度和湿度控制如下：20-26℃，40-70％湿度，并且每12小时光照。笼含有压力消毒的玉米芯垫底料，其每周更换1次。在整个研究阶段，小鼠自由进食高压灭菌的干燥颗粒食物和水。食品是SPF级的，并且水通过超滤纯化。
将如本文所描述的处于BC44形式的双重特异性抗体保持在1mg/mL的储液浓度并在-80℃储存。在使用前一天开始融化。使用当天，将抗体小瓶转移到透明锥形底1.7mL微量离心管并在4℃，以最大速度(21，130rcf)离心2分钟。在无Ca2+和Mg2+PBS(Cat#20012027，Gibco)中制备抗体稀释液。
在治疗前7-10天，向小鼠植入鼠科结肠癌细胞系，MC38-hPD-L1/hCD47细胞。在右侧腹，向每只小鼠皮下注射在0.1mL PBS中的MC38-hPD-L1/hCD47肿瘤细胞(5.0×105)。接种时，动物年龄为7-10周(群组内，小鼠的出生日期在±3天内)并且接种时的体重为18-25克。当平均肿瘤尺寸达到约125mm3时，将患肿瘤动物随机招募到研究组中。每组由8只小鼠组成。表13显示了效力群组的研究组和每组的动物个数。在治疗第0天开始治疗，并且研究终点长达28天。每周监测两次TV和BW。
表13.效力群组组名、剂量水平和剂量施用计划表
s＝沉默Fc
在研究终点，通过心脏刺穿(末端放血)从效力研究的每个组中的4只小鼠收集血液用于后续分析。
用卡尺至少每周测量两次肿瘤尺寸，并使用公式：TV＝a×b2/2估计肿瘤体积(mm3)，其中“a”和“b”分别是肿瘤的长和短直径。使用以下公式，将TV用于计算肿瘤生长抑制(TGI，抗肿瘤有效性的指示)和肿瘤消退(TR)值：
TGI(％)＝[1-(Tt-T0)/(Ct-C0)]×100％
TR(％)＝[1-(Tt-T0)]×100％
Tt＝时间t时的治疗小鼠的平均TV，T0＝时间0(基线)时治疗小鼠的平均TV，Ct＝时间t时对照的平均TV，和C0＝时间0(基线)时对照的平均TV。
图7显示了肿瘤体积(mm3)的示例性结果。
在整个研究期间，至少每周测量两次小鼠体重。使用以下公式计算体重
(BW)变化，以％表示：
BW变化(％)＝((BWt-BW0)/BW0)×100
BWt”和“BW0”分别是时间t和时间0(基线)时的BW。
图8显示了体重(克)的示例性结果。
为了评价毒性，如表14所述，处理24只具有-肿瘤的小鼠的另外的毒性群组。在第一剂量后2天处死小鼠用于全血细胞计数(CBC)分析(例如，评价血小板和/或红细胞(RBC)耗尽)。将CBC结果与来自研究结束时所采集的样品的以上所描述的效力研究的4小鼠相比。
在第2天，从表14中所描述的毒性群组，通过心脏刺穿(末端放血)收集血液用于后续分析。
表14.毒性群组组名、剂量水平和剂量施用计划表
s＝沉默Fc
在两个时间点通过心脏刺穿收集全血用于CBC和双重特异性抗体水平分析，第2天(单次剂量后)从毒性群组中的小鼠和在研究终点，从效力群组的每个组的4只小鼠。
对于用于CBC分析的血液收集，将250μL血液收集到肝素-涂覆的管中并通过倒转充分混合。混合后，将血液样品保持在2-8℃。
对于血清收集，将剩余全血(250μL或以上)收集到血清收集管中。然后，通过使其在室温下保持不扰动30分钟，使血液凝块。根据生产商的规程，通过在冷冻离心机中以12,000×g离心90秒除去凝块。离心后，立即将所得上清液(血清)转移至干净的标记的聚丙烯管中，分成2等份(～60μL×2)并在-80℃储存直至通过ELISA分析。处理时，将血清样品保持在2-8℃。
抗-CD47抗体可以引起红细胞凝集，这限制了它们的治疗应用。使用红细胞结合测定测试本文所公开的双重特异性抗体以确定对红细胞凝集的影响。
据报道RBC和血小板具有高CD47表达。剂量施用后48小时，分析红细胞和血小板浓度以确定是否存在这些细胞类型的耗尽。
如所描述的，通过经由心脏刺穿收集的血液在HEMAVET950(Drew Scientific)上测量CBC。确定了每个样品的RBC、WBC(通过亚型计数)、血小板、血红蛋白和血细胞比容的血液学参数(图9A-9E)。确定了红细胞分布宽度(RDW)、平均红血球容积(MCV)、红细胞平均血红蛋白(MCH)、网织红细胞计数的信息(图10A-10G)。
通过C56×P22(G5和G6)和C40×P24(G7)(图9C和9D)观察到了白细胞和淋巴细胞减少。
将酶联免疫吸附测定(ELISA)用于定量确定从以上所描述的毒性群组中的小鼠制备的血清中的人IgG1抗体的量。
该测定使用了对在96-孔板上涂覆的人IgG抗体特异的affiniPure山羊抗-人IgG(H+L)(Cat#109-005-003，Jackson ImmunoResearch)。将标准品、质量对照样品和测试样品移液至孔中并且通过固定化抗体样品中的人IgG结合至孔。清洗孔，并添加过氧化物酶-缀合的affiniPureF(ab′)2片段山羊抗-人IgG Fc抗体(Cat#109-0036-003，JacksonImmunoResearch)。在清洗掉未结合的过氧化物酶-缀合抗体后，将TMB底物溶液加入至孔中并与结合的人IgG的量成比例显色。停止溶液将颜色从蓝色改变为黄色，并且在450nm和570nm测量颜色强度。用于确定人抗体浓度的夹心法的定量下限(LLOQ)为约1.56ng/mL。
图11显示了来自毒性群组的研究组的小鼠血液中的所指明的人抗体的浓度。结果显示C56×P22(G5)的血液浓度稍高于其它测试的双重特异性抗体。
为了进一步评价体内治疗效力，如上述研究所述，在雌性B-hPD-L1/hSIRa/hCD47小鼠中在使用同基因MC38-hPDL1/hCD47鼠科结肠癌模型的其它研究中测试了双重特异性抗体。再次基于肿瘤体积(TV)变化评价治疗效力。再次基于体重(BW)评价动物的整体健康情况。
如上述研究所述安置和饲喂动物，并且如以上所描述的，但从2mg/mL的储液浓度制备如本文所描述的处于BC44形式的双重特异性抗体的抗体稀释液。
在该其它研究中，在治疗前7-10天，向小鼠植入鼠科结肠癌细胞系，MC38-hPD-L1/hCD47细胞。在右前侧腹，向每只小鼠皮下注射在0.1mL PBS中的MC38-hPD-L1/hCD47肿瘤细胞(5.0×105)。接种时，动物年龄为7-10周(群组内，小鼠的出生日期在±3天内)并且接种时的体重为18-25克。当平均肿瘤尺寸达到约117mm3时，将患肿瘤动物随机招募到研究组中。每组由8只小鼠组成。表15显示了效力群组的研究组和每组的动物个数。在治疗第0天开始治疗，并且研究终点长达28天。每周监测两次TV和BW。
表15.效力群组组名、剂量水平和剂量施用计划表
用卡尺至少每周测量两次肿瘤尺寸，并如上述研究所述估计肿瘤体积(mm3)。
图12A显示了在使用示例性双重特异性抗体的所指示的处理组中的小鼠的示例性肿瘤体积(mm3)结果。图12B-12D显示了各个小鼠的示例性肿瘤体积结果。如以上对于上述研究所描述的，计算肿瘤生长抑制(TGI)。例如，在该研究结束时(治疗开始后第28天)，示例性结果显示C56×P22(20mg/kg，IP)证实抗-肿瘤活性，如通过对肿瘤体积的影响所指示的，其％TGI为58.5％(P＜0.05)，并且C59×P22(20mg/kg，IP)证实抗-肿瘤活性，其％TGI为36.6％(P＞0.05)。
在整个研究期间，至少每周测量两次小鼠体重。使用以下公式计算体重(BW)变化，以％表示：
BW变化(％)＝((BWt-BW0)/BW0)×100
“BWt”和“BW0”分别是时间t和时间0(基线)时的BW。
图12E显示了在使用示例性双重特异性抗体的所指示的处理组中的小鼠的示例性平均体重(克)结果。
为了评价肿瘤浸润白细胞(TIL)，在研究终点，制备肿瘤单细胞悬液以通过FACS分析。将肿瘤切成2-4mm的小片，转移到含有酶混合物(Miltenyi Biotec，cat#130-096-730)的管中并在37℃培育40分钟。然后，在4℃，在10mL RPMI-1640中用无菌注射器柱塞研磨肿瘤片。在4℃，以300g离心细胞混悬液7分钟。完全吸出上清液，将细胞颗粒在PBS中以适当体积再混悬，并使用血细胞计算室计数。将肿瘤细胞在PBS中再混悬至所期望的浓度以用于进一步FACS分析。
对于FACS分析，将每个肿瘤样品的细胞混悬液与抗-小鼠CD16/32抗体、用于Fc受体阻断的可固定活力染料(fixable viability dye)和活细胞/死细胞染色剂在室温下培育10分钟。然后，在4℃，用表面标志物，包括小鼠(m)CD45、mCD11b、mCD3、mCD4、mCD8和mF4/80的荧光缀合抗体染色样品30分钟。染色后，用PBS清洗样品两次。在固定和透性化后，在4℃用荧光缀合的抗-小鼠Foxp3抗体染色样品30分钟。用PBS清洗样品，在PBS中再混悬并通过流式细胞术分析(Attune NxT，Thermo Fisher Scientific)。
将FACS分析用于确定CD4+T细胞、CD8+T细胞、调节性T细胞(Treg)和巨噬细胞在所有活细胞中的百分比，并计算每种细胞类型的每克肿瘤的细胞计数。通过对CD45+CD3+CD4+CD8-设门，确定CD4+T细胞计数，并且每克肿瘤的细胞CD4+T细胞的示例性结果如图13A所示。通过对CD45+CD3+CD4-CD8+设门，确定CD8+T细胞(CTL)计数，并且每克肿瘤的CD8+细胞的示例性结果如图13B所示。通过对CD45+CD3+CD4+CD8-Foxp3+设门，确定Treg计数，并且每克肿瘤的Treg细胞的示例性结果如图13C所示。通过对CD45+CD11b+F4/80+设门，确定巨噬细胞计数，并且每克肿瘤的巨噬细胞计数的示例性结果如图13D所示。如图13A-13D所示，与单独媒介物的对照组相比，使用C56×P22和C59×P22观察到了TIL升高。
还在具有A-375黑素瘤肿瘤的人源化NOD-SCID小鼠模型中评价了体内治疗效力。A-375细胞具有约200,000的CD47表面拷贝数和约25,000的PD-L1表面拷贝数。
将动物安置在动物研究室的无特定病原条件下。在实验前，使动物适应7天。温度和湿度控制如下：20-24℃，45-65％湿度，并且每12小时光照。顶部过滤器笼含有HEPA过滤的空气，其最少每小时换气15次且无再循环。笼含有白杨木垫料，并且动物饲喂25kGy辐照的饮食和无菌过滤(5、1、0.2μm)自来水。
以1mg/mL浓度提供处于BC44形式的双重特异性抗体并在-80℃储存。使用前，将双重特异性抗体融化并以10mg/kg净剂量使用，其中将剂量保持在4℃直至体内注射。媒介物是无Ca++和Mg++的达尔伯克氏PBS，pH7.4。
A-375细胞系是人皮肤黑素瘤(美国模式培养物保藏所，USA，cat#CRL1619)并且由Giard等人分离自患有黑素瘤的54岁女性患者(D.J.Giard等人，In vitro cultivation ofhuman tumors：establishment of cell lines derived from a series of solidtumors，”J.Natl.CancerInst.，51卷，5期，第1417-1423页，1973年11月)。将肿瘤细胞作为单层在37℃，在加湿气氛(5％CO2，95％空气)中，在含有2g/L葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、2g/L碳酸氢钠并补充有10％胎牛血清的RPMI培养基中生长。肿瘤细胞贴壁至塑料烧瓶。对于实验使用，除去培养基并用无Ca++&Mg++的达尔伯克氏PBS清洗细胞，然后添加胰蛋白酶-EDTA并将培养瓶在室温下培育5至15分钟。然后，收集细胞并与完全培养基混合，然后以300g离心5分钟。清洗成粒的细胞，在无酚红的RPMI中再混悬，计数并通过0.25％台盼蓝拒染测定评价它们的存活力。将存活力＞80％的肿瘤细胞培养物用于体内植入。
使用所建立的程序，从血沉棕黄层制备周围血单核细胞(PBMC)。从健康志愿者供体获得三个(3)新近收集的血沉棕黄层样品。在总血液采集后48小时内，根据Ficoll-
plus程序使用梯度离心纯化PBMC。仅当如通过0.25％台盼蓝拒染测定确定的，存活力＞80％时，将PBMC用于体内注射。
五十七(57)只接收时5周大的健康雌性NOD-SCID(NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl)小鼠得自Charles River Laboratories。在肿瘤诱导前3天，在第3天(D-3)注射PBMC。将五十七只小鼠分成3个亚组，每个亚组19只小鼠，并且将每个亚组分配给一个PBMC供体(供体A、B和C)。三个亚组在PBMC接种时具有相当的平均体重。在同一天，将来自每个供体的PBMC注射到19只小鼠的一个亚组中。每只小鼠接受在200μL无酚红RPMI中的1×107个PBMC的一次单一静脉内(IV)注射。
在第0天(D0)，通过将在200μL无酚红RPMI 1640中的1×107个A-375细胞皮下注射到每只动物的右侧腹，在全部五十七只NOD SCID雌性小鼠中诱导肿瘤。在第1天(D1)，按个体体重随机分配动物。使用Vivo Manager® 软件，将来自每个亚组的三(3)只小鼠根据它们的个体体重随机分配至6个组。这种分布获得了6个组，每组9只小鼠，每个供体每组3只小鼠。实施统计检验(方差分析，ANOVA)以测试每个供体的组间均一性。
通过使用pH 7.4的IP制剂和调节至最接近的个体体重的10mL/kg的施用体积注射至腹膜腔(IP)，在第1天(D1)施用治疗。表16中描述了组名、剂量水平、施用和治疗计划表(TIW×3，每周三次，施用3周)。
表16.具有A-375肿瘤的NOD-SCID小鼠模型-组名、剂量水平和治疗计划表
s＝沉默Fc
基于肿瘤生长均一性收集肿瘤，其中在研究终止前，当肿瘤达到500mm3时，每个供体每组收集一个肿瘤。对于所有其它小鼠，当小鼠达到仁慈终点或在研究终点(肿瘤细胞注射后最长8周)收集肿瘤。将所收集的肿瘤切成4mm厚的片，在4％中性缓冲的福尔马林中固定24至48小时，并随后包埋在石蜡(
，Histolab，Sweden)中以使得能够对完整肿瘤连续切片。评价肿瘤坏死水平并如尸检报告中所提及。
监测动物参数，包括动物体重测量、肿瘤体积、临床和死亡率记录，并且每天观察动物存活力和行为。每周至少测量两次体重。用卡尺每周测量两次肿瘤的长(L)和宽(W)，并通过公式(L×W2)/2计算体积。肿瘤诱导后最长监测小鼠8周，并且在不超过第56天(D56)将所有存活的小鼠安乐死。另外，通过Human Therapeutic IgG1 ELISA(Cayman Chemical，试剂盒产品No.500910)分析血液中双重特异性抗体水平。图14显示了示例性结果。
图15A和图15B分别显示了在所指明的处理组中使用示例性双重特异性抗体的示例性平均肿瘤体积(平均TV)和中值肿瘤体积(中值TV)结果。图15C-15G显示了各个小鼠的示例性肿瘤体积结果。图15H显示了在使用示例性双重特异性抗体的所指示的处理组中的小鼠的示例性平均体重结果。
在其它研究中，在具有A-375黑素瘤肿瘤的人源化NOD-SCID小鼠模型中进一步评价了双重特异性抗体的体内治疗效力。
如以上在上述A-375研究中所描述的，安置和饲喂动物，并且如以上所描述的，制备如本文所描述的BC44形式的双重特异性抗体。
还如以上上述A-375研究中所述，制备了用于体内注射的PBMC。
五十四只接收时7至8周大的健康雌性NOD-SCID(NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl)小鼠得自Charles River Laboratories。在肿瘤诱导前3天，在第3天(D-3)注射PBMC。将五十四只小鼠分成6个亚组，每个亚组9只小鼠，并且将每个亚组分配给一个PBMC供体(供体A、B和C)。三个亚组在PBMC接种时具有相当的平均体重。在同一天，将来自每个供体的PBMC注射到9只小鼠的一个亚组中。每只小鼠接受在200μL无酚红RPMI中的1×107个PBMC的一次单一静脉内(IV)注射。
在第0天(D0)，通过将在200μL无酚红RPMI 1640中的1×107个A-375细胞皮下注射到每只动物的右侧腹，在全部五十四只NOD SCID雌性小鼠中诱导肿瘤。在第1天(D1)，按个体体重随机分配动物。使用Vivo
软件，将来自每个亚组的三(3)只小鼠根据它们的个体体重随机分配至6个组。这种分布获得了6个组，每组9只小鼠，每个供体每组3只小鼠。实施统计检验(方差分析，ANOVA)以测试每个供体的组间均一性。
通过使用pH 7.3-7.4的IP制剂和调节至最接近的个体体重的10mL/kg的施用体积注射至腹膜腔(IP)，在第1天(D1)施用治疗。表17中描述了示例性双重特异性抗体的组名、剂量水平、施用和治疗计划表(TIW×4，每周三次，施用4周)。
表17.具有A-375肿瘤的NOD-SCID小鼠模型-组名、剂量水平和治疗计划表
在第29天(D29)的最终剂量之后，在第31天(D31)收集肿瘤，称量并用于通过流式细胞术分析评价肿瘤浸润。监测动物参数，包括动物体重测量、肿瘤体积、临床和死亡率记录，并且每天观察动物存活力和行为。每周至少测量两次体重。用卡尺每周测量两次肿瘤的长(L)和宽(W)，并通过公式(L×W2)/2计算体积。肿瘤诱导后最长监测小鼠8周，并且在不超过第56天(D56)将所有存活的小鼠安乐死。
图16A显示了在使用示例性双重特异性抗体的所指示的处理组中的小鼠的示例性平均肿瘤体积(平均TV)结果。图16B显示了在使用示例性双重特异性抗体的所指示的处理组中的小鼠的示例性平均体重结果。
通过流式细胞术分析巨噬细胞向肿瘤的浸润。对于肿瘤浸润的评价，使用手术刀将切下并称重的肿瘤解剖成较小片段，在非酶促细胞解离缓冲液中进一步分离成单细胞混悬液，在37℃培育30分钟并通过70μm细胞滤网机械分离。使用聚蔗糖-基梯度离心富集活细胞。在任何染色之前，对细胞混悬液计数并且每孔/管分布100万个细胞(当可能时)。在100μL每孔的最终染色体积中染色细胞。使用存活力染料实施第一步染色以使得能够在分析时排除死细胞。使用FcR封闭试剂(人和小鼠)最小化非特异性结合。根据供应商对于每种抗体所描述的程序(或者如果是标准化组，滴定剂量)，添加荧光标记的表面靶标抗体。将混合物在4℃避光培育30分钟。清洗一次后，按照生产商的说明使用FoxP3染色缓冲液进行胞内染色。该步骤包括固定和透性化步骤两者，从而允许胞质内和核内染色。根据供应商所述的程序，添加抗胞内靶标的荧光标记抗体。将染色溶液在4℃避光培育30分钟，用透性化缓冲液清洗并最终在20％L PBS中再混悬含1％甲醛的PKH26水珠。将所有样品在+4℃避光保存直至在细胞计数器上采集。
对于阳性和阴性群体的鉴定，将荧光减一(“FMO”)原理用于解释背景抗体荧光。使用从用于效力研究的随机化中排除肿瘤进行FMO对照。使用补偿珠和/或单染色细胞进行补偿。用配备有3个激发激光器的Fortessa X20细胞计数器(BD Biosciences)进行对每个孔(150μL)的采集。采集期间保存所有事件。使用FlowJo软件(Becton Dickinson)分析流式细胞术数据。示例性结果如图17所示。
还在Jeko-PD-L1模型中评价了双重特异性抗体的体内治疗效力。在本研究中，以400万个细胞/小鼠，用Jeko-PD-L1淋巴瘤细胞系在右后侧腹皮下接种一百只(100)雌性NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ；Jackson Lab)小鼠。基于肿瘤体积，以100mm3的平均肿瘤体积，将64只小鼠随机分成8个研究组，每组n＝8，并每隔一天腹膜内(i.p.)剂量施用媒介物或如本文所描述的BC44形式的双重特异性抗体6个剂量。在第0天剂量施用开始后，在第21天终止研究。
表18显示了效力群组的研究组和每组的动物个数。
表18.具有Jeko-PD-L1肿瘤的NSG小鼠模型-组名、剂量水平和治疗计划表
在第0天，按肿瘤体积将本研究招募的所有动物随机分配至如表18所示的研究组，并且随机分配时平均肿瘤体积在组间类似(约100mm3)。
图18A按处理组显示了从随机分配(第0天)至第14或17天的示例性Jeko-PD-L1肿瘤体积(平均值±SEM)。图18B也按处理组显示了从随机分配(第0天)至第14或17天的示例性体重(平均值±SEM)。如图18A和图18B所示，与媒介物组相比，所有处理组在剂量施用开始后2周显示出显著肿瘤抑制，并且无处理组的平均体重降低大于10％。
还使用以下公式计算了肿瘤生长抑制百分比(TGI)：％TGI＝(1-(Ti-T1)/(Vi-V1))×100，其中Ti是测量日时处理组的平均肿瘤体积；T1是第0天时处理组的平均肿瘤体积；Vi是测量日时媒介物处理组的平均肿瘤体积；V1是第0天时媒介物处理组的平均肿瘤体积
表19.具有在第14天采集的数据的TGI
示例性结果显示示例性双重特异性抗体具有抗-肿瘤活性，如对肿瘤体积的作用所示，其中％TGI如表19所示。
实施例8.可开发性测定
在多种可开发性方法中测试了对于结合至CD47和PD-L1所选的双重特异性抗体，例如，如实施例1-3中所述的那些。例如，使用多种色谱方法，包括尺寸排阻色谱(SEC)、疏水相互作用色谱(HIC)和直立单层吸附色谱(SMAC)评价可开发性因素，如单体百分比、溶解度和抗体聚集或沉淀。
使用7.8mm ID×30cm TSKgel G3000SWXL柱(Tosoh Bioscience LLC，PN 08541)在Agilent 1100HPLC上进行尺寸排阻色谱(SEC)分析。将如本文所描述的BC44形式的双重特异性抗体归一化至在达尔伯克氏PBS(pH 7.4，无Ca2+/Mg2+)中的1mg/mL浓度，并经由离心至小粒澄清，同时仍保留可溶性聚集物。流动相缓冲液是达尔伯克氏PBS(pH 7.4，无Ca2+/Mg2+)。对于每个样品，上样10μL并以1.0mL/min在20分钟内等度洗脱。在280nm监测吸光值。对色谱峰积分以确定均一性％和保留时间。除了分子尺寸(疏水相互作用比SMAC轻得多)外，柱固定相以及流动相的选择支持疏水相互作用。使用Agilent ChemStationB.04.03进行数据分析。
示例性SEC结果如图19A-19C所示。结果表明了低双重特异性抗体聚集。
使用4.6mm ID×3.5cm TSKgel丁基-NPR柱(Tosoh Bioscience LLC，PN 14947)在Agilent 1100HPLC上进行疏水相互作用色谱(HIC)分析。将如本文所描述的BC44形式的双重特异性抗体归一化至dPBS(pH 7.4)中的2mg/mL浓度，然后用等体积的流动相缓冲液B稀释至1mg/mL的最终蛋白浓度。以1mL/min的流速，用100％的流动相缓冲液B(2M硫酸铵/20mM磷酸钠，pH 7.0)平衡柱。对于每个样品，上样10μL并以1.0mL/min，使用在15min内从100％流动相缓冲液B至100％流动相缓冲液A(20mM磷酸钠，pH 7.0)的梯度洗脱，在100％A保持3min以清洗柱并恢复100％B2min以进行平衡。在280nm监测吸光值。计算样品保留时间并与一组标准对照相比较以随保留时间延长(疏水性升高)来鉴别双重特异性抗体。
示例性HIC结果如图20A-20D所示。抗体疏水性可以影响抗体聚集、溶解度和粘度。结果显示对于所测试的抗体类似的保留时间，并且表明低聚集和沉淀倾向。所测试的双重特异性抗体的HIC洗脱谱(例如，洗脱峰的尖锐度以及均一的保留时间)表明这些双重特异性抗体对聚集和/或沉淀的低倾向性。
整体上，可开发性测定结果显示对于所测试的示例性双重特异性抗体达到了可开发性标准。
使用4.6mm ID×300mm Zenix SEC 300柱(Sepax Technologies，PN 213300P-4630)在Agilent 1100HPLC上进行直立单层吸附色谱(SMAC)分析。将如本文所描述的BC44形式的双重特异性抗体归一化至在dPBS(pH 7.4)中的1mg/mL浓度，并经由离心至小粒澄清。流动相缓冲液为dPBS(pH 7.4，无钙和镁)。对于每个样品，上样10μL并以0.25mL/min在32min内等度洗脱。在280nm监测吸光值。计算样品保留时间并与一组标准对照相比较以随保留时间延长(形成聚集体的倾向升高)来鉴别双重特异性抗体。
