TW202031682A - 特異性結合至cd20的單株抗體 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於生物技術且提供特異性結合至CD20的單株抗體。本發明亦關於編碼該抗體的DNA、相應表現載體及其產生方法,以及使用該抗體治療的方法。
Description
本發明係關於生物技術領域,特定言之,係關於抗CD20抗體或其抗原結合片段,以及其用於治療B細胞相關疾病的用途。更特定言之,本發明係關於特異性結合至CD20(B淋巴球抗原CD20)的單株抗體。本發明亦關於編碼該抗體或其抗原結合片段的核酸、表現載體、產生抗體的方法,及抗體用於治療B細胞(特定言之,B淋巴球抗原CD20)相關疾病或病症的用途。
淋巴球為白血球的多種類型之一;其特異性識別外來抗原且對外來抗原作出反應。淋巴球的三種主要類型為B淋巴球(B細胞)、T淋巴球(T細胞)及自然殺手(NK)細胞。B淋巴球為負責產生抗體及負責體液免疫的細胞。B細胞在骨髓內成熟且離開骨髓,從而在細胞表面上表現結合抗原的抗體。當先前未暴露的B細胞首先遇到膜結合抗體特異性針對的抗原時,細胞開始快速分裂且其後代分化成記憶B細胞及效應細胞,稱為「漿細胞」。記憶B細胞具有較長壽命期限且以與原始親本細胞相同之特異性繼續表現膜結合抗體。漿細胞不產生膜結合抗體,而是產生可分泌形式的抗體。所分泌之抗體為體液免疫之主要效應分子。
抗原CD20(亦稱為人類B淋巴球限制性分化抗原,Bp35)為位於前B淋巴球及成熟B淋巴球上的具有約35kDa分子量之疏水性跨膜蛋白(Valentine等人,生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)264(19),1989,第11282-11287頁;及Einfeld等人,歐洲分子生物學學會雜誌(EMBO J.)7(3),1988,第711-717頁)。抗原亦表現於非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphomas)(HXJI)中超過90%的B細胞表面上(Anderson等人,血液(Blood)
63(6),1984,第1424-1433頁),但在造血幹細胞、原B細胞、正常漿細胞或其他正常組織上尚未偵測到(Tedder等人,免疫學雜誌(J.Immunol.)135(2),1985,第973-979頁)。CD20似乎調控活化過程中之關於細胞週期起始及分化的早期步驟(Tedder等人,同上)且可能充當鈣離子通道(Tedder等人,細胞生物化學雜誌(J.Cell.Biochem.)14D,1990,第195頁)。
鑒於CD20在B細胞淋巴瘤中的表現,因此此抗原在該淋巴瘤治療方面可為有價值的治療目標。
抗體利妥昔單抗(Rituximab)(RITUXAN、MabThera、Acellbia)為一種經基因工程改造之針對人類抗原CD20的鼠類/人類嵌合單株抗體,被指定用於治療罹患復發性或難治性低度或濾泡性CD20陽性B細胞非霍奇金淋巴瘤的患者。利妥昔單抗為US 5,736,137及US 5,776,456中稱為「C2B8」的抗體。對活體外作用模式的研究已表明利妥昔單抗經由補體依賴性細胞毒性(CDC)結合人類補體且溶解B淋巴細胞株(Reff等人,血液(Blood)83(2),1994,第435-445頁)。另外,此抗體在抗體依賴性細胞毒性(ADCC)分析中具有顯著的活性。臨床前活體內試驗已表明利妥昔單抗可能經由補體介導及細胞介導的過程來耗竭食蟹獼猴(Macaca fascicularis)之周邊血液、淋巴結及骨髓的B細胞(Reff等人,血液(Blood)83(2),1994,第435-445頁)。
另外,後來發現抗CD20抗體(諸如利妥昔單抗)亦為治療不同自體免疫疾病(諸如類風濕性關節炎(專利RU2358762、RU2489166及RU2457860)或韋格納氏肉芽腫病(專利RU2326127))的有效治療劑。
鼠類抗體用於人類療法的主要侷限為人類抗小鼠抗體(HAMA)的形成(參見例如Miller R.A.等人,《七位T細胞淋巴瘤患者的單株抗體治療試驗(Monoclonal antibody therapeutic trials in seven patients with T-cell lymphoma)》,血液(Blood),62,1983,第988-995頁;及Schroff R.W.等人,《接受單株抗體療法之患者的人類抗鼠類免疫球蛋白反應(Human anti-murine immunoglobulin response in patients receiving monoclonal antibody therapy)》,癌症研究(Cancer Res.),45,1985,第879-885頁)。即使其中嚙齒動物抗體可變(V)域與人類恆定(C)區融合的嵌合分子,仍能夠誘發顯
著的免疫反應(HACA,人類抗嵌合抗體反應)(Neuberger等人,自然(Nature)(倫敦(London)),314,1985,第268-270頁)。
克服單株抗體在臨床用途中之此等侷限的強大方法為使鼠類抗體或來自非人類物種的抗體發生「人類化」(Jones等人,自然(倫敦),321,1986,第522-525頁;Riechman等人,自然(倫敦),332,1988,第323-327頁)。
因此,有益的是產生針對CD20抗原之治療性抗體,該等抗體在投與患者時產生最小的抗原性或不產生抗原性且主要目的為用於慢性治療。本發明解決此問題。
單株抗體BCD-132選擇性地且特異性地結合至CD20抗原且為CD20抗原的有效抑制劑;此外,本發明抗體當投與患者時具有最小的抗原性。
在一個態樣中,本發明係關於一種單株抗體或其抗原結合片段,其特異性結合至CD20且包含:
1)包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列的重鏈可變域;
2)包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。
在一些實施例中,單株抗體或其抗原結合片段包含:
1)包含SEQ ID NO:2中所示之胺基酸序列的重鏈可變域;
2)包含SEQ ID NO:4中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。
在一些實施例中,單株抗體或其抗原結合片段包含:
1)包含SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列的重鏈可變域;
2)包含SEQ ID NO:8中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。
在一些實施例中,單株抗體包含:
1)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5中所示之胺基酸序列的重鏈;
2)包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7中所示之胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施例中,單株抗體包含:
1)包含SEQ ID NO:1中所示之胺基酸序列的重鏈;
2)包含SEQ ID NO:3中所示之胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施例中,單株抗體包含:
1)包含SEQ ID NO:5中所示之胺基酸序列的重鏈;
2)包含SEQ ID NO:7中所示之胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施例中,特異性結合至CD20的單株抗體為全長IgG抗體。
在一些實施例中,單株抗體為人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4同型。
在一些實施例中,單株抗體為人類IgG1同型。
在一個態樣中,本發明係關於編碼上述抗體的核酸。
在一些實施例中,核酸包含DNA。
在一個態樣中,本發明係關於包含上述核酸的表現載體。
在一個態樣中,本發明係關於一種用於產生宿主細胞以便產生上述抗體的方法,包含用上述載體使細胞轉型。
在一個態樣中,本發明係關於一種用於產生上述抗體的宿主細胞,該宿主細胞包含上述核酸。
在一個態樣中,本發明係關於一種用於產生上述抗體的方法,包含在培養基中在足以產生該抗體的條件下培養上述宿主細胞,必要時隨後分離及純化所得抗體。
在一個態樣中,本發明係關於一種醫藥組合物,其用於治療CD20介導之疾病或病症,該醫藥組合物包含治療有效量之該抗體或其抗原結合片段與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑的組合。
在一些實施例中,醫藥組合物意欲用於治療疾病或病症,其中該疾病或病症選自:
a)腫瘤疾病或病症,或
b)自體免疫疾病或病症。
在一些實施例中,醫藥組合物意欲用於治療選自包含以下之群的腫瘤疾病或病症:B細胞淋巴瘤或白血病。
在一些實施例中,醫藥組合物意欲用於治療選自以下之B
細胞淋巴瘤:非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或霍奇金氏病(霍奇金氏淋巴瘤)。
在一些實施例中,醫藥組合物意欲用於治療選自以下之白血病:慢性淋巴球性白血病(CLL)或小淋巴球性淋巴瘤(SLL)。
在一些實施例中,醫藥組合物意欲用於治療選自包含以下之群的自體免疫疾病或病症:類風濕性關節炎、幼年型類風濕性關節炎(斯蒂爾氏病(Still's disease))、全身性紅斑性狼瘡症(SLE)、狼瘡性腎炎、潰瘍性結腸炎、韋格納氏疾病(Wegener's disease)、發炎性腸病、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自體免疫血小板減少症、多發性硬化症、牛皮癬、IgA腎病變、IgM多發性神經病變、重症肌無力、脈管炎、ANCA脈管炎、實質性器官移植排斥反應、移植物抗宿主疾病(GvHD)、糖尿病、雷諾氏症候群(Raynaud's syndrome)、休格連氏症候群(Sjorgen's syndrome)及腎絲球腎炎。
在一個態樣中,本發明係關於一種醫藥組合,其用於預防或治療CD20介導之疾病或病症,該醫藥組合包含該抗體或其抗原結合片段及至少一種治療活性化合物。
在一些實施例中,醫藥組合包含選自化學治療劑、抗體或抗激素劑的不同治療活性抗腫瘤化合物。
在一個態樣中,本發明係關於一種抑制需要此類抑制之個體中之CD20生物活性的方法,包含投與有效量的該抗體或其抗原結合片段。
在一個態樣中,本發明係關於一種治療CD20介導之疾病或病症的方法,包含向需要此類治療之個體投與治療有效量的該抗體或其抗原結合片段或該醫藥組合物。
在一些實施例中,治療疾病或病症的方法係指選自以下的疾病或病症:
a)腫瘤疾病或病症,或
b)自體免疫疾病或病症。
在一些實施例中,治療疾病或病症的方法係針對選擇包含以下之群的腫瘤疾病或病症:B細胞淋巴瘤或白血病。
在一些實施例中,治療疾病或病症的方法係針對選自以下的
B細胞淋巴瘤:非霍奇金淋巴瘤(NHL)或霍奇金氏病(霍奇金氏淋巴瘤)。
在一些實施例中,治療疾病或病症的方法係針對選自以下的白血病:慢性淋巴球性白血病(CLL)或小淋巴球性淋巴瘤(SLL)。
在一些實施例中,治療疾病或病症的方法係針對選自包含以下之群的自體免疫疾病或病症:類風濕性關節炎、幼年型類風濕性關節炎(斯蒂爾氏病)、全身性紅斑性狼瘡症(SLE)、狼瘡性腎炎、潰瘍性結腸炎、韋格納氏疾病、發炎性腸病、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自體免疫血小板減少症、多發性硬化症、牛皮癬、IgA腎病變、IgM多發性神經病變、重症肌無力、脈管炎、ANCA脈管炎、實質性器官移植排斥反應、移植物抗宿主疾病(GvHD)、糖尿病、雷諾氏症候群、休格連氏症候群及腎絲球腎炎。
在一個態樣中,本發明係關於該抗體或其抗原結合片段或該醫藥組合物用於治療需要CD20介導之疾病或病症之此類治療之個體的用途。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段係用於治療疾病或病症,其中該疾病或病症選自:
a)腫瘤疾病或病症,或
b)自體免疫疾病或病症。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段係用於治療選自包含以下之群的腫瘤疾病或病症:B細胞淋巴瘤或白血病。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段係用於治療選自以下的B細胞淋巴瘤:非霍奇金淋巴瘤(NHL)或霍奇金氏病(霍奇金氏淋巴瘤)。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段係用於治療選自以下的白血病:慢性淋巴球性白血病(CLL)或小淋巴球性淋巴瘤(SLL)。
在一些實施例中,該抗體或其抗原結合片段係用於治療選自包含以下之群的自體免疫疾病或病症:類風濕性關節炎、幼年型類風濕性關節炎(斯蒂爾氏病)、全身性紅斑性狼瘡症(SLE)、狼瘡性腎炎、潰瘍性結腸炎、韋格納氏疾病、發炎性腸病、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓
性血小板減少性紫癜(TTP)、自體免疫血小板減少症、多發性硬化症、牛皮癬、IgA腎病變、IgM多發性神經病變、重症肌無力、脈管炎、ANCA脈管炎、實質性器官移植排斥反應、移植物抗宿主疾病(GvHD)、糖尿病、雷諾氏症候群、休格連氏症候群及腎絲球腎炎。
圖1.表現載體pEE CK之圖譜。
圖2.表現載體pEE HC之圖譜。
圖3. IgG1形式的示意圖。
圖4.人類初始組合文庫的合成流程。
圖5.用於選殖Fab噬菌體呈現文庫之噬菌質體的圖譜。
圖6.用於培養Fab之表現質體pLL的圖譜。
圖7.在Forte Bio Octet RED 386上分析BCD132L候選物-生物素化CD20肽相互作用。
圖8.在Forte Bio Octet RED 386上分析BCD132L-026候選物-生物素化CD20肽相互作用。
圖9.在Forte Bio Octet RED 386上分析BCD132L-028候選物-生物素化CD20肽相互作用。
圖10.在Forte Bio Octet RED 386上分析BCD132L-075候選物-生物素化CD20肽相互作用。
圖11.在Forte Bio Octet RED 386上分析BCD132L-077候選物-生物素化CD20肽相互作用。
圖12.在Forte Bio Octet RED 386上分析BCD132L-028候選物-生物素化CD20肽相互作用。
圖13.在Forte Bio Octet RED 386上分析BCD132L-077(1,2)候選物-生物素化CD20肽相互作用。
圖14.在Forte Bio Octet RED 386上分析BCD132L-077(3,4)候選物-生物素化CD20肽相互作用。
圖15.在Forte Bio Octet RED 386上分析BCD132L-077(5,6)候選物-生
物素化CD20肽相互作用。
圖16.在Forte Bio Octet RED 386上分析BCD132L-028候選物-FcγRIIIa-158F相互作用。
圖17.在Forte Bio Octet RED 386上分析BCD132L-077(1,2)候選物-FcγRIIIa-158F相互作用。
圖18.在Forte Bio Octet RED 386上分析BCD132L-077(3,4)候選物-FcγRIIIa-158F相互作用。
圖19.在Forte Bio Octet RED 386上分析BCD132L-077(5,6)候選物-FcγRIIIa-158F相互作用。
圖20.在Forte Bio Octet RED 386上分析BCD132L-028候選物-FcγRIIIa-158V相互作用。
圖21.在Forte Bio Octet RED 386上分析BCD132L-077(1,2)候選物-FcγRIIIa-158V相互作用。
圖22.在Forte Bio Octet RED 386上分析BCD132L-077(3,4)候選物-FcγRIIIa-158V相互作用。
圖23.在Forte Bio Octet RED 386上分析BCD132L-077(5,6)候選物-FcγRIIIa-158V相互作用。
圖24.表現載體pSX之圖譜。
圖25.利用流式細胞術量測BCD-132-L-028及BCD 132-L-077相較於MabThera對WIL2-S細胞株上之CD20受體的特異性結合。
圖26.量測BCD-132-L-028及BCD-132-L-077相較於MabThera的補體依賴性細胞毒性。
BCD-132-L-028
●MabThera■BCD-132-L-028▼BCD-132-L-077.
圖27.量測BCD-132-L-028及BCD-132-L-077相較於MabThera的補體依賴性細胞毒性。
BCD-132-L-077
●MabThera■BCD-132-L-028▼BCD-132-L-077.
圖28.量測BCD-132-L-028及BCD-132-L-077相較於MabThera的抗體
依賴性細胞毒性。低親和性CD16報導體細胞株:目標WIL2-S細胞株。
BCD-132-L-028
●MabThera■BCD-132-L-028▼BCD-132-L-077.
圖29.量測BCD-132-L-028及BCD-132-L-077相較於MabThera的抗體依賴性細胞毒性。低親和性CD16報導體細胞株:目標WIL2-S細胞株。
BCD-132-L-077
●MabThera■BCD-132-L-028▼BCD-132-L-077.
圖30.量測BCD-132-L-028及BCD-132-L-077相較於MabThera的抗體依賴性細胞毒性。低親和性CD16報導體細胞株:目標WIL2-S細胞株。
BCD-132-L-028
●MabThera■BCD-132-L-028▼BCD-132-L-077.
圖31.量測BCD-132-L-028及BCD-132-L-077相較於MabThera的抗體依賴性細胞毒性。低親和性CD16報導體細胞株:目標WIL2-S細胞株。
BCD-132-L-077
●MabThera■BCD-132-L-028▼BCD-132-L-077.
