ES2337224B1 - Anticuerpo anti-dectin-1 humano, hibridoma productor de dicho anticuerpo y sus aplicaciones. - Google Patents
Anticuerpo anti-dectin-1 humano, hibridoma productor de dicho anticuerpo y sus aplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
Anticuerpo
anti-Dectin-1 humano, hibridoma
productor de dicho anticuerpo y sus aplicaciones.
La presente invención consiste en el hibridoma
MGD3 y el anticuerpo monocional producido por él (denominado también
MGD3), que reconoce de forma especifica al receptor de membrana
Decti-1 humano. El anticuerpo MGD3 es capaz de
inhibir la unión de Dectin-1 a su ligando natural,
los \beta-glucanos que son componentes de la pared
de los hongos. Además, bloquea específicamente la unión a Candida
albicans así como la secreción de citoquinas inducidas por la misma.
El anticuerpo MGD3 obtenido permite la detección in vitro, ex
vivo e in vivo de la proteína humana
Dectin-1. Del mismo modo, puede emplearse para
detectar el nivel de expresión del receptor en leucocitos humanos y
para definir el papel de este receptor en la patogenia de
enfermedades autoinmunes y de condiciones caracterizadas por
inflamación crónica así como para conocer el efecto terapéutico de
distintos agentes anti-inflamatorios e
inmunosupresores. Además, el anticuerpo MGD3 podría tener potencial
terapéutico en enfermedades inflamatorias crónicas.
Description
Anticuerpo
anti-Dectin-1 humano, hibridoma
productor de dicho anticuerpo y sus aplicaciones.
La respuesta inmune innata es la encargada del
reconocimiento y contención inmediatos de la invasión microbiana y
dirige la respuesta adaptativa contra los patógenos a través del
control del crecimiento de los mismos, de la expresión de moléculas
co-estimuladoras en los fagocitos, de la
presentación antigénica y de la producción de citoquinas y
quimioquinas. Estos factores regulan el tráfico de los leucocitos
iniciando la respuesta inflamatoria, activan las capacidades
microbicidas de los fagocitos y dirigen la polarización de las
células T cooperadoras. La respuesta inflamatoria sirve para limitar
la infección, pero la inflamación tiene que resolverse para evitar
procesos patológicos. En este sentido, se ha propuesto que la
producción de citoquinas inhibitorias como la interleuquina
(IL)-10 por los neutrófilos, macrófagos, células
dendríticas (DCs) y células T reguladoras, tiene un papel importante
en las fases tardías de la infección para prevenir una activación
excesiva de la respuesta innata y el establecimiento del
comensalismo y quizá de la latencia y persistencia del patógeno
(Romani 2004).
En la respuesta inmune innata, el reconocimiento
de los patógenos se lleva a cabo por las células fagocíticas a
través de los receptores de patrones de reconocimiento (PRR,
Pattern Recognition Receptor) que detectan estructuras
microbianas altamente conservadas. El prototipo de PRR son los TLR
(Toll-like receptors), pero recientemente se
ha demostrado que también receptores de la familia de las lectinas
como Dectin-1 pueden funcionar como PRRs (Akira y
Takeda 2004; Gordon 2002; Brown 2005). El receptor de membrana
Dectin-1 humano reconoce polisacáridos con enlaces
\beta(1\rightarrow3) y/o \beta(1\rightarrow6),
los llamados \beta-glucanos, presentes en la pared
de los hongos (Brown y Gordon 2001; Brown et al. 2003). Como
consecuencia, Dectin-1 está implicado en la
respuesta inmune innata frente a patógenos fúngicos (Brown y Gordon
2003) tanto en humanos como en ratón.
La estructura de este receptor contiene una
región extracelular con un único dominio de unión a carbohidratos de
tipo CTLD (C-type lectin-like
domain) (Weis et al. 1998) conectado al dominio
intracelular a través de un cuello y una región transmembrana.
Dectin-1 sufre un proceso de procesamiento
alternativo que da lugar a varias isoformas, sólo dos de ellas
funcionales: Dectin-1a (completa) y
Dectin-1b (predominante, carente del cuello). Aunque
parecen funcionar de manera similar in vitro, se expresan de
forma diferencial según el tipo celular (Willment et al.
2001, Heinsbroek et al. 2006). En su tallo citoplasmático
posee un motivo semi-ITAM (Immunoreceptor
Tyrosine-based Activation Motif) con dos
residuos de tirosina potencialmente fosforilables, implicado en
activación celular (Gantner et al. 2003; Brown et al.
2003; Gordon 2002).
Identificado inicialmente en macrófagos de ratón
como el receptor principal de \beta-glucanos
(Brown y Gordon 2001; Willment et al. 2005),
Dectin-1 media la unión, captación y eliminación de
patógenos, dispara la respuesta oxidativa generando especies
reactivas de oxígeno (ROS) y produce citoquinas
pro-inflamatorias y quimioquinas. Además,
Dectin-1 está implicado en fenómenos de tolerancia y
control de la respuesta inmune puesto que puede inducir la
generación de citoquinas inhibitorias (Interleuquina
(IL)-10, IL-2). Estas funciones
pueden influenciar la respuesta inmune resultante y, en ciertas
circunstancias, llevar a procesos patológicos y de autoinmunidad
(Haskard y Landi 2002). Aunque se consideraba que
Dectin-1 se expresaba de forma mayoritaria en
células dendríticas (DCs) inmaduras y en células de Langerhans y que
los estímulos de maduración disminuían su expresión (Ariizumi et
al. 2000; Hermanz-Falcon et al. 2001;
Sobanov et al. 2001; Yokota et al. 2001),
posteriormente se comprobó que Dectin-1 no está
restringido al linaje mieloide, sino que también se expresa en
neutrófilos, eosinófilos, células B y una
sub-población de célu-
las T (Brown et al. 2002; Taylor et al. 2002; Willment et al. 2005) aunque no en todos los tejidos (Reíd. et al. 2004).
las T (Brown et al. 2002; Taylor et al. 2002; Willment et al. 2005) aunque no en todos los tejidos (Reíd. et al. 2004).
Dectin-1 es crucial en la
respuesta inmune frente a patógenos fúngicos vivos como Candida
albicans (Gantner et al. 2005; Taylor et al.
2007), Coccidiodes posadasii (Viriyakosol et al.