图21A-21D显示了示例性SMAC结果。结果显示所测试的示例性双重特异性抗体具有类似的短保留时间，从而表明了胶体稳定性和低聚集倾向。
实施例9：竞争性结合测定和表位框并
使用竞争性结合测定以确定抗体是否竞争人CD47或人PD-L1的相同或类似的结合区。使用竞争性免疫测定，如果一个抗体的抗原结合防止另一个的结合，则这两个抗体被认为结合至相同或类似(例如，重叠)的表位并且被认为处于相同表位箱(epitope bin)。如果抗体结合不防碍另一抗体的结合，则它们被认为结合至不同的CD47或PD-L1表位，并且处于不同的表位箱。
将octet-基“串联”测定形式用于交叉竞争测定以建立竞争性结合数据和表位框并。对于这些测定，将100nM生物素化的抗原在10×动力学缓冲液(ForteBio)中固定化在抗生蛋白链菌素传感器上。通过在连续步骤中将传感器浸入含有两种竞争(或非竞争)抗体的饱和浓度的孔中来监测抗体与CD47或PD-L1的结合。如果第一抗体的饱和不阻断结合(通过BLI信号进一步增加表示)，则抗体被认为结合至不同或非重叠表位并且属于不同的箱。
结果显示C40、C56和C59框并在一起。结果还显示P22和P31.2框并在一起(数据未显示)并与P24分开框并。
序列示例性多重特异性结合剂
BC1彤式的示例性双重特异性抗体的序列：
(1)C40×P22
C40第一多肽链(VL-BC1-CH2-CH3杵)
C40第二多肽链(VH-BC1)
P22第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)
P22第四多肽链(VH-CH1)
(2)C40×P24
C40第一多肽链(VL-BC1-CH2-CH3杵)
C40第二多肽链(VH-BCl)
P24第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)
P24第四多肽链(VH-CH1)
(3)C40×P31.2
C40第一多肽链(VL-BC1-CH2-CH3杵)
C40第二多肽链(VH-BC1)
P31.2第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)
P31.2第四多肽链(VH-CH1)
(4)C56×P22
C56第一多肽链(VL-BC1-CH2-CH3杵)
C56第二多肽链(VH-BC1)
P22第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)
P22第四多肽链(VH-CH1)
(5)C56×P24
C56第一多肽链(VL-BC1-CH2-CH3杵)
C56第二多肽链(VH-BC1)
P24第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)
P24第四多肽链(VH-CH1)
(6)C56×P31.2
C56第一多肽链(VL-BC1-CH2-CH3杵)
C56第二多肽链(VH-BC1)
P31.2第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)
P31.2第四多肽链(VH-CH1)
(7)C59×P22
C59第一多肽链(VL-BC1-CH2-CH3杵)
C59第二多肽链(VH-BC1)
P22第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)
P22第四多肽链(VH-CH1)
(8)C59×P24
C59第一多肽链(VL-BC1-CH2-CH3杵)
C59第二多肽链(VH-BC1)
P24第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)
P24第四多肽链(VH-CH1)
(9)C59×P31.2
C59第一多肽链(VL-BC1-CH2-CH3杵)
C59第二多肽链(VH-BC1)
P31.2第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)
P31.2第四多肽链(VH-CH1)
(10)C40×P22(沉默Fc)
C40第一多肽链(VL-BC1-CH2-CH3杵)沉默Fc
P22第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)沉默Fc
(11)C40×P24(沉默Fc)
C40第一多肽链(VL-BC1-CH2-CH3杵)沉默Fc
P24第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)沉默Fc
(12)C40×P31.2(BC1；沉默Fc)
C40第一多肽链(VL-BC1-CH2-CH3杵)沉默Fc
P31.2第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)沉默Fc
(13)C56×P22(沉默Fc)
C56第一多肽链(VL-BC1-CH2-CH3杵)沉默Fc
P22第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)沉默Fc
(14)C56×P24(沉默Fc)
C56第一多肽链(VL-BC1-CH2-CH3杵)沉默Fc
P24第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)沉默Fc
(15)C56×P31.2(沉默Fc)
C56第一多肽链(VL-BC1-CH2-CH3杵)沉默Fc
P31.2第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)BC1-3沉默Fc
(16)C59×P22(沉默Fc)
C59第一多肽链(VL-BC1-CH2-CH3杵)沉默Fc
P22第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)沉默Fc
(17)C59×P24(沉默Fc)
C59第一多肽链(VL-BC1-CH2-CH3杵)沉默Fc
P24第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)沉默Fc
(18)C59×P31.2(沉默Fc)
C59第一多肽链(VL-BCl-CH2-CH3杵)沉默Fc
P31.2第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)沉默Fc
BC44形式的示例性双重特异性抗体的序列：
(1)C40×P22
C40第一多肽链(VL-BC44-CH2-CH3杵)
C40第二多肽链(VH-BC44)
P22第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)
P22第四多肽链(VH-CH1)
(2)C40×P24C40第一多肽链(VL-BC44-CH2-CH3杵)
C40第二多肽链(VH-BC44)
P24第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)
P24第四多肽链(VH-CH1)
(3)C40×P31.2
C40第一多肽链(VL-BC44-CH2-CH3杵)
C40第二多肽链(VH-BC44)
P31.2第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)
P31.2第四多肽链(VH-CH1)
(4)C56×P22
C56第一多肽链(VL-BC44-CH2-CH3杵)
C56第二多肽链(VH-BC44)
P22第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)
P22第四多肽链(VH-CH1)
(5)C56×P24
C56第一多肽链(VL-BC44-CH2-CH3杵)
C56第二多肽链(VH-BC44)
P24第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)
P24第四多肽链(VH-CH1)
(6)C56×P31.2
C56第一多肽链(VL-BC44-CH2-CH3杵)
C56第二多肽链(VH-BC44)
P31.2第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)
P31.2第四多肽链(VH-CH1)
(7)C59×P22
C59第一多肽链(VL-BC44-CH2-CH3杵)
C59第二多肽链(VH-BC44)
P22第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)
P22第四多肽链(VH-CH1)
(8)C59×P24
C59第一多肽链(VL-BC44-CH2-CH3杵)
C59第二多肽链(VH-BC44)
P24第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)
P24第四多肽链(VH-CH1)
(9)C59×P31.2
C59第一多肽链(VL-BC44-CH2-CH3杵)
C59第二多肽链(VH-BC44)
P31.2第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)
P31.2第四多肽链(VH-CH1)
(10)C40×P22(沉默Fc)
C40第一多肽链(VL-BC44-CH2-CH3杵)沉默Fc
P22第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)沉默Fc
(11)C40×P24(沉默Fc)
C40第一多肽链(VL-BC44-CH2-CH3杵)沉默Fc
P24第三多肽链(VH-CH1)沉默Fc
(12)C40×P31.2(沉默Fc)
C40第一多肽链(VL-BC44-CH2-CH3杵)沉默Fc
P31.2第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)沉默Fc
(13)C56×P22(沉默Fc)
C56第一多肽链(VL-BC44-CH2-CH3杵)沉默Fc
P22第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)Fc
(14)C56×P24(沉默Fc)
C56第一多肽链(VL-BC44-CH2-CH3杵)沉默Fc
P24第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)沉默Fc
(15)C56×P31.2(沉默Fc)
C56第一多肽链(VL-BC44-CH2-CH3杵)沉默Fc
P31.2第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)沉默Fc
(16)C59×P22(沉默Fc)
C59第一多肽链(VL-BC44-CH2-CH3杵)沉默Fc
P22第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)沉默Fc
(17)C59×P24(沉默Fc)
C59第一多肽链(VL-BC44-CH2-CH3杵)沉默Fc
P24第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)沉默Fc
(18)C59×P31.2(沉默Fc)
C59第一多肽链(VL-BC44-CH2-CH3杵)沉默Fc
P31.2第三多肽链(VL-Ck-CH2-CH3臼)沉默Fc
在整个发明申请中，己参考了多个专利公开、专利、专利申请及其它文档。在本发明申请中，这些专利公开、专利、专利申请及其它文档的公开内容出于所有目的，包括为了更全面描述本文所公开的主题所属的现有技术，以其全部内容作为参考并入本文。尽管己参考以上提供的实施例描述了所公开的主题，但是应理解可以在不背离所公开的主题的精神的情况下，做出多种改变。通过审阅本说明书，多种改变将对于本领域技术人员来说是显而易见的。
序列表
<110> 埃克塞里艾克西斯公司
<120> 多重特异性结合剂及其用途
<130> 14529-008-228
<140>
<141>
<150> US 63/061,112
<151> 2020-08-04
<160> 217
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VH CDR1 (Exemplary, AbM)
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VH CDR2 (Exemplary, Kabat)
<400> 2
Trp Ile Asp Pro Tyr Gly His Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VH CDR3 (Exemplary, Kabat, AbM)
<400> 3
Gly Gly Arg Gly Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VL CDR1 (Exemplary, Kabat, AbM)
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VL CDR2 (Exemplary, Kabat, AbM)
<400> 5
Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VL CDR3 (Exemplary, IMGT, Kabat, AbM)
<400> 6
Gln Gln Arg Tyr Ser Ser Leu Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VH CDR1 (IMGT)
<400> 7
Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr Tyr
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VH CDR2 (IMGT)
<400> 8
Ile Asp Pro Tyr Gly His Ser Thr
1 5
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VH CDR3 (IMGT)
<400> 9
Ala Arg Gly Gly Arg Gly Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VL CDR1 (IMGT)
<400> 10
Gln Ser Val Ser Ser Ala
1 5
<210> 11
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VL CDR2 (IMGT, Chothia)
<400> 11
Ser Ala Ser
1
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VH CDR1 (Kabat)
<400> 12
Tyr Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VH CDR1 (Chothia)
<400> 13
Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 14
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VH CDR2 (Chothia)
<400> 14
Pro Tyr Gly His
1
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VH CDR3 (Chothia)
<400> 15
Gly Arg Gly Ala Met Asp
1 5
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VL CDR1 (Chothia)
<400> 16
Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
1 5
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VL CDR3 (Chothia)
<400> 17
Arg Tyr Ser Ser Leu Leu
1 5
<210> 18
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VH CDR1 (Contact)
<400> 18
Ser Tyr Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VH CDR2 (Contact)
<400> 19
Trp Val Ala Trp Ile Asp Pro Tyr Gly His Ser Thr Thr
1 5 10
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VH CDR3 (Contact)
<400> 20
Ala Arg Gly Gly Arg Gly Ala Met Asp
1 5
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VL CDR1 (Contact)
<400> 21
Ser Ser Ala Val Ala Trp Tyr
1 5
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VL CDR2 (Contact)
<400> 22
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr
1 5 10
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VL CDR3 (Contact)
<400> 23
Gln Gln Arg Tyr Ser Ser Leu Leu
1 5
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VH CDR2 (AbM)
<400> 24
Trp Ile Asp Pro Tyr Gly His Ser Thr Thr
1 5 10
<210> 25
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VH序列
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Asp Pro Tyr Gly His Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C40 VL序列
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Ser Ser Leu Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VH CDR1 (Exemplary, AbM)
<400> 27
Gly Phe Thr Phe Thr Tyr Tyr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VH CDR2 (Exemplary, Kabat)
<400> 28
Phe Ile Asp Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VH CDR3 (Exemplary, Kabat, AbM)
<400> 29
Gly Gly Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VL CDR1 (Exemplary, Kabat, AbM)
<400> 30
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VL CDR2 (Exemplary, Kabat, AbM)
<400> 31
Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VL CDR3 (Exemplary, IMGT, Kabat, AbM)
<400> 32
Gln Gln Gly Arg Ser Asp Leu Arg Thr
1 5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VH CDR1 (IMGT)
<400> 33
Gly Phe Thr Phe Thr Tyr Tyr Tyr
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VH CDR2 (IMGT)
<400> 34
Ile Asp Pro Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VH CDR3 (IMGT)
<400> 35
Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 36
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VL CDR1 (IMGT)
<400> 36
Gln Ser Val Ser Ser Ala
1 5
<210> 37
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VL CDR2 (IMGT, Chothia)
<400> 37
Ser Ala Ser
1
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VH CDR1 (Kabat)
<400> 38
Tyr Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VH CDR1 (Chothia)
<400> 39
Gly Phe Thr Phe Thr Tyr Tyr
1 5
<210> 40
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VH CDR2 (Chothia)
<400> 40
Pro Tyr Ser Gly
1
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VH CDR3 (Chothia)
<400> 41
Gly Leu Tyr Ala Leu Asp
1 5
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VL CDR1 (Chothia)
<400> 42
Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
1 5
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VL CDR3 (Chothia)
<400> 43
Gly Arg Ser Asp Leu Arg
1 5
<210> 44
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VH CDR1 (Contact)