圖32.量測抗體BCD-132-L-028及BCD-132-L-077誘導之CD19+對具有FF(A)、FV(B)及VV(C)異型之健康供者之全血的B細胞耗竭。
圖33.相對於市售抗體利妥昔單抗,量測BCD-132-L-028及BCD-132-L-077的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
圖34.發炎反應嚴重度(BCD132-L-077)。
圖35.脫髓鞘嚴重度(BCD132-L-077)。
圖36.在以22.0mg/kg、44.0mg/kg、88.0mg/kg劑量反覆靜脈內投與BCD132-L-077產品下,靈長類動物血清的平滑化濃度曲線。
定義及通用方法
除非另外定義,否則本文所用之所有技術及科學術語均具有如一般技術者通常理解相同之含義。
此外,除非上下文另外需要,否則單數術語應包括複數個且複數術語應包括單數個。典型地,細胞培養、分子生物學、免疫學、微生
物學、遺傳學、分析化學、有機合成化學、醫學及醫藥化學的分類及方法以及本文所述之蛋白質及核酸的雜交及化學性質已為熟習此項技術者熟知且廣泛使用。根據製造商說明書,如此項技術所常見或如本文所述來執行酶反應及純化方法。
與抗體有關的定義
CD20或B淋巴球抗原CD20為B淋巴球表面上所發現的一種蛋白質共受體。CD20為人類MS4A1基因產物。此蛋白質的確切功能仍然未知,然而預期該蛋白質在B淋巴球活化及增殖方面起作用。
MS4A1基因為由至少25種其他基因組成之MS4A(跨膜4A)基因家族的一員。此家族的基因叢集於人類染色體基因座11q12-13。預期相應蛋白質具有類似的空間結構:其具有四跨膜拓樸結構,該拓樸結構具有N端及C端細胞質域(JANAS E.ET ALL.,脂質筏在CD20活性中的功能作用?(Functional role of lipid rafts in CD20 activity?),生物化學學會研討會(Biochem Soc Symp.)2005;(72):165-75)。
此基因的擴增及/或其蛋白質的過度表現已在多種癌症或自體免疫疾病中觀測到,包括:
a)選自包含以下之群的腫瘤疾病或病症:非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金氏疾病(霍奇金氏淋巴瘤)、慢性淋巴球性白血病(CLL)或小淋巴球性淋巴瘤(SLL)。
b)選自包含以下之群的自體免疫疾病或病症:類風濕性關節炎、幼年型類風濕性關節炎(斯蒂爾氏病)、全身性紅斑性狼瘡症(SLE)、狼瘡性腎炎、潰瘍性結腸炎、韋格納氏疾病、發炎性腸病、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自體免疫血小板減少症、多發性硬化症、牛皮癬、IgA腎病變、IgM多發性神經病變、重症肌無力、脈管炎、ANCA脈管炎、實質性器官移植排斥反應、移植物抗宿主疾病(GvHD)、糖尿病、雷諾氏症候群、休格連氏症候群及腎絲球腎炎。
術語「結合分子」包括抗體及免疫球蛋白。
如本文所用,術語「抗體」或「免疫球蛋白」(Ig)包括完整抗體及任何抗原結合片段(亦即,「抗原結合部分」)或單一鏈。術語「抗體」
是指包含經二硫鍵互連之至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈的醣蛋白,或抗原結合部分。各重鏈包含重鏈可變區(在本文中簡稱VH)及重鏈恆定區。哺乳動物Ig重鏈已知有五種類型,用希臘字母表示:α、δ、ε、γ及μ。存在的重鏈類型限定抗體類別;此等鏈分別在IgA、IgD、IgE、IgG及IgM抗體中發現。不同重鏈的尺寸及組成不同;α及γ含有約450個胺基酸,而μ及ε具有約550個胺基酸。每條重鏈具有兩個區域:恆定區及可變區。相同同型之所有抗體中的恆定區一致,但不同同型之抗體中的恆定區不同。重鏈γ、α及δ具有由三個恆定域CH1、CH2及CH3構成(線性)的恆定區,及柔性增加的鉸鏈區(Woof J.,Burton D.,自然免疫學評論(Nat Rev Immunol)4,2004,cc.89-99);重鏈μ及ε具有由四個恆定域CH1、CH2、CH3及CH4構成的恆定區。在哺乳動物中,輕鏈已知僅有兩種類型,表示為:lambda(λ)及kappa(κ)。每條輕鏈由輕鏈可變區(在本文中簡稱VL)及輕鏈恆定區組成。輕鏈之大致長度為211至217個胺基酸。輕鏈較佳為kappa(κ)輕鏈,且恆定域CL較佳為C kappa(κ)。
根據本發明的「抗體」可屬於任何類別(例如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM,優選IgG),或子類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2,優選IgG1)。
VL及VH區可進一步再分成高變區,稱為互補決定區(CDR),其間散置有更保守的區域,稱為構架區(FR)。每個VH及VL由三個CDR及四個FR構成,自氨基端至羧基端依以下次序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。抗體恆定區可介導免疫球蛋白結合至宿主組織或因子,包括免疫系統之多種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q)。
如本文所用,術語抗體的「抗原結合部分」或「抗原結合片段」(或簡稱為「抗體部分」或「抗體片段」)係指抗體的一或多個片段,該等片段保持特異性結合至抗原之能力。已證明抗體的抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。術語抗體之「抗原結合部分」內所包括的結合片段實例包括(i)Fab片段單價片段,其由VL、VH、CL及CH 1域組成;(ii)F(ab')2片段,一種二價片段,其包含在鉸鏈區經二硫橋鍵連接的兩個Fab片段;(iii)
Fd片段,其由VH及CH1域組成;(iv)Fv片段,其由抗體單臂之VL及VH域組成;(v)dAb片段(Ward等人,(1989)自然341:544-546),其由VH/VHH域組成;及(vi)經提取的互補決定區(CDR)。另外,Fv片段的兩個區域VL及VH係由單獨的基因編碼,該兩個區域可以利用重組方法、使用合成連接子連接,該連接子能夠使其收納成單一蛋白質鏈,其中VL及VH區域成對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv);參見例如Bird等人(1988)科學242:423-426;及Huston等人(1988)美國國家科學院院刊85:5879-5883)。假設術語抗體的「抗原結合部分」亦包括此類單鏈分子。此等抗體片段係利用熟習此項技術者已知之習知技術獲得,且篩選片段的方式與完整抗體相同。
較佳地,本發明的抗原結合部分或完整抗體之抗原結合部分的CDR來源於小鼠、羊駝或人類供者文庫,或基本上具有人類起源,但其中某些胺基酸殘基發生變化,例如經不同胺基酸殘基取代以便最佳化特定抗體的特性,例如KD、koff、IC50、EC50、ED50。較佳地,本發明抗體的構架區具有人類起源或基本上具有人類起源(人類起源的至少80、85、90、95、96、97、98或99%)。
在其他實施例中,本發明的抗原結合部分可以來源於其他非人類物種,包括(但不限於)小鼠、羊駝、兔、大鼠或倉鼠。或者,抗原結合區可來源於人類物種。
術語「可變域」係指可變域之某些部分的序列在抗體間大不相同的事實。V域介導抗原結合且決定每種特定抗體對其特定抗原之特異性。然而,可變性不均勻分佈於可變域之110個胺基酸跨度內。實情為,V區由具有15-30個胺基酸之稱為構架區(FR)的恆定片段組成,該等片段被稱為「高變區」或CDR之較短極端可變區分隔。原生重鏈及輕鏈之可變域各自包含基本上採取β薄片組態的四個FR,該等FR經由三個高變區連接,該等高變區形成的環連接β薄片結構且在一些情況下形成β薄片結構的一部分。各鏈中之高變區藉由FR緊密結合在一起,且與另一鏈之高變區一起促成抗體之抗原結合位點形成。恆定域不直接涉及抗體對抗原的結合,但展現各種效應功能,諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
如本文所用,術語「高變區」係指抗體中之負責抗原結合的胺基酸殘基。高變區通常包含來自「互補決定區」或「CDR」的胺基酸殘基及/或來自「高變環」的彼等殘基。
在某些情況下,為了改良針對目標抗原決定基的結合親和力,可能亦需要改變一或多個CDR胺基酸殘基。此稱為「親和力成熟」且視需要可以結合人類化來執行,例如如下情形:其中抗體人類化導致結合特異性或親和性減少且單獨的回復突變不能充分改良結合特異性或親和性。此項技術中已知多種親和力成熟方法,例如Burks等人,美國國家科學院院刊94:412-417(1997)所述之活體外掃描飽和誘變方法,及Wu等人,美國國家科學院院刊95:6037 6042(1998)之逐步活體外親和力成熟方法。
「構架區」(FR)為除CDR殘基之外的彼等可變域殘基。每個可變域典型地具有四個FR,標識為FR1、FR2、FR3及FR4。若CDR根據Kabat定義,則輕鏈FR殘基大約位於殘基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)及98-107(LCFR4)且重鏈FR殘基大約位於重鏈中的殘基1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)及103-113(HCFR4)。若CDR包含來自高變環的胺基酸殘基,則輕鏈FR殘基大約位於輕鏈中的殘基1-25(LCFR1)、33-49(LCFR2)、53-90(LCFR3)及97-107(LCFR4)且重鏈FR殘基大約位於重鏈殘基中的殘基1-25(HCFR1)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)及102-113(HCFR4)。在一些情況下,當CDR包含來自如根據Kabat定義之CDR的胺基酸與高變環的胺基酸時,相應地調整FR殘基。舉例而言,當CDRH1包括胺基酸H26-H35時,重鏈FR1殘基位於位置1-25且FR2殘基位於位置36-49。
免疫球蛋白的片段可結晶區域(「Fc區、Fc」)為免疫球蛋白分子中之與細胞表面Fc受體相互作用的「尾」區域,以及補體系統中的一些蛋白質。此特性讓抗體活化免疫系統。在IgG、IgA及IgD抗體同型中,Fc區係由分別來自兩條重鏈之第二及第三恆定域的兩個一致蛋白質片段構成;在IgM及IgE同型中,Fc區在每條多肽鏈中含有三個重鏈恆定域(CH域2-4)。
結合「目標抗原」之本發明抗體係指一種抗體,其能夠以足
夠親和力結合抗原,使得該抗體可用作靶向表現該抗原之蛋白質或細胞的診斷劑及/或治療劑,且該抗體與其他蛋白質發生的交叉反應微弱。根據分析方法:螢光活化細胞分選(FACS)、放射免疫分析(RIA)或ELISA,在此類實施例中,抗體對非目標蛋白質結合的程度小於抗體對特定目標蛋白結合的10%。就抗體對目標分子的結合而言,術語「特異性結合」或「特異性結合至」或「特異性針對」特定多肽或特定多肽目標上的抗原決定基意謂結合明顯地(可量測地)不同於非特異性相互作用(例如,在bH1-44或bH1-81的情況下,非特異性相互作用為結合至牛血清白蛋白、酪蛋白、胎牛血清或中性鏈親和素)。
特異性結合可例如相較於對照分子之結合藉由測定分子之結合來量測。舉例而言,特異性結合可以依據與類似於目標(例如過量的未標記目標)之對照分子的競爭來測定。在此情況下,若過量的未標記目標競爭性地抑制經標記之目標結合至探針,則表示特異性結合。如本文所用,術語「特異性結合」或「特異性結合至」或「特異性針對」特定多肽或特定多肽目標上的抗原決定基可以描述為分子對目標的Kd為至少約200nM,或至少約150nM,或至少約100nM,或至少約60nM,或至少約50nM,或至少約40nM,或至少約30nM,或至少約20nM,或至少約10nM,或至少約8nM,或至少約6nM,或至少約4nM,或至少約2nM,或至少約1nM,或更大。在一個實施例中,術語「特異性結合」係指其中分子結合至特定多肽或特定多肽上之抗原決定基而基本上不結合至任何其他多肽或多肽抗原決定基的結合。
如本文所用,術語「Ka」係指特定抗體-抗原相互作用的結合(on)速率。
如本文所用,術語「Kd」係指特定抗體-抗原相互作用的解離(off)速率。
「結合親和力」通常係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間非共價相互作用力的總和。除非另外指明,否則「結合親和力」係指固有(特徵性,真實)的結合親和力,其反映結合對成員(例如抗體與抗原)之間的1:1相互作用。分子X對其結合搭配物Y的親和
力通常可用解離常數(Kd)表示。較佳Kd值為約200nM、150nM、100nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、1nM或更小。可藉由此項技術中已知之常見方法(包括本文所述之方法)量測親和力。低親和力抗體通常緩慢地結合抗原且傾向於容易解離,而高親和力抗體通常較快地結合抗原且傾向於較長時間保持結合狀態。此項技術中已知多種量測結合親和力的方法,其中任一者可用於本發明之目的。
在一個實施例中,利用表面電漿子共振分析,使用BIAcoreTM-2000或BIAcore®-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.),在25℃下,使用約10個反應單位(RU)的固著式抗原CM5晶片量測「Kd」或「Kd值」。簡言之,根據製造商說明書,用N-乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧甲基化聚葡萄糖生物感測晶片(CM5,BIAcore Inc.)。抗原用10mM乙酸鈉(pH 4.8)稀釋成5μg/ml(約0.2μM)且接著以5微升/分鐘的流量注射,以使偶合之蛋白質達成約10個反應單位(RU)。投與抗原之後,投與1M乙醇胺溶液以阻斷未反應的基團。為了進行動力學量測,在25℃下,以約25μl/min的流量注射Fab於含0.05% Tween 20之PBS(PBST)中之兩倍連續稀釋液(0.78nM至500nM)。利用簡單的一比一朗格繆爾結合模型(Langmuir binding model)(BIAcore評估軟體3.2版),藉由同時擬合結合與解離感測器圖譜來計算結合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(Kd)係依比率koff/kon計算。參見例如Chen,Y.等人,(1999)分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)293:865-881。若藉由上述表面電漿子共振分析得到之結合速率超過106M-1 s-1,則結合速率可使用螢光淬滅技術測定,該技術量測PBS(pH 7.2)中之20nM抗抗原抗體(Fab形式)溶液在25℃、在濃度遞增之抗原存在下之螢光發射強度的增加或減少(激發=295nm;發射=340nm,16nm帶通),如用光譜儀(諸如具有攪拌式比色管之止流裝備型光譜光度計(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco光譜光度計(ThermoSpectronic))所量測。
術語「koff」係指結合分子與抗原之間之特定相互作用的解離速率常數。解離速率常數koff可使用生物層干涉量測術(例如使用OctetTM系統)量測。
根據本發明之「結合速率」或「kon」亦可藉由利用上述表面電漿子共振分析、使用BIAcoreTM-2000或BIAcore®-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)、在25℃下、使用約10個相對單位(反應單位,RU)的固著式抗原CM5晶片量測。簡言之,根據製造商說明書,用N-乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧甲基化聚葡萄糖生物感測晶片(CM5,BIAcore Inc.)。抗原用10mM乙酸鈉(pH 4.8)稀釋成5μg/ml(約0.2μM)且接著以5微升/分鐘的流量注射,以使偶合之蛋白質達成約10個反應單位(RU)。投與抗原之後,投與1M乙醇胺溶液以阻斷未反應的基團。
除非另有說明,否則術語「生物活性的」及「生物活性」及「生物特性」相對於本發明之多肽意謂具有結合至生物分子的能力。
術語「生物分子」係指核酸、蛋白質、碳水化合物、脂質及其組合。在一個實施例中,生物分子存在於自然界中。
可利用習知技術(諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗體),由完整抗體製備抗體片段,諸如Fab和F(ab')2片段。此外,抗體、其一部分及免疫黏附分子可利用標準重組DNA技術(例如如本文所述)製備。
術語「重組抗體」意指一種抗體,其表現於包含編碼抗體之核苷酸序列的細胞或細胞株中,其中該(等)核苷酸序列天然地與該細胞不相關。
如本文所用,術語「變異抗體」意指一種抗體,其胺基酸序列相較於親本抗體序列因一或多個胺基酸殘基的添加、缺失及/或取代而不同於「親本」抗體之胺基酸序列。在一較佳實施例中,相較於親本抗體,變異抗體包含至少一或多個(例如一至十二個,例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或九個、十個、十一個或十二個;在一些實施例中,變異抗體包含一至十個)胺基酸添加、缺失及/或取代。在一些實施例中,此類添加、缺失及/或取代係在變異抗體之CDR中產生。就變異抗體序列而言的一致性或同源性在本文中定義為在比對序列且必要時引入空位以達成序列一致性最大百分比之後,變異抗體序列中之與親本抗體殘基一致之胺基酸殘基的百分比。變異抗體保持結合至親本抗體所結合之相同抗原且較佳
保持結合至親本抗體所結合之抗原決定基的能力;且在一些實施例中,至少一種特性或生物活性優於親本抗體之特性或生物活性。舉例而言,相較於親本抗體,變異抗體可具有例如較強的結合親和力、較長半衰期、較低IC50,或增強抑制抗原生物活性之能力。本文中備受關注的變異抗體為相較於親本抗體,生物活性呈現至少2倍(較佳至少5倍、10倍或20倍)增強的變異抗體。
術語「雙特異性抗體」係指一種具有抗原結合域的抗體,該(等)抗原結合域能夠特異性結合至單一生物分子上的兩個不同抗原決定基或能夠特異性結合至兩種不同生物分子上的抗原決定基。雙特異性抗體在本文中亦稱為具有「雙重特異性」或「雙重特異性」抗體。
在廣義上,術語「嵌合抗體」意指一種抗體,其包含一種抗體之一或多個區域及一種或若干種其他抗體(典型地為部分人類及部分非人類抗體)之一或多個區域,亦即,部分來源於非人類動物,諸如小鼠、大鼠或其類似害獸動物,或駱駝科,諸如大羊駝及羊駝。為了降低人類抗抗體免疫反應(例如在鼠類抗體的情況下,為人類抗小鼠抗體免疫反應)的風險,嵌合抗體通常優於非人類抗體。典型的嵌合抗體實例係其中可變區序列為鼠類序列、而恆定區序列為人類序列的嵌合抗體。在嵌合抗體的情況下,可以使非人類部分經歷進一步的變異以便使抗體發生人類化。
術語「人類化」意指如下事實:當抗體具有完全或部分的非人類起源(例如藉由所關注抗原使小鼠或大羊駝免疫而分別獲得的小鼠或大羊駝抗體)時,或為基於小鼠或大羊駝之此類抗體的嵌合抗體時,可以取代某些胺基酸,特定言之,取代重鏈及輕鏈之構架區及恆定域中的某些胺基酸,以便避免或最小化人體中的免疫反應。抗體主要經由位於六個重鏈及輕鏈CDR中的胺基酸殘基與目標抗原相互作用。出於此原因,CDR內部之胺基酸序列在個別抗體之間的可變性遠大於CDR外部之胺基酸序列。由於CDR序列負責大部分抗體-抗原相互作用,因此可以表現模擬天然存在之特異性抗體或更一般而言具有該胺基酸序列之任何特異性抗體之特性的重組抗體,例如藉由構築表現來自特異性抗體之CDR序列及來自不同抗體之構架序列的表現載體來表現重組抗體。因此,可以使非人類抗體「人類化」