2005), Pneumocystis carinii (Steele et al. 2003 y
2005) y Aspergillus fumigatus (Hohl et al. 2005;
Steele et al. 2005; Gersuk et al. 2006). La relevancia
de este receptor se ha establecido gracias a la generación de
ratones deficientes en el gen que codifica para
Dectin-1, en los cuales se ha visto que aumenta la
susceptibilidad a C. albicans (Taylor et al. 2007) y a
P. carinii (Saijo et al. 2007). No obstante, el papel
que desempeña Dectin-1 en el control de la infección
es aún controvertido. En cualquier caso, se ha demostrado que
Dectin-1 puede desencadenar respuestas específicas
contra patógenos en colaboración con los TLRs o de forma
independiente de ellos. En la vía independiente de TLRs la unión del
ligando provoca una cascada de señalización intracelular: la
fosforilación de la tirosina proximal del motivo de activación ITAM
por la tirosina quinasa Src, permite reclutar la tirosina quinasa de
bazo (Syk, Spleen Tyrosine Kinase). Syk es necesaria para la
señalización a través del receptor específico de antígeno de células
T y B, y en células mieloides se ha descrito como crucial para
estimular la producción de especies de oxígeno reactivas a través de
Dectin-1 (Underhill et al. 2005; Rogers et
al. 2005). Tras la activación de Syk, se produce una cascada de
fosforilación que implica entre otros, al factor de transcripción
NF-\kappaB (Dennehy. y Gordon 2007; Dennehy et
al. 2008). Recientemente, se ha demostrado que la señalización
vía Dectin-1 (inducida por
\beta-glucano particulado (zymosan) o con esporas
de C. albicans) puede modular directamente la expresión
génica a través de la activación del factor de transcripción NFAT,
tanto en macrófagos como en DCs, induciendo a su vez los factores de
transcripción Egr2, Egr3 y COX-2 (Goodridge. et
al. 2007). Además, Dectin-1 participa en una
nueva ruta de señalización independiente de TLRs en DCs, mediando
directamente la activación de NF-\kappaB vía la
molécula adaptadora de señalización CARD9 (Gross et al.
2006). La ruta
Dectin-1-Syk-CARD9
acopla la respuesta inmune y la adaptativa, siendo CARD9 necesaria
para el desarrollo de una respuesta de tipo linfocito T cooperador
(T_{H}-17) frente a patógenos como C.
albicans (LeibundGut-Landmann et al.
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\vskip1.000000\baselineskip
Un objeto de la presente invención lo constituye
el anticuerpo anti-Dectin-1 humano
MGD3, caracterizado porque se une y reconoce específicamente el
dominio 71-247 de la proteína humana
Dectin-1 (SEQ ID NO2) ya sea un anticuerpo
monoclonal o policlonal, en adelante el anticuerpo de la
invención.
Un objeto más particular de la invención es el
anticuerpo de la invención caracterizado porque es monoclonal que es
producido por el hibridoma MGD3 (depositado en la colección de
cultivos ECACC -European Collection of Animal Cell Culture-
el 6 de Febrero de 2008 con la referencia 08020601).
Otro objeto de la presente invención es la
secuencia de nucleótidos caracterizada por ser codificante del
dominio 71-247 de la proteína humana
Dectin-1 (SEQ ID NO1), y por ser:
- a)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la SEQ ID NO1
- b)
- un fragmento de la secuencias de a, y
- c)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a) y b).
\vskip1.000000\baselineskip
Otro objeto de la invención lo constituye la
secuencia de aminoácidos aislada de la proteína humana
Dectin-1 caracterizada porque se corresponde con el
dominio 71-247 de ésta (SEQ ID NO2), y por ser:
- a)
- una secuencia de aminoácidos análoga a la SEQ ID NO2
- b)
- un fragmento de la secuencia de a, y
- c)
- una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a) y b).
\vskip1.000000\baselineskip
Un objeto particular de la invención es el uso
de la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO1) para la producción de
anticuerpos anti-Dectin-1 humanos,
ya sean monoclonales o policlonales.
Un objeto particular de la invención es el uso
de la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO2) para la producción de
anticuerpos anti-Dectin-1 humanos,
ya sean monoclonales o policlonales.
Un objeto de la presente invención es el
hibridoma caracterizado porque produce un anticuerpo específico del
dominio 71-247 de la proteína humana
Dectin-1 (SEO ID NO2).
Un objeto particular de la invención es el
hibridoma de la invención caracterizado porque es el hibridoma MGD3
productor del anticuerpo de la invención (depositado en la colección
de cultivos ECACC -European Collection of Animal Cell
Culture- el 6 de Febrero de 2008 con la referencia
08020601).
Otro objeto más particular de la invención es el
uso de hibridoma de la invención para la producción del anticuerpo
monoclonal anti-Dectin-1 humano,
preferentemente el anticuerpo monoclonal de la invención.
Un objeto de la presente invención es una
composición biotecnológica, farmacéutica, diagnostica o terapéutica
caracterizada porque contiene el anticuerpo de la invención.
Uso del anticuerpo de la invención para la
elaboración de una composición biotecnológica, farmacéutica
diagnóstica o terapéutica útil para la realización de:
- -
- ensayos de detección, identificación y/o cuantificación de la proteína Dectin-1 humana,
- -
- tratamiento de enfermedades infecciosas, autoinmunes y/o inflamatorias, y
- -
- diagnóstico de enfermedades infecciosas, autoinmunes y/o inflamatorias.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro objeto de la invención es la composición
biotecnológica, farmacéutica diagnostica o terapéutica caracterizada
porque comprende el anticuerpo de la invención.
Otro objeto particular de la invención es el uso
de la composición de la invención y del anticuerpo de la invención
en un procedimiento ex vivo de detección, identificación y/o
cuantificación de la proteína Dectin-1 humana.
Otro objeto particular de la invención es el uso
de la composición de la invención y del anticuerpo de la invención
en un procedimiento ex vivo para el diagnóstico de una
enfermedad autoinmune, infecciosa y/o inflamatoria.
Otro objeto particular de la invención es el uso
de la composición de la invención y del anticuerpo de la invención
en un procedimiento terapéutico de una enfermedad humana donde la
proteína Dectin-1 humana presenta un papel
etiopatogénico.
Otro objeto más particular de la invención es el
uso de la composición de la invención y del anticuerpo de la
invención donde la enfermedad a la que se le aplica el procedimiento
terapéutico es una enfermedad inflamatoria, infecciosa y/o
autoinmune.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se basa en que los
inventores han observado que un anticuerpo específico, concretamente
un anticuerpo monoclonal y más concretamente el anticuerpo
monoclonal MGD3, generado por los inventores al inmunizar ratones
con una proteína de fusión que comprende la región entre los
aminoácidos 71-247 (dominio
Dectin-1/71-247) de la proteína
Dectin-1 humana (SEQ ID NO2), presenta una serie de
características que le confieren una serie de ventajas técnicas con
respecto a los anticuerpos descritos en el estado de la técnica, por
lo que el anticuerpo MGD3 representa una nueva herramienta
biotecnológica útil en el campo de la investigación biomédica y en
el campo asistencial médico, tanto en el área del diagnóstico como
en el ámbito terapéutico.