<400> 44
Thr Tyr Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 45
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VH CDR2 (Contact)
<400> 45
Trp Val Ala Phe Ile Asp Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Glu
1 5 10
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VH CDR3 (Contact)
<400> 46
Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Ala Leu Asp
1 5
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VL CDR1 (Contact)
<400> 47
Ser Ser Ala Val Ala Trp Tyr
1 5
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VL CDR2 (Contact)
<400> 48
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr
1 5 10
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VL CDR3 (Contact)
<400> 49
Gln Gln Gly Arg Ser Asp Leu Arg
1 5
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VH CDR2 (AbM)
<400> 50
Phe Ile Asp Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Glu
1 5 10
<210> 51
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VH序列
<400> 51
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Tyr Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Asp Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr
<210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C56 VL序列
<400> 52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Arg Ser Asp Leu Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 53
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VH CDR1 (Exemplary, AbM)
<400> 53
Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VH CDR2 (Exemplary, Kabat)
<400> 54
Tyr Ile Asp Ser Lys His Gly Thr Thr Gln Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VH CDR3 (Exemplary, Kabat, AbM)
<400> 55
Gly Gly Arg Ser Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VL CDR1 (Exemplary, Kabat, AbM)
<400> 56
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala
1 5 10
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VL CDR2 (Exemplary, Kabat, AbM)
<400> 57
Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser
1 5
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VL CDR3 (Exemplary, IMGT, Kabat, AbM)
<400> 58
Gln Gln Arg Thr Thr Ser Leu Leu Thr
1 5
<210> 59
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VH CDR1 (IMGT)
<400> 59
Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 60
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VH CDR2 (IMGT)
<400> 60
Ile Asp Ser Lys His Gly Thr Thr
1 5
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VH CDR3 (IMGT)
<400> 61
Ala Arg Gly Gly Arg Ser Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 62
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VL CDR1 (IMGT)
<400> 62
Gln Ser Val Ser Ser Ala
1 5
<210> 63
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VL CDR2 (IMGT, Chothia)
<400> 63
Ser Ala Ser
1
<210> 64
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VH CDR1 (Kabat)
<400> 64
Ser Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VH CDR1 (Chothia)
<400> 65
Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
1 5
<210> 66
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VH CDR2 (Chothia)
<400> 66
Ser Lys His Gly
1
<210> 67
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VH CDR3 (Chothia)
<400> 67
Gly Arg Ser Ala Met Asp
1 5
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VL CDR1 (Chothia)
<400> 68
Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
1 5
<210> 69
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VL CDR3 (Chothia)
<400> 69
Arg Thr Thr Ser Leu Leu
1 5
<210> 70
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VH CDR1 (Contact)
<400> 70
Thr Ser Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 71
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VH CDR2 (Contact)
<400> 71
Trp Val Ala Tyr Ile Asp Ser Lys His Gly Thr Thr Gln
1 5 10
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VH CDR3 (Contact)
<400> 72
Ala Arg Gly Gly Arg Ser Ala Met Asp
1 5
<210> 73
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VL CDR1 (Contact)
<400> 73
Ser Ser Ala Val Ala Trp Tyr
1 5
<210> 74
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VL CDR2 (Contact)
<400> 74
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr
1 5 10
<210> 75
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VL CDR3 (Contact)
<400> 75
Gln Gln Arg Thr Thr Ser Leu Leu
1 5
<210> 76
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VH CDR2 (AbM)
<400> 76
Tyr Ile Asp Ser Lys His Gly Thr Thr Gln
1 5 10
<210> 77
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VH序列
<400> 77
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Asp Ser Lys His Gly Thr Thr Gln Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Arg Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr
<210> 78
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体C59 VL序列
<400> 78
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Thr Ser Leu Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VH CDR1 (Exemplary, AbM)
<400> 79
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 80
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VH CDR2 (Exemplary, Kabat)
<400> 80
Trp Ile Thr Ser His Gly Tyr Ser Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VH CDR3 (Exemplary, Kabat, AbM)
<400> 81
Asp Ser Val Ile Tyr Gly Leu Asp Tyr
1 5
<210> 82
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VL CDR1 (Exemplary, Kabat, AbM)
<400> 82
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala
1 5 10
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VL CDR2 (Exemplary, Kabat, AbM)
<400> 83
Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser
1 5
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VL CDR3 (Exemplary, IMGT, Kabat, AbM)
<400> 84
Gln Gln Tyr Tyr Thr Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 85
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VH CDR1 (IMGT)
<400> 85
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 86
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VH CDR2 (IMGT)
<400> 86
Ile Thr Ser His Gly Tyr Ser Thr
1 5
<210> 87
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VH CDR3 (IMGT)
<400> 87
Ala Arg Asp Ser Val Ile Tyr Gly Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 88
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VL CDR1 (IMGT)
<400> 88
Gln Ser Val Ser Ser Ala
1 5
<210> 89
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VL CDR2 (IMGT, Chothia)
<400> 89
Ser Ala Ser
1
<210> 90
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VH CDR1 (Kabat)
<400> 90
Ser Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VH CDR1 (Chothia)
<400> 91
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 92
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VH CDR2 (Chothia)
<400> 92
Ser His Gly Tyr
1
<210> 93
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VH CDR3 (Chothia)
<400> 93
Ser Val Ile Tyr Gly Leu Asp
1 5
<210> 94
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VL CDR1 (Chothia)
<400> 94
Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
1 5
<210> 95
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VL CDR3 (Chothia)
<400> 95
Tyr Tyr Thr Ser Pro Tyr
1 5
<210> 96
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VH CDR1 (Contact)
<400> 96
Ser Ser Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 97
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VH CDR2 (Contact)
<400> 97
Trp Val Ala Trp Ile Thr Ser His Gly Tyr Ser Thr Lys
1 5 10
<210> 98
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VH CDR3 (Contact)
<400> 98
Ala Arg Asp Ser Val Ile Tyr Gly Leu Asp
1 5 10
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VL CDR1 (Contact)
<400> 99
Ser Ser Ala Val Ala Trp Tyr
1 5
<210> 100
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VL CDR2 (Contact)
<400> 100
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr
1 5 10
<210> 101
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VL CDR3 (Contact)
<400> 101
Gln Gln Tyr Tyr Thr Ser Pro Tyr
1 5
<210> 102
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VH CDR2 (AbM)
<400> 102
Trp Ile Thr Ser His Gly Tyr Ser Thr Lys
1 5 10
<210> 103
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VH序列
<400> 103
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Thr Ser His Gly Tyr Ser Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Val Ile Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr
115
<210> 104
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P22 VL序列
<400> 104
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 105
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VH CDR1 (Exemplary, AbM)
<400> 105
Gly Phe Thr Phe Asp Gln Tyr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 106
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VH CDR2 (Exemplary, Kabat)
<400> 106
Glu Ile Tyr Pro Ala Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 107
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VH CDR3 (Exemplary, Kabat, AbM)
<400> 107
Gly Pro Tyr Ser Val Arg Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 108
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VL CDR1 (Exemplary, Kabat, AbM)
<400> 108
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala
1 5 10
<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VL CDR2 (Exemplary, Kabat, AbM)
<400> 109
Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser
1 5
<210> 110
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VL CDR3 (Exemplary, IMGT, Kabat, AbM)
<400> 110
Gln Gln Val Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 111
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VH CDR1 (IMGT)
<400> 111
Gly Phe Thr Phe Asp Gln Tyr Tyr
1 5
<210> 112
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VH CDR2 (IMGT)
<400> 112
Ile Tyr Pro Ala Gly Ser Tyr Thr
1 5
<210> 113
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VH CDR3 (IMGT)
<400> 113
Ala Arg Gly Pro Tyr Ser Val Arg Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 114
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VL CDR1 (IMGT)
<400> 114
Gln Ser Val Ser Ser Ala
1 5
<210> 115
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VL CDR2 (IMGT, Chothia)
<400> 115
Ser Ala Ser
1
<210> 116
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VH CDR1 (Kabat)
<400> 116
Gln Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 117