且在很大程度上保持初始抗體的結合特異性及親和性。儘管不能精確地預測免疫原性且藉此預測特定抗體之人類抗抗體反應,但非人類抗體的免疫原性典型地大於人類抗體。外來(例如害獸或駱駝科)恆定區已經人源序列取代之嵌合抗體展示的免疫原性通常小於完全外源之彼等物的免疫原性,且治療性抗體傾向於人類化或全人類抗體。因此,嵌合抗體或非人源之其他抗體可以發生人類化以降低人類抗抗體反應之風險。
對於嵌合抗體而言,人類化典型地涉及修飾可變區序列之構架區。作為互補決定區(CDR)之一部分的胺基酸殘基最通常因人類化而不加以修飾,然而在一些情況下可能需要修飾CDR之個別胺基酸殘基,例如以便使糖基化位點、脫醯胺位點、天冬胺酸異構化位點或非所需半胱胺酸或甲硫胺酸殘基缺失。在三肽序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr(其中X可為除Pro之外的任何胺基酸)中,藉由使寡醣鏈連接至天冬醯胺殘基而產生N連接型糖基化。移除N糖基化位點可藉由使Asn或Ser/Thr殘基突變成不同殘基,較佳藉助於保守性取代來達成。天冬醯胺及麩醯胺酸殘基之脫醯胺可視諸如pH及表面曝露之因素而進行。天冬醯胺殘基尤其容易發生脫醯胺,主要存在於序列Asn-Gly中,及以更低程度存在於諸如Asn-Ala之其他二肽序列中。若CDR序列包含此類脫醯胺位點,特定言之,Asn-Gly,則可能需要移除此位點,典型地藉助於保守性取代使所牽涉殘基之一缺失。
此項技術中已知使抗體序列發生人類化的許多方法。一種常用方法為CDR移植。CDR移植可以基於Kabat之CDR定義,然而最新版本(Magdelaine-Beuzelin等人,腫瘤學/血液病評論(Crit Rev.Oncol Hematol.)64:210 225(2007))提出IMGT®(國際免疫遺傳學資訊系統®,www.imgt.org)定義可以改良人類化結果(參見Lefranc等人,發展與比較免疫學(Dev.Comp Immunol.)27:55-77(2003))。在一些情況下,相較於CDR所得自之親本抗體,CDR移植可以減少CDR移植之非人類抗體的結合特異性及親和性,且從而減少其生物活性。為了恢復親本抗體的結合特異性及親和性,可以在CDR移植抗體的所選位置,典型地在構架區中引入回復突變(有時稱為「構架區修復」)。可能的回復突變位置可使用文獻及抗體資料庫中可利用的資訊鑑別。作為回復突變候選殘基的胺基酸殘基典型地為位於抗體分子表面
的彼等殘基,而內埋或表面暴露程度低的殘基通常不改變。CDR移植及回復突變之替代人類化技術為表面再塑,其中保留表面不暴露之非人源殘基,而表面殘基改變為人類殘基。
完全人類抗體可以利用兩種技術產生:利用活體外收集的噬菌體文庫或活體內免疫接種人類化動物(小鼠、大鼠等)。
組合型噬菌體抗體文庫的構築始於選擇基因譜系來源,此視可以區分的若干種抗體文庫類型而定:初始、免疫及合成。初始及免疫文庫分別使用天然重組的基因構築,該等基因編碼健康供者或免疫接種特定抗原之供者的免疫球蛋白可變域。出於此目的,自產生抗體的淋巴細胞株中分離出mRNA。主要使用周邊血液淋巴球,但亦已使用脾細胞[Sheets MD,Amersdorfer P,Finnern R,Sargent P,Lindquist E,Schier R等人,大型非免疫噬菌體抗體文庫的有效構築:產生針對蛋白質抗原的高親和性人類單鏈抗體(Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library:the production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens.),美國國家科學院院刊1998,95:6157-6162及de Haard HJ,van Neer N,Reurs A,Hufton SE,Roovers RC,Henderikx P等人,容許對高親和性抗體進行快速分離及動力學分析的大型非免疫人類Fab片段噬菌體文庫(A large non-immunized human Fab fragment phage library that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodies.),生物化學雜誌(J Biol Chem)1999,274:18218-18230.]、扁桃體細胞或骨髓淋巴球[Vaughan TJ,Williams AJ,Pritchard K,Osbourn JK,Pope AR,Earnshaw JC等人,自大型非免疫噬菌體呈現文庫分離出之具有次奈莫耳濃度親和力的人類抗體(Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library.),自然生物技術(Nat Biotechnol)1996,14:309-314.]。接著基於mRNA合成cDNA,且可以使用寡dT引子與以統計方式設計的六核苷酸產生編碼抗體可變域之所有可能基因變異體的cDNA複本[Ulitin AB,Kapralova MV,Laman AG,Shepelyakovskaya AO,Bulgakova EB,Fursova KK等人,呈噬菌體呈現形式之人類小型抗體的文庫:設計及測試DAN:Izd-vo「Nauka」(The library of human miniantibodies in the phage display format:
Designing and testing DAN:Izd-vo "Nauka");2005.]。
現在cDNA層面上,可以同時使用一個或若干個引子將所擴增基因的範圍限制於一種或若干種可變域基因家族或抗體同型[Marks JD,Hoogenboom HR,Bonnert TP,McCafferty J,Griffiths AD,Winter G.繞過免疫接種:噬菌體上所呈現之V基因文庫的人類抗體(Bypassing immunization.Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage.),分子生物學雜誌(J Mol Biol)1991,222:581-597]。用於擴增編碼免疫球蛋白之基因的引子與其最保守的區域互補。其序列選自組織成資料庫(諸如Kabat或V BASE資料庫)的基因集合。引子設計亦提供內部限制位點供PCR產物選殖入適當載體中。
合成文庫的構築係基於隨機序列集對天然CDR的置換。在此情況下,可產生大量的抗原結合位點。
噬菌體呈現係搜尋抗體用之最強大且使用最廣泛的活體外技術之一。1985年,Smith發現外來DNA序列可以選殖入絲狀細菌噬菌體M13中且此類經選殖的序列可以融合蛋白形式表現於噬菌體顆粒表面上(史密斯GP:絲狀融合噬菌體:病毒粒子表面上呈現所選殖抗原的新穎表現載體(Smith GP:Filamentous fusion phage:novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.),科學(Science)1985,228:1315-1317.)。因此,可基於結合其他蛋白質的能力來選擇所關注的融合蛋白。將此發現與PCR擴增方法組合,使得選殖免疫球蛋白基因之cDNA譜系以產生含有可變域之多種噬菌體文庫成為可能,該等可變域可以用於快速地搜尋目標特異性單株抗體。噬菌體文庫譜系反映血液用於產生文庫之每個人或動物的B細胞抗體譜系。1995年,兩篇論文報導基因工程化小鼠的產生,該等小鼠表現的完全人類抗體譜系可能類似於藉由融合瘤技術產生的彼等小鼠(Lonberg N,Taylor LD,Harding FA,Trounstine M,Higgins KM,Schramm SR,Kuo CC,Mashayekh R,Wymore K,McCabe JG等人:得自小鼠的抗原特異性人類抗體包含四種不同基因修飾(Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications.),自然(Nature)1994,368:856-859)。在此等動物中,其自身內源免疫球蛋白重鏈及k輕鏈基因被
有意破壞,隨後引入轉殖基因,該等轉殖基因為人類重鏈及k輕鏈基因區段。結果表明小鼠免疫系統可以利用人類基因譜系產生針對更多種抗原之高特異性及高親和力抗體。儘管事實在於轉殖基因小鼠表現的B細胞受體實質上為小鼠與人類組分(人類免疫球蛋白、小鼠Igα、Igβ,及其他信號傳導分子)之雜合體,但其B細胞正常發育且成熟。
術語「單株抗體」或「mAb」係指由單獨純系細胞群合成及分離的抗體。純系群體可為永生化細胞純系群體。在一些實施例中,純系群體中之永生化細胞為雜合體細胞:融合瘤,其典型地由來自免疫動物之個別B淋巴球與來自淋巴球腫瘤之個別細胞融合而產生。融合瘤為一種構築細胞類型且不存在於自然界中。
「原生抗體」通常為約150000道爾頓之雜四聚體醣蛋白,其由一致的兩條輕(L)鏈及一致的兩條重(H)鏈構成。每條輕鏈藉由一個共價二硫鍵連接至重鏈,而在不同免疫球蛋白同型之重鏈中,二硫鍵數目不同。每條重鏈及輕鏈亦具有有規律地間隔之鏈內二硫橋鍵。每條重鏈的一端具有可變域(VH),繼之為多個恆定域。每條輕鏈在一端具有可變域(VL)且在其另一端具有恆定域。輕鏈恆定域與重鏈之第一恆定域對準,且輕鏈可變域與重鏈可變域對準。咸信特定胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。
本說明書中用於描述多種抗體之術語「分離」係指一種抗體已得以鑑別且自表現該抗體的細胞或細胞培養物中分離及/或再生。來自其天然環境之雜質(污染物組分)為會干擾抗體之診斷或治療用途的物質,且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中,抗體經純化至(1)足以使用旋轉杯式測序儀(Edman測序儀)獲得N端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度,或(2)在非還原性或還原條件下藉由SDS-PAGE、使用考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)或較佳銀染色劑得到的均質性。經分離之抗體包括原位存在於重組細胞內之抗體,因為抗體之天然環境中的至少一種組分將不存在。經分離之多肽典型地藉由至少一個純化步驟製備。
「經分離」之核酸分子為一種核酸分子,其得以鑑別且與至
少一種核酸分子雜質分離,前者結合至抗體核酸之天然來源。分離之核酸分子不同於其在天然條件下被發現的形式或集合。因此,分離之核酸分子與天然條件下存在於細胞中的核酸分子不同。然而,分離之核酸分子包括位於正常表現抗體之細胞中的核酸分子,例如當該核酸分子的染色體位置不同於天然條件下其在細胞中的位置時。
如本文所用,術語「抗原決定基」意指抗原的一部分(決定子),其特異性結合至結合分子(例如抗體或相關分子,諸如雙特異性結合分子)。抗原決定基決定子通常由表面上具化學活性之各類分子(諸如胺基酸或碳水化合物或糖側鏈)組成且典型地包含特定的三維結構特徵以及特定的電荷特徵。抗原決定基可呈「線性」或「構形」。在線性抗原決定基中,蛋白質(例如抗原)與相互作用分子(諸如抗體)之間的所有相互作用點沿著蛋白質之初始胺基酸序列呈線性存在。在構形抗原決定基中,相互作用點存在於初始胺基酸序列中彼此分隔的蛋白質胺基酸殘基中。抗原之所需抗原決定基一經確定,即可使用此項技術中熟知之技術產生針對彼抗原決定基之抗體。另外,抗體或其他結合分子的產生及表徵可以闡明關於所需抗原決定基的資訊。根據此資訊,接著可以競爭方式篩選出結合至相同或一致抗原決定基的抗體,例如進行競爭研究以找到彼此競爭結合至抗原的結合分子。
如本文所用,術語「肽連接子」意指有能力組合結構域的任何肽,其長度視其彼此結合的結構域而定且包含任何胺基酸序列。較佳地,肽連接子具有超過5個胺基酸的長度且由選自G、A、S、P、E、T、D、K之胺基酸的任何集合組成。
術語「活體外」係指位於身體外部、處於人工條件下的生物實體、生物過程或生物反應。舉例而言,活體外生長之細胞應理解為在身體外部之環境中(例如在試管、培養瓶或微量滴定盤中)生長之細胞。
如本文所用,術語「IC50」(抑制性濃度50%)係指藥物濃度,在此濃度下,細胞(諸如腫瘤細胞)之可量測活性或反應(例如生長/增殖)被抑制50%。IC50值可利用適當的劑量反應曲線、使用專門的用於曲線擬合之統計學軟體計算。
術語「IC50」(50%抑制性濃度或半最大抑制性濃度)係指藥
物濃度且表示將生物過程抑制50%所需的抑制劑體積。IC50值可利用適當的劑量反應曲線、使用專門的用於曲線擬合之統計學軟體計算。
術語GI50(生長抑制50%)係指藥物濃度,在此濃度下,細胞(諸如腫瘤細胞)增殖被抑制50%。
術語「ED50」(EC50)(50%有效劑量/濃度)係指產生50%生物效應(可以包括細胞毒性)的藥物濃度。
術語「抗增殖活性」意指停止或抑制細胞(諸如癌細胞)生長。
術語抗體「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區(原生Fc區序列或Fc區胺基酸變異體)的生物活性,其隨抗體同型而變。抗體效應功能之實例包括:C1q結合及補體依賴性細胞毒性;Fc受體結合;抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC);吞噬作用;細胞表面受體(例如B細胞受體BCR)下調;及B細胞活化。
「抗體依賴性細胞毒性」或「ADCC」係指細胞介導的反應,其中表現Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性球及巨噬細胞)識別目標細胞上所結合的抗體且隨後引起目標細胞溶解或吞噬。介導ADCC的初級細胞NK細胞僅表現FcγRIII,而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上的FcR表現概述於Ravetch及Kinet,免疫學年鑒(Annu.Rev.Immunol)9:457-92(1991)第464頁的表3中。為了評估所關注分子之ADCC活性,可以進行活體外ADCC分析,諸如美國專利第5,500,362號或5,821,337號中所述之分析。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。替代地或另外,可以評估所關注分子在活體內(例如在動物模型中,諸如Clynes等人,PNAS(USA)95:652-656(1998)中所揭示的動物模型)的ADCC活性。
「人類效應細胞」為表現一或多種FcR且執行效應功能之白血球。較佳地,該等細胞至少表現FcγRIII且執行ADCC效應功能。介導ADCC之人類白血球實例包括周邊血液單核細胞(PBMC)、自然殺手(NK)細胞、單核球、細胞毒性T細胞及嗜中性球;其中PBMC及NK細胞較佳。效應細胞可以自其原生來源分離,例如自血液或PBMC分離,如本文所述。
術語「Fc受體」或「FcR」用於描述結合至抗體之Fc區的
受體。較佳FcR為原生序列人類FcR。另外,較佳FcR為結合IgG抗體的FcR(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體,包括此等受體之對偶基因變異體及交替剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」),兩者具有相似的胺基酸序列,不同之處主要在於其細胞質域。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基元(ITIM)(參見Daëron,免疫學年鑒(Annu.Rev.Immunol.)15:203-234(1997)中的評述)。FcR評述於Ravetch及Kinet,免疫學年鑒9:457-92(1991)中。在本文中,術語「FcR」涵蓋其他FcR,包括將來鑑別之FcR。該術語亦包括負責母親IgG轉移至胎兒的新生兒受體FcRn。
「補體依賴性細胞毒性」及「CDC」係指分子在補體存在下溶解目標之能力。補體活化路徑始於補體系統之第一組分(C1q)結合至與同源抗原複合的分子(例如抗體)。為評估補體活化,可進行CDC分析,例如如Gazzano-Santoro等人,免疫學方法雜誌(J.Immunol.Methods)202:163(1996)中所述。
術語「一致性」或「同源性」理解為意謂在比對序列且必要時引入空位以達成整個序列之最大一致性百分比之後,且不考慮任何保守取代作為序列一致性的一部分,候選序列中之與所比較之對應序列之殘基一致的胺基酸殘基之百分比。N端或C端延伸與插入皆不理解為減少一致性或同源性。用於比對之方法及電腦程式為此項技術中所熟知。序列一致性可以使用序列分析軟體(例如序列分析套裝軟體(Sequence Analysis Software Package),遺傳學電腦基團(Genetics Computer Group),威斯康辛州大學生物技術中心(University of Wisconsin Biotechnology Center),1710University Ave.,Madison,WI 53705)來量測。此軟體藉由向不同取代、缺失(消除)及其他修飾賦予同源度而使相似序列匹配。
關於抗體之多肽序列的術語「同源」應理解為抗體相對於多肽序列展現至少70%、較佳80%、更佳90%且最佳95%序列一致性。關於核酸序列的術語應理解為核苷酸序列相對於核酸序列展現至少85%、較佳90%、更佳95%且最佳97%序列一致性。
提供本文所述之抗體之胺基酸序列的修飾。舉例而言,可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物特性。抗體的胺基酸序列變異體係藉由將適當核苷酸變化引入抗體核酸中或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如抗體胺基酸序列內的殘基缺失及/或插入及/或取代。進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體,其限制條件為該最終構築體具有所需特徵。胺基酸變化亦可改變抗體之轉譯後過程,諸如改變糖基化位點之數目或位置。
使用胺基酸取代修飾抗體胺基酸序列的變異體。此類變異體為抗體分子中的至少一個胺基酸殘基被不同殘基取代。最受關注之取代誘變位點包括高變區或CDR,但亦涵蓋FR或Fc變異。保守取代展示於表A中的「較佳取代」。若此類取代引起生物活性變化,則可以產生其他實質性變化,標示為表A中所示之「例示性取代」,或下文更詳細描述之變化(當描述胺基酸類別時),且亦可執行產物篩選。
本說明書中可互換使用的術語「核酸」、「核序列」、「核酸序列」、「聚核苷酸」、「寡核苷酸」、「聚核苷酸序列」及「核苷酸序列」意謂確切的核苷酸序列,其經修飾或未經修飾、確定核酸之片段或區域、含有或不含有非天然核苷酸,且為雙股DNA或RNA、單股DNA或RNA,或該DNA之轉錄產物。
在此亦應包括本發明與天然染色體環境(亦即,天然狀態)中的核苷酸序列無關。本發明序列已經分離及/或經純化,亦即,其直接地或間接地被取樣,例如藉由複本,其環境已至少部分地經修飾。因此,在此亦應提及藉由重組遺傳學(例如藉由宿主細胞)獲得或藉由化學合成獲得的經分離之核酸。
除非另外說明,否則提及核苷酸序列涵蓋其補體。因此,提及具有特定序列的核酸應理解為涵蓋其互補股與其互補序列的核酸。
術語「控制序列」係指在特定宿主生物體中表現可操作地連接之編碼序列所需之DNA序列。適用於原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況存在之操縱序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號及增強子。