Las ventajas técnicas que posee el anticuerpo
MGD3 de la invención son las siguientes: es capaz de inhibir la
unión del ligando natural a su receptor -en ensayos de citometría de
flujo (Figura 6)- de manera análoga a los
\beta-glucanos solubles (laminarina). También es
capaz de inhibir de forma significativa la producción de citoquinas
pro- y anti-inflamatorias como
TNF-\Box e interleuquina (IL)-10,
respectivamente, en células dendríticas derivadas de monocitos en
respuesta a la interacción con esporas de C. albicans
(Figuras 7A y 7B). Puede emplearse para detectar cambios en los
niveles de expresión del receptor Dectin-1 en
leucocitos humanos, lo que podría indicar la capacidad de estas
células para detectar la presencia de patógenos fúngicos como
Candida albicans, Coccidiodes posadasii, Pneumocystis carinii
y/o Aspergillus fumigatus y por tanto, la susceptibilidad
hacia estos. Son útiles como marcadores de la proteína
Dectin-1 humana in vivo en la superficie de
monocitos, macrófagos, células de Langerhans y células dendríticas
derivadas de monocitos de sangre periférica (Figura 3), leucocitos
en reposo y activados en procesos infecciosos, por ejemplo por
agentes fúngicos, así como en patologías autoinmunes y/o
inflamatorias y podrían servir para definir el papel de este
receptor en la patogenia de estas enfermedades así como para definir
la susceptibilidad hacia diferentes patologías inflamatorias.
Finalmente, los anticuerpos MGD3 de la invención pueden ser
utilizados como indicadores del efecto terapéutico de distintos
agentes anti-inflamatorios e inmunosupresores.
Además, el anticuerpo MGD3 de la invención:
- 1.
- reconoce la proteína Dectin-1 in vivo en células mieloides con una elevada calidad en la relación señal-fondo (ver Figura 3).
- 2.
- es el único anticuerpo monoclonal anti-Dectin-1 humano que bloquea la unión de Candida albicans en ensayos in vitro con transfectantes estables de la proteína.
- 3.
- es el único anticuerpo monoclonal anti-Dectin-1 humano que reconoce la proteína Dectin-1 humana (SEC ID NO2) con alta afinidad tanto en ensayos de citometría de flujo como de Western Blot (ver Figuras 1, 2, 3 y 4).
- 4.
- es capaz de capturar la proteína soluble DECTIN-1-FLAG en ensayos de interacciones moleculares mediante SPR en el biosensor Biacore 3000, lo que indica una gran afinidad por el ligando (Figura 7).
- 5.
- es capaz de inhibir de forma significativa la producción de TNF-\Box en DCs derivadas de monocitos que han estado en contacto con esporas de C. albicans (Figura 7A).
- 6.
- es capaz de inhibir de forma significativa la producción de IL-10 en DCs derivadas de monocitos que han estado en contacto con esporas de C. albicans (Figura 7B).
Todas las características descritas y enumeradas
hasta ahora confieren al anticuerpo MGD3 de la invención las
ventajas técnicas que hacen del mismo un anticuerpo único y
ventajoso sobre el resto de anticuerpos
anti-Dectin-1 humanos descritos
previamente.
La invención, también se refiere a un hibridoma
clonado (MGD3) (depositado en la colección de cultivos ECACC
-European Collection of Animal Cell Culture- el 6 de Febrero
de 2008 con la referencia 08020601) que produce un anticuerpo
monoclonal, denominado en adelante MGD3, que reconoce
específicamente el receptor de membrana Dectin-1
humano. Dicho clon se obtuvo por procedimientos estándar de fusión
celular entre un linfocito B del bazo de un ratón BALB/c inmunizado
y células de mieloma (X63.Ag.653 NP3) (Ejemplo 1).
Por lo tanto, un aspecto de la presente
invención es un anticuerpo
anti-Dectin-1 humano, en adelante
anticuerpo de la invención, que se une y reconoce específicamente el
dominio 71-247 de la proteína humana
Dectin-1 (SEQ ID NO2), ya sea un anticuerpo
monoclonal o policlonal.
Un aspecto más particular de la invención lo
constituye el anticuerpo monoclonal de la invención y producido por
el hibridoma MGD3 (depositado en la colección de cultivos ECACC
-European Collection of Animal Cell Culture- el 6 de Febrero
de 2008 con la referencia 08020601), en adelante anticuerpo
monoclonal MGD3 de la invención.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo recombinante o
minianticuerpo que mantienen su capacidad de unión a antígeno. El
término "minianticuerpo" se define como fragmentos derivados de
anticuerpos construidos por tecnología de ADN recombinante, que,
pese a su menor tamaño, conservan la capacidad de unión al antígeno
ya que mantienen al menos un dominio variable de inmunoglobulina
donde residen las zonas de unión a antígenos, e incluye, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al
siguiente grupo: Fab, F(ab')2, scFv, y anticuerpos
recombinantes monodominio (dAbs). En el marco de la presente
invención, se entiende por anticuerpos recombinantes monodominio y/o
dominios tipo inmunoglobulina con capacidad de unión y
reconocimiento independiente, tanto a los dominios variables de
cadena pesada (VH), a los dominios variables de cadena ligera (VL),
a los anticuerpos recombinantes de camélidos (VHH), los anticuerpos
recombinantes de camélidos humanizados, los anticuerpos
recombinantes de otras especies camelizados, los anticuerpos
monodominio IgNAR de peces cartilaginosos; es decir, que se incluyen
tanto dominios que de forma natural son monodominio (caso de VHH e
IgNAR), como anticuerpos que por ingeniería se han alterado para que
por sí solos sean capaces de interaccionar con el antígeno y mejorar
sus propiedades de estabilidad y solubilidad. Se incluye en esta
definición cualquier modificación de los anticuerpos recombinantes
como su multimerización o la fusión a cualquier molécula (p.ej.
toxinas, enzimas, antígenos, otros fragmentos de anticuerpos,
etc.).
El anticuerpo puede ser obtenido de un ser
humano o un animal (p.ej. camellos, llamas, vicuñas, ratones, ratas,
conejos, caballos, tiburones nodriza, etc.) o mediante técnicas de
DNA recombinante o síntesis química de genes, o bien desde o
selección in vitro o in vivo de genotecas de
anticuerpos.
Otro aspecto de la presente invención es la
secuencia de nucleótidos caracterizada por ser codificante del
dominio 71-247 de la proteína humana
Dectin-1 (SEQ ID NO1), así como cualquier secuencia
de nucleótidos análoga a ésta. En el sentido utilizado en esta
descripción, el término "análoga" pretende incluir cualquier
secuencia de nucleótidos que pueda ser aislada o construida en base
a la secuencia de nucleótidos mostrada en la presente memoria, por
ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos
conservativos o no conservativos, incluyendo la inserción de uno o
más nucleótidos, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera
de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más
nucleótidos, en cualquier extremo o en el interior de la secuencia,
y que constituya una secuencia codificante o péptido con actividad
similar a la secuencia de la proteína humana
Dectin-1.