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VH CDR1 (Chothia)
<400> 117
Gly Phe Thr Phe Asp Gln Tyr
1 5
<210> 118
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VH CDR2 (Chothia)
<400> 118
Pro Ala Gly Ser
1
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VH CDR3 (Chothia)
<400> 119
Pro Tyr Ser Val Arg Tyr Ala Leu Asp
1 5
<210> 120
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VL CDR1 (Chothia)
<400> 120
Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
1 5
<210> 121
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VL CDR3 (Chothia)
<400> 121
Val Ser Tyr Ser Pro Tyr
1 5
<210> 122
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VH CDR1 (Contact)
<400> 122
Asp Gln Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 123
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VH CDR2 (Contact)
<400> 123
Trp Val Ala Glu Ile Tyr Pro Ala Gly Ser Tyr Thr Tyr
1 5 10
<210> 124
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VH CDR3 (Contact)
<400> 124
Ala Arg Gly Pro Tyr Ser Val Arg Tyr Ala Leu Asp
1 5 10
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VL CDR1 (Contact)
<400> 125
Ser Ser Ala Val Ala Trp Tyr
1 5
<210> 126
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VL CDR2 (Contact)
<400> 126
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr
1 5 10
<210> 127
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VL CDR3 (Contact)
<400> 127
Gln Gln Val Ser Tyr Ser Pro Tyr
1 5
<210> 128
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VH CDR2 (AbM)
<400> 128
Glu Ile Tyr Pro Ala Gly Ser Tyr Thr Tyr
1 5 10
<210> 129
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VH序列
<400> 129
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Gln Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Tyr Pro Ala Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Pro Tyr Ser Val Arg Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr
115
<210> 130
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P24 VL序列
<400> 130
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ser Tyr Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 131
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VH CDR1 (Exemplary, AbM)
<400> 131
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 132
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VH CDR2 (Exemplary, Kabat)
<400> 132
Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 133
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VH CDR3 (Exemplary, Kabat, AbM)
<400> 133
Gly Tyr Thr Leu Thr Pro Val Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 134
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VL CDR1 (Exemplary, Kabat, AbM)
<400> 134
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala
1 5 10
<210> 135
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VL CDR2 (Exemplary, Kabat, AbM)
<400> 135
Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser
1 5
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VL CDR3 (Exemplary, IMGT, Kabat, AbM)
<400> 136
Gln Gln Phe Gly Ala Glu Pro Ile Thr
1 5
<210> 137
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VH CDR1 (IMGT)
<400> 137
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 138
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VH CDR2 (IMGT)
<400> 138
Ile Ser Ser Gly Gly Gly Phe Thr
1 5
<210> 139
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VH CDR3 (IMGT)
<400> 139
Ala Arg Gly Tyr Thr Leu Thr Pro Val Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 140
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VL CDR1 (IMGT)
<400> 140
Gln Ser Val Ser Ser Ala
1 5
<210> 141
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VL CDR2 (IMGT, Chothia)
<400> 141
Ser Ala Ser
1
<210> 142
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VH CDR1 (Kabat)
<400> 142
Ser Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 143
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VH CDR1 (Chothia)
<400> 143
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 144
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VH CDR2 (Chothia)
<400> 144
Ser Gly Gly Gly
1
<210> 145
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VH CDR3 (Chothia)
<400> 145
Tyr Thr Leu Thr Pro Val Leu Asp
1 5
<210> 146
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VL CDR1 (Chothia)
<400> 146
Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
1 5
<210> 147
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VL CDR3 (Chothia)
<400> 147
Phe Gly Ala Glu Pro Ile
1 5
<210> 148
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VH CDR1 (Contact)
<400> 148
Ser Ser Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 149
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VH CDR2 (Contact)
<400> 149
Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Phe Thr Tyr
1 5 10
<210> 150
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VH CDR3 (Contact)
<400> 150
Ala Arg Gly Tyr Thr Leu Thr Pro Val Leu Asp
1 5 10
<210> 151
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VL CDR1 (Contact)
<400> 151
Ser Ser Ala Val Ala Trp Tyr
1 5
<210> 152
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VL CDR2 (Contact)
<400> 152
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr
1 5 10
<210> 153
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VL CDR3 (Contact)
<400> 153
Gln Gln Phe Gly Ala Glu Pro Ile
1 5
<210> 154
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VH CDR2 (AbM)
<400> 154
Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Phe Thr Tyr
1 5 10
<210> 155
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VH序列
<400> 155
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Thr Leu Thr Pro Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr
115
<210> 156
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体P31.2 VL序列
<400> 156
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ala Glu Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 157
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C40第一多肽链(BC1)
<400> 157
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Ser Ser Leu Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Pro Arg Glu
100 105 110
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
115 120 125
Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
130 135 140
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
165 170 175
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
180 185 190
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
195 200 205
Ser Leu Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 158
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C40第二多肽链(BC1)
<400> 158
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Asp Pro Tyr Gly His Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Asp
115 120 125
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 159
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P22第三多肽链(BC1和B44)
<400> 159
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 160
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P22第四多肽链(BC1和BC44)
<400> 160
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Thr Ser His Gly Tyr Ser Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Val Ile Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 161
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P24第三多肽链(BC1和BC44)
<400> 161
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ser Tyr Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 162
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P24第四多肽链(BC1和BC44)
<400> 162
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Gln Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Tyr Pro Ala Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Pro Tyr Ser Val Arg Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 163
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P31.2第三多肽链(BC1和BC44)
<400> 163
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ala Glu Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 164
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P31.2第四多肽链(BC1)
<400> 164
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Thr Leu Thr Pro Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 165
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C56第一多肽链(BC1)
<400> 165
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Arg Ser Asp Leu Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Pro Arg Glu
100 105 110
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
115 120 125
Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
130 135 140
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
165 170 175
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
180 185 190
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
195 200 205
Ser Leu Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 166
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C56第二多肽链(BC1)
<400> 166
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Tyr Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Asp Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Asp
115 120 125
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 167
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C59第一多肽链(BC1)
<400> 167
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Thr Ser Leu Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Pro Arg Glu
100 105 110
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
115 120 125
Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
130 135 140
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
165 170 175
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
180 185 190
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
195 200 205
Ser Leu Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 168
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C59第二多肽链(BC1)
<400> 168
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Asp Ser Lys His Gly Thr Thr Gln Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Arg Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Asp
115 120 125
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 169
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C40第一多肽链(BC1；沉默Fc)
<400> 169
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Ser Ser Leu Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Pro Arg Glu
100 105 110
