CN101098889A

CN101098889A - 抗体导致的细胞膜损伤

Info

Publication number: CN101098889A
Application number: CNA2005800382429A
Authority: CN
Inventors: 奈利马·M·拜特; 玛西娅·M·拜伯; 纳尔逊·N·H·滕; 马丁·E·山德士
Original assignee: Palingen Inc
Current assignee: IGM Biosciences Inc
Priority date: 2004-11-05
Filing date: 2005-11-04
Publication date: 2008-01-02
Also published as: WO2006052641A2; ZA200705020B; US20130164283A1; BRPI0517057A; DK1814913T3; AU2005304973A1; US9458241B2; EP1814913B1; CA2586285A1; EP1814913A4; US20060153854A1; IL182892A0; JP2008519030A; KR20080007425A; WO2006052641A3; EP1814913A2; ES2551502T3; US8377435B2; MX2007005320A

Abstract

本发明提供了导致细胞膜损伤、细胞渗透和细胞杀伤的组合物和方法。该组合物包括连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的多价因子。优选的，细胞表面抗原与细胞的细胞骨架相联。优选的多价因子是IgM，并且通过加入交联剂能够提供增强的细胞损伤和杀伤。在体内亚致死浓度，细胞损伤抗体渗透细胞并戏剧化的增强其对于化疗剂的反应，甚至在患者对于化疗剂顽固难治的情况下。

Description

抗体导致的细胞膜损伤

交叉参考有关申请

[001]本申请要求2004年11月5日申请的申请号为60/625,398的美国在先申请的优先权，并引入此处作为参考。本申请与同样是在2004年11月5日申请的申请号为10/982,698，代理人案卷号为1IO.OINP的美国专利申请相关，并于此处加以引用以作参考。

技术领域

[002]本发明涉及用于渗透细胞、治疗癌症和自身免疫性疾病等的组合物和方法。

背景技术

[003]细胞膜损伤是细胞质膜的分裂，该事件一般是可以存活的。细胞膜损伤是哺乳动物机械活动组织中的常见事件，如主动脉内皮层或胃肠道，皮肤上皮或心肌细胞或骨骼肌，并且在细胞被锥虫侵蚀过程中也可出现。在实验室中，典型的采用机械手段撕裂细胞膜损伤来导致细胞损伤，例如使用微针穿透质膜或通过刮擦培养盘来切断细胞的一部分。

[004]对于大的分裂，如＞1μm的膜上的撕裂，需要快速修复反应来修补膜并维持细胞的生存。开始认为这是一个被动过程，现在认为修复是一种能量和钙依赖过程，造成钙依赖的泡囊-泡囊和质膜-泡囊融合，来修补膜撕裂。用于提供为膜的补丁的泡囊现在已知是溶媒体。从而，内部的溶媒体膜加到细胞表面来修补分裂位置。见McNeil，P.L.(2002)J细胞Sd.115(5)：873；Togo，T.，等(1999)J Cell Sd.112：719；McNeil，P.L.，和R.A.Steinhardt(2003)Ann.Rev.CellDev.Biol.19：697。

[005]为了允许溶媒体接近质膜，该修复过程需要肌动蛋白解聚作用。另外，肌球蛋白和/或驱动蛋白介导的收缩过程被认为包括于将溶媒体带入撕裂的邻近位置。另外，根据来自高尔基体的溶媒体的产生增加推测，已知随后修复的发生要快于对损伤的最初反应。这种大分裂的修复依赖于功能性肌动蛋白和高尔基复合物来促进溶媒体接近损伤位置，并重建参予修复过程的溶媒体储存。

[006]因而，尽管细胞膜损伤和随后的修复是现有技术中已知的，但并没有关于导致细胞膜损伤来作为研究工具或治疗途径的教导或指示，例如，渗透细胞来激活因子或杀伤恶性细胞。进一步的，使用结合到细胞表面抗原的因子来导致细胞膜损伤的可能性也没有被提示。最后，没有用导致细胞膜损伤来治疗人或动物患者疾病或病症的提示。

发明概述

[007]如前所述，本申请的主要目的是阐述现有技术中存在的上述需要，并通过提供使用抗体造成的细胞膜损伤的方法和组合物来治疗人或动物患者的疾病或病症。

[008]本发明的另一个目的是利用多价因子渗透和/或杀伤细胞，提供改进的用于导致细胞膜损伤的的组合物和方法。

[009]本发明的另一个目的是提供提高了的组合物和方法，该方法用于将抗体或其他多价因子交联来提供增强的细胞膜损伤和/或细胞杀伤。

[0010]本发明的另外一个目的是提供改进的组合物和方法，用于治疗人或动物患者的由细胞的过度增生或活动过度所介导的疾病和病症。

[0011]因而，在本发明的一个具体实施中，提供了用于导致细胞膜损伤的组合物，其中所述的组合物包括一个连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的多价因子。优选的，细胞表面抗原与细胞的细胞骨架相联。

[0012]在另一个具体实施中，提供了用于渗透细胞组合物，它包括连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的一个多价因子。在另一方面，提供了渗透细胞的方法，包括用连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的多价因子接触细胞。

[0013]在另一个具体实施中，细胞膜损伤是不可存活的，至少部分通过提供足以继续损伤细胞数量的多价因子，因此细胞再也不能够修复损伤。

[0014]因而，导致细胞膜损伤的组合物也能用作杀伤细胞的组合物。另外，该用于杀伤细胞的组合物也能用于杀伤细胞的方法中。优选的，细胞是恶性的，并与身体组织的新生物相关，如神经、淋巴、卵巢、宫颈、子宫内膜、睾丸、前列腺、肾、结肠、胰腺、胃、肠、食管、肺、甲状腺、肾上腺、肝、骨、皮肤、口腔、喉等。在一个附加的具体实施中，细胞活动过度，并且该细胞的活动过度介导的疾病可以用此处所揭示的用于杀伤活动过度细胞的方法治疗。

[0015]在一个特定具体实施中，提供了治疗具有以细胞过度增生为特征的病症的人类患者的方法，包括给予连接到过度增生细胞高度表达的细胞表面受体的多价因子，其中所述的多价因子的给予量能够相对于正常细胞优先杀伤过度增生细胞。优选的，过度增生细胞是癌细胞。在另一个具体实施中，用生长因子、胞质分裂、感染病毒等，刺激过度增生细胞进入过度增生状态。

[0016]在一个优选具体实施方式中，多价因子能有效优先杀伤过度增生细胞的量，是足以饱和过度增生细胞表面受体的最小量。在一个更优选的具体实施方式，多价因子能有效优先杀伤过度增生细胞的量，足以饱和具有高度表达的细胞表面抗原的正常细胞的细胞表面受体，保持正常细胞的生存在患者健康可接受的范围之内。相对于正常细胞，优先杀伤过度增生细胞，通常通过给予足以减低过度增生细胞活性但不足以减低正常细胞活性到相同程度的量的多价因子来实现。例如，用细胞膜损伤抗体，可降低瘤细胞的活性，通过给予大于百分之十的最小量，更优选为大于百分之二十，更优选为大于百分之三十或更多，相对于正常细胞的活性，即使当瘤细胞和正常细胞在其各自的表面都表达相同的细胞表面抗原时。

[0017]因而，在一个具体实施方式中，提供了杀伤癌细胞的方法，包括用细胞毒数量的能造成癌细胞细胞膜损伤的抗体接触癌细胞。细胞膜损伤细胞毒性与补体介导的细胞毒性或细胞介导的细胞毒性截然不同。在另外一个具体实施方式中，细胞膜损伤抗体通过细胞膜损伤机制和补体和/或细胞介导的细胞毒性机制对癌细胞产生细胞毒性。

[0018]优选的，多价因子以能够有效杀伤快速分化细胞，如肿瘤细胞，但不杀伤正常细胞的量给予。在另一个具体实施方式中，多价因子以能够有效杀伤过度增生细胞，但不杀伤表现出正常运动或正常黏附特性的细胞。

[0019]在特定优选的具体实施方式中，方法进一步包括给予与多价因子相组合的细胞毒因子，该多价因子连接到过度增生细胞表面的高度表达表面受体。细胞毒因子可以是化疗剂、放射性同位素、细胞毒性抗体、免疫交联物、配体结合物、免疫抑制剂、细胞生长调节剂和/或抑制剂、毒素或其混合。

[0020]在另一个具体实施方式中，方法进一步包括给予提供细胞膜损伤抗体交联的交联剂。优选的交联剂是抗体如抗-kappa抗体、抗-Iambda抗体、抗-mu抗体等。

[0021]在一个特殊具体实施方式中，癌细胞是肿瘤B细胞，细胞膜损伤抗体是VH4-34抗体。在特定具体实施方式中，细胞膜损伤抗体是VH4-34抗体，交联剂是不阻止VH4-34抗体连接到B细胞的细胞表面抗原的抗-VH4-34抗体。

[0022]在另一个具体实施方式中，提供了导致细胞膜损伤的方法，包括用连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的多价因子接触细胞，其中细胞是淋巴细胞。在特定具体实施方式，多价因子是抗体，淋巴细胞是表达CDDVI抗原表位的B细胞。优选的，抗体以相对于正常B细胞，能有效优先损伤过度增生B细胞的量给予。在另一个具体实施方式，抗体以能有效损伤但不杀死过度增生B细胞的量给予。

[0023]在一个特殊具体实施方式，方法包括(1)检查需要治疗的患者的血样，以确定患者血中过度增生B细胞的数量；(2)确定过度增生B细胞和正常B细胞对抗体所致损伤的敏感性，以及(3)确定对该患者，足以损伤和/或杀死其体内的过度增生B细胞的抗体数量。

[0024]在另一个具体实施方式，方法包括(1)检查需要治疗的患者的血样，以确定患者血中过度增生B细胞的数量；(2)确定过度增生B细胞对抗体所致损伤的敏感性，以及(3)确定对该患者，足以优先损伤其体内的过度增生B细胞的抗体数量。该方法可进一步包括给予患者有效量的细胞毒素剂，来达到所期望的患者体内过度增生B细胞的量。

[0025]在其他具体实施方式，提供了导致细胞膜损伤的方法，包括用连接到细胞表面高度表达的细胞表面抗体的多价因子接触接触细胞，其中该细胞可以是任何表达高度表面细胞表面抗原的细胞。因而，该细胞可以是不同于淋巴的细胞的细胞类型，或可以是不同于B细胞的细胞类型。在另一个具体实施方式，高度表达的细胞表面抗原不是CDBVI抗原表位。

[0026]在另一个具体实施方式，提供了导致细胞膜损伤的组合物，包括连接到高度表达的细胞表面抗原的多价因子，其中导致细胞膜损伤的组合物可进一步包括交联剂，相对于没有该交联剂时多价因子的细胞毒性，它能增强该多价因子的细胞毒性。

[0027]在一个特殊具体实施方式，多价因子是抗体，优选IgM。在另一个特殊具体实施方式，交联剂是连接了IgM的抗体，倘若IgM的交联结合到该细胞的表面。

[0028]在另一个具体实施方式，提供了导致细胞膜损伤的方法，包括用连接到细胞表面的高度表达的细胞表面抗原的多价因子接触细胞。该方法可进一步包括用交联剂接触细胞，相对于没有该交联剂时多价因子的细胞毒性，该交联剂能增强该细胞因子的细胞毒性。在一个优选的具体实施方式，多价因子是抗体，优选IgM抗体，交联剂是抗体，交联剂是连接了IgM的抗体，倘若IgM的交联结合到该细胞的表面。优选的，细胞是B细胞，抗体是与该B细胞表面的CDIM抗原表位特异结合的IgM。优选的，抗体是抗-CDIM抗体，交联剂是连接到该抗-CDIM抗体，倘若该抗-CDIM抗体的交联结合到B细胞表面。交联剂优选抗-kappa或抗-Iambda抗体或抗-VH4-34抗体。

[0029]因此，提供了净化需要该治疗的患者的恶性B细胞骨髓的方法，包括用与B细胞表面的CDIM抗原表位有特异结合抗体接触骨髓细胞。方法可进一步包括用交联了结合到B细胞表面的CDIM抗原表位的交联剂接触B细胞，从而提供针对恶性B细胞的抗CDIM抗体的增强的细胞毒性。在一个优选的具体实施方式，方法进一步包括用细胞毒素剂接触细胞，来进一步净化恶性B细胞骨髓。

[0030]在另一个具体实施方式，提供了用于杀伤过度增生细胞的组合物，包括连接到细胞表面的高度表达的细胞表面抗原的多价因子，其中所述的多价因子包括交联途径提供的结合到细胞表面的交联的多价因子。与没有所述的交联途径的多价因子相比，该交联的多价因子产生了增强的杀伤过度增生细胞的能力。

[0031]在另一个具体实施方式，提供了用于治疗患有以细胞过度增生为特征的病症的哺乳动物的药物组合物，所述的药物组合物包括连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的多价因子。该药物组合物可进一步包括细胞毒素剂。优选的，该组合物进一步包括增强该多价因子的细胞毒性的交联方式。优选的，多价因子通过导致细胞膜损伤来杀伤过度增生细胞，细胞不能修复。

[0032]在特殊具体实施方式，交联方式可以是共价结合到多价因子的单功能交联剂，多价因子连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原上。交联剂可包括交联功能性，如琥珀酰亚胺、马来酸化油或硫醇等在交联剂远端与邻近多价因子相交联，该多价因子连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原。优选的该多价因子是抗体，如自然抗体，包括IgM、IgG、IgA、IgD、IgE；重组抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、合成抗体如四价抗体或包含抗体的融合蛋白；抗体片段如Fab2、scFv等。在优选的具体实施方式中抗体是IgM。

[0033]在另外一个具体实施方式，交联方式可以是连接到抗体的交联剂。在优选的具体实施方式，交联方式是与邻近结合到细胞表面上高度表达细胞表面抗原的抗体相交联的抗-kappa或抗-Iambda因子。

[0034]还是在另一个具体实施方式，交联方式可以是亲水聚合物或网状聚合物，其分子量为大约100-10,000道尔顿，承载大量与细胞表面上高度表达的细胞表面抗原特异结合的多价因子，如抗体或抗体蛋白，例如Fab或scFv。

[0035]连接到高度表达的细胞表面抗原的多价因子优选与高亲和力相结合。典型的，高亲和结合至少为10⁶ M″¹，优选大约10⁶ M″¹-10⁸ M″¹之间。

[0036]在另一个具体实施方式，提供了用于治疗患有以细胞过度增生为特征病症的哺乳动物的药物组合物，包括连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的多价因子，其中所述的多价因子含有与细胞表面上的细胞表面抗原相结合的多个结合位点。优选的，这些结合位点至少为5个，更优选为大约5-100。在特殊具体实施方式，这些结合位点可以是大约5-15，大约15-25，或大约15-50。