核酸當與另一種核酸序列依功能關係定位時為「可操作地連接」。舉例而言,若前序列或分泌性前導序列之DNA作為參與多肽分泌之前蛋白表現,則其可操作地連接至多肽之DNA;若啟動子或增強子影響編碼序列轉錄,則其可操作地連接至該序列;若核糖體結合位點經定位以便促進轉譯,則其可操作地連接至編碼序列。一般而言,「可操作地連接」意謂所連接之DNA序列為鄰接的且在分泌性前導序列之情況下,為鄰接的且處於閱讀階段。然而,增強子不必為鄰接的。
如本文所用,術語「載體」意謂一種核酸分子,其能夠輸送已與其連接的另一核酸。在一些實施例中,載體為質體,亦即,其他DNA區段可以接入其中之DNA的環狀雙股片。在一些實施例中,載體為病毒載體,其中病毒基因組中可接入其他DNA區段。在一些實施例中,載體能夠在其所引入之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。在其他實施例中,載體(例如非游離型哺乳動物載體)
可在引入宿主細胞之後,整合至宿主細胞之基因組中,且藉此與宿主基因一起複製。此外,某些載體能夠導引與其可操作地連接的基因之表現。此類載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡稱「表現載體」)。
如本文所用,術語「重組宿主細胞」(或簡稱「宿主細胞」)意指重組表現載體已引入其中的細胞。本發明係關於宿主細胞,其可包括例如上文所述之根據本發明之載體。本發明亦關於宿主細胞,其包含例如編碼本發明結合分子之第一結合域及/或第二結合域之重鏈或其抗原結合部分的核苷酸序列、編碼輕鏈或其抗原結合部分的核苷酸序列,或兩者。應瞭解「重組宿主細胞」及「宿主細胞」不僅意指特定的個體細胞,而且亦指此類細胞的後代。由於修飾因突變或環境影響而可以發生於後代,因此此類後代實際上可與親本細胞不相同,然而此類細胞仍包括於如本文所用的術語「宿主細胞」範疇內。
術語「賦形劑」在本文中用於描述除本發明化合物之外的任何成分。
術語「CD20介導之疾病或病症」係指與CD20直接或間接相關的任何疾病或病症,包括疾病或病症的病源學、發展、進展、持久性或病理學。「治療(Treat)」、「治療(treating)」及「療法(treatment)」係指一種減緩或消除生物學病症及/或其至少一種伴隨症狀的方法。如本文所用,「緩解」疾病、病症或病狀意謂減少疾病、病症或病狀之症狀的嚴重度及/或發生頻率。另外,本文中提及「療法」包括提及治癒性、姑息性及預防性療法。
在一個態樣中,治療的個體或患者為哺乳動物,較佳為人類個體。該個體可為任何年齡的雄性或雌性。
術語「病症」意謂將受益於本發明化合物治療之任何病狀。此意謂慢性及急性病症或疾病,包括使哺乳動物易患所討論之病症的彼等病理學病狀。
術語「癌症」及「癌變」係指生理學病狀或描述哺乳動物之生理學病狀,其典型地以不受調控之細胞生長/增殖為特徵。該定義涵蓋良性與惡性癌變疾病。癌變實例包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉
瘤及白血病。此類癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀癌瘤、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(胃腸癌)、胰臟癌、神經膠母細胞瘤、神經膠質瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎臟癌或腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、黑色素瘤,及各種頭頸癌。
術語「免疫反應」、「自體免疫反應」及「自體免疫發炎」係指例如淋巴球、抗原呈現細胞、吞噬細胞、顆粒球及由該等細胞或肝細胞產生之可溶性巨分子(包括作為侵入性病原體、感染病原體之細胞或組織、癌細胞或在自體免疫或病理性發炎之情況下來自人體之正常細胞或組織之選擇性損傷、摧毀或消除的結果而產生的抗體、細胞介素及補體)的作用。
術語「免疫反應」、「自體免疫反應」及「自體免疫發炎」係指例如淋巴球、抗原呈現細胞、吞噬細胞、顆粒球及由該等細胞或肝細胞產生之可溶性巨分子(包括作為侵入性病原體、感染病原體之細胞或組織、癌細胞或在自體免疫或病理性發炎之情況下來自人體之正常細胞或組織之選擇性損傷、摧毀或消除的結果而產生的抗體、細胞介素及補體)的作用。
如本文所用,術語「自體抗體」係指針對自身抗原的抗體。自身抗原包括(但不限於)核酸(例如雙股DNA或RNA、單股DNA或RNA,或其組合)、核蛋白質(例如SS-A(Ro)、SS-B(La)、Scl-70、著絲點、Jo-1、組胺醯基-tRNA合成酶、蘇胺醯基-tRNA合成酶、PM-1、Mi-2、組蛋白及染色體)、細胞受體(例如乙醯膽鹼受體、甲狀腺刺激性激素受體)、細胞蛋白質(例如心磷脂、β2GP1)、細胞膜蛋白質(例如水通道蛋白、橋粒黏蛋白)、RNA蛋白質複合物(例如RNP及Sm)、紅血球及血小板受體醣蛋白。
如本文所用,術語「自體免疫疾病」係指由個體之自身(自)抗原及/或組織產生且針對其的非惡性疾病或病症。
術語涵蓋(但不限於)類風濕性關節炎、幼年型慢性關節炎、敗血性關節炎、萊姆骨關節炎(Lyme osteoarthritis)、牛皮癬性關節炎、反應性關節炎、脊椎關節病、全身性紅斑狼瘡、克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、發炎性腸病、糖尿病、甲狀腺炎、哮喘、過敏性疾病、牛皮
癬、異位性皮膚炎、硬皮病、反應性「移植物抗宿主」、器官移植排斥、與器官移植相關的急性或慢性免疫疾病、類肉瘤病、川崎病(Kawasaki disease)、格雷夫斯疾病(Graves disease)、腎病症候群、慢性疲勞症候群、韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)、亨諾-許蘭紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、顯微鏡下腎脈管炎、慢性活躍性肝炎、葡萄膜炎、敗血性休克、毒性休克症候群、敗血症症候群、惡病質、後天免疫缺乏症候群、急性橫貫性脊髓炎、亨廷頓氏舞蹈症(Huntington's chorea)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、中風、原發性膽汁性肝硬化、溶血性貧血、成人(急性)呼吸窘迫症候群、禿髮症、斑禿、血清反應陰性關節病、關節病、萊特爾氏疾病(Reiter's disease)、與潰瘍性結腸炎關節病相關的牛皮癬性關節病、異位性過敏、自體免疫大皰性疾病、尋常天疱瘡、片狀天疱瘡、類天疱瘡疾病、線性IgA、IgG相關疾病、自體免疫溶血性貧血、庫姆斯陽性溶血性貧血(Coombs-positive hemolytic anemia)、惡性貧血、幼年型惡性貧血、顱腦巨動脈炎、關節炎、原發性硬化性A型肝炎、隱原性自體免疫性肝炎、纖維化肺病、隱原性纖維化肺泡炎、發炎後間質性肺病、間質肺炎、慢性嗜伊紅血球肺炎、感染後間質性肺病、痛風性關節炎、自體免疫性肝炎、I型自體免疫性肝炎(經典自體免疫性肝炎或類狼瘡)、II型自體免疫性肝炎、骨關節炎、原發性硬化性膽管炎、牛皮癬、特發性白血球減少症、自體免疫嗜中性球減少症、腎NOS病、腎絲球腎炎、顯微鏡下腎脈管炎、盤狀紅斑狼瘡、特發性或NOS男性不孕症[精子自體免疫]、多發性硬化症(所有亞型)、交感神經眼炎、結締組織疾病繼發之肺高血壓、古巴士德氏症候群(Goodpasture syndrome)、結節性多關節炎(polyarthritis nodosa)之肺臨床表現、急性風濕熱、類風濕性脊椎炎、僵直性脊椎炎、斯蒂爾氏病(Still's disease)、全身硬皮病、局部硬皮病、休格連氏症候群(Sjögren syndrome)、休格連氏疾病、白塞氏病(Behcet's disease)、僵直性脊椎炎、椎關節炎、中軸型起止點炎、復發性多軟骨炎、高安氏疾病(Takayasu's disease)、自體免疫血小板減少症、特發性血小板減少症、自體免疫甲狀腺疾病、自體免疫胃炎、多腺自體免疫症候群、甲狀腺高能症、橋本氏疾病(Hashimoto's disease)、自體免疫萎縮性甲狀腺低能
症、原發黏液腺瘤、晶狀體源性葡萄膜炎、原發脈管炎、白斑病、急性肝病、慢性肝病、過敏、哮喘、精神病症(包括抑鬱及精神分裂症)、Th2型/Th1型介導的疾病、結膜炎、過敏性接觸性皮炎、過敏性鼻炎、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌肉萎縮性側索硬化、貧血、囊腫性纖維化、與細胞介素療法相關的病症、脫髓鞘疾病、皮炎、虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經炎、局部缺血再灌注損傷、缺血性中風、幼年型類風濕性關節炎、自體免疫腸病、自體免疫聽覺損失、自體免疫淋巴增生症候群、自體免疫心肌炎、自體免疫心肌病、柯沙奇心肌炎(Coxsackie myocarditis)、戴斯勒氏症候群(Dressler's syndrome)、狼瘡性腎炎、血管性水腫(包括遺傳性血管性水腫)、蕁麻疹、化膿性汗腺炎、扁平苔癬、苔癬硬化症、苔蘚樣糠疹、白斑病、艾迪森氏病(Addison's disease)、自體免疫多內分泌症候群、自體免疫胰臟炎、乳糜瀉、顯微鏡下結腸炎、抗磷脂症候群、自體免疫淋巴增生症候群、冷凝集素病、原發性冷凝球蛋白血症、伊凡氏症候群(Evans syndrome)、惡性貧血、紅血球發育不全、CREST症候群、嗜伊紅血球筋膜炎、費爾蒂症候群(Felty syndrome)、重疊症候群、慢性萊姆病、帕瑞-隆伯格症候群(Parry-Romberg syndrome)、陣發性風濕症、風濕病、急性風濕熱、腹膜後症候群、類肉瘤病、施尼茲症候群(Schnitzler's syndrome)、未分化結締組織疾病、皮肌炎、多發性肌炎、肌肉纖維疼痛、重症肌無力、神經肌強直、急性播散性腦脊髓炎、格利-巴瑞症候群(Guillain-Barrésyndrome)、德維克氏疾病(Devic's disease)、橋本腦病變、蘭伯特-伊頓重肌無力症候群(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)、嗜伊紅血球肉芽腫伴多血管炎白血球破裂性脈管炎、狼瘡脈管炎、類風濕性脈管炎、結節性多囊炎(polyangitis nodosa)、自體免疫卵巢早衰及瞼炎。抗體亦可治療上述病症之任何組合。
「治療有效量」意指將在一定程度上緩解經治療之病症之一或多種症狀的治療劑投與量。
術語「慢性」使用係指與急性(短暫)投藥途徑相反的持續(不間斷)使用藥劑,以便長時期維持初始治療效果(活性)。
「間歇」使用係指並非不斷地進行而不中斷的治療,而是改呈定期性質。
如本文所用,詞語「包含(comprise)」、「具有(have)」、「包括(include)」或其變化形式,諸如「包含(comprises)」、「包含(comprising)」、「具有(has)」、「具有(having)」、「包括(includes)」或「包括(including)」及其所有文法變化形式應理解為意指包括陳述的整數或整數組,但不排除任何其他整數或整數組。
本發明的揭示內容
抗體
本發明係關於特異性結合至CD20的單株抗體。
在一個態樣中,本發明係關於一種單株抗體或其抗原結合片段,其特異性結合至CD20且包含:
1)重鏈可變域,其包含胺基酸序列
或
2)輕鏈可變域,其包含胺基酸序列
或
在一些實施例中,單株抗體或其抗原結合片段包含:1)重鏈可變域,其包含胺基酸序列
2)輕鏈可變域,其包含胺基酸序列
在一些實施例中,單株抗體或其抗原結合片段包含:
1)重鏈可變域,其包含胺基酸序列
2)輕鏈可變域,其包含胺基酸序列
在一些實施例中,單株抗體包含:
1)重鏈,其包含胺基酸序列
或
2)輕鏈,其包含胺基酸序列
在一些實施例中,特異性結合至CD20的單株抗體為BCD132-077。
單株抗體BCD132-077包含:
1)重鏈,其包含胺基酸序列
2)輕鏈,其包含胺基酸序列
在一些實施例中,特異性結合至CD20的單株抗體為BCD132-L-028。
單株抗體BCD132-L-028包含:
1)重鏈,其包含胺基酸序列
2)輕鏈,其包含胺基酸序列
在一些實施例中,特異性結合至CD20的單株抗體為全長IgG抗體。
在一些實施例中,單株抗體為人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4同型。
在一些實施例中,單株抗體為人類IgG1同型。
核酸分子
本發明亦關於核酸分子,特定言之,如本文所述的編碼根據本發明之特異性結合至CD20之單株抗體的序列,視情況包括與其連接的任何肽連接子序列。
除非另外說明,否則提及核苷酸序列涵蓋其補體。因此,提及具有特定序列的核酸應理解為涵蓋其互補股與其互補序列的核酸。如本文所用,術語「聚核苷酸」意謂具有至少10個鹼基長度之核苷酸或核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或任一核苷酸類型之修飾形式的聚合形式。術語包括單股及雙股形式。
在一個態樣中,本發明係關於一種核酸分子,其包含編碼選自SEQ ID NO:1-8之胺基酸序列的核苷酸序列。核酸分子亦可包含該等核苷酸序列之任何組合。
在一個態樣中,本發明係關於一種核酸分子,其包含編碼單株抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列,該單株抗體或其抗原結合片段特異性結合至CD20且包含:
1)包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列的重鏈可變域;
2)包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。
在一些實施例中,核酸分子包含編碼單株抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列,該單株抗體或其抗原結合片段包含:
1)包含SEQ ID NO:2中所示之胺基酸序列的重鏈可變域;
2)包含SEQ ID NO:4中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。
在一些實施例中,核酸分子包含編碼單株抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列,該單株抗體或其抗原結合片段包含:
1)包含SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列的重鏈可變域;
2)包含SEQ ID NO:8中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。
在一些實施例中,核酸分子包含編碼單株抗體的核苷酸序列,該單株抗體包含:
1)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5中所示之胺基酸序列的重鏈;
2)包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7中所示之胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施例中,核酸分子包含編碼單株抗體的核苷酸序列,該單株抗體包含:
1)包含SEQ ID NO:1中所示之胺基酸序列的重鏈;
2)包含SEQ ID NO:3中所示之胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施例中,核酸分子包含編碼單株抗體的核苷酸序列,該單株抗體包含:
1)包含SEQ ID NO:5中所示之胺基酸序列的重鏈;
2)包含SEQ ID NO:7中所示之胺基酸序列的輕鏈。
在任一個上述實施例中,核酸分子可經分離。
本發明的核酸分子可自產生特異性結合至CD20之單株抗體的任何來源中分離。在某些實施例中,可以合成而非分離本發明的核酸分子。
在一個實施例中,編碼VH(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6)或VL(SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8)域的核酸分子藉助於分別插入已編碼重鏈恆定(CH)或輕鏈恆定(CL)域之表現載體中、沿著整個長度轉型為抗體基因,使得VH區段可操作地連接至載體內的CH區段,且/或VL區段可操作地連接至載體內的CL區段。在另一個實施例中,藉助於利用標準分
子生物學技術使編碼VH及/或VL域的核酸分子與編碼CH及/或CL域的核酸分子連接(例如接合)而使編碼VH及/或VL域的核酸分子沿著抗體的整個長度轉型為基因。沿著整個長度編碼重鏈及/或輕鏈的核酸分子接著可以自其已引入其中的細胞表現。
該核酸分子可以用於表現大量特異性結合至CD20的重組單株抗體。
載體
在另一態樣中,本發明係關於一種適於表現本文所述之任一種核苷酸序列的載體。
本發明係關於包含核酸分子的載體,該等核酸分子編碼特異性結合至CD20之單株抗體的任一種胺基酸序列或其一部分(例如第一結合域的重鏈序列及/或第二結合域的重鏈及/或輕鏈序列),如本文所述。本發明進一步提供包含編碼融合蛋白、經修飾之抗體、抗體片段之核酸分子的載體。
在一些實施例中,根據本發明的特異性結合至CD20之單株抗體係藉由將如上文所述獲得的部分或完整編碼第一或第二結合域序列(例如輕鏈及重鏈序列,其中結合域包含輕鏈及重鏈序列)之DNA插入表現載體中來表現,使得基因可操作地連接至必需的表現控制序列,諸如轉錄及轉譯控制序列。表現載體包括質體、逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒(AAV)、植物病毒(諸如花椰菜花葉病毒、菸草嵌紋病毒)、黏質體、YAC、EBV源游離基因體及其類似物。DNA分子可以接合至載體中,使得載體內的轉錄及轉譯控制序列提供其調控DNA轉錄及轉譯的預定功能。可以選擇與所用表現宿主細胞相容的表現載體及表現控制序列。可以將部分地或完整地編碼第一與第二結合域序列(例如重鏈及輕鏈序列,其中結合域包含重鏈及輕鏈序列)的DNA分子引入個別載體中。在一個實施例中,該等DNA分子的任何組合係引入同一表現載體中。DNA分子可以藉由標準方法(例如若不存在限制位點,則為抗體基因片段與載體上之互補限制位點的接合,或鈍端接合)引入表現載體中。
適合載體為編碼功能完全人類CH或CL免疫球蛋白序列的載體,其中適當的限制位點工程化使得VH或VL序列可容易地插入且表現,如上文所述。此類載體中的HC及LC編碼基因可以含有內含子序列,該等內含子序列藉由使相應mRNA穩定而引起抗體蛋白質總產量增加。內含子序列側接剪接供體及剪接受體位點,其決定RNA剪接將在何處發生。使用多個內含子時,內含子序列的位置可位於抗體鏈的可變區或恆定區中,或位於可變區與恆定區中。聚腺苷酸化及轉錄終止可以發生於編碼區下游的原生染色體位點。重組表現載體亦可編碼促進抗體鏈自宿主細胞分泌的信號肽。可以將抗體鏈基因選殖入載體中,使得信號肽與免疫球蛋白鏈的胺基端同框連接。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(亦即,來自非免疫球蛋白之信號肽)。
除了抗體鏈基因之外,本發明的重組表現載體可以運載調控序列,該等調控序列控制抗體鏈基因在宿主細胞中的表現。熟習此項技術者應瞭解,表現載體的設計,包括調控序列的選擇,可以視以下因素而定:諸如待轉型之宿主細胞的選擇、所需蛋白質之表現量等。哺乳動物中之表現型宿主細胞的較佳控制序列包括確保蛋白質在哺乳動物細胞中之高表現量的病毒元件,諸如來源於以下的啟動子及/或增強子:逆轉錄病毒LTR、細胞巨大病毒(CMV)(諸如CMV啟動子/增強子)、猿猴病毒40(SV40)(諸如SV40啟動子/增強子)、腺病毒(例如主要晚期啟動子腺病毒(AdMLP))、多瘤病毒及強哺乳動物啟動子,諸如原生免疫球蛋白啟動子或肌動蛋白啟動子。關於病毒控制元件及其序列的進一步描述,參見例如美國專利第5,168,062號、第4,510,245號及第4,968,615號。此項技術中已知用於表現結合分子(諸如植物中的抗體)的方法,包括啟動子及載體的描述,以及植物轉型。參見例如美國專利第6,517,529號。此項技術中亦熟知用於在細菌細胞或真菌細胞(例如酵母細胞)中表現多肽的方法。