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
115 120 125
Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
130 135 140
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
165 170 175
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
180 185 190
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
195 200 205
Ser Leu Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Lys Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 170
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P22第三多肽链(BC1；沉默Fc和BC44；沉默Fc)
<400> 170
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Lys Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 171
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P24第三多肽链(BC1；沉默Fc和BC44；沉默Fc)
<400> 171
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ser Tyr Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Lys Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 172
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P31.2第三多肽链(BC1；沉默Fc和BC44；沉默Fc)
<400> 172
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ala Glu Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Lys Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 173
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C56第一多肽链(BC1；沉默Fc)
<400> 173
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Arg Ser Asp Leu Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Pro Arg Glu
100 105 110
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
115 120 125
Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
130 135 140
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
165 170 175
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
180 185 190
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
195 200 205
Ser Leu Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Lys Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
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Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> C59第一多肽链(BC1；沉默Fc)
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
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435 440
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<223> C56第二多肽链(BC44)
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<223> C59第二多肽链(BC44)
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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275 280 285
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Lys Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 184
<211> 323
<212> PRT
<213> 人
<220>
<223> 人CD47的全长氨基酸序列
<400> 184
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu
130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe
145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr
165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val
180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr
195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His
210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala
225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu
245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile
260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr
275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys
290 295 300
Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met
305 310 315 320
Asn Asp Glu
<210> 185
<211> 504
<212> PRT
<213> 人
<220>
<223> 人SIRPa的全长氨基酸序列
<400> 185
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val
130 135 140
Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser
165 170 175
Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser
180 185 190
Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser
195 200 205
Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser
210 215 220
Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu
225 230 235 240
Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu
245 250 255
Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr
260 265 270
Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu
275 280 285
Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu
290 295 300
Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val
305 310 315 320
Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp
325 330 335
Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His
340 345 350
Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn
355 360 365
Glu Arg Asn Ile Tyr Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu Leu Val
370 375 380
Ala Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Val Arg Ile Arg Gln Lys Lys
385 390 395 400
Ala Gln Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu Lys Asn
405 410 415
Ala Arg Glu Ile Thr Gln Asp Thr Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu
420 425 430
Asn Leu Pro Lys Gly Lys Lys Pro Ala Pro Gln Ala Ala Glu Pro Asn
435 440 445
Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Gln Thr Ser Pro Gln Pro Ala Ser
450 455 460
Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Asn Arg
465 470 475 480
Thr Pro Lys Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr
485 490 495
Ala Ser Val Gln Val Pro Arg Lys
500
<210> 186
<211> 290
<212> PRT
<213> 人
<220>
<223> 人PD-L1的全长氨基酸序列
<400> 186
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1 5 10 15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50 55 60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
130 135 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165 170 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
180 185 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
195 200 205
Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
210 215 220
Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
225 230 235 240
Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr
245 250 255
Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys
260 265 270
Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu
275 280 285
Glu Thr
290
<210> 187
<211> 288
<212> PRT
<213> 人
<220>
<223> 人PD-1的全长氨基酸序列
<400> 187
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225 230 235 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 188
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Exemplary Fc区序列
<400> 188
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 189
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Exemplary变体Fc区(沉默Fc)序列
<400> 189
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Lys Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 190
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Exemplary变体CH2域(例如,沉默CH2)序列
<400> 190
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Lys Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105 110
<210> 191
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Exemplary IgG重链包含任何VH域
<400> 191
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 192
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Exemplary IgG重链包含任何VH域
<400> 192
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Lys Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 193
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Exemplary轻链(例如，用于与IgG重链配对)包含任何VL域
<400> 193
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Ser
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 194
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD47 VH CDR1
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 194
Gly Phe Thr Phe Xaa Xaa Tyr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 195
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD47 VH CDR2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(8)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 195
Xaa Ile Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 196
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD47 VH CDR3
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 196
Gly Gly Xaa Xaa Ala Xaa Asp Tyr
1 5
<210> 197
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD47和PD-L1 VL CDR1
<400> 197
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala
1 5 10
<210> 198
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD47和PD-L1 VL CDR2
<400> 198
Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser
1 5
<210> 199
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD47 VL CDR3
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(6)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 199
Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Thr
1 5
<210> 200
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 VH CDR1
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 200
Gly Phe Thr Phe Xaa Xaa Tyr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 201
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 VH CDR2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(8)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 201
Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 202
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 VH CDR3
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 202
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 203
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 VL CDR3
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(6)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 203
Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr
1 5
<210> 204
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 噬箘体展示重链
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(35)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(66)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (99)..(112)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 204
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys
225
<210> 205
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 噬箘体展示轻链
<220>
<221> misc_feature
<222> (89)..(97)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 205
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Ser Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 206
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD47 VH CDR2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X是W、F或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X是P或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X是Y或K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X是G、S或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X是H或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X是S或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X是T、E或Q