[0037]优选的，含有多个与细胞表面抗原结合的结合位点的多价因子提供了与大量结合位点相结合的过度增生细胞的增强的细胞毒性。

[0038]本发明的其他的目的、优点和新颖性特征，部分的在下文阐明、部分的对于本领域技术人员将根据随后的操作而显而易见，或者通过实践本申请而得到。

附图说明

[0039]附图1说明VH4-34编码的抗体结合原始B细胞淋巴瘤和白血病。

[0040]附图2说明VH4-34编码的单克隆抗体结合并杀伤人B细胞系。

[0041]附图3说明mAb 216对滤泡淋巴瘤细胞细的细胞毒性的多样性。

[0042]附图4说明mAb 216和长春新碱杀伤B细胞是协同的。

[0043]附图5A说明用mAb 216处理的细胞B表面的Lamp-1出现的经时反应进程，与细胞活性丧失的经时反应进程相比较。

[0044]附图5B说明受损伤细胞中释放ATP的经时反应进程，与活细胞数目进行比较。

[0045]附图6A说明用在有和没有钙的介质中的两种VH4-34抗体处理的细胞的生存力。

[0046]附图6B说明用细胞毒素剂处理的细胞的生存力。

[0047]附图7说明当抗体进行交联时所增加的mAb的细胞毒性。

[0048]附图8说明导致细胞膜损伤抗体的剂量依赖细胞毒性

[0049]附图9A和B说明用mAb216和长春新碱在人类患者中的功效。

发明详述

I.定义及概述

[0050]在详细描述本发明前，应当理解除非有相反的指明，本发明不限于具体的缓冲液、辅料、化疗剂等，它们可以变换。还应当理解，此处所用的术语是为了描述具体的实施方式，而非意图限制本发明的范围。

[0051]应当注明此处及权利要求书中所用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数，除非上下文有清楚的相反指明。因而，例如，参照“一种化疗剂″包括两种和多种化疗及；参照”已知药学辅料“包括两种和多种药学辅料，等。

[0052]出现数值范围时，需要理解的是，在范围的上限和下限之间，达到下限值单位的十分之一的每一插入值，除非文中清楚地指出另外含义，和任何其它已公开或已该公开范围内的插入值，包括于本发明。这些较小范围的上限和下限独立的包括于该较小范围中，视在所述范围内任何特定排除的限值而定，也包含于本发明中。所述范围包括一个或两个限值时，排除了一个或两个该限值的范围也包括于本发明。

[0053]此处使用的术语“抗CDIM抗体”和“CDIM结合抗体”指具有与B细胞上的CDIM抗原表位特异结合的抗体。此处这些术语可互换使用。

[0054]术语″抗-VH4-34抗体″指抗体特异连接到VH4-34基因编码抗体可变区的抗原表位的抗体，VH4-34抗体，并且照此可包括VH4-34抗体的称为超可变区或″互补决定区″(″CDRs″)的种系序列。然而，抗原表位不是体细胞高度突变形成的独特免疫球蛋白的标记，如非种系CDR。在一个优选的具体实施方式，抗原表位存在于抗体的框架区，优选不包括抗体的CDR。在另一个优选的具体实施方式，抗-VH4-34抗体不干预VH4-34抗体和其抗原的特异结合。

[0055]术语″9G4″指已显示识别VH4-34 Ab的鼠单克隆抗体(Stevenson，等Blood 68：430(1986))。mAb 9G4对VH4-34抗原表位的识别是结构限制并且依赖于接近可变重链框架1区(″FRI″)中氨基酸23-25的独特序列。9G4是一种抗-VH4-34抗体。

[0056]术语″抗体″以最广义加以使用，具体涵盖了完整的自然抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、由最少两个完整抗体组成的多特异抗体(如二特异性抗体)、合成抗体如四价抗体，以及抗体片段，只要它们显示出所期望的生物活性。人抗体包括以非人类物种制成的抗体。术语抗体也包括仅形成于重链的Ig分子，如获自Camelids的，例如，见于Casterman的专利号为6,765,087和6,015,695的美国专利。术语抗体也包括抗体与细胞毒或细胞调节因子的融合或化学配对(即，结合)。

[0057]″抗体片段″包括完整抗体的一部分，优选该完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab¹、F(ab′)₂、和Fv片段；双链抗体；线性抗体(Zapata等(1995)，Protein Eng.8(10)：1057-1062)；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

[0058]此处所用的术语″单克隆抗体″指获自抗体基本同种群抗体，即，组成种群的单个抗体是相同的，除外可能出现在少量中的自然突变。单克隆抗体有高度特异性，直接抗单个抗原的位点。进一步的，与一般的(多克隆)典型的包括不同抗体直接抗不同决定子(抗原表位)抗体制品相比，每个单克隆抗体直接抗抗原上的一个单独决定子。在其特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们由杂交瘤培养合成，未被其它免疫球蛋白污染。修饰剂″单克隆″指抗体获自基本同种群抗体的特性，不能解释为由任何具体方法得到的要求的抗体产物。例如，用于与本发明相一致的单克隆抗体可由杂交瘤方法制得，首次描述见于Kohler等，Nature，256：495(1975)，或由重组DNA方法制得(参见，如专利号为4,816,567的美国专利)。″单克隆抗体″也可从噬菌体抗体基因库分离得到，采用的技术参见Clackson等(1991)，Nature，352：624-628和Marks等(1991)，J.Mol.Biol.，222：581-597。

[0059]此处单克隆抗体具体包括″嵌合体″抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一段与抗体中的相应序列相同或同源，该抗体获自特定物种或属于特定抗体类或亚类，而该链(多条链)的剩余部分与抗体中相应序列相同或同源，该抗体获自另一物种或属于另一抗体类或亚类，还包括这些抗体的片段，只要它们显示出期望的生物活性(专利号为4,816,567的美国专利；Morrison等(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-55)。

[0060]非人类(如，鼠类的)抗体的“人化的”形式是嵌合体免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或其它抗体的抗原结合序列)，含有获自非人类免疫球蛋白的最少序列。大部分的，人化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的补体决定区(CDR)的残基被非人类物种(供体抗体)，如具有期望的特异性亲和力和容量的小鼠、大鼠或兔，的CDR的残基取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人类残基取代。进一步的，人化抗体可包括在受体抗体、输入的CDR和框架序列都没有发现的残基。进行这些修饰，来进一步精练和最大化抗体性能。一般而言，人化抗体将基本包括所有的至少一个，通常为两个可变域，其中，所有的和基本所有的CDR与非人类免疫球蛋白中的CDR相应，并且所有的和基本所有的FRs是人免疫球蛋白序列的FRs。人化抗体最好还包含至少一段免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白。详细资料参见Jones等，(1986)Nature 321：522-525；Reichmann等，(1988)Nature 332：323-329；和Presta，(1992)Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596。人化抗体包括PRIMATIZEDTM抗体，该抗体的抗原结合区获自一种用相关抗原免疫的猕猴产生的抗体。

[0061]″单链Fv″或″scFv″抗体片段包括抗体的VH和VL区，其中这些区存在于一个单独的多肽链。优选的，Fv多肽进一步包括VH和VL区之间的多肽连接，使得scFv能够形成所期望的用于抗原结合的结构。关于scFv的综述见Pluckthun in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg and Moore eds.，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。

[0062]术语″双链抗体″指有两个抗原结合位点的小抗体，其中片段在相同的多肽链(VH-VL)组成了连接轻链可变区(VL)的重链可变区。通过使用很短的联结子，不允许同一条链的两个区域配对，迫使该区域与另一条链的补体区配对，并产生两个抗原结合位点。双链抗体的详细描述，参见，如-EP 404,097；WO 93/11161；以及Hollinger等(1993)Proa Natl.Acad.Sd.USA 90，6444-6448。

[0063]″分离″抗体是从它天然环境成分中识别和分离和/或恢复的抗体。它天然环境成分的污染成分是能干预抗体的诊断和治疗用途的物质，可以包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白溶剂。在优选实施方案中，抗体被提纯为(1)经罗氏蛋白质定量法确定的大于95％重量的抗体，最优选为大于99％重量，(2)通过使用旋杯(spinning cup)顺序分析仪，达到足以获得至少15个氨基末端残基或内部氨基酸序列，或(3)用考马斯蓝或优选银染色在还原或非还原条件下，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳达到基因同源。分离抗体包括原位具有重组细胞的抗体，因为至少一个该抗体的固有环境的成分不存在。然而，通常分离抗体的制备至少经过一个提纯步骤。

[0064]此处使用的“阻止生长”或“生长抑制剂”的药物指抑制细胞生长或增殖的化合物或组合物。特别是表达B细胞抗原的赘生细胞型，如所需的CD20抗原。生长抑制剂能显著降低S相的赘生细胞百分率。

[0065]术语“癌”和“癌性”是指或描述哺乳动物以无调节的细胞生长为特征的生理状况。

[0066]″CD20”抗原是发现于外周血或淋巴器官90％以上B细胞表面的35kDa、非糖基化磷蛋白。CD20在前B细胞发育的早期表达，并保留至血浆细胞分化。CD20参见普通B细胞和恶性B细胞。文献中CD20的其它名字包括″B淋巴细胞限制性抗原″和″Bp35″。如，CD20抗原参见Clark等的PNAS(USA)82：1766(1985)。

[0067]术语″细胞损伤″指残存的细胞膜破裂事件，标记为摄取到胞质溶胶的正常膜非渗透示踪剂。细胞损伤破裂典型的在大约1和1000μm2内，这远大于伴随补体介导的细胞毒性或穿孔蛋白或毒素形成的大孔或短杆菌肽或金黄色葡萄球菌α毒素的膜破裂。通过探察细胞修复机制，证明细胞损伤是损伤的结果，即细胞表面Lamp-I的表达是溶酶体融合修复损伤的结果。

[0068]术语″细胞损伤抗体″或″细胞膜损伤抗体″指，结合到高度表达的细胞表面抗原上的抗体，造成可存活的质膜分裂事件，以正常膜不渗透示踪的吸收进入细胞溶质为标记。细胞损伤通过显示出的分子修复机制作为损伤的结果而得到，即细胞表面表达Lamp-1作为溶媒体融合修复损伤的结果。

[0069]术语″化疗剂″指在癌症或其他以细胞过度增生为特征的病症中使用的化学化合物。

[0070]此处所用的术语″细胞毒素剂″和″细胞毒素″指抑制或阻止细胞生长、或妨碍细胞功能，并且/或者导致细胞死亡的物质。该术语包括一种或多种放射性同位素、化学治疗剂、免疫抑制剂、细胞生长调节剂和/或抑制剂，它可以是低分子治疗剂、细胞毒性抗体和毒素，如细菌、真菌、植物或动物源性的酶活性毒素或其片段。该术语也包括免疫交联物，包含用毒素或放射性同位素标示的与靶细胞特异结合的抗体，和其它配位子结合物，如放射示踪的配位子和毒素标示的配位子。另外，可以联合使用一种或多种细胞毒素剂。

[0071]″病症″是任何能受益于此处所描述的联合治疗的情况。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物易于罹患所讨论的病症的病理情况。此处治疗的病症包括但不限于癌、血液恶性肿瘤、白血病和淋巴恶性肿瘤和自身免疫性疾病，如炎性和免疫病症。

[0072]术语″高度表达的细胞表面抗原″指细胞表面上的易于接近的表面抗原(即，不需要细胞穿透来显示结合)，每个细胞至少存在10⁴个拷贝，或者以至少25拷贝/μm²的密度存在于细胞的一部分。细胞表面抗原细胞表面表达的分子，如受体、免疫球蛋白、胞质分裂、糖蛋白等。

[0073]术语″过度增殖″和″过度增殖的″指细胞类型的异常增殖，它可以是癌性或良性。过度增殖包括介导自身免疫性疾病的B细胞分泌型自身抗体的多克隆表达。

[0074]术语″免疫交联物″指细胞毒素剂的抗体结合物，它可以共价或非共价连接。

[0075]术语″静脉输注″指经一段时间向患病的动物或人体内注射药物，通常为大于15分钟，更通常为大约30-90分钟之间。

[0076]术语″静脉快速注射″或″静脉推注″指静脉给予动物或人药物，机体以大约15分钟或较短的，通常为5分钟或较短的时间接受药物。

[0077]为治疗目的的术语″哺乳动物″指任何哺乳动物种类，包括人、家养和野生动物，动物园、运动场或宠物动物，只要出生后CDIM抗原表达主要限定于B细胞系的细胞。

[0078]人化抗CD20抗体指，如“RITUXAN牌”的抗CD20抗体，是一种遗传工程的嵌合体鼠/人单克隆抗体，指向抗CD20抗原。在利号为、1998年4月7日颁发的美国专利中，美罗华称为″C2B8″。RITUXANW牌C2B8抗体用于治疗复发或难治性低级或滤泡的、阳性、CD20Y阳性、B细胞非霍奇金淋巴瘤患者。

[0079]术语特异性结合指具有至少10⁶M^-1高亲和力的性质，通常介于大约10⁶M^-1-10⁸M^-1之间。

[0080]术语″皮下给药″指在患病动物或人的皮下给药，最好在皮肤和皮下组织之间的囊内，由药物容器中经一段时间相对缓慢、持续传递。囊可通过揪起皮肤或将皮肤从皮下组织上拉起来形成。

[0081]术语“皮下快速注射″指在动物或人的皮下给予药物，给予快速注射药物优选短于约15分钟，更优选短于约5分钟，最优选短于60秒。最好在皮肤和皮下组织间隙给药。

[0082]术语″皮下输注”指在患病动物或人的皮下注射药物，最好在皮肤和皮下组织之间，由药物容器中经一段时间相对缓慢、持续传递，时间包括但不限于，30或少于30分钟、90或少于90分钟。任选的，输注可以通过植入患病动物或人皮肤的药物传递泵皮下植入，其中该泵以预定时间传递预定药量，如30分钟、90分钟或跨越治疗方案长度的时间段。

[0083]术语″治疗有效量″指具有阻止生长或导致所述细胞死亡作用的活性剂用量。在这一实施方案中，治疗有效量具有透化细胞、抑制增殖信号、抑制细胞代谢、加速细胞凋亡或诱导细胞死亡的特性。在详细的方案中，治疗有效量是指能显示出有效性的目标血清浓度，如，减缓疾病进程。根据治疗的情况，可用常规方法测定效力。例如，淋巴癌，效力可通过评价时间-疾病发展(time to diseaseprogression)(TTP)或检测应答率(RR)来测定。