除抗體鏈基因及調控序列之外,本發明的重組表現載體可以運載其他序列,諸如調控載體在宿主細胞中複製的序列(例如複製起點)及可選標記物基因。可選標記物基因促進其中已引入載體之宿主細胞的選擇(參見例如美國專利第4,399,216號、第4,634,665號及第5,179,017號)。舉例
而言,典型地,可選標記物基因賦予其中已引入載體之宿主細胞針對藥劑(諸如G418、潮黴素或甲胺喋呤)的抗性。舉例而言,可選標記物基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(在甲胺喋呤選擇/擴增期間,用於dhfr-宿主細胞中)、neo基因(用於G418選擇),及麩胺酸合成酶基因。
如本文所用,術語「表現控制序列」意指實現與其接合之編碼序列之表現及加工所需的聚核苷酸序列。表現控制序列包括適當轉錄起始、終止、啟動子及增強子序列;有效RNA加工信號,諸如剪接及聚腺苷酸化信號;使細胞質mRNA穩定之序列;增大轉譯效率之序列(亦即,Kozak共同序列);增強蛋白質穩定性之序列;及必要時,增強蛋白質分泌之序列。此類控制序列之性質視宿主生物體而不同;在原核生物中,此類控制序列通常包括核糖體結合位點之啟動子,及轉錄終止序列;在真核生物中,此類控制序列典型地包括啟動子及轉錄終止序列。術語「控制序列」意欲包括其存在為表現及加工所必需的至少所有組分,且亦可包括其存在有利的其他組分,例如前導序列及融合搭配物序列。
宿主細胞
本發明之另一態樣係關於產生根據本發明之特異性結合至CD20之單株抗體的方法。本發明的一個實施例係指一種產生特異性結合至CD20之如本文所定義之單株抗體的方法,其包含:產生能夠表現特異性結合至CD20之單株抗體的重組宿主細胞;在適於表現/產生特異性結合至CD20之單株抗體的條件下培養該宿主細胞;及分離出特異性結合至CD20的所得單株抗體。藉由此類重組宿主細胞中之此類表現而產生的特異性結合至CD20之單株抗體在本文中稱為「特異性結合至CD20的重組單株抗體」。本發明亦關於來自此類宿主細胞之細胞子代,及以類似方式產生之特異性結合至CD20的單株抗體。
編碼根據本發明之特異性結合至CD20之單株抗體的核酸分子及包含此等核酸分子的載體可用於轉染適合哺乳動物或其細胞、植物或其細胞、細菌或酵母宿主細胞。轉型可藉由用於將聚核苷酸引入宿主細胞中之任何已知技術達成。用於將異源聚核苷酸投與哺乳動物細胞之方法
為此項技術中熟知,且包括聚葡萄糖介導之轉染、陽離子聚合物-核酸複合物轉染、磷酸鈣沈澱、凝聚胺介導之轉染、原生質體融合、將聚核苷酸囊封於脂質體中及將DNA直接顯微注射至核內。另外,核酸分子可藉由病毒載體引入哺乳動物細胞中。細胞轉染方法在此項技術中已熟知。參見例如美國專利第4,399,216號、第4,912,040號、第4,740,461號及第4,959,455號。植物細胞轉型方法在此項技術中已熟知,包括例如農桿菌介導的轉型、基因槍轉型、直接注射、電穿孔及病毒轉型。細菌及酵母細胞的轉型方法在此項技術中亦熟知。
用作轉型宿主的哺乳動物細胞株在此項技術中已熟知且包括可獲得的複數種永生化細胞株。此等細胞株包括例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0細胞、SP2細胞、HEK-293T細胞、FreeStyle 293細胞(Invitrogen)、NIH-3T3細胞、海拉細胞(HeLa cells)、幼倉鼠腎(BHK)細胞、非洲綠猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如Hep G2)、A549細胞及多種其他細胞株。藉由確定哪種細胞株具有高表現量且提供所產生蛋白質之必需特徵來選擇細胞株。可使用的其他細胞株為昆蟲細胞株,諸如Sf9或Sf21細胞。當將編碼特異性結合至CD20之單株抗體的重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時,藉由將宿主細胞培養足以允許抗體在宿主細胞中表現之時間段或更佳地使抗體分泌至宿主細胞生長於其中之培養基內來產生抗體。特異性結合至CD20的單株抗體可以利用標準蛋白質純化技術、自培養基中復原。植物宿主細胞包括例如菸草、芥菜、浮萍、玉米、小麥、馬鈴薯等。細菌宿主細胞包括埃希氏桿菌屬(Escherichia)及鏈黴菌屬菌種。酵母宿主細胞包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及甲醇酵母(Pichia pastoris)。
另外,可以利用多種已知技術增強生產型細胞株產生根據本發明之特異性結合至CD20之單株抗體的水準。舉例而言,麩醯胺酸合成酶基因表現系統(GS系統)為用於在某些條件下增強表現之常用方法。GS系統完整或部分地論述於EP第0216846號、第0256055、第0323997號及第0338841號中。
特異性結合至由不同細胞株或轉殖基因動物表現之CD20
的單株抗體可能具有彼此不同的糖基化分佈。然而,特異性結合至由本文所述之核酸分子編碼之CD20或包含本文所提供之胺基酸序列的單株抗體為本發明的一部分,不論結合分子的糖基化且一般而言,不論轉譯後修飾的存在或不存在。
抗體製備
本發明亦關於產生特異性結合至CD20之單株抗體及其抗原結合片段的方法及製程。
單株抗體
單株抗體可以利用首次由Kohler等人,《自然(Nature)》256,1975,第495頁描述的融合瘤方法製備,或可以利用重組DNA方法(US 4816567)製備。
在融合瘤方法中,根據上述方法使小鼠或其他適當宿主動物(諸如倉鼠)免疫誘使淋巴球產生或能夠產生將特異性結合至免疫接種用之蛋白質的抗體。根據另一個實施例,可以藉由活體外免疫接種來產生淋巴球。免疫接種之後,利用適合的融合劑(諸如聚乙二醇)使淋巴球與骨髓瘤細胞株融合,以產生融合瘤細胞。
以上述方式產生的融合瘤細胞可以在適合的培養基中培養,該培養基較佳含有一或多種抑制未融合親本骨髓瘤細胞生長或存活的物質。舉例而言,若親本骨髓瘤細胞缺乏酵素次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT),則用於融合瘤之培養基典型地將包括次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷(HAT培養基),亦即,阻止缺乏HGPRT之細胞生長的物質。
用作骨髓瘤細胞融合組分的較佳細胞為有效融合、支持所選產抗體細胞高水準穩定產生抗體且對選擇未融合親本細胞之培養基敏感的彼等細胞。較佳骨髓瘤細胞株為鼠類骨髓瘤細胞株,諸如來源於以下之彼等細胞株:獲自Salk研究所細胞分配中心(美國加利福尼亞州聖地亞哥(San Diego,California,USA))的MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤,及獲自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection)(美國馬里蘭州羅克維爾
(Rockville,Maryland,USA))的SP-2或X63-Ag8-653細胞。亦已描述用於產生單株抗體的人類骨髓瘤及小鼠-人類雜骨髓瘤細胞株(Kozbor,《免疫學雜誌(J.Immunol.)》,133,1984,第3001頁)。
較佳地,融合瘤細胞所產生之單株抗體的結合特異性係藉由免疫沈澱或藉由活體外結合分析(諸如放射免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附分析(ELISA))來測定。
單株抗體的結合親和力可藉由例如Munson等人,《分析生物化學(Anal.Biochem.)》,107:220(1980)所述之史卡查分析(Scatchard analysis)測定。
鑑別出產生具有所要特異性、親和力及/或活性之抗體的融合瘤細胞之後,可藉由限制稀釋程序次選殖純系且藉由標準方法生長。適用於此目的之培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。此外,融合瘤細胞可在動物中以腹水腫瘤形式活體內生長,例如藉由小鼠腹膜內(i.p.)注射細胞。
次純系所分泌之單株抗體可以藉由習知抗體純化技術(諸如親和層析(例如使用蛋白質A或蛋白質G-瓊脂糖)或離子交換層析、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析等)、自培養基、腹水液或血清中分離。
編碼單株抗體之DNA容易使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性結合至編碼鼠類抗體重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)分離及測序。融合瘤細胞充當此類DNA之較佳來源。DNA一經分離,則可置放於表現載體中,接著轉染至未經轉染則不產生抗體蛋白質之宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中,以在重組宿主細胞中達成單株抗體之合成。
在另一實施例中,可以自利用McCafferty等人,《自然》348:552-554(1990)所述之技術產生的抗體噬菌體文庫中分離出單株抗體或抗體片段。Clackson等人,《自然》,352:624-628(1991)及Marks等人,《分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)》,222:581-597(1991)描述利用噬菌體文庫分別分離出鼠類及人類抗體。後續出版物描述藉由鏈改組來產生高親和性(nM範圍)人類抗體(Marks等人,《生物技術(Bio/Technology)》10:779-783(1992))
以及感染與體內重組組合作為構築極大型噬菌體文庫的策略(Waterhouse等人,《核酸研究(Nucl.Acids.Res.)》21:2265-2266(1993))。因此,此等技術為用於分離單株抗體之傳統單株抗體融合瘤技術的可行替代方案。
為了產生嵌合或融合抗體多肽,可以對編碼抗體的DNA例如進行修飾,例如用重鏈及輕鏈(CH及CL)恆定區序列取代同源鼠類序列(US 4816567及Morrison等人,《美國國家科學院院刊》:81:6851(1984),或使免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽(異源多肽)之編碼序列之全部或一部分共價融合。可以用非免疫球蛋白多肽序列取代抗體恆定區,或可以用其取代抗體之抗原結合中心之可變域,以產生嵌合二價抗體,該嵌合二價抗體包含一個特異性針對一種抗原的抗原結合位點及另一個特異性針對不同抗原的抗原結合位點。
基於噬菌體呈現文庫的人類抗體及方法
現可以產生轉殖基因動物(例如小鼠),其在免疫接種之後能夠在不產生內源免疫球蛋白之情況下產生全範圍之人類抗體。舉例而言,已描述嵌合及生殖系突變小鼠中之抗體重鏈連接區(JH)基因的同型接合缺失使得內源抗體產生被完全抑制。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至此類生殖系突變小鼠中使得在抗原攻擊之後產生人類抗體(US 5545806、US 5569825、US 5591669(皆為GenPharm);US 5545807;及WO 97/17852)。
或者,可以利用噬菌體呈現技術(McCafferty等人,《自然》348:552-553(1990),利用來自免疫供者身體的免疫球蛋白可變(V)區基因譜系活體外產生人類抗體及抗體片段。根據此技術,將抗體V區基因與絲狀細菌噬菌體之主要或次要鞘蛋白基因(諸如M13或fd)同框選殖,且以功能抗體片段形式在噬菌體顆粒表面上呈現。由於絲狀顆粒含有噬菌體基因組之單股DNA複本,因此基於抗體功能特性進行的選擇亦使得編碼展現該等特性之抗體之基因得以選擇。因此,噬菌體模擬一些B細胞特性。噬菌體呈現可以多種形式進行。V基因區段之若干來源可用於噬菌體呈現。Clackson等人,《自然(Nature)》352:624-628(1991)自來源於免疫小鼠脾臟之V基因之小型隨機組合文庫中分離出多種不同的抗噁唑酮抗體。可構築來
自未免疫人類供者之V基因譜系;且可以利用Mark等人,《分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)》222:581-597(1991)所述之技術基本上分離出針對多種不同抗原(包括自身抗原)的抗體。
如上文所述,人類抗體亦可由活體外活化的B細胞產生(參見US 5567610及5229275)。
抗體片段
在某些情況下,使用抗體片段而非整個抗體係合理的。片段尺寸小有助於其快速清除且可以有助於更好地滲入緻密腫瘤中。
已開發出用於產生抗體片段的多種技術。傳統上,此等片段經由完整抗體之蛋白水解消化而產生。然而,此等片段現可由重組宿主細胞直接產生。Fab、Fv及ScFv抗體片段均可在大腸桿菌中表現且自大腸桿菌分泌,從而能促進大量此等片段產生。抗體片段可自上述抗體噬菌體文庫中分離。根據另一個實施例,可以自大腸桿菌中直接分離出Fab'-SH片段且化學偶合以形成F(ab')2片段(Carter等人,《生物技術(Bio/Technology)》10:163-167(1992)。根據另一方法,可自重組宿主細胞培養物中直接分離出F(ab')2片段。活體內半衰期延長、保留抗原決定基結合受體殘基的Fab及F(ab')2描述於US 5869046中。用於產生抗體片段之其他技術對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。在其他實施例中,所選抗體為單鏈Fv片段(scFv)(參見WO 93/16185;US 5571894及US 5587458)。Fv及scFv為具有完整結合位點、缺乏恆定區的唯一種類;因此,其在活體內使用期間適於減少非特異性結合。可以構築scFv融合蛋白以產生效應蛋白在scFv之N端或C端的融合物。抗體片段亦可為「線性抗體」,例如如U.S.5641870中所述。此類線性抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。
醫藥組合物
在另一態樣中,本發明提供一種醫藥組合物,其包含特異性結合至CD20的單株抗體作為活性成分(或作為唯一活性成分)。
醫藥組合物可以包括至少一種特異性結合至CD20的單株
抗體及至少一種選自由醫藥學上可接受且藥理學上相容性賦形劑組成之群的組分。
醫藥組合物可以包括至少一種特異性結合至CD20的單株抗體及靶向一或多種相應表面受體的一或多種其他結合分子(例如抗體)。在一些實施例中,組合物旨在改善、預防或治療可能與CD20相關的病症。
「醫藥組合物」意謂一種組合物,其包含特異性結合至CD20之根據本發明的單株抗體及至少一種選自由醫藥學上可接受且藥理學上相容性賦形劑組成之群的組分,諸如填充劑、溶劑、稀釋劑、載劑、助劑、分配劑、遞送劑、防腐劑、穩定劑、乳化劑、懸浮劑、增稠劑、延長遞送的控制劑,其選擇及比例視投藥類型及途徑及劑型而定。本發明之醫藥組合物及其製備方法對於熟習此項技術者而言無疑為顯而易見的。醫藥組合物較佳應依照GMP(良好製造實務)要求來製造。組合物可包含緩衝液組合物、張力劑、穩定劑及增溶劑。組合物之作用延長可藉由活性醫藥成分吸收減緩劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來達成。適合載劑、溶劑、稀釋劑及遞送劑的實例包括注射用的水、乙醇、多元醇及其混合物、油及有機酯。
「藥劑(藥物)」為作為醫藥組合物的化合物或化合物混合物,其呈以下形式:錠劑、膠囊、散劑、凍乾物、注射液、輸注液、軟膏以及意欲用於恢復、改善或調節人類及動物生理學機能及治療及預防疾病、診斷、麻醉、避孕、美容學及其他目的的其他即用形式。此項技術中接受的用於投與肽、蛋白質或抗體的任何方法可以適當地用於特異性結合至CD20之根據本發明的單株抗體。
術語「醫藥學上可接受」係指適於投與哺乳動物(較佳為人類)的一或多種相容性液體或固體組分。
術語「賦形劑」在本文中用於描述除本發明之上述成分之外的任何成分。為了賦予藥品必需的物理化學特性,此等物質為醫藥製造時所用之具有無機或有機性質的物質。
術語「緩衝液(buffer)」、「緩衝液組合物」、「緩衝劑(buffering agent)」係指一種溶液,其能夠藉由其酸-鹼共軛組分之作用抵抗pH變化,且其允許特異性結合至CD20之單株抗體之藥物抵抗pH變化。一般而言,
醫藥組合物較佳具有4.0至8.0範圍內之pH。所用緩衝液之實例包括(但不限於)乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸、丁二酸鹽等緩衝溶液。
如本文所用,術語「張力劑」、「滲透液」或「滲透劑」係指能夠提高液體抗體調配物之滲透壓的賦形劑。「等張性」藥物為滲透壓等效於人類血液滲透壓的藥物。等張性藥物典型地具有約250至350mOsm/kg的滲透壓。所用等張劑包括(但不限於)多元醇、醣類及蔗糖、胺基酸、金屬鹽(例如氯化鈉)等。
「穩定劑」係指提供活性劑之生理學及/或化學穩定性的賦形劑或兩種或更多種賦形劑之混合物。穩定劑包括胺基酸,例如(但不限於)精胺酸、組胺酸、甘胺酸、離胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸;界面活性劑,例如(但不限於)聚山梨醇酯20(商標:Tween 20)、聚山梨醇酯80(商標:Tween 80)、聚乙烯-聚丙二醇及其共聚物(商標:Poloxamer、Pluronic)、十二烷基硫酸鈉(SDS);抗氧化劑,例如(但不限於)甲硫胺酸、乙醯半胱胺酸、抗壞血酸、單硫甘油、亞硫酸鹽等;螯合劑,例如(但不限於)乙二胺四乙酸(EDTA)、二伸乙三胺五乙酸(DTPA)、檸檬酸鈉等。
若活性劑在指定的存放期期間、在儲存溫度(例如2-8℃)下保持其物理穩定性及/或化學穩定性及/或生物活性,則醫藥組合物為「穩定的」。較佳地,活性劑保持物理與化學穩定性,以及生物活性。基於加速或天然老化條件下的穩定性測試結果來調整儲存期。
本發明的醫藥組合物可以單一單位劑型或複數個單一單位劑型、以即用調配物形式製造、封裝或廣泛出售。如本文所用,術語「單一單位劑型」係指容納預定量之活性成分的離散量之醫藥組合物。活性成分的量典型地等於待投與個體之活性成分的劑量,或此類劑量的適宜部分,例如此類劑量的一半或三分之一。
根據本發明之醫藥組合物典型地適於作為無菌調配物非經腸投藥,該等無菌調配物意欲藉助於注射、輸注及植入、經由突破皮膚或黏膜障壁、繞過胃腸道來投與人體。舉例而言,非經腸投藥尤其包括皮下、腹膜內、肌肉內、胸骨內、靜脈內、動脈內、鞘內、心室內、尿道內、顱內、滑膜內、經皮注射或輸注;及腎臟透析輸注技術。亦可利用腫瘤內遞
送,例如腫瘤內注射。亦提供局部灌注。較佳實施例包括靜脈內及皮下途徑。此項技術中接受的用於投與肽或蛋白質的任何方法可以適當地用於特異性結合至CD20之根據本發明的單株抗體。
可注射調配物可以(不限於)單位劑型製備、封裝或出售,諸如安瓿、小瓶、塑膠容器、預填藥注射器、自動注射裝置。非經腸投藥的調配物尤其包括油性或水性基質中的懸浮液、溶液、乳液、漿料及其類似物。
在另一個實施例中,本發明提供非經腸投藥的組合物,包含以乾燥(亦即,粉末或顆粒)形式提供的醫藥組合物,其在投與之前,用適合的基質(例如不含熱原質的無菌水)復原。此類調配物可藉由例如凍乾法製備,凍乾法在此項技術中稱為冷凍乾燥且包括冷凍產物、隨後自冷凍的物質中移除溶劑。
根據本發明的特異性結合至CD20之單株抗體亦可單獨地、作為與醫藥學上可接受之適合賦形劑的混合物鼻內投與或藉由吸入自吸入器(諸如加壓氣溶膠容器、泵、噴霧器、霧化器或氣霧器(其中使用或不使用適合推進劑))投與,或作為滴鼻劑或噴霧投與。