<400> 206
Xaa Ile Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 207
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD47 VH CDR3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X是R或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X是G、Y或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X是M或L
<400> 207
Gly Gly Xaa Xaa Ala Xaa Asp Tyr
1 5
<210> 208
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD47 VL CDR3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X是R或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X是Y、R或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X是S或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X是S或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X是L或R
<400> 208
Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Thr
1 5
<210> 209
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 VH CDR2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X是E、W或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X是Y、T或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X是P或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X是A、H或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X是S、Y或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X是Y、S或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X是Y或K
<400> 209
Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 210
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 VH CDR3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X是G或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X是P、S或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X是Y、V或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X是S、I或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X是V、Y或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X是R、G或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X是Y或V(或不存在)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X是A(或不存在)
<400> 210
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 211
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 VL CDR3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X是V、Y或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X是S、Y或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X是Y、T或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X是S或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X是Y或I
<400> 211
Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr
1 5
<210> 212
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD47 VH共有序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X是S或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X是Y或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X是W、F或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X是P或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> X是Y或K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> X是G、S或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> X是H或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> X是S或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> X是T、E或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> X是R或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X是G、Y或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> X是M或L
<400> 212
Gly Phe Thr Phe Xaa Xaa Tyr Tyr Ile His Xaa Ile Asp Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Gly Gly Xaa Xaa Ala
20 25 30
Xaa Asp Tyr
35
<210> 213
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD47 VL共有序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> X是R或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> X是Y、R或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> X是S或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> X是S或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> X是L或R
<400> 213
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Ser Ala Ser Ser Leu
1 5 10 15
Tyr Ser Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Thr
20 25
<210> 214
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 VH共有序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X是D或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X是Q或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X是E, W,或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> X是Y、T或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X是P或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> X是A、H或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> X是S、Y或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> X是Y, S,或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> X是Y或K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> X是G或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> X是P、S或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> X是Y、V或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X是S、I或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X是V、Y或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> X是R、G或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> X是Y或V(或不存在)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> X是A(或不存在)
<400> 214
Gly Phe Thr Phe Xaa Xaa Tyr Tyr Ile His Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Leu Asp Tyr
35
<210> 215
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 VL共有序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> X是V、Y或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> X是S、Y或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> X是Y、T或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> X是S或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> X是Y或I
<400> 215
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Ser Ala Ser Ser Leu
1 5 10 15
Tyr Ser Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr
20 25
<210> 216
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD47 VH CDR1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X是S或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X是Y或S
<400> 216
Gly Phe Thr Phe Xaa Xaa Tyr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 217
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 VH CDR1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X是D或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X是Q或S
<400> 217
Gly Phe Thr Phe Xaa Xaa Tyr Tyr Ile His
1 5 10
Claims (199)
1.多重特异性抗体或其片段，其包含结合至CD47的第一结合域和结合至一个或多个非CD47的靶标的一个或多个其它结合域，其中所述多重特异性抗体或其片段与以下抗体竞争对人CD47的结合，所述抗体包含：(i)具有SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列的轻链可变区；(ii)具有SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列的轻链可变区；或者(iii)具有SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列的轻链可变区。
2.根据权利要求1所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
3.根据权利要求1或2所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
4.具有结合至CD47的第一结合域的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR1：
(i)SEQ ID NO：1、27或53，
(ii)SEQ ID NO：7、33或59，
(iii)SEQ ID NO：12、38或64，
(iv)SEQ ID NO：13、39或65，和
(v)SEQ ID NO：18、44或70；
(2)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR2：
(i)SEQ ID NO：2、28或54，
(ii)SEQ ID NO：8、34或60，
(iii)SEQ ID NO：14、40或66，
(iv)SEQ ID NO：19、45或71，和
(v)SEQ ID NO：24、50或76；和
(3)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR3：
(i)SEQ ID NO：3、29或55，
(ii)SEQ ID NO：9、35或61，
(iii)SEQ ID NO：15、41或67，和
(iv)SEQ ID NO：20、46或72；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR1：
(i)SEQ ID NO：4、30或56，
(ii)SEQ ID NO：10、36或62，
(iii)SEQ ID NO：16、42或68，和
(iv)SEQ ID NO：21、47或73；
(2)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR2：
(i)SEQ ID NO：5、31或57，
(ii)SEQ ID NO：11、37或63，和
(iii)SEQ ID NO：22、48或74；和
(3)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR3：
(i)SEQ ID NO：6、32或58，
(ii)SEQ ID NO：17、43或69，和
(iii)SEQ ID NO：23、49或75。
5.根据权利要求4所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
6.根据权利要求4或5所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
7.根据权利要求5或6所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR1：
(i)SEQ ID NO：79、105或131，
(ii)SEQ ID NO：85、111或137，
(iii)SEQ ID NO：90、116或142，
(iv)SEQ ID NO：91、117或143，和
(v)SEQ ID NO：96、122或148；
(2)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR2：
(i)SEQ ID NO：80、106或132，
(ii)SEQ ID NO：86、112或138，
(iii)SEQ ID NO：92、118或144，
(iv)SEQ ID NO：97、123或149，和
(v)SEQ ID NO：102、128或159；和
(3)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR3：
(i)SEQ ID NO：81、107或133，
(ii)SEQ ID NO：87、113或139，
(iii)SEQ ID NO：93、119或145，
(iv)SEQ ID NO：98、124或150；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR1：
(i)SEQ ID NO：82、108或134，
(ii)SEQ ID NO：88、114或140，
(iii)SEQ ID NO：94、120或146，和
(iv)SEQ ID NO：99、125或151；
(2)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR2：
(i)SEQ ID NO：83、109或135，
(ii)SEQ ID NO：89、115或141，和
(iii)SEQ ID NO：100、126或152；和
(3)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR3：
(i)SEQ ID NO：84、110或136，
(ii)SEQ ID NO：95、121或147，
(iii)SEQ ID NO：101、127或153。
8.具有结合至CD47的第一结合域的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR1：
(i)SEQ ID NO：1、27或53，
(ii)SEQ ID NO：7、33或59，
(iii)SEQ ID NO：12、38或64，
(iv)SEQ ID NO：13、39或65，和
(v)SEQ ID NO：18、44或70；
(2)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR2：
(i)SEQ ID NO：2、28或54，
(ii)SEQ ID NO：8、34或60，
(iii)SEQ ID NO：14、40或66，
(iv)SEQ ID NO：19、45或71，和
(v)SEQ ID NO：24、50或76；和
(3)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR3：
(i)SEQ ID NO：3、29或55，
(ii)SEQ ID NO：9、35或61，
(iii)SEQ ID NO：15、41或67，和
(iv)SEQ ID NO：20、46或72。
9.根据权利要求8所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
10.根据权利要求8或9所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
11.根据权利要求9或10所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR1：
(i)SEQ ID NO：79、105或131，
(ii)SEQ ID NO：85、111或137，
(iii)SEQ ID NO：90、116或142，
(iv)SEQ ID NO：91、117或143，和
(v)SEQ ID NO：96、122或148；
(2)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR2：
(i)SEQ ID NO：80、106或132，
(ii)SEQ ID NO：86、112或138，
(iii)SEQ ID NO：92、118或144，
(iv)SEQ ID NO：97、123或149，和
(v)SEQ ID NO：102、128或159；和
(3)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR3：
(i)SEQ ID NO：81、107或133，
(ii)SEQ ID NO：87、113或139，
(iii)SEQ ID NO：93、119或145，和
(iv)SEQ ID NO：98、124或150。
12.具有结合至CD47的第一结合域的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR1：
(i)SEQ ID NO：4、30或56，
(ii)SEQ ID NO：10、36或62，
(iii)SEQ ID NO：16、42或68，和
(iv)SEQ ID NO：21、47或73；
(2)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR2：
(i)SEQ ID NO：5、31或57，
(ii)SEQ ID NO：11、37或63，和
(iii)SEQ ID NO：22、48或74；
(3)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR3：