[0084]本发明文中所用的术语″处理″和“治疗”等，其含义包括治疗和预防、或抑制疾病或病症的手段，能导致期望或有益的临床效果，包括但不限于，缓解一种或多种症状，退化、减慢或停止疾病或病症进程。因此，例如，术语处理包括先于或在疾病或病症的症状初起的随后，给予药物，从而阻止或去除疾病或病症的所有表现。如另一个例子，术语包括在出现临床表现后给予药物，控制疾病症状。进一步的，在初起后和临床症状发展后，给予药物，给药影响疾病或病症的临床参数，如，组织损伤程度或转移的数量或程度，不论治疗是否导致了疾病的改善，组成了本发明文中的“处理”。

II.细胞膜损伤抗体

[0085]VH4-34抗体(可变重链区)是53种已鉴定的人功能抗体种系抗体之一，由种系基因编码(VH4.21)。Cook，G.P.，等，(1994)Nat.Genet.7，162-168。VH4-34抗体的基因，存在于所有单倍型，在分离自无血缘关系的个体的种系DNA中，未报告有序列变异。Weng，N.P.，等，(1992)Eur.J.Immunol.22，1075-1082；van der Maarel，S.，等，(1993)J.Immunol.150，2858-2868。VH4-34基因编码的抗体已显示出具有独特的性质。所有针对红细胞(RBCs)的″I″或″i″原的mAbs是由VH4-34基因编码，通常是IgM类，由于他们在4℃凝集RBCs，因此经典的将其描述为冷凝集素(CAs)。Pascual，V.，等，(1991)J.Immunol.146，4385-4391；Pascual，V.，(1992)JImmunol.149，2337-2344；Silberstein，L.E.，等，(1991)Blood 78，2372-2386。CAs识别的配体是线性或分支的配糖体，存在于蛋白质和/或RBCs的脂质体上。新生和脊髓血RBC具有线性i抗原。分支的I链在出生后产生。Pruzanski，W.等，(1984)CUn.Immunol，itev.3，131-168；Roelcke，D.(1 989)Transfusion Med.Rev.2，140-166。在人B细胞上识别的″i″抗原是线性乳胺(lactosamine)决定子，对酶内-β-半乳糖苷酶敏感。对独立获得的VH4-34抗-B细胞/抗-i mAbs序列分析显示它们是种系构型。Bhat N.M.，等，(1997)Clin.Exp.Immunol.108，151-159。

[0086]活体内，VH4-34基因编码抗体的表达有严格调节。尽管4-8％的人B细胞表达VH4-34编码抗体，VH4-34编码抗体的正常成人血清水平可以忽略。Stevenson F.K.，等，(1989)Br.J.Haematol.12，9-15；Kraj P，等，(1995)J.Immunol.154，6406-6420。VH4-34得到的抗体循环增加仅见于选择性病理状态，包括病毒感染(Epstein Barr(单核细胞增多症)，人免疫缺陷病毒和肝炎C病毒)，支原体肺炎核特定的自身免疫疾病。也见于Bhat，N.M.，等(2005)HumanAntibodies 13，63-68。

[0087]本发明的发明者已深入研究了VH4-34编码的抗体以及它们在自身免疫疾病中的作用。先前的研究证明特定抗B细胞VH4-34抗体对B细胞有细胞毒性，并导致B细胞增殖减少Bhat，N.等(1997)Clin.Exp.Immunol.108：151；Bhat，N.，等，(2001)Crit.Rev.Oncol.Hematol.39，59。已显示细胞毒性独立于补体，高度依赖于温度，当在4℃处理时，造成严重的细胞死亡和质膜缺损形成，如细胞表面的大泡和穿孔。该质膜缺损显著大于其他已知的成孔蛋白所形成的孔，如C9补体成分(-100A)和穿孔素(-160A)。提示细胞毒性可能由新的机制介导。

[0088]本发明的发明者作出了惊人和意想不到的发现，这些VH4-34基因得到的抗体能造成B细胞中的细胞膜损伤，这与先前所报告的抗CDDVI抗体杀伤的细胞中所见的大的质膜缺损(Bhat，N.等(1997)Clin.Exp.Immunol.108：151；Bhat，N.，等，(2001)Crit.Rev.Oncol.Hematol.39，59)截然不同。尽管抗体在特定情况下造成细胞的穿孔和膜缺损，当用亚致死浓度处理时，一些B细胞仅是受伤，并能够在一些情况下修复损伤。尽管膜损伤是有核哺乳类细胞的常见威胁，但抗体能直接造成膜损伤的事实是新颖的。

[0089]进一步，本发明的发明者已证明抗体导致的细胞膜损伤，以类似任何其他膜损伤修复的方式进行修复。用这些补体依赖细胞毒性抗体处理的细胞，试图用溶媒体融合质膜修补膜损伤，来修复抗体导致的细胞膜损伤，导致细胞表面出现溶媒体膜蛋白。也证明当当细胞不能修复损伤时，最终导致死亡。

[0090]另外，本发明的发明者发现受伤细胞是可渗透的，至少是一过性的，并变得对加入细胞毒素剂更加敏感，倘若新的治疗选项已增强了对人和动物疾病核病症的治疗功效的话。细胞膜损伤造成B细胞渗透，允许细胞毒素剂如化疗剂进入，因而增强化疗药物的功效，即使在对该药物耐药或不渗透的细胞中，或在将它们主动转运出细胞的细胞中。

[0091]由于CDIM结合抗体所提供的细胞死亡核损伤的机制不同于通过常规细胞毒抗体所使用的细胞毒机制(补体或细胞介导的杀伤)，联合CDDVI结合抗体与常规免疫治疗，可提供通过细胞毒性抗体结合附加B细胞抗原的增强的杀伤效力，特别是在免疫缺陷如补体缺失或缺乏的情况下。

[0092]进一步的，细胞损伤抗体的作用可以通过加入交联剂而加强，相对于没有交联剂的抗体的细胞毒性，加入交联剂能增加抗体的细胞毒性。这一观察与过度互联所导致的凋亡不同，例如，报告于Marches，R.，等(1995)Ther.Immunol.2，125，论述了IgM与结果信号的交联可能是诱导和维持过度互联后休眠和凋亡的主要因素。

[0093]在一个优选的具体实施方式，根据发明的一个方面的抗体是结合了人B细胞上的CDBVI抗原表位的VH4-34编码单克隆抗体，如，见于Grillot-Courvalin，C，等(1992)Eur.J.Immunol.22，1781-1788；Bhat，N.M.，等(1993)J.Immunol.151，5011-5021；Silberstein，L.E.，等(1996)Blood Cells，Molecules，and dieseases，22，126-138，说明见附图1和2。这些抗体对于获自复发滤泡淋巴瘤患者的B细胞有细胞毒性，说明见附图3。另外，该抗体对B细胞系有细胞毒性，如附图4所示。在优选的具体实施方式，这些mAbs由人淋巴细胞和异骨髓(heteromyeloma)细胞系融合形成，它产生分泌人抗体的杂交瘤。例如，mAb 216是VH4-34基因编码的IgM，是此处所描述的CDEvl结合VH4-34抗体的优选实施方式。MAb216进一步记载于专利号为5,593,676和5,417,972的美国专利，和Bhat等的EP 712 307 B1。

[0094]另外的结合CDIM抗原表位、由VH4-34获得的抗体包括RT-2B、FS 12、A6(H4C5)、Cal-4G、S20A2、FS 3、Gee、HT、Z2D2、Y2K。这些抗体中的一些以富有碱性氨基酸残基的CDR3序列，以及当CDRS为+2电荷时的特别将的结合为特征。相应的，任何具有阳性电荷的CDR，特殊的CDR3，并显示出与CDHM抗原表位的结合的抗体，包括于本发明和权利要求中所要求的范围内。然而，本领域的技术人员应当理解，结合CDIM抗原表位并显示出对B细胞的细胞毒性的抗体，包括于此处所述的CDIM结合抗体的范围之内。

III.导致细胞膜损伤的方法和组合物

[0095]如上所述，在本发明的一个具体实施方式，提供了导致细胞膜损伤的组合物，其中所述的组合物包括连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的多价因子。优选的，该细胞表面抗原与细胞的细胞骨架相联。例如，在用洗涤剂提取去除可溶成份后，细胞表面抗原与细胞保持连接。细胞膜损伤是可存活的膜损伤，通过溶媒体融合修复，根据细胞表面出现和表达溶媒体蛋白可以进行检测，并造成至少为一过性的细胞渗透。

[0096]在另一个具体实施方式，提供了用于渗透细胞的组合物，包括连接到细胞表面的高度表达的细胞表面抗原的多价因子。在另一个方面，提供了用于渗透细胞的方法，包括用连接到细胞表面的高度表达的细胞表面抗原的多价因子接触细胞。

[0097]在其它具体实施方式，提供了用于导致细胞膜损伤的方法，包用连接到细胞表面的高度表达的细胞表面抗原的多价因子括接触细胞，其中该细胞可以是任何表达高度表达的细胞表面抗原的细胞。因而，该细胞可以是与淋巴细胞不同类型的细胞，或者可以是B细胞以外的其他类型的细胞。在另一个具体实施方式，高度表达的细胞表面抗原不是CDIM抗原表位。

[0098]此处所述的方法和组合物也包括细胞膜损伤多价因子，特别是细胞膜损伤抗体，在制备用于治疗患有以细胞过度增生为特征的疾病或病症的哺乳动物的药剂中的应用。

IV.杀伤和/或抑制细胞生长的方法和组合物

[0099]在另一个具体实施方式，细胞膜损伤是不可存活的，至少是部分的通过提供足以持续损伤细胞量的多价因子，以至于该细胞失于或不能再修复损伤。致死的细胞损伤，可以通过提供足以超过细胞表面上高度表达的细胞表面抗原数的量多价因子实现，以至于膜修复无效或者不能维持。致死性细胞损伤也可通过提供锁定或干预修复机制的因子来实现，例如抗肌动蛋白因子或影响细胞表面受体与细胞的支撑骨架连接的因子。致死性细胞损伤也可通过提供影响或干预细胞黏附和/或细胞运动的因子来实现。

[00100]相应的，用于导致细胞膜损伤的组合物也用作杀伤细胞的组合物。另外，该用于杀伤细胞的组合物也用于杀伤细胞的方法。优选的，细胞是恶性的，并与身体组织的新生物相联，如，例如，神经、淋巴、卵巢、宫颈、子宫内膜、睾丸、前列腺、肾、结肠、胰腺、胃、肠、食管、肺、甲状腺、肾上腺、肝、骨、皮肤、口腔、喉等。在另一个具体实施方式，细胞是活动过度的，并且细胞的该活动过度介导的疾病或病症可以用此处所述的用于杀伤过度活动细胞的组合物和方法治疗。

V.给予附加的细胞毒素剂

[00101]本发明的发明者作出了惊人的发现，通过加入细胞毒素剂，包括化疗剂、放射性同位素、细胞毒抗体、免疫交联物、配体结合物、免疫抑制剂、细胞生长调节剂和/或抑制剂、毒素或其混合，可以显著甚至协同的增强这些细胞膜损伤抗体的毒性。

[00102]因此，在特定的优选具体实施方式，方法进一步包括与细胞毒素剂联合给予连接到过度增生细胞表面的高度表达的细胞表面受体的多价因子。细胞毒素剂可以是化疗剂、放射性同位素、细胞毒抗体、免疫交联物、配体结合物、免疫抑制剂、细胞生长调节剂和/或抑制剂、毒素或其混合。

[00103]另外，可利用细胞膜损伤来渗透细胞，以允许正常不能渗透的因子接近细胞溶质，如带电荷药物、蛋白质和缩氨酸、核酸、基因治疗剂和基因表达调节物。在这种方式中，细胞膜损伤可用于调节细胞活性、基因表达和对增生信号的反应，例如，在一个细胞中，并提供了不急性杀伤细胞，治疗患有以过度增生细胞和活动过度细胞为特征的疾病和病症患者的方法。

VI.优先杀伤肿瘤细胞

[00104]在特殊具体实施方式，提供了患有以细胞过度增生为特征的病症的人类患者的方法，包括给予连接到过度增生细胞表面高度表达的细胞表面受体的多价因子，其中所述的多价因子给予的量相对于正常细胞能有效优先杀伤过度增生细胞。优选的，该过度增生细胞是癌细胞，在另一个具体实施方式，过度增生细胞被生长因子、胞质分裂、病毒感染等刺激进入过度增生状态。

[00105]在一个优选的具体实施方式，多价因子能有效优先杀伤过度增生细胞的量，至少足以饱和过度增生细胞的细胞表面受体。在一个更优选的具体实施方式，多价因子能有效优先杀伤过度增生细胞的量，足以饱和具有高度表达的细胞表面抗原的正常细胞的细胞表面受体，但保持正常细胞的活性在患者健康能够接受的范围之内。相对于正常细胞，优先杀伤过度增生细胞，通常通过给予足以减低过度增生细胞活性但不足以减低正常细胞活性到相同程度的量的多价因子来实现。例如，用细胞膜损伤抗体，可降低瘤细胞的活性，通过给予大于百分之十的最小量，更优选为大于百分之二十，更优选为大于百分之三十或更多，相对于正常细胞的活性，即使当瘤细胞和正常细胞在其各自的表面都表达相同的细胞表面抗原时。

[00106]因而，在一个具体实施方式中，提供了杀伤癌细胞的方法，包括用细胞毒数量的能造成癌细胞细胞膜损伤的抗体接触癌细胞。细胞膜损伤细胞毒性与补体介导的细胞毒性或细胞介导的细胞毒性截然不同。在另外一个具体实施方式中，细胞膜损伤抗体通过细胞膜损伤机制和补体和/或细胞介导的细胞毒性机制对癌细胞产生细胞毒性。

[00107]优选的，多价因子以能够有效杀伤过度增生细胞，如肿瘤细胞，但不杀伤正常细胞的量给予。在另一个具体实施方式中，多价因子以能够有效杀伤过度增生细胞，但不杀伤表现出正常运动或正常黏附特性的细胞。

[00108]如实施例10中所讨论的，以及附图8中所显示的，细胞活性对于多价因子浓度的依赖在细胞类型之间有显著变化。例如，在实施例10，抗体浓度大约为5μg/ml抗体，脾B细胞显示的生存力大约为65％，而在相同浓度的抗体下，Nalm-6细胞显示的生存力仅为大约42％。这一抗体量足以提供至少超过Nalm-6细胞的CDIM抗原表面总数的三成，接近脾B细胞过剩量的5成。在较高的抗体浓度，约为10 μg/ml，脾B细胞显示出的生存力为大约48％，而Nalm-6细胞显示的生存力仅为大约30％。因而，B细胞系对用CDIM结合抗体显示出比正常B淋巴细胞更强的敏感性，提示肿瘤B细胞比正常B细胞对于用mAb 216的杀伤更为敏感。

[00109]不希望受到理论束缚，提出假说：快速分化细胞内膜交通的停止，妨碍或减慢了维持受伤细胞活性所需要的修复机制。作为选择，在肿瘤B细胞和正常B细胞之间可能存在另外的差异，造成了敏感性增加，特别是在CDIM表位抗原与B细胞支撑细胞骨架的连接中，或者是差异表达和黏附分子的活性，和/或细胞的运动。