En general, una secuencia de nucleótidos análoga
es sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácidos comentada
anteriormente. En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "sustancialmente homologa" significa que las
secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad
de, al menos, un 40%, preferentemente de, al menos, un 85%, o más
preferentemente de, al menos, un 95%.
Esta secuencia de nucleótidos puede ser
utilizada bien en su totalidad o bien de forma parcial mediante
fragmentos de la misma para la expresión del péptido/s
correspondientes en distintas células para sus posteriores usos
biotecnológicos.
Otro aspecto de la presente invención es la
secuencia de aminoácidos aislada de la proteína humana
Dectin-1 correspondiente al dominio
71-247 de la misma (SEQ ID NO2), así como cualquier
secuencia de aminoácidos análoga a ésta. En el sentido utilizado en
esta descripción, el término "análoga" pretende incluir
cualquier secuencia de aminoácidos que pueda ser aislada o
construida en base a la secuencia de aminoácidos mostrada en la
presente memoria, por ejemplo, mediante la introducción de
sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas,
incluyendo la inserción de uno o más aminoácidos, la adición de uno
o más aminoácidos en cualquiera de los extremos de la molécula o la
deleción de uno o más aminoácidos, en cualquier extremo o en el
interior de la secuencia, y que constituya un péptido con actividad
similar a la secuencia de la proteína humana
Dectin-1.
En general, una secuencia de aminoácidos análoga
es sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácidos comentada
anteriormente. En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "sustancialmente homologa" significa que las
secuencias de aminoácidos en cuestión tienen un grado de identidad
de, al menos, un 40%, preferentemente de, al menos, un 85%, o más
preferentemente de, al menos, un 95%.
Otro aspecto de la invención es el uso de la
secuencia nucleótidos y de aminoácidos -SEC ID NO1 y SEC ID NO2,
respectivamente- para producir anticuerpos
anti-Dectin-1 humanos, ya sean
monoclonales y policlonales.
Otro aspecto de la invención es un hibridoma, en
adelante hibridoma de la invención, que produce un anticuerpo
específico del dominio 71-247 de la proteína humana
Dectin-1 (SEQ ID NO2).
Otro aspecto más particular de la invención lo
constituye el hibridoma de la invención denominado hibridoma MGD3 y
productor del anticuerpo MGD3 (depositado en la colección de
cultivos ECACC -European Collection of Animal Cell Culture-
el 6 de Febrero de 2008 con la referencia 08020601).
Otro aspecto de la invención lo constituye el
uso del anticuerpo de la invención en la elaboración de una
composición biotecnológica o una composición farmacéutica
diagnóstica o terapéutica útil para la realización de ensayos de
identificación de la proteína Dectin-1 humana o para
el tratamiento y/o diagnóstico de enfermedades autoinmunes y/o
inflamatorias.
Otro aspecto de la invención lo constituye una
composición biotecnológica, composición farmacéutica diagnóstica o
terapéutica que comprende el anticuerpo
anti-Dectin-1 de la invención.
Otro aspecto de la invención lo constituye el
uso del anticuerpo o de la composición farmacéutica de la invención
en un procedimiento ex vivo de detección, identificación y/o
cuantificación de la proteína
anti-Dectin-1 humana, ya sea con
fines de investigación o con fines de diagnóstico de una enfermedad
humana.
Otro aspecto más particular de la presente
invención es el uso del anticuerpo
anti-Dectin-1 humano o de la
composición biotecnológica de la invención, en un procedimiento
biotecnológico ex vivo donde se requiera la identificación de
la proteína Dectin-1 humana, como por ejemplo y sin
que ello limite el alcance de la invención, en:
- -
- ensayos de inmunofluorescencia e inmunohistoquímica
- -
- procesos de inmunoprecipitación de la proteína Dectin-1
- -
- ensayos in vivo para reconocer la proteína Dectin-1 humana en la superficie de monocitos, macrófagos, células de Langerhans y células dendríticas derivadas de monocitos de sangre periférica y que permitan identificar o seleccionar poblaciones que expresan Dectin-1 de poblaciones que no la expresan.
- -
- ensayos in vitro de inhibición de la unión de hongos, por ejemplo de Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Coccidiodes posadasii, Pneumocystis carinii y Aspergillus fumigatus, al receptor Dectin-1 expresado en transfectantes estables o transitorios de dicha proteína o en células primarias.
- -
- ensayos in vitro de inhibición de la producción de citoquinas mediada por Dectin-1 (por ejemplo TNF-a, IL-6, IL-10, IL-2, etc).
\newpage
Otro aspecto más particular de la presente
invención es el uso del anticuerpo
anti-Dectin-1 humano o de la
composición farmacéutica diagnóstica de la invención en un
procedimiento ex vivo de identificación de la proteína
Dectin-1 humana, como por ejemplo y sin que limite
el alcance de la invención, en:
- -
- la identificación de células patogénicas activadas en enfermedades autoinmunes y/o inflamatorias, que indique el grado de exacerbación de la enfermedad y permita medir la eficacia de los tratamientos en las fases tempranas de ensayos clínicos con nuevas terapias,
- -
- un procedimiento para determinar la susceptibilidad a la infección por patógenos fúngicos, mediante la identificación de cambios en la expresión del receptor endógeno de la proteína Dectin-1 humana, indicativos de la presencia de \beta-glucano en fluidos biológicos,
- -
- la detección y cuantificación por citometría de la expresión del receptor de la proteína Dectin-1 humana en fagocitos activados en patologías autoinmunes o condiciones de inflamación crónica, como la artritis psoriásica.
Así, otro aspecto particular de la presente
invención es el uso del anticuerpo
anti-Dectin-1 humano o de la
composición farmacéutica terapéutica de la invención en un
procedimiento terapéutico de una enfermedad donde la proteína Dectin
-1 humana presenta un papel etiopatogénico.
El anticuerpo monoclonal
anti-Dectin-1 humano de la
invención, más concretamente el anticuerpo MGD3, podría utilizarse
para la elaboración de composiciones farmacéuticas útiles en el
tratamiento de patologías inflamatorias, ya que bloquea la
producción de citoquinas pro-inflamatorias que se
inducen a través de Dectin-1 (por ejemplo el Factor
de Necrosis Tumoral, TNF-alfa) y que están
involucradas en la patogenia, por ejemplo y sin que limite el
alcance de la invención, de diversas formas de artritis.
Así, otro objeto de la invención es el uso de la
composición y/o del anticuerpo de la invención en el tratamiento de
enfermedades inflamatorias.
Otro objeto de la invención es el uso de la
composición y/o del anticuerpo de la invención en el tratamiento de
enfermedades infecciosas y/o autoinmunes.