用於非經腸投藥的劑型可調配成速釋型或調釋型。調釋型調配物包括延遲釋放型、持續釋放型、脈衝釋放型、控制釋放型、靶向釋放型及程式化釋放型。
特異性結合至CD20之根據本發明之單株抗體的治療用途
在一個態樣中,根據本發明的特異性結合至CD20之單株抗體適用於治療與CD20活性相關(由其介導)的病症。
在一個態樣中,個體為哺乳動物,較佳為人類個體。該個體可為任何年齡的雄性或雌性。
在腫瘤(例如癌症)的情況下,治療有效量的抗體或其片段(例如特異性結合至CD20的抗體或其片段)可以減少癌細胞數目;減少初始腫瘤尺寸;抑制(亦即,在一定程度上減緩且較佳終止)癌細胞浸潤至周邊器官中;抑制(亦即,在一定程度上減緩且較佳終止)腫瘤轉移;在一定程度上抑制腫瘤生長;且/或在一定程度上緩解與病症相關的一或多種症狀。抗體或
其片段可以在一定程度上阻止現有癌細胞生長及/或殺死現有癌細胞,其可具有細胞抑制性及/或細胞毒性。就癌症治療而言,活體內功效可以例如藉由評估存活率、腫瘤進展時間(TTP)、針對治療的腫瘤反應率(RR)、持續反應時間及/或生活品質來量測。
如本文所用,提及特異性結合至CD20之單株抗體及一或多種不同治療劑,術語「共投藥」、「共投與」及「組合」意指、係指或包括以下:
1)將根據本發明的特異性結合至CD20之單株抗體與治療劑之此組合同時投與需要治療之患者,此時將此類組分一起調配成單一劑型,該單一劑型使該等組分基本上同時釋放至該患者;
2)將根據本發明的特異性結合至CD20之單株抗體與治療劑之此組合同時投與需要治療之患者,此時將此等組分彼此分開調配成各別劑型,該等各別劑型基本上同時被該患者服用,隨後該等組分基本上同時釋放至該患者;
3)將根據本發明的特異性結合至CD20之單株抗體與治療劑之此組合依序投與需要治療之患者,此時將此等組分彼此分開調配成各別劑型,該等各別劑型以每次投藥之間的顯著時間間隔被該患者連續多次服用,隨後該等組分在基本上不同的時間釋放至該患者;以及
4)將根據本發明的特異性結合至CD20之單株抗體與治療劑之此組合依序投與需要治療之患者,此時將此類組分一起調配成以可控方式釋放該等組分的單一劑型,隨後其同時、連續或共同地、在相同及/或不同時間釋放至該患者,其中各部分可以藉由相同或不同途徑投與。
根據本發明的特異性結合至CD20之單株抗體可以在不存在進一步治療性治療(亦即,作為獨立療法)的情況下投與。另外,根據本發明的特異性結合至CD20之單株抗體的治療可以包含至少一種其他治療性治療(組合療法)。在一些實施例中,特異性結合至CD20的單株抗體可以與用於治療癌症或自體免疫疾病的另一種療法/製劑共同投與或一起調配。
如本文所用,術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞毀壞之物質。該術語意欲包括放射性同位素(例如At211、I131、
I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32及Lu放射性同位素)化學治療劑,及毒素,諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶活性毒素,包括其片段及/或變異體。
「化學治療劑」為適用於治療癌症之化合物。化學治療劑之實例包括烷基化劑,諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(CYTOXAN®);烷基磺酸鹽,諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan);氮丙啶,諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa);乙烯亞胺及甲基三聚氰胺,包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三伸乙基磷醯胺(triethylenephosphoramide)、三伸乙基硫代磷醯胺(triethylenethiophosphoramide)及三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine);乙醯精寧(acetogenins)((例如布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone));δ-9-四氫大麻酚(屈大麻酚(dronabinol),MARINOL®);β-拉帕酮(beta-lapachone);拉帕醇(lapachol);秋水仙鹼;樺木酸;喜樹鹼(包括合成類似物拓朴替康(topotecan)(HYCAMTIN®)、CPT-11(伊立替康(irinotecan,CAMPTOSAR®))、乙醯基喜樹鹼(acetylcamptothecin)、東莨若素(scopolectin)及9-胺基喜樹鹼);苔蘚蟲素(bryostatin);海洋抑素(callystatin);CC-1065(包括其合成類似物阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin));鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸;替尼泊苷(teniposide);念珠藻環肽(cryptophycin)(例如念珠藻環肽1及念珠藻環肽8);海兔毒素(dolastatin);倍癌黴素(duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189及CB1-TM1);艾榴素(eleutherobin);水鬼蕉鹼(pancratistatin);沙考地汀(sarcodictyin);海綿抑素(spongistatin);氮芥,諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、二氯甲基二乙胺氧化物鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新恩比興(novembichin)、芬司特瑞(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard);亞硝基脲,諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司
汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine);抗生素,諸如烯二炔抗生素(例如卡奇黴素(calicheamicin),例如卡奇黴素γII及卡奇黴素ΩII(參見例如《德國應用化學國際版(Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.)》33:183-186(1994));達內黴素(dynemicin),包括達內黴素A;埃斯培拉黴素(esperamicin);以及新抑癌蛋白發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycins)、放線菌素C(cactinomycin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycins)、放線菌素d、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、小紅莓(doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN®、嗎啉基小紅莓、氰基嗎啉基小紅莓、2-吡咯啉基小紅莓、小紅莓HCl脂質體注射劑(DOXOL®)、脂質體小紅莓TLC D-99(MYOCET®)、聚乙二醇化脂質體小紅莓(CAELYX®),及去氧小紅莓)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycins)(諸如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代謝物,諸如甲胺喋呤、吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR®)、替加氟(tegafur)(UFTORAL®)、卡培他濱(capecitabine)(XELODA®)、埃坡黴素(epothilone)及5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物,諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤(methotrexate)、蝶羅呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate);嘌呤類似物,諸如氟達拉賓(fludarabine)、6-巰基嘌呤、噻咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine);嘧啶類似物,諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine);抗腎上腺藥劑,諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦
(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);葉酸補充劑,諸如亞葉酸;乙醯葡醛酯(aceglatone);醛磷醯胺糖苷(aldophosphamideglycoside);胺基乙醯丙酸;恩尿嘧啶(eniluracil);安吖啶(amsacrine);貝斯布西(bestrabucil);比生群(bisantrene);艾達曲克(edatraxate);地磷醯胺(defofamine);地美可辛(demecolcine);地吖醌(diaziquone);艾弗利散(elfornithine);依利醋銨(elliptinium acetate);依託格魯(etoglucid);硝酸鎵;羥脲(hydroxyurea);磨菇多糖(lentinan);氯尼達明(lonidainine);類美登素(maytansinoids),諸如美登素及安絲菌素(ansamitocins);丙脒腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌達醇(mopidanmol);硝拉維林(nitraerine);噴司他汀(pentostatin);凡那明(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);2-乙基醯肼;丙卡巴肼(procarbazine);PSK®多醣複合物(JHS Natural Products,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根瘤菌素(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);螺旋鍺(spirogermanium);細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亞胺醌(triaziquone);2,2',2"-三氯三乙胺;單端孢黴烯(trichothecenes)(例如T-2毒素、黏液黴素A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及胺癸叮(anguidine));烏拉坦(urethan);達卡巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛矛醇(mitolactol);哌泊溴烷(pipobroman);甲托辛(gacytosine);阿拉伯糖苷(「Ara-C」);噻替派(thiotepa);紫杉醇(taxoid),例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL®)、白蛋白工程化太平洋紫杉醇奈米粒子調配物(ABRAXANETM),及多烯紫杉醇(docetaxel)(TAXOTERE®);苯丁酸氮芥(chlorambucil);6-硫鳥嘌呤;巰基嘌呤(mercaptopurine);甲胺喋呤;鉑劑,諸如順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)及卡鉑(carboplatin);阻止微管蛋白聚合形成微管的長春花鹼,包括長春鹼(vinblastine)(VELBAN®)、長春新鹼(vincristine)(ONCOVIN®)、長春地辛(vindesine)(ELDISINE®)、FILDESIN®)及長春瑞賓(vinorelbine)(NAVELBINE®);依託泊苷(etoposide)(VP16);異環磷醯胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);甲醯四氫葉酸(leucovorin);諾凡特龍(novantrone);依達曲沙(edatrexate);柔紅黴素(daunomycin);胺基喋呤(aminopterin);伊班膦酸鹽(ibandronate);拓樸異構酶抑制劑RFS 2000;二
氟甲基鳥胺酸(DMFO);類視黃素,諸如視黃酸,包括貝瑟羅汀(bexarotene)(TARGRETIN®);雙膦酸鹽,諸如氯屈膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS®或OSTAC®)、依替膦酸鹽(etidronate)(DIDROCAL®)、NE-58095、唑來膦酸(zoledronic acid)/唑來膦酸鹽(ZOMETA®)、阿侖膦酸鹽(alendronate)(FOSAMAJX®)、帕米膦酸鹽(pamidronate)(AREDIA®)、替魯膦酸鹽(tiludronate)(SKELID®)或利塞膦酸鹽(risedronate)(ACTONEL®);曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧雜環戊烷核苷胞嘧啶類似物);反義寡核苷酸,特定言之,抑制涉及異常細胞增殖之信號傳導路徑基因表現的彼等物,諸如PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生長因子受體(EGF-R);疫苗,諸如THERATOPE®疫苗及基因治療疫苗,例如ALLOVECTIN®疫苗、LEUVECTIN®疫苗及VAXID®疫苗;拓樸異構酶1抑制劑(例如LURTOTECAN®);rmRH(例如ABARELIX®);BAY439006(索拉非尼(sorafenib);Bayer);SU-11248(Pfizer);哌立福新(perifosine)、COX-2抑制劑(例如塞內昔布(celecoxib)或依託昔布(etoricoxib))、蛋白酶體抑制劑(例如PS341);硼替佐米(bortezomib)(VELCADE®);CCI-779;替吡法尼(tipifarnib)(Rl 1577);索拉非尼(orafenib)、ABT510;Bcl-2抑制劑,諸如奧利默森鈉(oblimersen sodium)(GENASENSE®);匹蒽醌(pixantrone);EGFR抑制劑(參見下文定義);酪胺酸激酶抑制劑(參見下文定義);以及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物;以及上述中之兩者或更多者之組合,諸如CHOP(環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼與潑尼松龍之組合療法的縮寫)及FOLFOX(奧沙利鉑(ELOXATINTM)與5-FU及盧考弗文(leucovovin)組合治療方案的縮寫)。
此定義亦包括用於調控或抑制激素對腫瘤之作用的抗激素劑,諸如具有促效劑/拮抗劑混合特徵的抗雌激素,包括他莫昔芬(tamoxifen)(NOLVADEX®)、4-羥基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)(FARESTON®)、艾多昔芬(idoxifene)、曲洛昔芬(droloxifene)、拉洛昔芬(raloxifene)(EVTSTA®)、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene),及選擇性雌激素受體調節劑(SERM),諸如SERM3;不具有促效劑特性的純抗雌激素,諸如氟維司群(fulvestrant)(FASLODEX®),及EM800
(此類藥劑可以阻斷雌激素受體(ER)二聚合,抑制DNA結合,增加ER周轉及/或抑制ER水準);芳香酶抑制劑,包括類固醇芳香酶抑制劑,諸如福美司坦(formestane)及依西美坦(exemestane)(AROMASIN®),及非類固醇芳香酶抑制劑,諸如阿那曲唑(anastrazole)(AREVIIDEX®)、來曲唑(letrozole)(FEMARA®)及胺魯米特(aminoglutethimide),及其他芳香酶抑制劑,包括伏羅唑(vorozole)(RIVISOR®)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)(MEGASE®)、法屈唑(fadrozole)、咪唑;黃體激素釋放激素促效劑,包括亮丙立德(leuprolide)(LUPRON®及ELIGARD®)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)及曲特瑞林(tripterelin);性類固醇,包括助孕素,諸如乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)及乙酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate),雌激素,諸如己烯雌酚(diethylstilbestrol)及普雷馬林(premarin),及雄激素/類視黃素,諸如氟羥甲基睪酮(fluoxymesterone)、所有反式視黃酸及非瑞替尼(fenretinide);奧那司酮(onapristone);抗孕酮;雌激素受體下調劑(ERD);抗雄激素,諸如氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)及比卡魯胺(bicalutamide);睪內酯(testolactone);以及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物;以及上述中之兩者或更多者的組合。
治療上述自體免疫疾病或相關自體免疫病狀時,可以利用多藥療法,將如本文所提供之特異性結合至CD20的單株抗體與不同治療劑(諸如免疫抑制劑、消炎藥、全身激素藥物、抗贅生性及免疫調節藥物或其他)組合投與患者。特異性結合至CD20的單株抗體可與不同治療劑同時、依序或交替地投與,或對不同療法展示抗性之後投與。相較於此項技術中使用的彼等物,不同治療劑可以相同或較低劑型投與。選擇較佳的不同治療劑時,應考慮多種因素,包括待治療之疾病的類型及患者的醫學病歷。
如本文所用,附加療法中所用的術語「免疫抑制劑」係指旨在抑制或遮蔽患者免疫系統的物質。此類藥劑可為抑制細胞介素產生、下調或抑制自身抗原表現或遮蔽主要組織相容複合體(MHC)抗原的物質。此類藥劑之實例包括類固醇,諸如糖皮質激素,例如潑尼松(prednisone)、甲基潑尼松龍(methylprednisolone)及地塞米松(dexamethasone);2-胺基-6-芳基-5-取代之嘧啶(參見US 4665077)、硫唑嘌呤(azathioprine)(或環磷醯胺,在