[00110]在另一个具体实施方式，提供了导致细胞膜损伤的方法，包括用连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的多价因子接触细胞，其中该细胞是淋巴细胞。在一个特定具体实施方式，多价因子是抗体，淋巴细胞是表达CDIM抗原表位的B细胞。优选的，以相对于正常B细胞，能有效优先杀伤过度赠送B细胞的量给予抗体，在一个特殊具体实施方式，方法包括(1)检查需要治疗的患者的血样，以确定患者血中过度增生B细胞的数量；(2)确定过度增生B细胞和正常B细胞对抗体所致损伤的敏感性，以及(3)确定对该患者，足以损伤和/或杀死其体内的过度增生B细胞的抗体数量。方法可进一步包括给患者滴定附加量的抗体来达到所期望的损伤和/或杀死细胞的数量。方法可进一步包括接触细胞毒素剂接触细胞。

[00111]在另一个具体实施方式，方法包括(1)检查需要治疗的患者的血样，以确定患者血中过度增生B细胞的数量；(2)确定过度增生B细胞对抗体所致损伤的敏感性，以及(3)确定对该患者，足以损伤其体内的过度增生B细胞的抗体数量。方法可进一步包括给患者滴定附加量的抗体来达到所期望的损伤和/或杀死细胞的数量。方法可进一步包括接触细胞毒素剂接触细胞。

VII.增强细胞膜损伤的方法和组合物

[00112]在另一个具体实施方式，提供了用于导致细胞膜损伤的组合物，包括连接到高度表达的细胞表面抗原的多价因子，其中导致细胞膜损伤的组合物可进一步包括交联剂，相对于没有交联剂时多价因子的细胞毒性，交联剂增强了多价因子的细胞毒性。

[00113]在一个特殊具体实施方式，多价因子是抗体，优选IgM。在另一个特殊具体实施方式，交联剂是结合了IgM的抗体，倘若IgM的交联结合到该细胞的表面，并进一步提供了附加的膜损伤和细胞毒性。在一个优选的具体实施方式，细胞膜损伤被交联剂增强。在特定优选的具体实施方式，增强至少为大约25％，更优选为大约50％或更多。

[00114]在另一个具体实施方式，提供了导致细胞膜损伤的方法，包括用连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的多价因子接触细胞，进一步包括用交联剂接触细胞，相对于没有交联剂时多价因子的细胞毒性，交联剂增大了多价因子的细胞毒性。在一个优选的具体实施方式，多价因子是IgM，交联剂是结合了IgM的抗体，倘若IgM的交联结合到该细胞的表面。优选的，细胞是B细胞，抗体是与B细胞表面的CDIM抗原表位有特异结合的IgM。在一个具体实施方式，抗体是VH4-34抗体，交联剂抗-kappa抗体、抗-Iambda抗体或抗-VH4-34抗体。

[00115]因而，提供了净化患者恶性B细胞骨髓的方法，包括用具有与B细胞表达的CDBVI抗原表位有特异结合的抗体接触骨髓细胞。方法可进一步包括用交联剂接触B细胞，交联剂强抗体交联结合到B细胞表面的CDEVI抗原表位，从而提供了抗-CDEVI抗体对于恶性B细胞的增强的细胞毒性，在一个更优选的具体实施方式，方法进一步包括用细胞毒素剂接触细胞，来进一步净化恶性B细胞的骨髓。

[00116]在另一个具体实施方式，提供了用于杀伤过度增生细胞的组合物，包括连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的多价因子，其中所述的多价因子包括交联方式，该方式提供了结合到细胞表面的交联的多价因子。交联的多价因子提供了增强的对过度增生细胞的杀伤，与没有所述的交联方式时的多价因子相比。

[00117]在另一个具体实施方式，提供了用于治疗患有以细胞过度增生为特征病症的哺乳动物的药物组合物，所述的药物组合物包括连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的多价因子。优选的，组合物进一步包括交联方式，增强多价因子的细胞毒性。优选的，多价因子通过导致细胞膜损伤来杀伤过度增生细胞，细胞不能修复。

[00118]在特殊具体实施方式，交联方式可以是共价结合到多价因子的功能交联剂，能够与邻近的结合到细胞上的多价因子交联，多价因子连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原上。例如，单、双、三或四功能交联剂可与多价因子共价结合。交联剂可包括交联功能性，如马来酸化油、琥珀酰亚胺、碳化二亚胺或硫醇等在交联剂的末端与邻近多价因子交联，该多价因子结合到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原上。例如，专利号为2004/0121951的美国专利申请，引入此处作为参考，描述了可用于本发明所描述的组合物的交联剂的许多例子。本领域的技术人员应当理解对于该组合物中所可以采用的交联方式没有特别的限制。只要该交联剂足够长，能够接触邻近的多价因子，并有连接邻近多价因子的反应力，任何交联方式都可使用。

[00119]优选的该多价因子是抗体，如自然抗体，包括IgM、IgG、IgA、IgD、IgE；重组抗体或嵌合抗体；单克隆抗体；多克隆抗体；合成抗体如四价抗体，例如，见于WO 02/096948，引入此处作为参考，包含抗体的融合蛋白；抗体片段如Fab₂、scFv等。在优选的具体实施方式中抗体是IgM。

[00120]在另一个具体实施方式，交联方式可以是连接到抗体的交联剂。在一个优选的具体实施方式，交联方式是抗-kappa或抗-Iambda或抗-mu剂，它与邻近抗体交联，该邻近抗体连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原。在另一个优选的具体实施方式，多价因子是VH4-34类抗体的IgM抗体，如mAb 216、RT-2B、FS 12、A6(H4C5)、Cal-4G、S20A2、FS3、Gee、HT、Z2D2或Y2K，并且交联剂是抗-VH4-34抗体结合抗体。优选的，抗-VH4-34抗体不阻止VH4-34抗体结合到细胞表面抗原。在一个特殊具体实施方式，抗-VH4-34抗体是9G4。

[00121]仍是在另一个具体实施方式，交联方式可以是亲水聚合物或网状聚合物，分子量为约100-1,000,000道尔顿，或更优选的，约1000-250,000道尔顿，具有多个与细胞表面上高度表达的细胞表面抗原特异结合的多价因子。亲水聚合物可以是多肽或碳水化合物。多肽可包括具有自由氨基以利于多价因子与多肽主链，如(Ala)_nLyS，其中n为2-20，共价连接的碱性氨基酸。共价结合的多价因子可包括抗体片段，如Fab′、Fab₂′或完整IgM，例如。共价结合可以使用双功能交联剂常规的提供，如或双马来酸化油交联剂，尽管可以使用任何适合的结合手段。

[00122]连接到高度表达的细胞表面抗的原多价因子优选显示出特异结合，即，它以高亲和性结合。典型的，高亲和结合为至少10⁶M″¹，典型的为大约10⁶M″¹-10⁸M″¹。

[00123]在另一个具体实施方式，提供了用于治疗患有以细胞过度增生为特征病症的哺乳动物的药物组合物，包括连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的多价因子，其中所述的多价因子包括用于与细胞表面的细胞表面抗原结合的多结合位点。优选的，多结合位点至少为5个，更优选的为大约5-100。在特殊具体实施方式，这些多结合位点可以是大约5-15，大约15-25，或大约15-50，或更多。

[00124]优选的，包含与细胞表面抗原结合的多结合位点的多价因子提供了与结合位点数目增多相关的增强的过度增生细胞的细胞毒性。

[00125]在人类患者体内试验细胞损伤抗体niAb 216，详细描述见实施例12。对于化疗药物的标准治疗方案(VCR/DNR/ASPR/泼尼松)，患者(诊断为ALL的成人)为难治型，即，对于化疗治疗爆发计数不再下降，患者为终末期。在第0和第7天，按1.25mg/kg剂量给予两例患者抗体，如附图9A和9B的箭头所示。血清抗体浓度分别约为26μg/ml和25μg/ml血清，根据患者体重、剂量和大约的血清容积(假定为30％红细胞压积)。每个患者的爆发计数(患者1和患者2)分别为大约125×10⁶/ml和65×10⁶/ml，在mAb 216+VCR治疗时。相对于进行体内研究的大约10⁶细胞/ml的浓度，相应的mAb浓度分别大约是0.2μg/10⁶细胞和0.38μg/10⁶细胞，该浓度适当的低于已证明的体内mAb 216杀伤B细胞的致死阈浓度。

[00126]在VCR的存在下，爆发计数短暂下降，在低抗体浓度试验终，较之mAb 216介导的细胞损伤，该结果更可能归因于补体介导的细胞杀伤。然而，与VCR联用，观察到爆发细胞计数戏剧性的下降，如附图9A和9B所示，并导致患者生命的延长。这些资料证明，白血病爆发(leukemic blast)的戏剧性增加的细胞死亡归因于体内mAb 216和VCR的协同结合。甚至在非常低浓度(亚致死)的mAb216浓度，mAb 216治疗仅是将爆发损伤或渗透，细胞对VCR毒性的敏感性显著增强，疗效增强。因而，这些结果表现出了显著进步的癌症治疗效果。

IX.试剂盒

此处所描述的多价因子，特别是细胞膜损伤抗体，可在试剂盒中使用，试剂盒用于确定多价因子对于需要治疗的患者的剂量阈值。在哺乳动物中导致细胞膜损伤的多价因子的量，可以通过提供包括足量连接到高度表达的细胞表面抗原的多价因子的试剂盒，来进行结合测定，或者确定由多价因子导致的细胞损伤和/或杀伤的细胞数目加以确定。在另一个具体实施方式，试剂盒用于确定哺乳动物中细胞膜损伤抗体的剂量阈值，包括足量连接到高度表达的细胞表面抗原的细胞损伤抗体来进行结合测定，或者确定由多价因子导致的细胞损伤和/或杀伤的细胞数目。试剂盒也可包括交联剂，或细胞毒素剂，或其组合，来确定在细胞毒素剂和/或细胞膜损伤增强交联剂的存在下，多价因子的剂量阈值。典型的，获取并检验患者自己的细胞(如，血细胞、肿瘤细胞等)，使用试剂盒内的试剂来确定细胞上表达的细胞表面抗原数目，以及确定由预定数量的多价因子导致的损伤和/或杀伤细胞的数量。

X.过度增生细胞

[00127]以细胞过度增生为特征的病症包括癌症、自身免疫疾病、病毒感染和免疫缺陷。癌症可包括任何细胞类型和组织的癌症。优选的癌症包括B细胞源，如淋巴瘤和白血病。

[00128]自身免疫疾病包括系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、自身免疫性淋巴增生病、多发性硬化症、银屑病和重症肌无力，但也可包括桥本氏甲状腺、狼疮肾炎、皮肌炎、Sjogren综合征、阿尔茨海默氏病、Sydenham舞蹈病、狼疮肾炎、风湿热、多腺性综合征，大疱性类天疱疮、糖尿病、过敏性紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安动脉炎、Addison病、局限性肠炎、结节病、溃疡性结肠炎、结节红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、肺出血肾炎综合征、血栓闭塞性血管炎、原发性胆汁性肝硬变、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肌炎、多软骨炎、pamphigusVulgaris、韦格纳氏肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球性肾炎、纤维化肺泡炎、III类自身免疫病如免疫介导的血小板减少症、如急性特发性血小板减少性紫癜和慢性特发性血小板减少性紫癜等。

[00129]病毒感染也可造成多种细胞类型和组织的细胞过度增生状态和病症。导致过度增生的病毒感染的例子包括人免疫缺陷病毒(HIV)感染，包括HTLV-I、HTLV-2，Epstein Barr病毒(EBV)感染、人乳头装瘤病毒(HPV)感染等。

XI.与附加的细胞毒素剂组合

[00130]本发明的发明者作出了惊人的发现，通过加入细胞毒素剂，包括化疗剂、放射性同位素、细胞毒抗体、免疫交联物、配体结合物、免疫抑制剂、细胞生长调节剂和/或抑制剂、毒素或其混合，细胞损伤抗体的毒性可以显著甚至是协同的增强。

[00131]可用于本发明制剂和方法的化学治疗剂包括紫杉烷、秋水仙碱、长春花碱、鬼臼乙叉甙、喜树碱、抗生素、铂配位络合物、烷化剂、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物或拓扑异构酶抑制剂。优选的拓扑异构酶抑制剂是鬼臼乙叉甙。优选的嘧啶类似物包括卡培他滨、5-氟脲嘧啶、5-氟尿嘧啶脱氧核苷、5-氟尿嘧啶脱氧核苷一磷酸盐、阿糖胞苷、5-氮杂胞嘧啶核苷或2′，2′-二氟脱氧胞苷酸。优选的嘌呤类似物包括巯嘌呤、咪唑巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁、赤羟壬基腺嘌呤、克拉屈滨、阿糖腺苷和磷酸氟达拉滨。叶酸类似物包括甲氨喋呤、雷替曲塞、洛美曲索、permefrexed、依达曲沙和培美曲塞。优选的鬼臼乙叉甙是依托泊苷或替尼泊苷。优选的喜树碱是irinotocan、托泊替康或camptothecan。

优选的，抗生素是更生霉素、柔红霉素(道诺霉素枸橼酸柔红霉素脂质体)、阿霉素、伊达比星、表柔比星、valrubucin、米托蒽醌、争光霉素或丝裂霉素。

优选的铂配位络合物是顺铂、卡铂或奥沙利铂。

优选的，烷化剂是双氯乙基甲胺、环磷酰胺、异磷酰胺、美法仑、达卡巴嗪、替莫唑胺、塞替派、六甲基嘧胺、链佐星、卡莫司汀、白消安、六甲蜜安或苯丁酸氮芥。

[00132]附加的化学治疗剂例子可包括烷化剂，如塞替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)；

[00133]烷基磺酸盐如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；

[00134]氮丙啶如苯并多巴、卡波醌、美妥多巴和尿多巴；

[00135]氮并啶和methylamelamines包括六甲蜜安、曲他胺、乙基trietylenephosphoramide、噻替派和trimethylolomelamine；[00136]己酸配质(特别是bullatacin和bullatacinone)；

[00137]喜树碱(包括合成的类似物托泊替康)；

[00138]苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成的类似物)；

[00139]cryptophycins(特别是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；

[00140]多拉司他汀；duocarmycin(包括该合成类似物，KW-2189和CBI-TMI)；

[00141]eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；

[00142]氮芥如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide雌氮芥、异磷酰胺、双氯乙基甲胺、双氯乙基甲胺氧化氢氧化物、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀；