Otro objeto particular de la invención es el uso
de la composición y/o del anticuerpo de la invención en un
procedimiento ex vivo para el diagnóstico de una enfermedad
autoinmune, infecciosa y/o inflamatoria.
Figura 1.- El anticuerpo monoclonal (mAb)
MGD3 de la invención reconoce Dectin-1 humano en la
superficie de transfectantes estables. Células de la línea
celular linfoblástica humana K562 transfectadas establemente con
DectinlaFlag (denominadas de ahora en adelante K562Dectin1aFlag) y
células de la línea parental, fueron teñidas con el mAb
anti-Dectin-1 MGD3 y con el control
de isotipo (lgG2a) y analizadas por citometría de flujo. En la
figura solo se muestran las células K562Dectin1aFlag teñidas con el
control de isotipo (en gris) y con el anticuerpo MGD3 (en
negro).
Figura 2.- El mAb MGD3 reconoce
Dectin-1 humano en la superficie de transfectantes
transitorios de Dectin-1. Las células humanas
HEK293T se transfectaron transitoriamente con
Dectin-1a humano y con el vector vacío (pcDNA 3.1)
como control. A las 48 horas se realizó una citometría de flujo,
tiñendo las células con el mAb anti- Dectin-1 MGD3
(línea negra) y con un control de isotipo (lgG2a, histograma
gris).
Figura 3.- El mAb MGD3 de la invención
reconoce específicamente a la proteína Dectin-1
in vivo en la superficie de monocitos (MO), macrófagos
(M\diameter) y células dendríticas derivadas de monocitos de
sangre periférica humana (MDDC). Los MO se obtuvieron mediante
purificación con bolas magnéticas acopladas a CD14 (Miltenyi
Biotech). Para la obtención de M\diameter, se cultivaron los MO
durante 5 - 7días en presencia de 1000 U/ml GM-CSF y
para obtener MDDCs se cultivaron las células con 1000 U/ml
GM-CSF + 10 \mug/ml IL-4. Los
histogramas grises representan la tinción con un mAb control (X63) y
la línea negra representan la tinción con el mAb
anti-Dectin-1 MGD3. En la parte
inferior de la figura se muestra la tinción obtenida por un marcador
específico de cada tipo celular utilizado.
Figura 4.- El mAb MGD3 de la invención es
capaz de reconocer Dectin-1 humano, en ensayos de
Western Blot. Lisados totales de células K562Dectin1aFlag
tratadas o no con tunicamicina (3 \muM, 16 horas) fueron sometidos
a electroforesis (SDS-PAGE) en condiciones no
desnaturalizantes (30 \mug de proteína celular total/carril),
transferido a una membrana y revelado con el mAb MGD3. El MGD3
reconoce una banda de aproximadamente 45 kDa en los carriles de los
lisados de las células K562Dectin1aFlag sin tratar con tunicamicina,
correspondiente a la isoforma a del Dectin-1 humano.
En los carriles dónde la muestra ha sido tratada con tunicamicina,
aparece una banda de aproximadamente 43 kDa que corresponde a esta
misma isoforma tras la pérdida de N-glicosilaciones
debidas al tratamiento.
Figura 5.- El mAb MGD3 es capaz de reconocer
Dectin-1 humano en ensayos de
inmunofluorescencia. A.- Se utilizaron células K562 WT y
K562Dectin1aFlag adheridas a cristales (10 x 10^{4}
céls/cubreobjeto) recubiertos con
poli-L-lisina. Las células se
tiñeron con los mAb anti-Dectin-1
humano MGD3 o con un control de isotipo lgG2a, seguidos de un Ab
secundario de
cabra-anti-inmunoglobulinas de ratón
conjugado a Alexa488 (verde). En la figura se muestran las imágenes
obtenidas mediante microscopía de fluorescencia utilizando el
control de isotipo, y el mAb MGD3. En paralelo se muestra la tinción
de núcleos con el colorante DAPI (azul), la imagen del contraste
diferencial (DIC) de Nomarsky y el resultado de solapar las
imágenes. En verde tan sólo se observa tinción cuando se utiliza el
mAb MGD3 en las células K562Dectin1aFlag. B.- Células HeLa WT y
transfectadas transitoriamente con
Dectin-1a-Flag, (50 x 10^{3}
células/cubreobjeto), se tiñeron con el anticuerpo
anti-Dectin-1 humano MGD3, seguido
de un Ab secundario de
cabra-anti-inmunoglobulinas de ratón
conjugado a Alexa488. Del mismo modo, se utilizó un mAb
anti-Flag como control positivo de la expresión de
la proteína transfectada. En la figura se muestran las imágenes
obtenidas mediante microscopía de fluorescencia con el Ab
anti-Flag y MGD3. Únicamente muestran tinción las
células que expresan Dectin-1.
Figura 6.- El mAb MGD3 de la invención es
capaz de inhibir la unión de Candida albicans a
Dectin-1 humano en ensayos de citometría de flujo de
manera similar a la inhibición causada por el
\beta-glucano soluble laminarina. Se estudió
la capacidad de unión de Candida albicans a células K562 WT y
a los transfectantes K562Dectin1aFlag, para lo que se incubaron las
células con laminarina (500 \mug/ml, SIGMA) o con el mAb MGD3 (2
\mug/ml), previamente a la incubación con las esporas marcadas con
fluoresceína. A.- Análisis por citometría de flujo del bloqueo de la
unión de esporas a células K562Dectin1aFlag. La línea gris oscura
representa el bloqueo por laminarina y la línea negra representa el
bloqueo por el anticuerpo monoclonal MGD3. En gris aparece la unión
total, en ausencia de competidor. Se muestra un experimento
representativo. B.- Análisis de siete experimentos de citometría
realizados en los que se muestra la cuantificación de la unión
(binding) y los bloqueos con el MGD3 y la laminarina.
Figura 7.- El mAb MGD3 de la invención es
capaz de inhibir la producción de citoquinas secretadas por células
dendríticas en respuesta a esporas de Candida albicans .
Se utilizaron células dendríticas humanas derivadas de monocitos de
sangre periférica. Las células fueron incubadas con esporas de C.
albicans (obtenidas a partir de la cepa CAF2). Las esporas
fueron previamente inactivadas con luz ultravioleta (U.V.) para
evitar su germinación. Los tratamientos de inhibición con 5
\mug/ml de los anticuerpos purificados y libres de endotoxinas,
anti-Dectin-1 MGD3 (blanco) y el
control de isotipo lgG2a (gris), o en ausencia de tratamiento
(negro), se pre-incubaron 30 min a 37ºC antes de
añadir las esporas. Como controles de las condiciones experimentales
se utilizaron zymosan (200 \mug/ml, SIGMA) y lipopolisacárido
(LPS, 100 ng/ml, SIGMA). Se recogieron los sobrenadantes y se
cuantificó la producción de TNF-\alpha e
IL-10 mediante ELISA (Immunotools y R&D
respectivamente). (A) Secreción de TNF-a las 6 horas
B) producción de IL-10 a las 18 horas. **P<0.01
células no tratadas versus tratadas con el anticuerpo MGD3. Los
valores de P fueron calculados por el método de Mann Whitney's
two tailed analysis. Los datos representan la media \pm S.E.
de los duplicados de seis diferentes experimentos.