對硫唑嘌呤(azathioprine)產生有害反應的情況下);溴隱定(bromocryptine);戊二醛(其遮蔽MHC抗原,如US 4120649中所述);針對MHC抗原及MHC片段的抗個體基因型抗體;環孢靈A(cyclosporine A);細胞介素及細胞介素受體拮抗劑,包括干擾素-γ、干擾素-β或干擾素-α抗體;抗腫瘤壞死因子抗體;抗介白素-2抗體及抗IL-2受體抗體;抗L3T4抗體、異源抗淋巴球球蛋白、泛T抗體,較佳為抗CD3或抗CD4/CD4a抗體;含有LFA-3結合域的可溶肽(WO 90/08187,1990年6月26日公開);鏈激酶(streptokinase);TGF-p;鏈球菌去氧核糖核酸酶(streptodomase);宿主DNA/RNA;FK506;RS-61443;去氧斯匹胍素(deoxyspergualin);雷帕黴素(rapamycin);T細胞受體(US 5114721);T細胞受體片段(Offner等人,《科學(Science)》251:430-432(1991);WO 90/11294;以及WO 91/01133);以及T細胞受體抗體(EP340109),諸如T10B9。
治療類風濕性關節炎時,可以將根據本發明的特異性結合至CD20之單株抗體單獨或與以下藥物中之一或多者組合投與患者:DMARD(鹼性消炎藥(例如甲胺喋呤、來氟米特(leflunomide)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine))、NSAID(非類固醇消炎藥,例如環加氧酶抑制劑)、皮質類固醇(例如潑尼松龍(prednisolone)、布地奈德(budesonide))。用於治療RA之典型DMARD為羥氯喹(hydroxychloroquine)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、甲胺喋呤、來氟米特(leflunomide)、硫唑嘌呤(azathioprine)、D-青黴胺(D-penicillamine)、金基製劑(口服)、金基製劑(肌肉內)、二甲胺四環素(minocycline)、環孢靈(cyclosporine)、藉由蛋白質A免疫吸附所得的葡萄球菌。用於治療RA的習知方法描述於例如J.A.Singh等人,2015《美國風濕病學會治療類風濕性關節炎指南(American College of Rheumatology Guideline for the Treatment of Rheumatoid Arthritis)》,《關節炎照護及研究(Arthritis Care Res)》(Hoboken)68,1-25(2016)。
意謂可以用於如上文所述之治療方法中之根據本發明之特異性結合至CD20的單株抗體可以用於如上文所述的治療,且/或可以用於製造供如上文所述之治療的藥品。
劑量及投藥途徑
根據本發明的特異性結合至CD20之單株抗體以有效治療所討論之病狀的量投與,亦即,以達成所需結果所需之劑量及時間段投與。治療有效量可根據諸如以下因素而變化:所治療之特定病狀、患者之年齡、性別及體重,及特異性結合至CD20之單株抗體是否作為單獨療法或與一或多種其他藥物或療法組合投與。
可調整給藥方案以提供最佳反應。舉例而言,可投與單一藥團,可隨時間投與若干分次劑量,或可依治療情況之緊急性所指示按比例減少或增加劑量。就容易投藥及劑量之均一性而言,將非經腸組合物調配成單位劑型尤其有利。如本文所用的單位劑型意指適合作為待治療之患者/個體之單位劑量的實體不連續單元;每個單位含有經計算可產生所需治療效果的預定量之活性化合物與所需醫藥載劑。本發明之單位劑型之規格典型地取決於且直接依賴於:(a)化學治療劑之獨特特徵及欲達成之特定治療或預防作用,及(b)混配用於治療個體敏感性之此類活性化合物之技術中固有的限制。
因此,熟習此項技術者會瞭解,基於本文提供之揭示內容,根據治療技術中熟知之方法調整劑量及給藥方案。亦即,可容易確定最大可耐受劑量,且亦可確定向患者提供可偵測治療效果之有效量,亦可確定投與各藥劑的暫時需求以向患者提供可偵測的治療效果。因此,儘管本文中舉例說明某些劑量及投藥方案,但此等實例決不限制在實施本發明之實施例時可向患者提供之劑量及投藥方案。
應注意,劑量值可隨待緩解之病狀的類型及嚴重程度而變化,且可包括單次或多次劑量。另外應瞭解,對於任何特定個體而言,特定劑量方案應根據個別需要及投與組合物或監督組合物投與之醫學專業人員的判斷而隨時間調整,且本文所闡述之劑量範圍僅具例示性且不意欲限制所主張之組合物的範疇或實務。另外,本發明組合物之給藥方案可以基於多種因素,包括疾病類型、患者的年齡、體重、性別、醫學病狀、病狀之嚴重度、投藥途徑,及特異性結合至CD20之所用特定單株抗體。因此,給藥方案可廣泛變化,但可使用標準方法常規確定。舉例而言,可基於藥
物動力學或藥效學參數來調整劑量,該等參數可包括臨床效應,諸如毒性效應及/或實驗值。因此,本發明涵蓋如熟習此項技術者所確定之患者內劑量遞增。用於確定適當劑型及方案的方法在此項技術中已熟知且在提供本文所揭示之構思後,為熟習此項技術者所瞭解。
以上提供適合投藥方法之實例。
咸信根據本發明的特異性結合至CD20之單株抗體之適合劑量在0.1-200mg/kg範圍內,較佳為0.1-100mg/kg,包括約0.5-50mg/kg,例如約1-20mg/kg。特異性結合至CD20之單株抗體可以例如至少0.25mg/kg之劑量投與,諸如至少0.5mg/kg,包括至少1mg/kg,例如至少1.5mg/kg,諸如至少2mg/kg,例如至少3mg/kg,包括至少4mg/kg,例如至少5mg/kg;且直至例如50mg/kg之最大值,包括直至30mg/kg之最大值,例如直至20mg/kg之最大值,包括直至15mg/kg之最大值。投藥典型地以適當的時間間隔重複進行,諸如一週一次、每兩週一次、每三週一次或每四週一次,且只要負責醫師視為適當,則必要時,其可以在一些情況下增加或降低劑量。
診斷用途及組合物
根據本發明的特異性結合至CD20之單株抗體亦用於診斷過程(例如活體外、離體)。舉例而言,根據本發明的特異性結合至CD20之本發明單株抗體可用於偵測或量測自患者獲得之樣品(例如組織樣品或體液樣品,諸如炎性泌出物、血液、血清、腸液、唾液或尿液)中的CD20含量。適用於偵測及量測之方法包括免疫分析,諸如流式細胞術、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、化學發光分析、放射免疫分析及免疫組織化學。本發明進一步包括套組,例如包含特異性結合至CD20之本文所述單株抗體的診斷套組。
以下實例係為了更好地理解本發明而提供。此等實例僅用於說明之目的且不應視為以任何方式限制本發明之範疇。
本說明書中所引用之所有公開案、專利及專利申請案均以引
用之方式併入本文中。儘管出於清楚理解之目的已藉助於說明及實例較詳細地描述前述發明,但顯而易見的是,一般熟習此項技術者根據本發明之教示,可以在不背離隨附實施例之精神或範疇之情況下對其進行某些變更及修改。
實例
以下實例係為了更好地理解本發明而提供。此等實例僅用於說明之目的且不應視為以任何方式限制本發明之範疇。
本說明書中所引用之所有公開案、專利及專利申請案均以引用之方式併入本文中。儘管出於清楚理解之目的已藉助於說明及實例較詳細地描述前述發明,但顯而易見的是,一般熟習此項技術者根據本發明之教示,可以在不背離隨附實施例之精神或範疇之情況下對其進行某些變更及修改。
材料及通用方法
關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核昔酸序列的一般資訊提供於Kabat,E.A.等人,《免疫學所關注之蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,第5版,美國公眾衛生服務署(Public Health Service),國家衛生研究院(National Institutes of Health),Bethesda,MD(1991)。抗體鏈之胺基酸係根據EU編號加以編號及提及(Edelman,G.M.等人,美國國家科學院院刊63(1969)78-85;Kabat,E.A.等人,《免疫學所關注之蛋白質序列》,第5版,美國公眾衛生服務署,國家衛生研究院,Bethesda,MD,(1991)。
重組DNA技術
使用標準方法操控DNA,如Sambrook,J.等人,《分子選殖:實驗室手冊(Molecular cloning:A laboratory manual)》;冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),紐約冷泉港1989中所述。分子生物學試劑係根據製造商說明書使用。
基因合成
由化學合成製備的寡核苷酸製備所需基因區段。側接單數個限制位點的300-4000kb長之基因區段如下組裝:使寡核苷酸黏接及接合(包括PCR擴增),及隨後經由指定的限制位點選殖。次選殖之基因片段的DNA序列藉由DNA測序來證實。
DNA序列測定
藉由桑格測序(Sanger sequencing)來測定DNA序列。
DNA及蛋白質序列分析及序列資料管理
Infomax的Vector NT1 Advance套件8.0版用於序列產生、定位、分析、註釋及說明。
表現載體
就所述抗體及抗原的表現而言,應用旨在原核細胞(大腸桿菌)表現、在真核細胞(例如CHO細胞)中短暫表現之表現質體變異體。除抗體表現卡匣之外,載體含有;允許該質體在大腸桿菌中複製的複製起點、賦予大腸桿菌針對各種抗生素(例如安比西林(ampicillin)及卡那黴素(kanamycin))之抗性的基因。
如下文所述之包含所述抗體鏈的融合基因係藉由PCR及/或基因合成來產生且利用已知重組方法及技術、藉由連接相應核酸區段(例如利用相應載體中的獨特限制位點)而組裝。藉由DNA測序來驗證次選殖的核酸序列。就短暫轉染而言,藉由自轉型的大腸桿菌培養物製備質體來製備大量的質體。
實例1.在哺乳動物細胞之懸浮培養物中產生重組對照抗體
利妥昔單抗(Rituximab)(序列已公開的抗體)用作對照。合成抗體重鏈/輕鏈可變域基因且分別選殖入載體pEE-HC、pEE-CK之SalI/NheI
及SalI/BstWI限制位點(圖1、2),該等載體旨在哺乳動物細胞中產生蛋白質。
在大腸桿菌細胞中培養所需量之質體且使用Qiagen套組純化。
利用獲自中國倉鼠卵巢細胞的已建立細胞株細胞(CHO-T株系)產生對照抗體。使用補充有8mM L-麩醯胺酸及1g/l普洛尼克68(pluronic 68)的無血清培養基(HyCell TransFx-C),在位於回轉式振盪培育箱上的燒瓶中進行懸浮培養。就短暫表現而言,藉助於線性聚乙烯亞胺(PEI MAX,Polysciences)轉染細胞(2-2.2×106個細胞/毫升)。DNA/PEI比率為1:3-1:10。轉染之後的第9天,藉由0.5/0.22μm深度床層過濾器過濾而將培養液與細胞分離。藉由親和HPLC、利用蛋白質A(一種細菌蛋白質)自培養液中分離出目標蛋白質。
藉由還原及非還原SDS凝膠電泳來評估所得蛋白質溶液的純度。
實例2.構築初始人類抗體FAB文庫MeganLibTM
使用RNeasy小型套組,根據所提出的方案(QIAGEN)自超過一千位個別人類供者之血液樣品中分離出B淋巴球總RNA。使用Nanovue套組(GE Healthcare)執行RNA濃度分析,藉助於1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查所分離之RNA的品質。
使用MMLV RT套組(Evrogen),使用MMuLV逆轉錄酶及無規六聚體寡核苷酸作為引子,根據推薦的方案進行逆轉錄反應。
逆轉錄產物在兩階段聚合酶鏈反應中用作基質以產生側接限制位點的可變域基因;使用寡核苷酸套組,根據[《生物化學雜誌(J Biol Chem.)》1999年6月25日;274(26):18218-30]的方案執行反應。
所得DNA製劑VL-CK-VH(圖4)用NheI/Eco91I限制性核酸內切酶處理且接入原始噬菌質體pH5中(圖5)。接合產物轉型為根據方案[《酶學方法(Methods Enzymol.)》2000;328:333-63.]製備的SS320電感受態細胞。組合型噬菌體Fab呈現文庫MeganLibTM的譜系為1011轉型體。根
據更早期間描述的程序製備Fab文庫噬菌體產物[《分子生物學雜誌(J Mol Biol.)》1991年12月5日;222(3):581-97]。
實例3.藉由噬菌體呈現選擇FAB文庫
特異性抗CD20人類噬菌體Fab抗體係獲自組合型噬菌體Fab呈現文庫MeganLibTM。藉由噬菌體呈現[《自然生物技術(Nat Biotechnol)》1996年3月;14(3):309-14;《分子生物學雜誌(J Mol Biol.)》1991年12月5日;222(3):581-97],但使用磁珠及KingFisher Flex裝置(因為此技術能夠同時執行多達96種不同生物淘選方案及變異體)對表現CD20的人類真核細胞進行生物淘選。
在生物淘選期間,藉由在旋轉機上將細胞與珠粒一起培育20分鐘而使生物素化真核細胞固著於抗生蛋白鏈菌素磁珠表面上。接著用PBS(pH7.4)洗滌珠粒,接著用2%脫脂牛乳於PBS(pH 7.4)之溶液將珠粒阻斷1小時。接著將與抗原陰性細胞一起預培育之噬菌體於補充有2%脫脂牛乳之PBS(pH 7.4)中的溶液添加至結合有細胞的磁珠中。在攪拌下培育混合物40分鐘。藉由用補充有0.1%Tween-20之PBS(pH 7.4)溶液將磁珠洗滌若干個循環來移除未結合的噬菌體。洗滌循環數目逐輪增加(第一輪10個洗滌循環,第二及第三輪30個洗滌循環)。在攪拌下用100mM Gly-HCl溶液(pH 2.2)將結合至磁珠表面上之抗原的噬菌體自珠粒溶離15分鐘,且接著用1M Tris-HCl(pH 7.6)中和溶液。用所得噬菌體感染大腸桿菌TG1細菌,在細菌中培養噬菌體,且分離出來且用於下一個選擇循環。三至四輪之後,自噬菌體分離出DNA(噬菌粒),且將抗體可變域基因選殖入表現載體(圖6)用於在大腸桿菌細胞中產生Fab。
實例4.文庫篩選
初始篩選
根據標準技術產生Fab:細菌細胞用含有Fab基因的表現載體轉型,而隨後在培養所得轉型體期間將觸發乳糖操縱子轉錄的誘導劑添加至培養基中誘導Fab表現。
吾人接著針對Fab對受質固著之CD20肽的結合執行ELISA。使用抗人類Fab HRP結合之二級抗體(Pierce-ThermoScientific)偵測抗原結合的Fab。
插入表現質體pLL中的利妥昔單抗Fab序列用作陽性對照(圖6)。
作為初始篩選之結果,吾人選擇能夠結合至目標CD20肽之純系。該材料轉交二次篩選。
二次篩選
二次篩選旨在選擇與CD20肽發生相互作用而與其他抗原IL6R-Fc、PCSK9-VG-FE、PD-1-Fc不發生相互作用的產Fab純系。
根據標準技術產生Fab。吾人接著根據標準程序針對Fab對受質固著之多種抗原的結合執行ELISA。
作為二級篩選的結果,選擇僅特異性結合目標CD20肽的產Fab純系。
實例5.前導候選物最佳化
為了增強人類化,使所選候選物最佳化。使用YLab套裝軟體(Biocad開發)的Humanizer工具選擇取代點。來自不同生物學物種的生殖系功能V、D、J區段係獲自IMGT資料庫且用作資料源。人類區段用作陽性參考物,而來自大鼠及小鼠的彼等區段用作陰性參考物。該工具基於此資料提出待取代的位置。
為了進一步選擇,吾人產生1000個候選物,所選取代集合具有複數個子集。所得候選物基於初始候選物-目標CD20複合物的晶體結構模型化。使用BENDER(Biocad開發)及BioLuminate(得自Schrodinger軟體套件,Schrodinger開發)軟體產生模型。沿著100ns分子動態軌跡使用OPLS 2005力場、藉由計算平均值MM-GBSA來評估所得模型。使用Desmond(Schrodinger套件,Schrodinger開發)獲得分子動態軌跡。在所得結果中,吾人明確地區分為了進一步合成而提出的133種候選物之叢集,
以及對照候選物。
實例6.製備呈IgG1形式的全長抗體
使用Ylab套裝軟體(BIOCAD)的OligoDesigner工具,針對所製備的133種候選物,對CHO細胞進行密碼子最佳化。重新合成重鏈/輕鏈可變域的最佳化序列且分別在Sal1/Nhe1及Sal1/BsiW1限制位點選殖入載體pEE-HC、pEE-CK(IgG1形式)(圖1、2)。IgG1形式的示意圖示於圖3中。
所得基因構築體用於CHO-T細胞株轉型。根據標準方法,藉由細菌蛋白質A親和層析分離且純化蛋白質,如實例1中所述。經由7.5% PAGE變性來執行電泳。22種候選物的生產效能低於臨限水準(50mg/l);因此,其不分離及純化。
實例7.高親和性純系測序
在Applied Biosystems 3130基因分析儀(Applied Biosystems)上,根據標準方案對陽性純系的可變域基因進行測序且分析。
實例8.在Forte Bio Octert RED 384上測定全長抗體親和力
在Forte Bio Octet RED 384上測定所得全長候選物的KD值。
研究使用SAX生物感測器及生物素修飾之CD20肽(Sigma Aldrich)。抗體利妥昔單抗用作對照。將SAX生物感測器浸入含有濃度為20μg/ml之生物素化CD20肽的溶液中,其中該肽發生固著。在30℃下使用含有0.1% Tween 20及0.1% BSA之PBS作為工作緩衝液進行進一步分析。
在緩衝溶液中經歷基線記錄之後,將感測器在含有濃度為10μg/ml之抗體溶液的孔中浸沒150秒,其中複合物發生結合。接著偵測緩衝溶液中的複合物解離300秒。
使用Octet資料分析軟體(9.0版),使用1:1相互作用模型,根據標準程序分析扣除參考信號之後的結合曲線。
116種候選物轉交分析。其中67種對肽不展示任何結合。剩餘49種候選物以奈莫耳濃度及微莫耳親和力與肽發生相互作用(圖7及表1)。
基於以上分析的結果選擇候選物BCD132L-026、BCD132L-028、BCD132L-075及BCD132L-077。
實例9.使用Forte Bio Octert RED 384測定瞬時產生之後的最終候選物對CD20的親和力
研究使用SAX生物感測器及生物素修飾之CD20肽(Sigma Aldrich)。抗體利妥昔單抗用作對照。將SAX生物感測器浸入含有濃度為20μg/ml之生物素化CD20肽的溶液中,其中該肽發生固著。在30℃下使用含有0.1% Tween 20及0.1% BSA之PBS作為工作緩衝液進行進一步分析。
在緩衝溶液中經歷基線記錄之後,將感測器在具有濃度為10μg/ml之抗體溶液的孔中浸沒210秒,其中複合物發生結合。接著偵測緩衝溶液中的複合物解離100秒。
使用Octet資料分析軟體(9.0版),使用1:1相互作用模型,根據標準程序分析扣除參考信號之後的結合曲線(參見圖8-11)。
基於以上分析的結果選擇候選物BCD132L-028及BCD132L-077。
實例10.製備穩定產生呈IgG1形式之抗體的細胞株
基於以上分析的結果,BCD132-L-028、BCD132-L-077顯示最佳效能。將其重鏈及輕鏈序列選殖入載體pSX之HindIII、XbaI位點(圖24)。在大腸桿菌細胞中培養所得質體,使用BenchPro分離出600-700μg。質體藉由PvuI核酸內切酶線性化隔夜,且接著用乙醇再沈澱且達成900-1100ng/μl的最終濃度。
在S.3.87 MM培養基(BIOCAD開發的無FBS合成培養基)+6mM麩醯胺酸中培養CHO-K1-S細胞株。使用NucleofectorTM(Lonza),根據製造商方案,藉由電穿孔,用包含BCD132-L-028、BCD132-L-077候選物鏈之編碼序列的基因構築體進行轉染。
在轉染之後的當天,藉由將嘌呤黴素(最終濃度7.2μg/ml)、潮黴素B(最終濃度640μg/ml)添加至培養基中而使經轉染的培養物經歷選擇24天。選殖所選細胞群。基於目標蛋白水準/結構均質性之分析結果,考量生長速率、群體均質性,及形態變化的缺乏來選擇分別表現BCD132-L-028、BCD132-L-077的細胞純系,而候選物BCD132-L-026及BCD-132-L-075被排除。