[00143]nitrosureas如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；

[00144]抗生素如theenediyne抗生素(如刺孢霉素，特别是calicheamicin gammall和calicheamicin phill，参见，如Agnew(1994)Chem.Intl.Ed.Engl.，33：183-186；蒽环类抗生素，包括dynemicin A；二膦酸盐，如氯膦酸盐；esperamicin；和新制癌菌素生色团和相关的色蛋白enediyne抗生素chromomophores)、aclacinomysins放线菌素、authramycin、偶氮丝氨酸、争光霉素、放线菌素C、carabicin、去甲柔红霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧化-L-原亮氨酸、阿霉素(多柔比星)(包括吗啉代-阿霉素、cyanomorpholino-阿霉素、2-吡咯啉-阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；

[00145]抗代谢药如甲氨喋呤5-氟尿嘧啶(5-FU)；

[00146]叶酸类似物如二甲叶酸、甲氨喋呤、蝶罗呤、三甲曲沙；

[00147]叶酸补充剂如亚叶酸；

[00148]嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫唑嘌呤、硫鸟嘌呤；

[00149]嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿嘧啶脱氧核苷；

[00150]雄激素如卡普睾酮、屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内脂；

[00151]抗肾上腺如氨鲁米特、曲洛司坦；

[00152]醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；elfornithine；依利醋铵；大环内酯类抗肿瘤药；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登醇类如美登素和柄型菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；乙肼；丙卡巴肼；PSK；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯乙胺；单端孢霉烯族毒素类(特别是T-2毒素，疣孢菌素A，杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春花碱酰胺；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；胞嘧啶，阿糖胞苷(″Ara-C″)；

[00153]环磷酰胺；塞替派；紫杉烷例如紫杉醇(TAXON，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和泰索帝(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(Gemzar)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨喋呤；

[00154]铂类似物如顺铂和卡铂；

[00155]长春碱，长春新碱；长春瑞滨(NavelbineTM)；

[00156]依托泊苷(VP-16)；异磷酰胺；米托蒽醌；；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；

[00157]拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；

[00158]类视黄醇如维甲酸；卡培他滨；和药学上可接受的盐、酸或任何上述衍生物。

[00159]特别优选干预微管聚合或解聚的药物。可以效仿的药物包括秋水仙碱、长春花碱、如长春新碱、长春碱、长春花碱酰胺或长春瑞滨，和紫杉烷，如紫杉酚、紫杉醇和紫杉萜。也可使用任何以上药物的混合。

[00160]附加优选药物是抗肌动蛋白剂。在一个优选的具体实施方式，抗肌动蛋白剂是jasplakinolide或细胞松弛素，在离体处理中使用，如净化恶性细胞骨髓。

[00161]毒素可作为免疫交联物、配位子结合物或与抗体共同给予。毒素包括，假单胞菌外毒素A、蓖麻毒素、白喉毒素、木鳖子苷、美洲商陆抗病毒蛋白、葡萄球菌肠毒素A、白树毒素、maytansinoids(如，参见于专利号为6,441,163的美国专利)等，不限于此。

XII.抗体

[00162]在本发明中有用的细胞损伤抗体可包括对于任何高度表达的细胞表面抗原的抗体。细胞表面抗原包括细胞表面表达的分子如受体、免疫球蛋白、胞质分裂、糖蛋白等。优选的细胞表面抗原与细胞骨架相联。

[00163]优选的细胞损伤抗体包括对于与细胞骨架相联的细胞表面抗原的抗体，这一特征显示出增强了细胞损伤。优选的细胞损伤抗体包括VH4-34基因编码的抗体，例如，抗CDIM抗体。如以上所述，术语″抗体″以其最大含义使用，包括没有Fc部分的抗体片段(如，非Fc支撑抗体)。抗体和抗体片段的例子可包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双链抗体；线性抗体(Zapata等，Protein Eng.8(10)：1057-1062)；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。术语″抗体″和″抗体片段″包括显示出所描述的抗体结合特性的将来形成的药剂。优选的，抗体和抗体片段可进一步与交联剂交联，如具有与细胞损伤抗体和细胞损伤抗体片段的一部分特异结合的抗体，只要该交联抗体结合不妨碍细胞损伤抗体和抗体片段结合到细胞表面抗原。在优选的具体实施方式，交联剂是连接到结合了细胞的细胞损伤抗体上的交联抗体。优选的，该交联抗体不妨碍细胞损伤抗体的结合。在具体实施方式，细胞损伤抗体包括Fc部分，交联剂连接到细胞损伤抗体的Fc部分，在另一个具体实施方式，交联剂连接到抗体Fc部分以外的部分，如果存在的话。

[00164]在一个优选的具体实施方式，细胞损伤抗体是VH4-34抗体，优选抗CDIM抗体。抗CDIM抗体可用于损伤、渗透和杀伤细胞，。在一个特殊具体实施方式，抗CDIM抗体是一个抗体片段，如Fab₂′，并可以用一个具有与该抗CDIM抗体特异结合的抗体(如，9G4)交联。优选的，交联抗体不阻止抗CDIM抗体与细胞的CDBVI抗原表位相结合，并提供与细胞上的CDEVI抗原表位结合了的抗CDIM抗体的交联。

[00165]抗CDIM抗体可与附加的具有与细胞上的细胞表面分子特异结合的细胞毒抗体联合使用，如B细胞。抗CDIM抗体和附加的细胞毒抗体可用于联合治疗方案。在优选的具体实施方式，细胞毒抗体可与B的任何细胞表面分子特异结合。例如，细胞毒抗体可显示出与B细胞的细胞表面分子CDlla、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD34、CD37、CD38、CD40、CD45、CD52、CD80、CD86、IL-4R、IL-6R、IL-8R、IL-13、IL-1 3R、α-4/β-1整合素(VLA4)、BLYS受体、细胞表面个体基因型Ig、肿瘤坏死因子(TNF)或其混合的特异结合，不限于此。例如，具有与CD11a特异结合的细胞毒性抗体可以是，例如，依法利珠单抗(RAPTIVA)。具有与CD20特异结合的细胞毒性抗体可以是美罗华(RITUXAN)。具有与CD22特异结合的细胞毒性抗体可以是，例如，依帕珠单抗。具有与CD25特异结合的细胞毒性抗体可以是，例如，达珠单抗(ZENAPAX)或巴利普单抗(SIMULECT)。对CD52的抗体包括，例如，CAMPATH。对α-4/β-1整合素(VLA4)的抗体包括，如，那他珠单抗。对TNF的抗体包括，例如，英夫利普单抗(REMICADE)。

[00166]因而，在优选的具体实施方式，具有与B细胞的CDIM抗原表位特异结合的抗体可用于联合免疫治疗方案，与RITUXAN、ZENAPAX、REMICADE或RAPTIVA，或其联合一起。细胞毒抗体也可用作免疫交联物，例如，包括放射性同位素或毒素。进一步的在一个附加具体实施方式，可以使用联合治疗，包括具有与B细胞的CDIM抗原表位特异结合的抗体、附加的与具有与B细胞的细胞表面分子有特异结合的细胞毒抗体，和一种和多种化疗剂。例如，mAb216可以与抗CD20抗体联合使用，如美罗华、tosutimab、或替伊莫单抗，与抗CD22抗体联合使用，如依帕珠单抗，或与抗CD52抗体联合使用，如CAMPATH。联合治疗可以进一步包括化学治疗，如在化学治疗和免疫治疗联合方案中的破坏细胞骨架剂，如长春新碱。

XIII.放射性同位素

[00167]同位素用于制备有治疗作用的免疫或配位子结合物，它典型的产生治疗有效径长的αY或β粒子。这样的放射性核素杀死与它们非常接近的细胞，例如结合了结合物的赘生细胞。定向传送的优点在于放射性示踪的抗体或配位子对于与靶细胞不是非常接近的细胞一般很少或没有影响。

[00168]就放射性同位素用于细胞毒素剂而言，修饰的抗体或配位子可以直接标示(如通过碘化作用)或用螯合剂标示。在另一种方法中，抗体或配位子用至少一种放射性核素标示。特别优选包含1-二乙烯三胺五乙酸(″MX-DTPA″)和环己基二亚乙基三胺五乙酸

(″CHX-DTPA″)衍化物的鳌合剂。其它鳌合剂包括P-DOTA和EDTA衍化物。特别优选用于间接标示111In和911Y的放射性核素。

[00169]放射性同位素可连接到抗体或配位子的特异位点，如仅存在于该抗体Fc段的末端连接的糖残基。锝-99m标示的抗体或配位子可通过配位子交换过程或Batch标记过程制备。例如，抗体的标示可以通过用亚锡离子溶液还原高锝(TcO4)，将经还原的锝络合到葡聚糖凝胶柱上，并将抗体加入该凝胶拄。Batch标示技术包括，例如，孵育高锝、还原剂如SnCI2、缓冲液如钠钾酞酸盐溶液和抗体。优选的放射性核素是现有技术所公知的。可效仿的用于标示的放射性核素是经由酪氨酸残基共价连接的131I。根据本发明，放射示踪的抗体的制备可用放射性钠或碘化钾和化学氧化剂，如次氯酸钠、氯亚明等，或酶氧化剂，如乳酸过氧化物酶、葡萄糖氧化酶核葡萄糖。

[00170]关于鳌合剂和鳌合剂结合物的专利，是现有技术中已知的。例如，Ganasow的专利号为4,831,175的美国专利，是关于内容相同的多取代二乙烯三胺五乙酸鳌合物和蛋白轭合物及其制备。Gansow的专利号为5,099,069、5,246,692、5,286,850、5,434,287和5,124,471的美国专利，也是关于多取代的DTPA鳌合物。这些专利全部引入此处作为参考。其它的适合的金属鳌合剂有乙二胺四醋酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DPTA)、1，4，8，11-四氮十四烷、1，4，8，11四氮十四烷-1，4，8，11-四乙酸、1-噁-4，7，12，15-四氮十七烷、4，7，12，15-四乙酸等。最优选环己基-DTPA或CHX-DTPA。仍是其它的适合的鳌合剂，包括未列出的，可以由本领域技术人员容易的使用的，也明确包括于本发明的范围之内。附加的鳌合剂包括特殊的双功能鳌合剂，参见于专利号为6,682,734、6,399,061和5,843,439的专利，最优选用于对三价金属提供高度亲和力，显示出增加的肿瘤-非肿瘤比例，降低骨吸收，和增大放射性核素在体内靶位点，即B细胞淋巴瘤肿瘤位点的滞留。然而，其它双功能鳌合剂，可以拥有或没有现有技术中已知的这些特点，它们也有利于肿瘤治疗。

[00171]为诊断和治疗目的，修饰的抗体也可结合于放射性示踪物。用于肿瘤成像诊断的放射示踪治疗性轭合物的使用，可先于给予患者抗体和细胞毒素剂。例如，结合了人CD20抗原的单克隆抗体，已知为C2B8，可用111In放射示踪，采用双功能鳌合剂，如，MX-DTPA(二乙烯三胺五乙酸)，它包括1-异硫氰酸根苯甲基-3-甲基-DTPA和1-甲基-3-异硫氰酸根苯甲基-DTPA的1∶1的混合物。111In是优选的诊断性放射性同位素，由于在大约1-10mCi之间可以安全施用，未监测到毒性作用，并且其成像数据指示出随后的90Y标示的抗体分布。成像观察通常采用5mCi 111In标示抗体的剂量，最佳成像可在给予标示的抗体或配位子后的多种时间确定，通常为给予后3到6天。如，参见Murray，J.(1 985)Nuc.Med.26：3328和Carraguillo等，(1985)J.Nuc.Med.26：67。

[00172]多种放射性同位素可以利用，本领域技术人员能够容易的确定不同情况下最适合的放射性同位素。例如，131I最常用于靶向免疫治疗。然而，131I的临床应用受到限制，由于半衰期短(8天)、血液和肿瘤或位点中的碘化抗体的脱卤作用特性、以及它的高γ射线不能提供期望的取决于肿瘤大小的足量局部肿瘤沉积剂量。使用了附加鳌合剂时，另外提供了将金属鳌合基加到蛋白并利用其它放射性核素如附加的IIIIn和90Y的机会。90Y具有几种利用于放射免疫治疗的优点。例如，90Y的64小时的较长的使用半衰期足够抗体聚集于肿瘤细胞，并且，不同于131I，90Y是高能纯β发射体，在其衰退中不伴有γ射线，在组织中具有100-1000个细胞直径的范围。进一步的，最低量的穿透辐射允许给门诊病人施用90Y-标记的抗体。另外，标记的抗体的细胞内陷作用不为细胞杀伤所需，而且电离放射对缺乏靶抗原的临近肿瘤细胞有致命作用。

[00173]90Y标记的抗体的单次有效治疗剂量(即，治疗有效量)范围为大约5-75mCi之间，更优选大约10-40mCi。131I标记的抗体的非骨髓清除单次有效治疗剂量为大约5-70mCi之间，更优选大约5-40mCi之间。131I标记的抗体的单次清除治疗有效剂量(即，需要自体骨髓移植的)为大约30-600mCi，更优选大约50或低于500mCi。当相对于异种蛋白，如鼠抗体，抗体或配位子具有较长循环半衰期时，131I标记的抗体的非骨髓清除单次有效治疗剂量为大约5-40mCi，更优选低于大约30mCi。放射性同位素标记物的成像剂量，如111In标记物，通常少于大约5mCi。

[00174]131I和90Y已广泛用于临床，现有技术中其它已知的放射性同位素也能用于同样目的。有其它放射性同位素用于成像。例如，其它的能够使用的放射性同位素包括，但不限于，131I、125I、123I、90Y、111In、105Rh、153Sm、166Ho、177Lu、188Re、86R、32P、57Co、64Cu、67Cu、77Ga、81Rb、81Kr、87Sr、113In、127Cs、129Cs、132I、197Hg、213Pb、216Bi、117Lu、212Pb、212Bi、47Sc、105Rh、109Pd、199Au、225Ac、211At和213Bi。就此方面，α、γ和β发射体均作为本发明的方案。进而，应认为，本领域技术人员能够容易的确定适用于所选择的疗程的放射性核素，不需要进行过度试验。到这里，另外的已经用于临床诊断的放射性核素包括125I、123I、Tc、K、Fc、Ga、Ga和113In。抗体也已经用多种放射性核素标记，用于靶向免疫治疗，如，参见于Peitersz等(1987)Immunol.Cell Biol.65：111-125。这些放射性同位素包括188Re、186Re、和199Au和67Cu。专利号为5,460,785的美国专利提供了关于这些放射性同位素的信息，引入此处作为参考。

XIV.细胞生长调节剂和/或抑制剂

[00175]细胞生长调节剂和/或抑制剂包括低分子治疗剂如激素或抗激素剂、激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、基因治疗剂或基因表达修饰剂。