Figura 8.- El mAb MGD3 de la invención es
capaz, en ensayos de interacciones moleculares mediante resonancia
de plasmón de superficie (SPR), de capturar la proteína
Dectin-1 recombinante humana (dominio extracelular,
aminoácidos 71-247) presente en el medio
condicionado por el crecimiento de células de mamífero
transfectadas. Se utilizó un equipo biosensor Biacore 3000 (GE
Healthcare) y un chip modelo CM5, al que se unió un anticuerpo de
captura anti-inmunoglobulinas de ratón, de forma
covalente, utilizando técnicas estandarizadas de entrecruzamiento de
grupos amino. Se muestran las respuestas como señal relativa de
resonancia (RU) en función del tiempo en segundos. Las curvas de la
figura corresponden a la sustracción entre la señal obtenida para el
anticuerpo MGD3 y la señal obtenida para el anticuerpo control
negativo. La línea base corresponde a la señal de inyección del
tampón HBS, seguida por la inyección de los medios condicionados
realizada entre los 300 y 1200 segundos. En esta fase de asociación
se observa la captura progresiva de las dos formas solubles de
Dectin-1 por el anticuerpo. Una vez finalizada la
inyección, el sistema continúa inyectando tampón y puede observarse
la disociación de Dectin-1 y de
HA-Dectin-1-Flag del
complejo formado con el anticuerpo MGD3.
En una primera etapa, se generó una proteína
soluble con la secuencia de aminoácidos 71-247 del
receptor Dectin-1 humano, que comprende el cuello y
el dominio de reconocimiento de carbohidratos (CTLD) de dicho
receptor (SEQ ID NO2). Dicha proteína se obtuvo mediante inserción
de la secuencia génica de ADN codificante para dicho péptido soluble
(SEQ ID NO1) en vectores de expresión de mamífero (pEF), fusionados
a los dominios HA y Flag, transitoriamente transfectados mediante la
técnica de fosfato cálcico en la línea celular humana HEK293T. La
recolección de los sobrenadantes de cultivo de dichas células
eucariotas y su posterior purificación mediante técnicas de
inmunoafinidad y cromatográficas, permitió obtener cantidad
suficiente como para realizar la inmunización de ratones de la cepa
BALB/c, siguiendo protocolos estándar de inmunización.
Tras la fusión, la selección de hibridomas se
realizó por ensayos de inmuno-absorción enzimática
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA).
En este caso, los antígenos inmovilizados sobre la fase sólida
utilizados han sido proteínas solubles de Dectin-1
humanas, purificadas y obtenidas tanto en mamíferos como en
bacterias, así como diversos \beta-glucanos
(ligandos del receptor Dectin-1). En estos ensayos
se utilizaron los antígenos referidos como tapiz y como método de
detección se añadió un anticuerpo
anti-inmunoglobulinas de ratón acoplado a peroxidasa
seguidos del sustrato de la reacción colorimétrica. De esta forma,
se seleccionaron los hibridomas secretores de anticuerpos más
específicos para el antígeno. Todos los hibridomas fueron testados y
confirmados en paralelo por ensayos de citometría de flujo sobre
transfectantes estables de Dectin-1 humano en la
línea linfoblastoide K562 versus la línea parental. Del mismo modo
se testó su capacidad de reconocer células humanas obtenidas a
partir de sangre periférica (monocitos y derivados de ellos, células
dendríticas, macrófagos y células de Langerhans). Como resultado de
los tres tipos de análisis realizados se seleccionaron los mejores
hibridomas entre los que destacó el hibridoma MGD3 (depositado en la
colección de cultivos ECACC -European Collection of Animal Cell
Culture- el 6 de Febrero de 2008 con la referencia 08020601) que
expresa establemente inmunoglobulinas del isotipo lgG2a,
correspondientes al anticuerpo monoclonal (mAb)
anti-Dectin-1 humano MGD3.
Se utilizaron células de la línea celular
linfoblástica humana K562 transfectadas establemente con un vector
con el cDNA de Dectin-1 a-humano
acoplado al epítopo reportero FLAG (K562Dectin1aFlag) y células
parentales, fueron teñidas con el mAb
anti-Dectin-1 MGD3 y con control de
isotipo (lgG2a) y analizadas por citometría de flujo. El patrón de
tinción permitió comprobar que el mAb MGD3 reconoce específicamente
Dectin-1 humano ya que tiñe específicamente las
células transfectadas K562Dectin1aFlag y no las células parentales
(Figura 1).
El resultado obtenido en el ejemplo 2 no
descarta la posibilidad de que el hibridoma MGD3 pudiera estar
secretando anticuerpos que reconozcan el epítopo FLAG. Para
comprobar que el hibridoma MGD3 tan solo producía mAb
anti-Dectin-1 se utilizó otras
células humanas (HEK293T, derivadas de riñon embrionario) que se
transfectaron transitoriamente con el cDNA completo de
Dectin-1a humano sin FLAG o con el vector vacío
(pcDNA 3.1) como control. A las 48 horas se realizó una citometría
de flujo, tiñendo las células con el mAb anti-
Dectin-1 MGD3 y con un control de isotipo. El patrón
de tinción de membrana obtenido, tanto en los transfectantes
estables de Dectin-1 con el epítopo Flag, como en
los transfectantes transitorios que carecen de él, permitió
comprobar que el mAb MGD3 de la invención reconoce específicamente
Dectin-1 humano y no reconoce el epítopo Flag
(Figura 2).
Se aislaron células mononucleares de sangre
periférica (PBMCs) humanas a partir de concentrados de células
sanguíneas exentos de plaquetas (buffy coats) de donantes
sanos mediante gradientes de densidad obtenidos utilizando medios de
separación de linfocitos (Figura 3). Los monocitos se obtuvieron
mediante purificación con bolas magnéticas acopladas a CD14
(Miltenyi Biotech). Para la obtención de MDDCs y M\diameter, se
cultivan los monocitos durante 7 días en presencia de 1000 U/ml
GM-CSF para los M\diameter, y 1000 U/ml
GM-CSF + 10 \mug/ml IL-4 para las
MDDCs. Debido a la gran variabilidad de las muestras procedentes de
diferentes individuos, en la figura 3 se muestran los perfiles de
citometría de un solo donante representativo. Los patrones de
tinción muestran una expresión semejante de Dectin-1
en la membrana de los tres tipos celulares. En la parte inferior se
muestra la expresión de marcadores moleculares característicos de
cada tipo celular.