(i)SEQ ID NO：6、32或58，
(ii)SEQ ID NO：17、43或69，和
(iii)SEQ ID NO：23、49或75。
13.根据权利要求12所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
14.根据权利要求12或13所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
15.根据权利要求13或14所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR1：
(i)SEQ ID NO：82、108或134，
(ii)SEQ ID NO：88、114或140，
(iii)SEQ ID NO：94、120或146，和
(iv)SEQ ID NO：99、125或151；
(2)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR2：
(i)SEQ ID NO：83、109或135，
(ii)SEQ ID NO：89、115或141，和
(iii)SEQ ID NO：100、126或152；和
(3)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR3：
(i)SEQ ID NO：84、110或136，
(ii)SEQ ID NO：95、121或147，
(iii)SEQ ID NO：101、127或153。
16.具有结合至CD47的第一结合域的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含全部3个重链互补决定区(CDR)或者全部3个轻链CDR，其来自：
表示为C40的抗体，其包含作为SEQ ID NO：25的VH序列和作为SEQ ID NO：26的VL序列；
表示为C56的抗体，其包含作为SEQ ID NO：51的VH序列和作为SEQ ID NO：52的VL序列；或者
表示为C59的抗体，其包含作为SEQ ID NO：77的VH序列和作为SEQ ID NO：78的VL序列。
17.根据权利要求16所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
18.根据权利要求16或17所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
19.根据权利要求17或18所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含全部3个重链互补决定区(CDR)或者全部3个轻链CDR，其来自：
表示为P22的抗体，其包含作为SEQ ID NO：103的VH序列和作为SEQ ID NO：104的VL序列；
表示为P24的抗体，其包含作为SEQ ID NO：129的VH序列和作为SEQ ID NO：130的VL序列；
表示为P31.2的抗体，其包含作为SEQ ID NO：155的VH序列和作为SEQ ID NO：156的VL序列。
20.根据权利要求16所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含来自表示为C40的抗体的全部3个重链CDR和/或全部3个轻链CDR。
21.根据权利要求20所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
22.根据权利要求20或21所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
23.根据权利要求21或22所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含来自表示为P22的抗体的全部3个重链CDR和全部3个轻链CDR。
24.根据权利要求21或22所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含来自表示为P24的抗体的全部3个重链CDR和全部3个轻链CDR。
25.根据权利要求21或22所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含来自表示为P31.2的抗体的全部3个重链CDR和全部3个轻链CDR。
26.根据权利要求16所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含来自表示为C56的抗体的全部3个重链CDR和全部3个轻链CDR。
27.根据权利要求26所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
28.根据权利要求26或27所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
29.根据权利要求27或28所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含来自表示为P22的抗体的全部3个重链CDR和全部3个轻链CDR。
30.根据权利要求27或28所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含来自表示为P24的抗体的全部3个重链CDR和全部3个轻链CDR。
31.根据权利要求27或28所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含来自表示为P31.2的抗体的全部3个重链CDR和全部3个轻链CDR。
32.根据权利要求16所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含来自表示为C59的抗体的全部3个重链CDR和全部3个轻链CDR。
33.根据权利要求32所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
34.根据权利要求32或33所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
35.根据权利要求33或34所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含来自表示为P22的抗体的全部3个重链CDR和全部3个轻链CDR。
36.根据权利要求33或34所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含来自表示为P24的抗体的全部3个重链CDR和全部3个轻链CDR。
37.根据权利要求33或34所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含来自表示为P31.2的抗体的全部3个重链CDR和全部3个轻链CDR。
38.具有结合至CD47的第一结合域的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：表1-3中所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3氨基酸序列；
或
(b)轻链可变(VL)区，其包含：表1-3中所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列。
39.根据权利要求38所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：表1-3中所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3氨基酸序列；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：表1-3中所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列。
40.根据权利要求38所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
41.根据权利要求38-40中任一项所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
42.根据权利要求40或41所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：表4-6中所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3氨基酸序列；
如/或
(b)轻链可变(VL)区，其包含：表4-6中所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列。
43.根据权利要求38所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含重链可变(VH)区，其包含：表1-3中所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3氨基酸序列。
44.根据权利要求43所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
45.根据权利要求43或44所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
46.根据权利要求44或45所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含重链可变(VH)区，其包含：表4-6中所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3氨基酸序列。
47.根据权利要求38所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含轻链可变(VL)区，其包含：表1-3中所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列。
48.根据权利要求47所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
49.根据权利要求47或48所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
50.根据权利要求48或49所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含轻链可变(VL)区，其包含：表4-6中所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列。
51.根据权利要求38所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR1：SEQ ID NO：1、7、12、13和18；
(2)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR2：SEQ ID NO：2、8、14、19和24；和
(3)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR3：SEQ ID NO：3、9、15和20；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR1：SEQ ID NO：4、10、16和21；
(2)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR2：SEQ ID NO：5、11和22；和
(3)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR3：SEQ ID NO：6、17和23。
52.根据权利要求51所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
53.根据权利要求51或52所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
54.根据权利要求51所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的VL CDR3。
55.根据权利要求54所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
56.根据权利要求54或55所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
57.根据权利要求55或56所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。
58.根据权利要求55或56所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。
59.根据权利要求55或56所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。
60.根据权利要求51所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的VL CDR3。
61.根据权利要求60所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
62.根据权利要求60或61所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
63.根据权利要求61或62所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：85所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：86所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：87所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：88所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：89所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。
64.根据权利要求61或62所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：112所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：115所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。
65.根据权利要求61或62所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：137所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：138所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：139所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：140所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：141所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。
66.根据权利要求51所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的VL CDR3。
67.根据权利要求66所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
68.根据权利要求66或67所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
69.根据权利要求67或68所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：90所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。
70.根据权利要求67或68所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：116所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。
71.根据权利要求67或68所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：142所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。
72.根据权利要求51所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列的VL CDR3。
73.根据权利要求72所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
74.根据权利要求72或73所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
75.根据权利要求73或74所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：91所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：93所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：94所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：89所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：95所示的氨基酸序列的VL CDR3。
76.根据权利要求73或74所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：117所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：118所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：119所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：120所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：115所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：128所示的氨基酸序列的VL CDR3。
77.根据权利要求73或74所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：143所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：144所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：145所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：146所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：141所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：147所示的氨基酸序列的VL CDR3。
78.根据权利要求51所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列的VL CDR3。
79.根据权利要求78所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
80.根据权利要求78或79所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
81.根据权利要求79或80所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：96所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：97所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：98所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：99所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：100所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：101所示的氨基酸序列的VL CDR3。
82.根据权利要求79或80所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：122所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：123所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：124所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：125所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：126所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：127所示的氨基酸序列的VL CDR3。
83.根据权利要求79或80所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：149所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：150所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：151所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：152所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：153所示的氨基酸序列的VL CDR3。
84.根据权利要求51所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的VL CDR3。
85.根据权利要求84所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
86.根据权利要求84或85所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
87.根据权利要求85或86所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：102所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。