[00176]抗激素剂对治疗涉及激素增加、特别是女性的雌激素作用的自身免疫性疾病特别有效。抗激素剂调节或抑制肿瘤的激素样作用，如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERMs)，包括，例如，他莫昔芬(包括他莫普芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟泰米芬、曲沃普芬、keoxifene、LYI 17018、奥那斯酮和托瑞米芬(FarestonTM)；阻断酶芳香酶的芳香酶抑制剂，它调节肾上腺雌激素的产生，例如，4(5)-咪唑、氨鲁米特、甲地孕酮醋酸盐(MegaceTM)、依西美坦、福美坦、法倔唑、伏氯唑(RivisorTM)、来曲唑(FemaraTM)和阿那曲唑(ArimidexTM)；抗雄激素，如氟他胺、尼鲁米特、卡比鲁胺、醋酸亮丙瑞林和戈舍瑞林；药学上可接受的盐、酸或以上所述的衍化物。雄激素特别用于治疗自身免疫性疾病，其代表为双氢表雄甾酮(DHEA)。选择性雄激素受体调节剂(SARMs)包括，例如，Hutchinson的专利号为6,645,974的美国专利所描述的化合物，如雄甾烷和雄甾烯氨甲酰。

[00177]激酶抑制剂广为所知，特别优选的激酶抑制剂包括bcr/abl酪氨酸激酶抑制剂，如imatinib(Gleevec)和它的相关化合物，Zimmermann的参见专利号为5,521,184的美国专利。附加的酪氨酸激酶抑制剂可包括阻断Lyn激酶的激活和转录中的信号合成的药物，包括，如，阻断Lyn激酶激活的siRNAs。附加激酶抑制剂还包括化合物如AGL 2592，参见Ben-Bassat，H.等，(2002)J.Pharmacol.Exp.Ther.303：163显示了凋亡诱导非霍奇金淋巴瘤；除莠霉素A，参见Mahon，TM和O′Neill，LA(1995)J.Biol.Chem.270：28557，显示阻断DNA结合和NF-κB-驱使的基因表达；苄达明酮化合物，如，参见Tang的专利号为6,680,335的美国专利；吡唑啉酮嘧啶(pyrazolopyrimidine)衍化物，如，参见Hirst的专利号为6,660,744的美国专利，等。蛋白酶体抑制剂包括硼酯(boronicester)，参见Adams的专利号为6,083,903的美国专利。优选的蛋白酶体抑制剂是bortezomib(Velcade)。

[00178]基因治疗剂和基因表达修饰剂包括反义核苷酸序列、干扰核苷酸序列等。基因治疗剂和基因表达修饰剂可用作免疫交联物或单独给予的细胞毒素剂。特定用途的基因治疗剂和基因表达修饰剂包括，编码凋亡前通道涉及的蛋白的药物，阻断凋亡前通道抑制剂的药物，或阻断增殖信号的药物，它们均能对非控制的生长和过度增殖起效。例如，基因表达修饰剂可包括反义或siRNA，作用于抑制NF-kB通道，从而抑制异常激活该通道时出现的异常增殖。

[00179]反义DNA寡核苷酸通常由补充目标序列的序列组成，通常为信史RNA(mRNA)或mRNA前体。mRNA包含功能或感觉、方向的基因信息，与反义寡核苷酸的结合灭活所指向的mRNA，并阻止它转运入蛋白内。这样的反义分子的确定基于生化试验，可设计试验表明，蛋白由特异性RNA编译，一旦确定该RNA的序列，反义分子通过补充的Watson-Crick碱基对与其结合。这样的反义分子通常包含10-30个碱基对，优选10-25个，最优选为15-20个。该反义寡核苷酸可经修饰，来提高对核酸酶水解的抵抗力，这样的类似物包括磷硫酰、甲基膦酸酯、phosphoroselenoate、磷酸二酯和p-乙氧基寡核苷酸，参见WO 97/07784。

[00180]基因治疗剂也可以是核酶、DNA酶、催化性RNA或小干扰RNA(siRNA)。RNA干预利用少于大约30个碱基对的短RNAs，通-过补充的碱基对作用，参见上文。SiRNAs可以是直线或环状。

[00181]如上文所述，阻止Lyn激酶激活和转录所涉及的信号合成的药物和修饰剂，是最佳的。在优选实施方案中，阻断Lyn激酶激活的siRNA，如Ptasznik，A等，(2004)Nat.Med.10：1187报告的siRNA，可与抗CDIM结合抗体一起给予，作为一种免疫交联物或作为单独给予的细胞毒素剂。

XV.药物制剂和给药方法

[00182]抗体和细胞毒素剂可用任何方法和现有技术中已知的药学上接受的辅料制备。具体而言，抗体可以盐的形式提供，具有任选的辅料和稳定剂。化学治疗剂的制备方法和辅料可以广泛变化，本信息的获自，例如，参见Remington′s Pharmaceutical Sciences(ArthurOsol，Editor)。

[00183]此处所描述的方法和组合物可以用于体内、体外和试管内施用。

[00184]本发明的组合物可以多种不同方式给予患者。给药方法根据所需的施用而变化。本领域的技术人员应当理解，组合物的给药可以多种方式进行，例如，局部给药，包括但不限于，表皮、眼睛和直肠；经表皮，由被动或主动方式，如如使用补丁、载体或离子电渗疗法；转化黏液质的，如，舌下、颊下、直肠、阴道或经尿道；口服，如，胃或十二指肠；注射入体腔或脉管，如，腹膜内、静脉内、淋巴管内、瘤内、肌内、间隙内、动脉内、皮下、损害内、眼内、滑膜内或关节内；吸入，如，肺或鼻吸入，使用，如雾化器。多价因子是抗体的组合物和方法一般胃肠外给药。

[00185]需要理解的是，尽管本发明结合了其优选的具体实施方案来进行描述，上述的描述和以下实施例用于说明发明，但不限制发明的范围。除非有相反的指明，本发明的实施将采用现有技术中常规的制备药物制剂的技术。其它属于本发明范围的改进和修饰对于本领域技术人员而言是显而易见的。这些技术在文献中全部说明了。

[00186]上文和下文中的所有专利、专利申请书和此处提到的出版物，引入此处，作为参考。

[00187]在以下的实施例中，已努力确保所用数据的准确性(如，数量、温度)但一些试验误差和偏差应当可以得到补救。除非有相反的指明，温度为摄氏度，压力为大气压或接近大气压。

[00188]缩写：

[00189]ALL 急性淋巴性白血病

[00190]ASPR 天冬酰胺酶

[00191]BCR B细胞受体

[00192]BFA 布雷菲德菌素A

[00193]DNR 柔红霉素

[00194]FITC 异硫氰酸荧光系

[00195]IM 传染性单核细胞增多症

[00196]mAb 单克隆抗体

[00197]PI 碘化丙啶

[00198]RBC 红细胞

[00199]SLE 系统性红斑狼疮

[00200]VCR 长春新碱

[00201]WBC 白细胞

实施例1mAb 216损伤B细胞膜并引起溶酶体重新密封

(resealing)反应

[00202]对细胞膜损伤的固有反应是由附加的内部溶酶体膜在损伤处快速重新密封。Lamp-1是正常不出现于细胞膜上的丰富的溶酶体膜糖蛋白(Granger，B.L.，等(1990)J.Biol.Chem.265：12036；McNeil，P.L.(2002)J.细胞Sci.115：873)。当溶酶体被诱导与细胞膜融合时，Lamp-1的内-溶酶体氨基末端区域开始暴露于细胞表面。这一融合事件可以通过用定向Lamp-1的腔抗原表位的mAbs的活细胞表面染色来监测(Reddy，A.，等(2001)细胞106：157；Rodriguez，A.，等(1997)J.Cell.Biol.137.93；Martinez，I.，等(2000)J.Cell.Biol.148：1141)。从而，Lamp-1在细胞表面的出现是膜破裂后细胞膜重新密封的指标。(McNeil，P.L.，和R.A.Steinhardt(2003)Ann.Rev.Cell Dev.Biol.19：697)。

[00203]为试验VH4-34编码mAb 216是否损伤细胞并且继而引起快速修复和重新密封反应，测定了用mAb 216治疗的人B细胞系的细胞表面溶酶体特异蛋白Lamp-1的快速出现。

细胞和试剂

[00204]人前B细胞系Nalm-6(Hurwitz，R.，等(1979)Int.J.Cancer 23.174)，Reh(Rosenfield，C.，A.等(1977)Nature 267：841)和成熟Bcell lineOCI-Ly8Tweeddale，M.E.，等(1987)Blood69：1307)用热灭活的10％FCS在培养基中保持在对数相。B细胞系获自ATCC。VH4-34编码mAbs，mAb 216(Bhat，N.M.，等(1993)J.Immunol.151：5011)、Z2D2(Bhat，N.M.，等(2000)Scand.J.Immunol.51：134)、Y2K，和同种配对的获自VH3家族的对照mAb，MS2B6(Glasky，M.S.，等(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3：114)，由实验室产生，用水经2X沉淀由血清游离杂交瘤提纯。当Centriprep浓缩器(Amnicon，Dancers，MA)有需要时，浓缩单抗(Mabs)。经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，IgM mAbs的纯化度为90-95％。纯化的IgMs浓缩的确定通过以人IgM为标准的夹层ELISA来确定(catalog &num；31146，Pierce Biochemicals，Rockford，IL)。除了MS2B6，穿孔IgM也用作同种型对照。所有mAbs经无菌过滤，并游离于叠氮化钠。

用PI染色和前向散射的细胞活力测定

[00205]用细胞排除碘化丙啶(PI，Sigma，St.Louis，MO)的能力测定细胞膜的完整性。用Stanford′s FACS实验室的连接了VersatermPro和FlowJo软件的FACScan(Becton-Dickinson，SanJose CA)流式细胞计量仪定量PI的混合水平。用前向散射信号测得的大小正常的PI阴性细胞，被认为活细胞。

[00206]简要的说，细胞在每个试验中被具体处理，并用3％FCS和10μgs/ml的PI的PBS液重悬浮。在用钙游介质测定毒性的试验中，用加入10ugs/ml PI的有和没有钙的适当介质重悬浮细胞。由于先前有研究表明，mAb 216-介导的毒性在较低温度下显著(Bhat，N.M.，等(1996)Clin.Exp.Imrnunol.105：183)，应注意使所有介质和细胞保持在37℃，室温下离心。

ATP消耗和释放的测定

[00207]根据生物发光检验试剂盒的生产说明，测定细胞内和释放的ATP(Catalog &num；A-22066，Molecular Probes)。范围为1nM-luM的标准ATP稀释作为试验的阳性对照。在每个试验特定的不同的介质中，细胞暴露于多种浓度的mAb216。将10ul反应上清液加入到90ul含有DTT、荧光素和荧光素酶的标准反应液中。出现了作为协同底物的ATP，通过连接了MicroWin 2000，4.2版软件(MikrotekLaborsysteme，Gmbh)的发光计(Lumimark Microplate Reader，Bio-Rad)，发光被立即测定。该测定可以检测到毫微微克分子(femtomolar)数量的ATP。为检测细胞内ATP含量，用1％NP-40在RT溶化细胞10分钟，检验10ul溶解产物，方法参见上文。Lamp4表达的研究

[00208]用落射式荧光、流式细胞计量仪和共聚焦显微镜研究了表面Lamp-1的表达。人Lamp-1(CD107a，H4A3克隆)腔抗原表位和Lamp-1同种对照的抗体，由BD-PharMingen IgGlk小鼠获得。用次级FITC-结合的Goat F(ab)2抗鼠IgG(Pierce Biochemicals)检测两种抗体。37℃下，在每个试验的特定时间，将细胞(5×105)暴露于各种浓度的mAb 216或对照的人IgM(mAb MS2B6或穿孔IgM)。然后用2％预加温的RT多聚甲醛固定细胞20分钟，用预加温的介质洗涤两次，用抗Lamp-1或同种对照染色15分钟。然后用染色介质(3％FCS和0.2％叠氮化钠PBS)洗涤细胞两次，再用抗Lamp-1的次级抗体孵育另外15分钟。洗涤两次后，在染色介质中重悬浮细胞，并用流式细胞计量仪、荧光免疫检验和共聚焦显微镜分析。

[00209]在斯坦福细胞科学成像实验室的多探针(MultiProbe)2010激光共聚焦显微镜(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)上进行共聚焦成像。MultiProbe使用激发光线为488，568和647的氩/氪混和气体激光器，设置在Nikon Diaphot 200倒置显微镜上。以488nm的激发波长，发光通过510LP分光器，用510长的通过过滤器收集。使用Nikon 60X(NA1.4)平面镜。在配备有AxioCam HRc摄像机(Carl Zeiss)的Axioplan 2 Microscope(Carl Zeiss，Inc.，GmbH)和连接了Axiovision 3.1软件(Carl Zeiss)的Opti-Quip PowerSupply(Model 1200，Highland Mills，New York)上，进行落射式荧光成像。在FACScan上进行流式细胞计量。

结果和结论

[00210]在不同的试验中，未治疗细胞的Lamp-1表达由低至5％变化至50％。变异的发生归因于B细胞系的标准实验室处理。在lamp-1表达基线水平为50％的试验中，同种对照治疗细胞具有50％的阳性率，Ab 216治疗的细胞为100％Lamp-1阳性。细胞系的Lamp-1染色重复5次，确保再现性。讨论Lamp-1基线表达为5％的试验的结果。

[00211]将Nalm-6细胞暴露于mAb 216 1分钟，显示出Lamp-1染色的急剧增加，而暴露于同种对照的细胞和未治疗的细胞没有增加它们的Lamp-1表达。Lamp-1暴露也在其它B细胞系观察到，OCI-Ly8(成熟-B)、Reh用FACS和落射式荧光(未显示数据)。用PI摄取，同时测定细胞膜的完整性。经暴露于216 1分钟后，细胞保持PI阴性。

[00212]经mAb暴露后，在不同时间点，也测定Lamp-1染色和PI摄取。抗体暴露后30秒，观察到具有明亮染色的Lamp-1暴露迅速发生，在随后的5分钟内逐渐降低(附图5A)。在这一时间期限，细胞保持PI-阴性。暴露于mAb2165分钟后，显现PI摄取，到20分钟时，由于PI摄取的出现，10-25％的细胞开始膜渗透。

[00213]通过ATP释放测定的膜破裂也显示出相似的时间过程。如附图5B所示，在2分钟时，当Lamp-1在细胞膜上被检测到时，上清液中未检测到ATP。但在15分钟和1小时时ATP释放增加，提示不能重新密封的膜损伤发生。在mAb 216治疗后2小时和24小时，测定的ATP下降，可能是细胞溶解和坏死降解释放的ATP的结果。当测定了细胞片的ATP含量时，生物发光分析成为测定细胞增殖和细胞毒性的方法。mAb 216的细胞毒性作用出现在暴露1小时之内。