Se realizó un Western Blot en condiciones no
reductores con Usados totales de la línea celular humana
establemente transfectada K562Dectin1aFlag y el correspondiente
control con las células parentales. Para inhibir las
N-glicosilaciones las células fueron tratadas con
tunicamicina 3 \muM durante 16 horas. Los lisados (30 \mug de
proteína celular total/carril), fueron sometidos a electroforesis
(SDS-PAGE) en condiciones no desnaturalizantes,
transferidos a una membrana de nitrocelulosa. Tras el bloqueo de la
membrana (TBS-Tween 0,1%, 5% leche desnatada en
polvo y 2% BSA) se procedió a la hibridación de la misma durante la
noche a 4ºC con el mAb anti-Dectin-1
humano MGD3 de la invención a 2 \mug/ml. Tras los lavados
correspondientes, la membrana se incubó con un Ab secundario de
cabra-anti-inmunoglobulinas de ratón
acoplado a peroxidasa y se reveló con un sustrato
quimioluminiscente. El mAb MGD3 de la invención reconoció dos
bandas: una de 45 kDa aprox. correspondiente a la isoforma a del
Dectin-1 humano presente en la muestra de células
transfectadas K562Dectin1aFlag sin tratar y otra de 43 kDa
aproximadamente que corresponde a esta misma isoforma tras el
tratamiento con tunicamicina (Figura 4).
Se utilizaron células K562Dectin1aFlag en
suspensión, adheridas a cristales (10 x 10^{3} céls/cubreobjeto)
recubiertos de poli-L-lisina. Las
células se fijaron con paraformaldehído 3,7% y tras los lavados y
bloqueos pertinentes se tiñeron con el anticuerpo
anti-Dectin-1 humano MGD3, seguido
de un Ab de
cabra-anti-inmunoglobulinas de ratón
conjugado a Alexa488. Del mismo modo, se usó un mAb de isotipo lgG2a
como control. La figura 5A muestra las imágenes obtenidas mediante
microscopía de fluorescencia para el control de isotipo y el mAb
MGD3. Tan solo se detecta señal en verde en las células
K562Dectin1aFlag teñidas con el mAb MGD3 lo que indica que el
receptor Dectin-1a -FLAG está siendo reconocido
específicamente.
Estos datos se confirmaron utilizando otra línea
celular humana adherente (HeLa, epiteliales de ovario), transfectada
transitoriamente con Dectin-1a-Flag.
Las células fueron crecidas sobre cristales (50 x 10^{3}
células/cubreobjeto) y fijadas con paraformaldehído 3,7%. Tras los
lavados y bloqueos pertinentes se tiñeron con el anticuerpo
anti-Dectin-1 humano MGD3 o con el
mAb anti-Flag que reconoce el epítopo FLAG como
control positivo, seguidos de un Ab secundario
cabra-anti-inmunoglobulinas de ratón
acoplado a Alexa488. En la Figura 5B aparecen las imágenes obtenidas
con el microscopio de fluorescencia donde se comprueba como el mAb
MGD3 tiñe Dectin-1 con similar intensidad que el Ab
anti-Flag el epítopo FLAG.
Se estudió la capacidad de unión de Candida
albicans (cepa CAF-2) a los transfectantes
K562Dectin1aFlag. Para ello se utilizaron esporas de C.
albicans marcadas con fluoresceína (FITC) incubadas en una
relación célula/espora de 1/10 durante 30 min. Para determinar la
capacidad del mAb MGD3 de bloquear esta unión, se preincubaron las
células con laminarina (500 \mug/ml), o con el mAb MGD3 de la
invención (2 \mug/ml) durante 20 min., antes de la incubación con
las esporas. El análisis de la unión y bloqueo de la misma se
realizó por citometría de flujo (Figura 6A). Los resultados indican
que el anticuerpo MGD3 inhibe totalmente la unión especifica de
C. albicans mediada por Dectin-1 puesto que
la incubación con el anticuerpo disminuye la unión a niveles aún
inferiores a los que presentan las células parentales. En este
ensayo el anticuerpo MGD3 tiene la misma capacidad de inhibir la
unión de esporas a Dectin-1 que el
beta-glucano soluble laminarina (Figura 6B).
Para estimular la producción de citoquinas, se
incubaron las MDDC con esporas de C. albicans inactivadas por
luz U.V. Para determinar la capacidad del mAb MGD3 de bloquear dicha
secreción, se preincubaron las células con los mAb MGD3 de la
invención (5 \mug/ml) o con el control de isotipo (lgG2a, 5
\mug/ml) durante 30 min., antes de la incubación con las esporas.
Se recogió sobrenadante a las 6 y a las 18 horas. La cuantificación
de las citoquinas presentes en el sobrenadante se realizó mediante
ensayos de ELISA. Los resultados indican que el anticuerpo MGD3
inhibe significativamente tanto la producción de
TNF-\Box Fig. 7A como la de IL-10
Fig. 7B inducidas por las esporas de C. albicans en las MDDC.
Esta inhibición es específica puesto que el control de isotipo
(lgG2a) no produce una disminución significativa en la secreción de
ninguna de las dos citoquinas analizadas. En cuánto a los controles
positivos, el anticuerpo MGD3 no bloquea de forma significativa la
secreción de TNF-\Box producida por zymosan
seguramente debido a que este estímulo induce elevados niveles de
secreción de TNF-\Box mediada por la existencia de
otros receptores (ej. TLR2 y receptor de mañosa) que también
reconocen esta partícula (constituida además de por
\beta-glucanos, por chitina, mananos y lípidos).
En el caso del LPS la disminución de la secreción tampoco es
significativa, resultado esperado puesto que el receptor implicado
es el TLR4, no Dectin-1.
Se estudió la capacidad de interacción entre el
anticuerpo MGD3 de la invención y proteínas solubles de
Dectin-1. Para ello, se transfectaron
transitoriamente células HEK293T bien con la porción extracelular
(aminoácidos 71-247, dominio
Dectin-1/71-247) del receptor humano
Dectin-1 o bien con esta misma porción extracelular
fusionada a los epítopos HA y Flag
(HA-Dectin-1a-Flag)
(SEQ ID NO2). Los sobrenadantes recolectados se purificaron mediante
técnicas de inmunoafinidad y cromatográficas.