88.根据权利要求85或86所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：128所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。
89.根据权利要求85或86所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：154所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。
90.根据权利要求38所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR1：SEQ ID NO：27、33、38、39和44；
(2)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR2：SEQ ID NO：28、34、40、45和50；和
(3)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR3：SEQ ID NO：29、35、41和46；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR1：SEQ ID NO：30、36、42和47；
(2)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR2：SEQ ID NO：31、37和48，和
(3)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR3：SEQ ID NO：32、43和49。
91.根据权利要求90所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
92.根据权利要求90或91所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
93.根据权利要求90所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的VL CDR3。
94.根据权利要求93所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
95.根据权利要求93或94所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
96.根据权利要求94或95所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。
97.根据权利要求94或95所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。
98.根据权利要求94或95所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。
99.根据权利要求90所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的VL CDR3。
100.根据权利要求99所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
101.根据权利要求99或100所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
102.根据权利要求100或101所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。
103.根据权利要求100或101所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。
104.根据权利要求100或101所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。
105.根据权利要求90所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的VL CDR3。
106.根据权利要求105所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
107.根据权利要求105或106所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
108.根据权利要求106或107所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。
109.根据权利要求106或107所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。
110.根据权利要求106或107所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。
111.根据权利要求90所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列的VL CDR3。
112.根据权利要求111所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
113.根据权利要求111或112所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
114.根据权利要求112或113所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。
115.根据权利要求112或113所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。
116.根据权利要求112或113所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。
117.根据权利要求90所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列的VL CDR3。
118.根据权利要求117所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
119.根据权利要求117或118所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
120.根据权利要求118或119所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。
121.根据权利要求118或119所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。
122.根据权利要求118或119所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。
123.根据权利要求90所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的VL CDR3。
124.根据权利要求123所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
125.根据权利要求123或124所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
126.根据权利要求124或125所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。
127.根据权利要求124或125所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。
128.根据权利要求124或125所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。
129.根据权利要求38所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR1：SEQ ID NO：53、59、64、65和70；
(2)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR2：SEQ ID NO：54、60、66、71和76；和
(3)具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR3：SEQ ID NO：55、61、67和72；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR1：SEQ ID NO：56、62、68和73；
(2)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR2：SEQ ID NO：57、63和74；和
(3)具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR3：SEQ ID NO：58、69和75。
130.根据权利要求129所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
131.根据权利要求129或130所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
132.根据权利要求129所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列的VL CDR3。
133.根据权利要求132所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
134.根据权利要求132或133所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
135.根据权利要求133或134所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。
136.根据权利要求133或134所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。
137.根据权利要求133或134所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。
138.根据权利要求129所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列的VL CDR3。
139.根据权利要求138所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
140.根据权利要求138或139所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
141.根据权利要求139或140所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VHCDR1；
(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。
142.根据权利要求139或140所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。
143.根据权利要求139或140所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。
144.根据权利要求129所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列的VL CDR3。
145.根据权利要求144所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
146.根据权利要求144或145所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
147.根据权利要求145或146所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。
148.根据权利要求146或147所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。
149.根据权利要求146或147所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。
150.根据权利要求129所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列的VL CDR3。
151.根据权利要求150所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
152.根据权利要求150或151所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
153.根据权利要求151或152所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDRl；
(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。
154.根据权利要求151或152所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。
155.根据权利要求151或152所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。
156.根据权利要求129所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：73所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：74所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列的VL CDR3。
157.根据权利要求156所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
158.根据权利要求156或157所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
159.根据权利要求157或158所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。
160.根据权利要求157或158所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。
161.根据权利要求157或158所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。
162.根据权利要求129所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第一结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：76所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列的VL CDR3。
163.根据权利要求162所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述多重特异性抗体包含结合至PD-L1的第二结合域。
164.根据权利要求162或163所述的多重特异性抗体或其片段，其是双重特异性抗体。
165.根据权利要求163或164所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列的VL CDR3。
166.根据权利要求163或164所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：105所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的VL CDR3。
167.根据权利要求163或164所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述第二结合域包含：
(a)重链可变(VH)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列的VH CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列的VH CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：133所示的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(b)轻链可变(VL)区，其包含：
(1)具有SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列的VL CDR1；
(2)具有SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列的VL CDR2；和
(3)具有SEQ ID NO：136所示的氨基酸序列的VL CDR3。
168.根据权利要求38-167中任一项所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述VH区或VL区还包含人框架序列。
169.根据权利要求168所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述VH区和VL区还包含人框架序列。
170.根据权利要求38-167中任一项所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述VH区或VL区还包含框架1(FR1)、框架2(FR2)、框架3(FR3)或者框架4(FR4)序列。
171.根据权利要求170所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述VH区和VL区还包含框架1(FR1)、框架2(FR2)、框架3(FR3)和/或框架4(FR4)序列。
172.根据权利要求1-171中任一项所述的多重特异性抗体或片段，其中所述抗体是重组抗体。
173.根据权利要求172所述的多重特异性抗体或片段，其中所述重组抗体是人源化抗体、人抗体或嵌合抗体。
174.根据权利要求1-173中任一项所述的多重特异性抗体或其片段，其是Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、scFv、(scFv)2、单链抗体分子、双重可变区抗体、单可变区抗体、线性抗体、V区或者由抗体片段形成的多重特异性抗体。
175.根据权利要求1-174中任一项所述的多重特异性抗体或其片段，其缀合或重组融合至诊断试剂、可检测试剂或治疗剂。
176.根据权利要求175所述的多重特异性抗体或其片段，其中所述治疗剂是化疗剂、细胞毒素或药物。
177.结合剂，其结合至与根据权利要求1-176中任一项所述的多重特异性抗体或其片段基本相同的人CD47表位。
178.根据权利要求177所述的结合剂，其是多重特异性抗体或其片段。
179.根据权利要求177所述的结合剂，其包括非抗体蛋白质骨架。
180.根据权利要求179所述的结合剂，其中所述非抗体蛋白质骨架包括纤连蛋白骨架、抗运载蛋白、纤连蛋白(adnectin)、亲和体(affibody)、DARPin、fynomer、affitin、affilin、高亲和性多聚体(avimer)、富含半胱氨酸的打结素(knottin)肽或者工程化Kunitz型抑制剂。
181.结合剂，其与根据权利要求1-176中任一项所述的多重特异性抗体或其片段竞争对人CD47的结合。
182.根据权利要求181所述的结合剂，其中所述结合剂是抗体或其片段。
183.一个或多个载体，其包含编码根据权利要求1-176中任一项所述的多重特异性抗体或其片段的一个或多个多核苷酸。
184.药物组合物，其包含根据权利要求1-176中任一项所述的多重特异性抗体或其片段和药物可用的载体。
185.治疗受试者中癌症或肿瘤的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1-176中任一项所述的多重特异性抗体或其片段，或根据权利要求184所述的药物组合物。
186.减轻受试者中与癌症或肿瘤有关的一种或多种症状的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1-176中任一项所述的多重特异性抗体或其片段，或根据权利要求184所述的药物组合物。
187.减小具有肿瘤的受试者中肿瘤尺寸的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1-176中任一项所述的多重特异性抗体或其片段，或根据权利要求184所述的药物组合物。
188.增强具有肿瘤的受试者中肿瘤细胞去除的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1-176中任一项所述的多重特异性抗体或其片段，或根据权利要求184所述的药物组合物。
189.治疗受试者中吞噬细胞功能障碍疾病、病症或病况的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1-176中任一项所述的多重特异性抗体或其片段，或根据权利要求184所述的药物组合物。
190.提高受试者中免疫细胞吞噬的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1-176中任一项所述的多重特异性抗体或其片段，或根据权利要求184所述的药物组合物。
191.根据权利要求190所述的方法，其中所述免疫细胞是巨噬细胞、嗜中性白细胞、树突状细胞或者B淋巴细胞。
192.根据权利要求190或191所述的方法，其中所述受试者被诊断患有癌症或肿瘤。
193.治疗受试者中T细胞功能障碍疾病、病症或病况的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1-176中任一项所述的多重特异性抗体或其片段，或根据权利要求184所述的药物组合物。
194.根据权利要求193所述的方法，其中所述T细胞功能障碍疾病、病症或病况是肿瘤免疫。
195.增强受试者中T细胞功能的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1-176中任一项所述的多重特异性抗体或其片段，或根据权利要求184所述的药物组合物。
196.根据权利要求195所述的方法，其中所述T细胞功能是细胞因子分泌。
197.根据权利要求195所述的方法，其中所述T细胞功能是肿瘤细胞去除。
198.根据权利要求195-197中任一项所述的方法，其中所述受试者被诊断患有癌症或肿瘤。
199.根据权利要求185-198中任一项所述的方法，其中与所述多重特异性抗体或其片段或者所述药物组合物组合，向所述受试者施用一种或多种治疗剂。
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