[00214]这些结果显示，mAb 216介导的膜损伤修复的机制与机械和物理伤害造后细胞活力修复的制剂相同，指示mAb 216治疗造成的细胞损伤事件与任何其它大的膜破裂相似。迄今为止，未观察到抗体导致的细胞损伤。由于内膜快速加入到类脂双层膜，mAb 216所致的膜损伤在开始被重新密封，但随着暴露于mAb 216时间的增加，重新密封的尝试失败，膜开始渗透PI和ATP。除了mAb 216，其它抗B细胞VH4-34编码IgM mAbs介导类似膜损伤，并引起类似的溶酶体重新密封反应。

实施例2

mAb 216诱导的膜损伤的修复依赖于功能性肌动蛋白

[00215]如McNeil，P.((2002)J.细胞Sci.115：873)以及其它中所讨论，膜损伤的修复涉及肌动蛋白依赖性程序。为检验mAb 216诱导的膜损伤是否利用了肌动蛋白依赖性修复机制，用影响肌动蛋白聚合剂处理细胞，评定对mAb 216诱导的膜损伤修复的作用。用细胞松弛素或jasplakinolide处理细胞，这两种药物具有与肌动蛋白聚合相反的作用。细胞松弛素将肌动蛋白解聚为单体，而jasplakinolide，获自海产海绵的环肽，将肌动蛋白固定为丝状体形式。两种处理均妨碍了基于肌动蛋白的细胞骨架活动。

方法：

[00216]细胞松弛素获自Sigma，而jasplakinolide获自MolecualProbes(Eugene，OR)。半胱天冬酶抑制剂、Ac-IETD-CHO和Ac-DEVD-CHO获自PharMingen(San Diego，CA)。在用mBb216处理之前，在37℃用jasplakinolide(3ugs/ml)、细胞松弛素(5ugs/ml)或半胱天冬酶抑制剂(10uM)处理Nalm-6细胞(1×106细胞/ml)2小时。并行设置等量的DMSO对照样本。然后将细胞暴露于25ug mAb216或对照抗体(Ab)中，用流式细胞计量仪分析。

结果：

[00217]用细胞松弛素或jasplakinolide和mAb 216处理的细胞，显示生存力下降(活细胞百分数)，以及由此产生的对mAb 216敏感性增加，证明了协同作用并指示修复过程需要功能性肌动蛋白。用细胞松弛素或jasplakinolide和对照抗体处理的细胞未显示生存力下降。来自具有代表性的一个试验的数据见附图6B。其余3个试验获得了相似的结果。

[00218]用半胱天冬酶抑制剂Ac-IETD-CHO和Ac-DEVD-CHO孵育细胞，未改变细胞生存力，表明细胞死亡的机制不归因于凋亡。

[00219]这些结果进一步支持了抗体诱导暴露于这些抗体中所致的细胞膜损伤的机制。

实施例3

mAb 216诱导的细胞膜损伤的修复依赖于钙

[00220]由于已知溶酶体的胞吐作用是钙依赖现象(Miyake，K.，和P.L.McNeil(1995)J.CellBiol.131：1737；Bi，G.Q.，等(1995)J.CellBiol.131：1747，试验了在没有钙和正常钙情况下mAb 216诱导的膜损伤修复。用两种VH4-34编码mAbs、mAb 216以50、25和12.5ng/ml浓度，和50ng/ml浓度的Y2K处理Nalm-6细胞，检验了在有和没有钙的介质中的细胞生存力。如附图6A所示，在钙缺失中，细胞生存力显著下降，表明钙是细胞损伤修复所必需的。用对照抗体处理或未经抗体处理的细胞，在存在或缺失钙中，未显示任何细胞生存力变化。其它B细胞系，OCI-Ly8和Reh在缺失钙的情况下，也显示出类似的细胞毒性增加。

实施例4

mAb 216诱导的膜损伤修复依赖于功能性高尔基体

[00221]已知用布雷菲德菌素A(BFA)处理导致高尔基相关的外壳蛋白释放、高尔基膜在内质网的重新分布和堵塞高尔基体的分泌(Klausner，R.D.，(1992)J.细胞Biol.116：1071)。用BFA处理的细胞不产生新形成的溶酶体，这样提供了检验损伤修复对它们的需要的条件。从而，通过用BFA处理细胞，检验新形成的溶酶体在mAb 216诱导的膜损伤修复中的帮助能力。

方法：

[00222]布雷菲德菌素A获自Sigma。mAb 216处理前，37℃下用BFA(25ug/ml)处理Nalm-6细胞(1×106细胞/ml)2小时。并行设置等量的DMSO对照样本。然后将细胞暴露于25ug mAb 216或对照抗体(Ab)中，用流式细胞计量仪分析。

结果：

[00223]如附图6B所示，经联合BFA和mAb 216，细胞生存力(活细胞百分数)下降，证明对细胞生存力具有协同作用。BFA对用对照抗体处理的细胞的生存力无影响。这一结果证明BFA阻止膜修复，提示新产生的溶酶体是mAb216损伤的B细胞系膜修复和后继存活基完整性所必需的。这一结果进一步确认，mAb 216产生膜损伤，细胞试图用溶酶体与细胞膜融合修补损伤。BFA抑制了附加溶酶体产生时，修复程序可能不足以维持细胞生存力。

实施例5长春新碱协同B细胞杀伤

[00224]直接抗B细胞系的细胞毒性测定中，当mAb 216与化学治疗剂联合时，特别是长春新碱，显示出增强的细胞杀伤。获自不同基因型和表现型ALL胚的三种细胞系， Nalm 6、REH和SUPB 15，单独用mAb 216或与长春新碱(VCR)联合，在37℃下孵育48小时。

[00225]如附图4和其下的表1所示，这些结果显示，单独用长春新碱处理，低浓度长春新碱(0.2ng/ml)时，未发生细胞死亡。然而，当长春新碱与mAb 216联用时，杀伤的B细胞百分比增至两倍多，证明了协同交互作用。单独及与化学治疗联合中mAb 216对B-始祖淋巴母细胞的细胞毒性，使该抗体成为进一步的儿童ALL免疫治疗研究中的一种有希望的试剂。

实施例6化学治疗剂增强mAB 216对B细胞系的细胞毒性

[00226]检验了mAb 216与单一化学治疗剂联用时的体外细胞毒性。获自不同基因型和表现型ALL胚的三种细胞系，Nalm 6、REH和SUPB 15，单用mAb 216或联用长春新碱(VCR)、柔红霉素(DNR)或L-门冬酰胺酶(ASPR)进行孵育。所有这些化学治疗剂与mAb 216联用时，导致更大程度的细胞毒性，与单用一种化学治疗剂或mAb216相比。然而，长春新碱与mAb 216的联合最为有效，与单用长春新碱或mAb 216所导致的杀伤细胞数量相比，形成了协同的细胞毒性强度。这些结果显示的在化学治疗剂存在下mAb 216细胞毒性的增强，至少部分是由于mAb 216处理造成的B细胞透化，允许不能渗透的化学治疗剂进入细胞内部。

表1.体外mAb 216联合化学治疗剂细胞毒性

细胞系/培育时间	治疗	成活细胞x10⁵	成活细胞改变％
细胞系/培育时间	治疗	成活细胞x10⁵	成活细胞改变％	Nalm 6 48hNalm 6 48hNalm 6 48hNalm 6 48h	对照mAb 216 5μg/mlVCR 0.2ng/mlmAb 216+VCR对照mAb 216 5μg/mlDNR 5ng/mlmAb 216+DNR对照mAb 216 5μg/mlVCR 2ng/mlDNR 5ng/mlmAb 216+VCRmAb 216+DNR对照mAb 2165μg/mlASPR 0.8U/mlmAb 216+ASPR	13101368.25.64.31.5117.154.50.284.3125.19.23.2	230533147813554599761572373
REH 48h	对照mAb 216 5μg/ml	8.64.6	46	Nalm 6 48hNalm 6 48hNalm 6 48hNalm 6 48h		13101368.25.64.31.5117.154.50.284.3125.19.23.2	230533147813554599761572373

REH 48hREH 48h	VCR 0.2ng/mlmAb 216+VCR对照mAb 216 5μg/mlVCR 2ng/mlDNR 5ng/mlmAb 216+VCRmAb 216+DNR对照mAb 216 5μg/mlASPR 0.8U/mlmAb 216+ASPR	4.20.4513117.74.50.94.19.63.46.22.4	86941540659368653575
REH 48hREH 48h		4.20.4513117.74.50.94.19.63.46.22.4	86941540659368653575	SUP B15 48hSUP B15 48h	对照mAb 216 5μg/mlVCR 2ng/mlDNR 4ng/mlmAb 216+VCRmAb 216+DNR对照mAb 216 5μg/mlASPR 0.8U/mlmAb 216+ASPR	5.13.62.80.441.50.385.74.332.3	2945915092244760

VCR；长春新碱，DNR：柔红霉素，ASPR：asparginase

实施例7B淋巴细胞上mAb 216受体的密度

[00227]B淋巴细胞上与mAb 216结合的表面受体的密度用标准程序确定，如下文简述。使用前B细胞系Nalm-6和人脾B淋巴细胞。简要的说，MAb 216与与异硫氰酸荧光系(FITC，分子探针，Inc.)结合，在280转和492转测定结合的纯抗体的吸光率，来确定荧光与蛋白质的比率(FTP)。用标准公式计算每分子216的FITC数。

[00228]用增加浓度的结合抗体孵育细胞，并用流式细胞仪分析标识的细胞。记录达到饱和所需的抗体的数量。荧光/蛋白质(F/P)比率，计算细胞表面受体分子：发现在细胞表面Nalm-6细胞以大约2×10⁶受体每细胞的密度表达受体，脾B细胞以大约1.34×10⁶受体每细胞的密度表达受体。这些密度与所观察到的T细胞上CD8的表达密度相似。Nalm-6细胞系细胞大约比脾B细胞大一倍半。

参考文献

1.Siiman，O and Burshteyn，A.(2000)″Cell surfacereceptor-antibody association constants and enumeration ofreceptor sites for monoclonal antibodies，″Cytometry 40(4)，316-26.2.http://www.drmr.com/abcon/FITC.html.FITC conjugation ofantibodies.

3.http://www.cyto.purdue.edu/hmarchiv/1995/0979.htm.Antigendensity.

4.http://iacf.bsd.uchicago.edu/FlowHome/Protocols/abconjugate.htm.Antibody conjugation.

实施例8用于mAb216的抗原表位与细胞骨架相连接

[00229]细胞表面受体可保持与细胞骨架结构相连接，在特异配体结合后，在通过凝集素交互连接后，或在空闲状态。受体和细胞骨架间的连接，可以通过测定未被非离子洗涤剂NP-40溶解并保持与不溶解的细胞骨架基质相连的受体的比例来进行研究。为明确B细胞的CDEVI抗原表位是否与细胞骨架相连接，用荧光和放射标记的抗体，研究结合了B细胞的不溶解细胞骨架基质的mAb 216的共同定位，如下文所述。

方法：

[00230]在4℃，用生物素标记的mAb 216、或用FITC结合的抗CD71或FITC结合的抗CD19，对Nalm-6细胞进行标记。将FITC标记的细胞洗涤2次，在含0.5％NP-40的提取缓冲液中混悬。用生物素标记的mAb 216标记的细胞，洗涤两次，然后用抗生物素蛋白-FITC染色，再次洗涤，在含0.5％NP-40的提取缓冲液中混悬。NP-40处理使细胞剥离溶于洗涤剂的膜蛋白质，留下细胞骨架基质和完整的细胞核。用FACS或荧光显微镜分析完整剥离的细胞。

[00231]直接连接放射同位素I的mAb 216，在4℃，用前B细胞系Nalm-6(1×10⁶细胞)孵育15分钟。多次洗涤后，将细胞机械匀化或用0.5％NP-40溶解膜蛋白。然后将所得原料以6000×g离心15分钟，并确定I-mAb 216在沉积物(主要由细胞核和相连接的细胞骨架组成)和上清液(主要由细胞膜损伤和细胞质组成)中的分布。结果：

[00232]由于FITC结合抗体，抗体的荧光在暴露于NP-40缓冲液后消失，钙抗体结合到与Nalm-6细胞上的抗原CD71和CD 19相连接的细胞膜上。然而，结合到B细胞配体的mAb 216的荧光强度，并不伴随洗涤剂处理而改变。

[00233]另外，发现在沉淀后，多数I-mAb 216(80-85％)与细胞核/细胞骨架部分相连接。发现几乎没有mAb 216在细胞质部分，已知大多数膜结合蛋白分馏于此。

[00234]这些数据证明抗CDIM抗体，mAb 216，连接到与B细胞的细胞骨架相连接的抗原表位上。

实施例9交联增强mAb 216的细胞毒性

[00235]用PI染色和生存力测定(活细胞百分比)评价试管内mAb216对Nalm-6细胞的细胞毒性，作为存在的mAb 216数目的一个功能。表1中显示了有和没有交联剂(次级mAb，如，抗-人lambda)时，达到Nalm-6细胞中50％和80％生存力所需的mAb 216的量，达到所指出的细胞毒性水平所需要的抗体以微毫克表达，通过PI进入细胞进行确定。

[00236]这些结果证明，细胞生存力也受到加入交联剂的影响，此处为连接到IgM的次级抗体。如下所示，交联剂的加入增强了mAb 216的细胞毒性，以至于在交联抗体的存在下，达到20％细胞死亡(80％生存力)只需要半量抗体，达到50％细胞死亡(50％生存力)仅需要60％的抗体。交联剂显示出对抗体-细胞表面受体组合物提供了附加的强度，来增强细胞损伤和/或死亡。

表1：有和没有交联情况下，mAb 216的ED50和ED80值

实施例10

交联增大mAb 216的细胞毒性，但未增加Rituxan的细胞毒性

[00237]对用mAb 216和C2B8处理的细胞进行PI染色和生存力分析(活细胞百分比)，评价mAb 216和C2B8(RITUXAN^)在试管内对OCI-Ly8细胞的细胞毒性。在37℃，在缺乏补体和效应细胞的情况下，用15μg每种抗体处理OCI-Ly8细胞(5×10⁵细胞/ml)过夜。向适当的样本(抗IgG和抗IgM)中加入次级抗体(5μg)。洗涤细胞，在含PI的染色介质中混悬，并在Facscan上分析。整个过程中将细胞保持在37℃。

结果：

[00238]附图7中显示了每种样本中的活细胞(PI阴性)。如附图7所示，未用抗体(对照)、用抗体C2B8、抗-IgG、抗-IgM和C2B8+抗IgG处理的细胞的生存力相似，表明在缺乏法补体和效应器细胞的情况下，这些处理均不导致显著的细胞毒性。没有次级抗体，用mAb216处理造成的生存力为大约65％。在次级抗体的存在下，联合使用mAb 216+抗IgM，造成的生存力仅为大约20％。