Se utilizó un equipo biosensor Biacore 3000 (GE
Healthcare) y un chip modelo CM5, al que se unió un anticuerpo de
captura anti-inmunoglobulinas de ratón, de forma
covalente, utilizando técnicas estandarizadas de entrecruzamiento de
grupos amino. Se utilizaron en paralelo dos celdas de flujo, en una
se inyectó sobrenadante que contenía un anticuerpo control
inespecífico y en la otra el anticuerpo MGD3, a una concentración de
15 \Boxg/ml y a una velocidad de 5 \Boxl/min, en tampón HBS (150
mN NaCl, Hepes 10 mM, pH 7.4). En un nuevo ciclo, realizado a
continuación, se inyectó el sobrenadante de células transfectadas
con los plásmidos control "mock" (verde),
Dectin-1 (azul) y
Dectin-1-Flag+HA (roja).
En la Figura 8 se muestran las respuestas como
señal relativa de resonancia (RU) en función del tiempo en segundos.
Las curvas de la figura corresponden a la sustracción entre la señal
obtenida para el anticuerpo MGD3 y la señal obtenida para el
anticuerpo control negativo. La línea base corresponde a la señal de
inyección del tampón HBS, seguida por la inyección de los medios
condicionados realizada entre los 300 y 1200 segundos. En esta fase
de asociación se observa la captura progresiva de las dos formas
solubles de Dectin-1 por el anticuerpo. Una vez
finalizada la inyección, el sistema continúa inyectando tampón y
puede observarse la disociación de Dectin-1 y de
HA-Dectin-1a-Flag
del complejo formado con el anticuerpo MGD3.
Los resultados indican que el anticuerpo MGD3 de
la invención captura de forma específica a las proteínas solubles
Dectin-1 y
HA-Dectin-1a-Flag
presentes en el medio de cultivo condicionado por el crecimiento de
los transfectantes HEK293T. Estos resultados indican que este
anticuerpo puede ser utilizado, en biosensores basados en la técnica
SPR, como componente fundamental de ensayos de rastreo y
caracterización de la interacción entre Dectin-1 y
diferentes ligandos.
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS, FUNDACIÓN PARA LA INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA DEL HOSPITAL
DE LA PRINCESA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ANTICUERPO
ANTI-DECTIN-1 HUMANO, HIBRIDOMA
PRODUCTOR DE DICHO
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipANTICUERPO Y SUS APLICACIONES
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Dectin_1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 528
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dectin_1_71/247
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(528)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia correspondiente a los
nucleótidos 206-720 de la secuencia completa del
mRNA de Dectin-1 humana (ID: AF400595) que codifican
para los aminoácidos 71-247 de la parte extracelular
(región del cuello y dominio de unión a carbohidratos, CTLD)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 176
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Synthetic Construct
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido HA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido FLAG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
Claims (14)
1. Anticuerpo
anti-Dectin-1 humano
caracterizado porque se une y reconoce específicamente el
dominio 71-247 de la proteína humana
Dectin-1 (SEQ ID NO2) ya sea un anticuerpo
monoclonal o policlonal.
2. Anticuerpo según las reivindicación 1
caracterizado porque es monoclonal y es producido por el
hibridoma MGD3 (depositado en la colección de cultivos ECACC
-European Collection of Animal Cell Culture- el 6 de Febrero
de 2008 con la referencia 08020601).
3. Secuencia de nucleótidos caracterizada
por ser codificante del dominio 71-247 de la
proteína humana Dectin-1 (SEQ ID NO1) y por ser
seleccionada del siguiente grupo:
- a)
- una secuencia de nucleótidos con al menos un 40% de identidad con la SEQ ID NO1, y
- b)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a).
\vskip1.000000\baselineskip
4. Secuencia de aminoácidos aislada de la
proteína humana Dectin-1 caracterizada porque
se corresponde con el dominio 71-247 de ésta (SEQ ID
NO2) y por ser seleccionada del siguiente grupo:
- a)
- una secuencia de aminoácidos con al menos un 40% de identidad con la SEQ ID NO2, y
- b)
- una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a).
\vskip1.000000\baselineskip
5. Uso de la secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 3 en la producción de anticuerpos
anti-Dectin-1 humanos, ya sean
monoclonales o policlonales.
6. Uso de la secuencia de aminoácidos según la
reivindicación 4 en la producción de anticuerpos
anti-Dectin-1 humanos, ya sean
monoclonales o policlonales.
7. Hibridoma caracterizado porque produce
un anticuerpo específico del dominio 71-247 de la
proteína humana Dectin-1 (SEQ ID NO2).
8. Hibridoma según la reivindicación 7
caracterizado porque es el hibridoma MGD3 productor del
anticuerpo MGD3 (depositado en la colección de cultivos ECACC
-European Collection of Animal Cell Culture- el 6 de Febrero
de 2008 con la referencia 08020601).
9. Uso de hibridoma según cualquiera de las
reivindicaciones 7 ó 8 para la producción del anticuerpo monoclonal
anti-Dectin-1 humano,
preferentemente el anticuerpo monoclonal MGD3.
10. Uso del anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2 para la elaboración de una composición
biotecnológica, farmacéutica diagnóstica o terapéutica útil para la
realización de:
- -
- ensayos de detección, identificación y/o cuantificación de la proteína Dectin-1 humana,
- -
- tratamiento de enfermedades infecciosas, autoinmunes y/o inflamatorias, y
- -
- diagnóstico de enfermedades infecciosas, autoinmunes y/o inflamatorias.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Composición biotecnológica, farmacéutica
diagnostica o terapéutica caracterizada porque comprende un
anticuerpo según las reivindicaciones 1 y 2.
12. Uso de la composición según la
reivindicación 11 ó del anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2 en un procedimiento ex vivo de
detección, identificación y/o cuantificación de la proteína
Dectin-1 humana.
13. Uso del anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2 para la elaboración de una composición
farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria,
infecciosa y/o autoinmune.
14. Uso de la composición según la
reivindicación 11 y del anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2 en un procedimiento ex vivo para el
diagnóstico de una enfermedad autoinmune, infecciosa y/o
inflamatoria.
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| ES200801766A ES2337224B1 (es) | 2008-06-11 | 2008-06-11 | Anticuerpo anti-dectin-1 humano, hibridoma productor de dicho anticuerpo y sus aplicaciones. |
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| CHEN J. et al. Medicinal Importance of Fungal Beta-(1-3), (1-6)- glucans. Mycological Research III. 2007, páginas 635-652. 11.02.2007. En particular páginas 639-640. * |
| HERNANZ-FALCÓN P. et al. "{}Cloning of human DECTIN-1, a Novel C-Type lectin-like Receptor Gene Expressed on Dendritic Cells"{}. Immunogenetics 2001, Vol. 53, páginas 288-295. Figura 1A. * |
| WILLMENT, J.A. et al. "{}Characterization of the Human Beta-glucan Receptor and Its Alternatively Spliced Isoforms"{}. The Journal of Biological Chemistry. 23.11.2001, Vol. 276, no. 47, páginas 43818- 43823. Todo el documento, especialmente figura 3. * |
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