[00239]这些结果证明了mAb 216(具有通过其渗透结构的性能来交联抗原能力的)细胞毒性的显著增强，这归因于过度交联剂抗IgM的存在下所发生的附加交联。

实施例11mAb 216对脾B细胞和B细胞系的剂量依赖细胞毒性

[00240]抗体滴定入Nalm-6细胞或脾B细胞(以5×10⁵细胞每ml)的细胞混悬液，证实mAb 216对B细胞的剂量依赖细胞毒性。如附图8所示，当FITC结合的抗体增加时，用facscan检测到的荧光快速增加，直至抗体饱和了所有细胞受体位点。两种细胞类型所显示的结合曲线相似，显示出在大体相同的抗体浓度饱和。然而，细胞生存力对于mAb浓度的依赖，在两种细胞类型间显著不同。例如，在大约5μg/ml抗体，脾B细胞显示的生存力为大约65％。相反，在相同抗体浓度，Nalm-6细胞显示的生存力仅为大约42％。这一抗体量足以提供至少超过Nalm-6细胞的CDIM抗原表面总数的三成，接近脾B细胞过剩量的5成。在约为10μg/ml的抗体浓度，脾B细胞显示出的生存力为大约48％，而Nalm-6细胞显示的生存力仅为大约30％。因而，B细胞系对用CDIM结合抗体显示出比正常B淋巴细胞更强的敏感性，提示肿瘤B细胞比正常B细胞对于用mAb 216的杀伤更为敏感。

实施例12在临床试验种mAb 216在ALL患者中的功效

[00241]该项人mAb 216 I期剂量扩大研究，在患复发或难治B-前体细胞ALL的成年人中进行，来初步定义在I期研究的范围内，mAb216的抗肿瘤活性；并评价mAb 216在复发或难治ALL患者中的生物活性。患者先前已经多次用长春新碱作为多药物治疗方案进行治疗，但已经开始对用长春新碱的治疗变得顽固难治，即，长春新碱治疗对于减少白血病的爆发计数无效。

给予抗体：第0天和第7天

[00242]首次mAb216输注时，初始剂量率应当为第一个半小时25mg/小时。如果没有毒性或输注相关事件发生，剂量率可以增加(以每30分钟25mg/小时)至最大量200mg/小时，至总剂量为1.25mg/kg。

疾病评价和药物代谢动力学

[00243]在进行第二抗体输注前，治疗的早期反应应当在第7天进行。患者接受与长春新碱联合的第二剂抗体。

化学治疗

[00244]第7天，先于抗体的首次药剂#2，长春新碱以1.5mg/m²/剂IVP的剂量给予。

结果

[00245]单独用mAb 216治疗的患者显示伴随抗体输注WBC下降。患者随后用长春新碱和mAb 216联合治疗，显示更为戏剧性的WBC下降。这些数据以图表形式记载于附图9A和9B。箭头指示给予mAb216的日期，与和没有与长春新碱联用。

[00246]患者2的外周血和骨髓中有90-95％的爆发，和白血病计数增加。单独用1.25mg/kg mAb 216治疗导致WBC计数暂时下降，但到第7天，WBC计数再次升高，超过10⁵ WBC每μL。用1.25mg/kg mAb 216与长春新碱以1.5mg/m/剂IVP联合使用，导致戏剧性的WBC下降。结果见于附图9A。

[00247]患者3的外周血和骨髓中有90-98％的爆发，白血病计数为大约40,000 WBC/μL。单独用1.25mg/kg mAb 216治疗导致WBC计数暂时下降，但到第7天，WBC计数再次升高，超过10⁵ WBC每μL。用1.25mg/kg mAb 216与长春新碱以1.5mg/m²/剂IVP联合使用，再次导致戏剧性的WBC下降。结果见于附图9B。

[00248]这些数据证明化学治疗与mAb 216联用，导致了在ALL人类患者中的惊人和协同的功效。这证明了由于使用mAb 216治疗，WBC对化疗剂变得更为敏感，甚至在抗体的亚致死浓度，也能增强附加化疗剂的治疗功效。

Claims

1.导致细胞膜损伤的组合物，包括连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的多价因子，其中所述的细胞表面抗原与细胞的细胞骨架相连接。

2.权利要求1的组合物，其中多价因子是抗体。

3.权利要求2的组合物，其中抗体是IgM。

4.权利要求1的组合物，其中细胞表面抗原是B细胞表面上的CDIM抗原表位。

5.权利要求1的组合物，进一步包括提供了与多价因子交联的交联剂，多价因子连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原。

6.权利要求5的组合物，其中交联剂是抗体。

7.用于增强淋巴细胞的细胞膜损伤的组合物，包括连接到淋巴细胞上高度表达的细胞表面抗原的多价因子，进一步包括交联剂，相对于没有交联剂时多价因子的细胞膜损伤，交联剂增强了多价因子的细胞膜损伤。

8.权利要求7的组合物，其中多价因子是抗体。

9.权利要求8的组合物，其中抗体是IgM。

10.权利要求7的组合物，其中细胞表面抗原是B细胞表面上的CDIM抗原表位。

11.权利要求7的组合物，其中交联剂是抗体。

12.用于杀伤细胞的组合物，包括连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的多价因子，进一步包括提供了与多价因子交联的交联剂。

13.权利要求12的组合物，其中多价因子是VH4-34抗体。

14.权利要求12的组合物，其中交联剂是抗-kappa剂、抗-Iambda剂或抗-VH4-34抗体。

15.权利要求12的组合物，进一步包括细胞毒素剂。

16.权利要求12的组合物，其中细胞是恶性的。

17.权利要求16的组合物，其中恶性细胞与选自淋巴、卵巢、宫颈、子宫内膜、睾丸、前列腺、肾、结肠胰腺、胃、肠、食管、肺、甲状腺、肾上腺、肝、骨、皮肤、口腔或喉的身体组织的新生物相关联。

18.用于渗透细胞的组合物，包括连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的多价因子。

19.权利要求18的组合物，其中细胞是B细胞。

20.权利要求17的组合物，其中多价因子是抗体。

21.权利要求18的组合物，其中抗体是IgM。

22.权利要求18的组合物，其中细胞表面抗原CDIM抗原表位。

23.权利要求17的组合物，其中抗体是VH4-34抗体。

24.权利要求18的组合物，其中交联剂是抗-kappa剂、抗-Iambda剂或抗-VH4-34抗体。

25.造成B细胞细胞膜损伤的组合物，包括连接到B细胞表面细胞表面抗原的多价VH4-34抗体。

26.权利要求25的组合物，进一步包括与结合到B细胞表面细胞表面抗原的VH4-34抗体相交联的交联剂。

27.权利要求26的组合物，其中交联VH4-34抗体的交联剂是抗-VH4-34抗体。

28.用于治疗患有以细胞过度增生为特征病症的哺乳动物的药物组合物，所述的药物组合物包括连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的多价因子，其中所述的多价因子导致细胞膜损伤。

29.权利要求28的药物组合物，进一步包括细胞毒素剂。

30.权利要求28的药物组合物，其中过度增生细胞是过度增生的B细胞。

31.权利要求30的药物组合物，其中以B细胞过度增生为特征的病症是淋巴癌、病毒感染、免疫缺陷或自身免疫疾病。

32.权利要求31的药物组合物，其中所述的病毒感染是人免疫缺陷病毒或单核细胞增多症。

33.权利要求31的药物组合物，其中所述的免疫缺陷是移植后淋巴细胞增生症或免疫缺陷综合征。

34.权利要求29的药物组合物，其中细胞毒素剂是化疗剂、放射性同位素、细胞毒抗体、免疫交联物、配体结合物、免疫抑制剂、细胞生长调节剂和/或抑制剂、毒素或其混合。

35.权利要求28的药物组合物，进一步包括提供与多价因子交联的交联剂。

36.用于增强细胞膜损伤抗体所导致的细胞膜损伤的组合物，包括连接到高度表达的细胞表面抗原的多价抗体，和增强多价抗体的细胞毒性的交联手段，其中相对于没有交联手段时多价抗体的细胞毒性，交联手段增强了多价抗体的细胞毒性。

37.权利要求36的药物组合物，其中多价抗体是IgM。

38.权利要求36的药物组合物，其中交联手段是抗-kappa、抗-Iambda或抗-mu抗体，或与多价抗体上表达的抗原表位有特异性的抗体，该多价抗体与邻近连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的多价抗体交联。

39.用于治疗患有以细胞过度增生为特征病症的哺乳动物的药物组合物，包括连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的多价因子，其中所述的多价因子包括多个与细胞表面的细胞表面抗原结合的位点。

40.权利要求39的药物组合物，其中多个结合位点为至少5个。

41.权利要求39的药物组合物，其中多个结合位点为大约5-100个。

42.权利要求39的药物组合物，其中多个结合位点为大约15-50个。

43.用于治疗患有以细胞过度增生为特征病症的哺乳动物的方法，包括给予连接到过度增生细胞表面高度表达的细胞表面受体的多价因子，其中所述的多价因子以相对于正常细胞能优先杀伤过度增生细胞的量施用。

44.权利要求43的方法，其中哺乳动物是人。

45.权利要求44的方法，其中哺乳动物是人类以外的哺乳动物。

46.权利要求43的方法，其中过度增生细胞是癌细胞。

47.权利要求46的方法，其中过度增生细胞由生长因子、胞质分裂或病毒感染刺激进入过度增生状态。

48.权利要求43的方法，其中多价因子是细胞膜损伤抗体。

49.权利要求46的方法，其中癌细胞的活性以至少大于正常细胞活性百分之十的量降低。

50.杀伤癌细胞的方法，包括用细胞毒数量的、连接到癌细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的、并导致癌细胞细胞膜损伤的细胞膜损伤抗体接触癌细胞。

51.权利要求50的方法，其中细胞膜损伤抗体以能有效优先杀伤癌细胞，但不杀伤正常细胞的量施用。

52.权利要求50的方法，进一步包括与细胞膜损伤抗体联合给予细胞毒素剂。

53.权利要求52的方法，其中细胞毒素剂是化疗剂、放射性同位素、细胞毒抗体、免疫交联物、配体结合物、免疫抑制剂、细胞生长调节剂和/或抑制剂、毒素或其混合。

54.权利要求50的方法，进一步包括给予交联剂，交联剂提供了连接到癌细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的细胞膜损伤抗体的交联。

55.权利要求54的方法，其中交联剂是抗体。

56.权利要求50的方法，其中癌细胞是恶性B细胞。

57.权利要求50的方法，其中所述的细胞膜损伤抗体是VH4-34抗体。

58.权利要求55的方法，其中抗体是抗-VH4-34抗体。

59.造成人类患者中淋巴细胞细胞膜损伤的方法，包括用连接到淋巴细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的多价因子接触细胞。

60.权利要求59的方法，其中多价因子是抗体。

61.权利要求59的方法，其中淋巴的细胞是表达CDIM抗原表位的B细胞。

62.权利要求59的方法，其中抗体以相对于正常B细胞，能有效优先损伤过度增生B细胞的量向患者施用。

63.权利要求59的方法，其中抗体以能有效优先损伤过度增生B细胞但不能杀死过度增生B细胞的量向患者施用。

64.权利要求62的方法，其中方法包括(1)检查需要治疗的患者的血样，以确定患者血中过度增生B细胞的数量；(2)确定过度增生B细胞和正常B细胞对抗体所致损伤的敏感性，以及(3)确定对该患者，足以损伤和/或杀死其体内的过度增生B细胞的抗体的量。

65.权利要求64的方法，进一步包括给患者滴定附加量的抗体来达到所期望的损伤和/或杀死细胞的数量。

66.权利要求63的方法，其中方法包括(1)检查需要治疗的患者的血样，以确定患者血中过度增生B细胞的数量；(2)确定过度增生B细胞对抗体所致损伤的敏感性，以及(3)确定对该患者，足以优先损伤其体内的过度增生B细胞的抗体数量。

67.权利要求59的方法，进一步包括给予患者有效量的细胞毒素剂。

68.导致细胞膜损伤的方法，包括用连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的多价因子接触细胞。

69.权利要求68的方法，进一步包括用交联剂接触细胞，相对于没有交联剂时多价因子的细胞毒性，交联剂能增强多价因子的细胞毒性。

70.权利要求69的方法，其中多价因子是抗体，交联剂是结合该抗体的抗体，交联剂提供了结合到细胞表面的抗体的交联。

71.权利要求68的方法，其中细胞是B细胞，抗体是抗CDIM抗体。

72.权利要求68的方法，其中抗CDIM抗体是IgM。

73.权利要求72的方法，进一步包括连接到抗CDIM抗体的交联剂。

74.权利要求73的方法，其中连接到抗CDIM抗体的交联剂是抗-kappa或抗-Iambda抗体或抗-VH4-34抗体。

75.用于渗透细胞的方法，包括用连接到细胞表面上高度表达的细胞表面抗原的多价因子接触细胞。

76.用于治疗患有以B细胞过度增生为特征病症的人类患者的方法，包括接触用(1)细胞毒数量的具有与B细胞上的CDIM抗原表位有特异结合的抗体，和(2)交联了与B细胞上的CDIM抗原表位有特异结合的抗体的交联剂，接触所述的B细胞。

77.权利要求76的方法，进一步包括用细胞毒素剂接触所述的B细胞。

78.权利要求76的方法，其中以B细胞过度增生为特征的病症是淋巴癌、病毒感染、免疫缺陷或自身免疫疾病。

79.权利要求78的方法，其中所述的病毒感染由HIV、EBV或HPV造成。

80.权利要求78的方法，其中所述的免疫缺陷是移植后淋巴细胞增生症，或免疫缺陷综合征。

81.净化需要治疗的患者恶性B细胞骨髓的方法，包括用与B细胞表面CDIM抗原表位有特异结合的抗体接触骨髓细胞，并进一步包括用交联了与B细胞上的CDIM抗原表位有特异结合的抗体的交联剂接触B细胞，从而提供增强的针对恶性B细胞的抗CDIM抗体的细胞毒性。

82.权利要求81的方法，进一步包括用细胞毒素剂接触细胞，来进一步净化恶性B细胞骨髓。

83.用于确定哺乳动物中细胞膜损伤多价因子的剂量阈值的试剂盒，包括足量连接到高度表达的细胞表面抗原的多价因子来进行结合测定。

84.用于确定哺乳动物中细胞膜损伤抗体的剂量阈值的试剂盒，包括进行结合测定的足量连接到高度表达的细胞表面抗原的细胞损伤抗体、交联剂，或细胞毒素剂，或其组合。

85.细胞膜损伤多价因子在制备治疗患有以细胞过度增生为特征疾病或病症的哺乳动物的药物中的应用。

86.细胞膜损伤抗体在制备治疗患有以细胞过度增生为特征的疾病或病症的哺乳动物的药物中的应用。