實例11.在Forte Bio Octert RED 384上測定穩定細胞株中所培養之最終
候選物對CD20的親和力
研究使用SAX生物感測器及生物素修飾之CD20肽(Sigma Aldrich)。抗體利妥昔單抗用作對照。將SAX生物感測器浸入含有濃度為20μg/ml之生物素化CD20肽的溶液中,其中該肽發生固著。在30℃下使用含有0.1% Tween 20及0.1% BSA之PBS作為工作緩衝液進行進一步分析。
在緩衝溶液中經歷基線記錄之後,將感測器在含有濃度為10μg/ml之抗體溶液的孔中浸沒150秒,其中複合物發生結合。接著偵測緩衝溶液中的複合物解離300秒。
使用Octet資料分析軟體(9.0版),使用1:1相互作用模型,根據標準程序分析扣除參考信號之後的結合曲線(圖12-15)。
實例12.在Forte Bio Octert RED 384上測定穩定細胞株中所培養之最終候選物對FcγRIIIa-158F的親和力
研究使用SAX生物感測器及生物素修飾之FcγRIIIa-158F蛋白質(Sigma Aldrich)。將SAX生物感測器浸入含有濃度為5μg/ml之生物素化蛋白質的溶液中,其中該蛋白質發生固著至0.5nm的信號位準。在30℃下使用含有0.1% Tween 20及0.1% BSA之PBS作為工作緩衝液進行進一步分析。
經歷基線記錄之後,將感測器浸入含有不同濃度之抗體溶液的孔中歷時90秒,其中複合物發生結合。接著偵測到緩衝溶液中之複合物解離150秒。
使用Octet資料分析軟體(9.0版),使用1:1相互作用模型,根據標準程序分析扣除參考信號之後的結合曲線(圖16-19)。
實例13.在Forte Bio Octert RED 384上測定穩定細胞株中所培養的最終候選物對FcγRIIIa-158V的親和力
研究使用SAX生物感測器及生物素修飾的FcγRIIIa-158V蛋白質(Sigma Aldrich)。將SAX生物感測器浸入含有濃度為5μg/ml之生物素化蛋白質的溶液中,其中該蛋白質發生固著至0.5nm的信號位準。在30℃下使用含有0.1% Tween 20及0.1% BSA之PBS作為工作緩衝液進行進一步分析。
經歷基線記錄之後,將感測器浸入含有不同濃度之抗體溶液的孔中歷時90秒,其中複合物發生結合。接著偵測到緩衝溶液中之複合物解離150秒。
使用Octet資料分析軟體(9.0版),使用1:1相互作用模型,根據標準程序分析扣除參考信號之後的結合曲線(圖20-23)。
實例14.利用流式細胞術量測BCD-132-L-028及BCD-132-L-077對WIL2-S細胞株上之CD20受體的特異性結合。
MabThera(利妥昔單抗)用作對照抗體。樣品及對照抗體稀釋至200μg/ml的濃度,在染色劑緩衝液(PBS、0.5% BSA、0.1% NaN3)中依增量4滴定。將濃度為1×106個細胞/毫升的WIL2-S(ATCC®CRL8885)細胞懸浮液與標準溶液及測試樣品的滴定液一起培育。攪拌懸浮液且在冰中培育30分鐘。培育時間之後,將培養盤離心,收集上清液,添加100μl染色劑緩衝液,將混合物再懸浮且離心。收集上清液,將沈澱物再懸浮於所結合之螢光抗人類Fc-PE抗體(Jackson Immunoresearch,109-115-098)於染色劑緩衝液中之溶液中。將培養盤在黑暗中在冰中培育30分鐘。培育時間之後,將培養盤離心,收集上清液,添加100μl染色劑緩衝液,將混合物再懸浮且離心。收集上清液,將沈澱物再懸浮於150μl染色劑緩衝液中且藉由流式細胞儀Guava12HT(Merck Millipore)分析。使用guavaSoft 3.1.1軟體的
InCyte模組分析資料。
測試抗體BCD-132-L-028及BCD-132-L-077對WIL2-S細胞株上之CD20受體的特異性結合水準與MabThera(利妥昔單抗)的特異性結合水準一致。結果展示於圖25中。
實例15.量測BCD-132-L-028及BCD-132-L-077之補體依賴性細胞毒性。
補體依賴性細胞毒性分析使用WIL2-S(ATCC®CRL-8885TM)細胞株。
在補充有2mM麩醯胺酸、0.1%牛血清白蛋白、50μg/ml慶大黴素(gentamicin)的RPMI-1640中進行分析。測試抗體BCD-132-L-028、BCD-132-L-077及MabThera(利妥昔單抗)自50μg/ml濃度連續稀釋。所得溶液以每孔50μl添加至96孔盤中。製備1×106個細胞/毫升的WIL2-S細胞懸浮液且以50微升/孔添加至盤孔中。製備補體之工作溶液(Quidel,A113)且以50微升/孔添加至培養盤中。
培養盤在37℃、5% CO2下培育2小時。培育時間之後,將15微升/孔的Alamar藍色染料添加至盤孔中,培養盤在37℃、5% CO2下培育直至發現梯度染色。在544/590nm之激發/發射波長下,使用Infinite M200Pro讀盤器量測螢光。
BCD-132-L-028及BCD-132-L-077的補體依賴性細胞毒性水準與MabThera(利妥昔單抗)的補體依賴性細胞毒性水準一致。結果展示於圖26、圖27中。
實例16.使用報導體株系Jurkat-NFAT-CD16量測BCD-132-L-028及BCD-132-L-077的抗體依賴性細胞毒性。
WIL-2S(ATCC®CRL-8885TM)用作量測抗體依賴性細胞毒性的目標株系。作為效應細胞,吾人使用高穩定性表現細胞表面FcγRIIIa(CD16a)受體的報導體株系Jurkat-NFAT-CD16(CD16之高親和性異型V158)及低穩定性表現細胞表面FcγRIIIa(CD16a)受體的報導體株系
Jurkat-NFAT-CD16(CD16之低親和性異型F158),該等報導體株系攜載處於NFAT反應元件控制下的螢光素酶編碼基因。
吾人以0.5×106個細胞/毫升製備VVIL-2S細胞於RPMI1640中的懸浮液,該RPMI1640補充有2mM L-Gln、4%(v/v)低IgG FBS及5μg/ml慶大黴素。將目標細胞懸浮液以25微升/孔添加至具有白壁的培養盤中。
吾人自5μg/ml以增量5添加BCD-132-L-028或BCD-132-L-077及MabThera(利妥昔單抗)之滴定液(25微升/孔),且以3×106個細胞/毫升添加報導體株系高或低表現Jurkat-NFAT-CD16(25微升/孔)。攪拌培養盤且在37℃、5%CO2下培育4-8小時。
培育時間之後,吾人以75微升/孔添加Bioa Glo螢光素酶分析試劑(Promega)且使用Infinite M200Pro量測100ms積分時間下的發光。
BCD-132-L-028及BCD-132-L-077展示的ADCC活性顯著高於MabThera:使用具有CD16之高親和性異型的報導體株系時,活性高3-4倍,且使用具有CD16之低親和性異型的報導體株系時,活性高12-16倍。結果展示於圖28中;圖29展示具有CD16之低親和性異型之報導體株系的結果,且圖30、圖31展示具有CD16之高親和性異型之報導體株系的結果。
實例17.使用健康供者的全血量測BCD-132-L-028及BCD-132-L-077誘導之CD19+ B細胞耗竭。
使用具有以下CD16a受體異型之健康供者的全血離體量測測試樣品活性:FF(低親和性受體)、FV(異型接合體)、VV(高親和性受體)。
MabThera(利妥昔單抗)用作對照抗體。對照及測試抗體在96孔盤中三重複滴定。將健康供者的血液收集於含有肝素鋰的真空管中。在室溫下培育管30分鐘。將所製備的10μl抗體溶液及190μl全血添加至側面有凹槽的96孔盤(Eppendorf)中。將5ml DPBS添加至96孔盤的側面凹槽中。培養盤在回轉式振盪器(2mm)上以600rpm攪拌2分鐘,且接著在CO2培育箱中培育22小時。
培育時間之後,樣品用螢光標記之針對CD45、CD3/CD19
的抗體(BD Pharmingen)染色1小時。吾人固定細胞且使用BD Pharmingen溶解緩衝液溶解紅血球,用染色劑緩衝液(DPBS、0.1% NaN3、0.5% BSA)自溶解緩衝液洗滌兩次且量測CD45+CD3+及CD45+CD19+事件的數目(閘CD45+內至少10,000個事件)。使用guavaSoft 3.1.1軟體的InCyte模組分析資料。
使用不存在抗體之點的B細胞/T細胞比率(B細胞數目計為100%=B細胞耗竭0%)來量測相對的B細胞耗竭。利用下式計算B細胞/T細胞比率:
利用下式計算B細胞耗竭百分比:
利用統計學環境R與擴展套裝程式drc繪製四參數曲線。
測試抗體BCD-132-L-028及BCD-132-L-077展示的活性顯著高於MabThera(利妥昔單抗)。因此,當使用異型FF的供者血液時,BCD-132-L-028及BCD-132-L-077誘導CD19+細胞發生約50%耗竭,而MabThera(利妥昔單抗)誘導約20%耗竭。當使用CD16異型FV及VV的供者血液時,MabThera(利妥昔單抗)的ED50值顯著高於BCD-132-L-028及BCD-132-L-077之彼等值。BCD-132-L-028及BCD-132-L-077之B細胞耗竭水準不依賴於供者CD16異型。結果展示於圖32中。
實例18.使用人類周邊血液單核細胞(PBMC)分析抗CD20抗體候選物對拉莫斯細胞株(Ramos cell line)的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性。
使用表現CD-20的拉莫斯細胞株及健康供者的PBMC進行ADCC分析。拉莫斯細胞在補充有10% FBS(胎牛血清)的RPMI-1640培養基中、在37℃、5% CO2下培養,細胞用螢光染料鈣黃綠素AM染色,該螢光染料僅可自細胞壁損傷的細胞逸出。以105個細胞/毫升的密度製備細胞於補充有10% FBS之RPMI-1640培養基中的懸浮液。
藉由Ficoll密度梯度分離(1.077g/cm3)自健康供者的靜脈血
液中分離出PBMC。以5*106個細胞/毫升的密度製備細胞於補充有10% FBS之RPMI-1640培養基中的懸浮液。
將一系列抗體稀釋液以50微升/孔添加至96孔盤的各孔中用於ADCC分析。向其中添加100微升/孔的拉莫斯懸浮液及50微升/孔的PBMC懸浮液。培養盤在37℃、5% CO2下培育4小時。培育結束之前的30分鐘,將10微升/孔的10% Tryton X-100添加至最大溶解孔中。培育之後,在不獲取細胞的情況下將100微升/孔的細胞液轉移至新盤中。在485/538nm之激發/發射波長下量測螢光。
利用下式計算ADCC功效:
基於ADCC與抗體濃度的關係,吾人使用GraphPad Prism 6.0套裝軟體測定4參數方程式所述的相關性且計算半最大有效濃度(EC50)。
根據ADCC分析,抗CD20抗體候選物BCD-132-L-028及BCD-132-L-077展示的效能優於利妥昔單抗的效能。結果展示於圖33中。
實例19.重複靜脈內投與食蟹獼猴(Macaca fascicularis)之後,研究BCD132-L-077單株抗體產物對實驗性自體免疫性腦脊髓炎(EAE)模型的活性。
對雄性食蟹獼猴(Macaca fascicularis)進行研究。總共12隻動物參與實驗,每組包括4隻猴。吾人在實驗中使用兩種產物劑量:5mg/kg;22mg/kg,對照組動物接受安慰劑產物。動物實驗組資料示於表2中。
為了誘導食蟹獼猴發生實驗性自體免疫性腦脊髓炎,使用經
修改的技術,該技術已描述於多個出版物中。為了使靈長類動物致敏,吾人使用得自JSC«BIOKAD»的重組蛋白,其為人類髓磷脂寡樹突神經膠質細胞蛋白質的胞外域(rhMOG,胺基酸1-125)。
每隻動物用含有400μg蛋白質於400μl磷酸鹽緩衝鹽水與400μl弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)混合物中之乳液注射三次。第一次投與rhMOG之後立即給猴注射熱滅活百日咳鮑特菌(B.pertussis)疫苗。
第一次投與rhMOG
為了製備乳液,將10mg rhMOG溶解於10ml磷酸鹽緩衝鹽水中。向所得溶液中添加10ml弗氏完全佐劑。藉由在8個點表皮下注射100μl(每隻猴的投藥總體積為800μl)投與所得乳液:
4次注射至脊椎區域(肩胛骨之間,2次位於脊髓右側且2次位於脊髓左側);
2次注射至腹股溝區域(1次位於右側且1次位於左側);
2次注射至腋下空間(1次位於右側且1次位於左側);
第一次投與rhMOG之後,靜脈內投與1010個滅活的百日咳鮑特菌顆粒。
第一次與第二次免疫接種之間間隔28天。
第二次投與rhMOG
為了製備乳液,將10mg rhMOG溶解於10ml磷酸鹽緩衝鹽水中。向所得溶液中添加10ml弗氏完全佐劑。藉由在8個點表皮下注射100μl(每隻猴的投藥總體積為800μl)投與所得乳液:
4次注射至脊椎區域(肩胛骨之間,2次位於脊髓右側且2次位於脊髓左側);
2次注射至腹股溝區域(1次位於右側且1次位於左側);
2次注射至腋下空間(1次位於右側且1次位於左側);
第二次與第三次免疫接種之間間隔14天。
第三次投與rhMOG
為了製備乳液,將10mg rhMOG溶解於10ml磷酸鹽緩衝鹽水中。向所得溶液中添加10ml弗氏完全佐劑。藉由在8個點表皮下注射100μl(每隻猴的投藥總體積為800μl)投與所得乳液:
4次注射至脊椎區域(肩胛骨之間,2次位於脊髓右側且2次位於脊髓左側);
2次注射至腹股溝區域(1次位於右側且1次位於左側);
2次注射至腋下空間(1次位於右側且1次位於左側);
評估BCD132-L-077產物對實驗性自體免疫性腦脊髓炎(EAE)模型的功效
為了量測產物活性,對腦及脊髓組織進行組織學檢查。根據表3,依三點量表對脊髓及腦組織的發炎反應嚴重度進行評分。
依表4中所示的量表對靈長類動物脊髓及腦組織的退化性變化嚴重度進行評分。
發炎嚴重度量測結果展示於圖34中。已展示研究中使用5.0mg/kg及22.0mg/kg劑量投與時,群組總分數相較於對照組(假處理對照組)降低。偵測到的變化不可靠。此外,實驗組之間不存在顯著差異。因此,吾人可以說兩種測試劑量的產物存在類似的消炎作用功效。
神經組織退化性變化嚴重度的量測結果展示於圖35中。使用5.0mg/kg最小劑量之測試產物BCD132-L-077時,吾人觀測到脫髓鞘分
數相較於對照組出現顯著降低。
接受22.0mg/kg劑量之產物的動物組亦展示所討論之參數值減小,但其不可靠。該等值在實驗組之間不存在顯著差異;因此,吾人可得出結論:兩種劑量的活性水準類似。
研究表明5.0mg/kg及22.0mg/kg劑量之產物在功效方面展示類似的消炎作用,且使實驗性靈長類動物之神經組織的脫髓鞘水準降低的程度類似。基於上述資料,5.0mg/kg的劑量可確立為藥理學活性劑量(FAD)。
實例20. BCD132-L-077多次皮下投與食蟹獼猴(Macaca fascicularis)之後的毒性及主要藥物動力學參數(毒物動力學)研究。
對雄性食蟹獼猴(Macaca fascicularis)進行研究。隔離之後,將動物根據待投與之產物劑量分成四個實驗組,每組包含三隻雄性,體重用作猴分組的準則。吾人在實驗中使用三種產物劑量:44mg/kg;88mg/kg;176mg/kg,對照組動物接受安慰劑產物。動物病狀、死亡動物數目及其死亡時序用作評估準則。注射之後觀測動物8小時,且接著每天觀測歷時42天。
實驗性動物組及產物劑量的資料示於表5中:
動物病狀、死亡動物數目及其死亡時序用作評估準則。
在研究界限內,在注射之後的第8小時及接著每日進行臨床檢查;另外,吾人評估以下:
.動物體重;
.體溫;
.尿分析;
.基於以下參數的全面血液分析:紅血球數目、白血球數目、血紅素濃
度;
.基於以下參數的血清生物化學分析:乳酸脫氫酶、總膽紅素、總蛋白質、葡萄糖、天冬胺酸轉胺酶、丙胺酸轉胺酶;
.血清中之產物濃度。
根據研究,測試產物在單次靜脈內投與之後不誘導食蟹獼猴死亡,實驗動物對投藥方法的耐受性良好。根據所討論之參數,產物對整體毒性指標及器官機能狀態不展示任何影響。在所選劑量範圍內,產物展現線性藥物動力學。
實例21. BCD132-L-077產物重複靜脈內投與食蟹獼猴(Macaca fascicularis)四週、隨後兩週恢復期之後的藥物動力學及免疫原性研究。
研究使用22.0、44.0及88.0mg/kg劑量重複靜脈內投與之後的藥物動力學及免疫原性。總共18隻性成熟猴(年齡4至7歲的9隻雌性猴及9隻雄性猴(食蟹獼猴))參與研究。基於待投與之產物劑量將動物分成3組。
藉由酶聯免疫吸附分析來量測靈長類動物血清中的BCD132-L-077含量。在研究期間,為了確定產物結合抗體之形成對藥物動力學參數的可能影響,量測BCD132-L-077產物的免疫原性。此外,吾人利用比率AUCss168(336-504):AUC0-168計算積聚係數。
為了計算AUC0-168值,即將在第一次投與之前,且接著在投與之後的0.25、24、72及168小時之後,獲取血清;為了計算AUCss168(336-504)值,即將在第四次投與產物之前,且接著在投與之後的0.25、24、72及168小時,獲取血清。基於僅來自其中未偵測到BAb之彼等動物的資料來計算
藥物動力學參數。因此,對產物展示免疫反應之動物的資料自藥物動力學參數計算中排除。藉由積聚指數量測產物積聚;為此目的,測定AUC0-168及AUCss(336-504)值且藉由下式計算指數:
其中AUCss168(336-504)為在重複投藥下,在與給藥間隔對應的時期期間(168小時),產物濃度-時間曲線下的面積平衡值;
AUC0-168為產物引入體內時至第一次投與後之168小時的產物濃度-時間曲線下的面積。
為了分析抗體結合BCD132-L-077產物的水準,吾人使用靈長類動物血清。第一次投與之前,及接著在實驗第4週及第7週獲取研究用的樣品。
實例22.重複靜脈內投與BCD132-L-077產物之遞增劑量(22.0mg/kg、44.0mg/kg、88.0mg/kg)之藥物動力學參數的比較。
圖36展示靈長類動物血清之BCD132-L-077產物濃度-時間平滑化曲線。表7展示各組主要藥物動力學參數的平均值。
利用產物投與後之336-504小時之給藥時段(168小時)中的穩態AUC值計算BCD132-L-077產物的藥物動力學參數。第一給藥間隔(1-168小時)中所計算的初始AUC與所用劑量直接相關。此參數在最小劑量組中為13,435.59±11,150.80(μg/ml)小時;在平均劑量組中為:13,301.04±8,719.10(μg/ml)小時;且在最大劑量組中為:34,145.90±16,765.50(μg/ml)小時。穩態下計算的AUC(336-504小時)亦與所用劑量相關。接受劑量為22mg/kg之產物之動物組的AUCss168(336-504)為26,227.47±16,819.40(μg/ml)小時;平均劑量組的該值為22,366.93±10,370.60(μg/ml)小時,且最大劑量組的該值為97,088.33±94,675.60(μg/ml)小時。接受劑量為22mg/kg之產物之動物組的半衰期值(T1/2)為94.76±50.30小時,平均劑量組的該值為155.38±111.20小時,且最大劑量組的該值為471.00±782.50小時。最小劑量組的清除率為0.00924±0.004 l/h,平均劑量組為0.01873±0.015 l/h且最大劑量組為0.01228±0.005 l/h。最小劑量組的產物平均滯留時間(MRT)為66.37±13.60小時,平均劑量組為68.30±17.50小時且最大劑量組為71.51±9.20小時。最小劑量組、平均劑量組及最大劑量組的穩態分佈體積(Vdss)分別為521.65±186.90ml/kg、1.639.68±1.170.50ml/kg、2.384.08±2.213.30ml/kg。最小劑量組、平均劑量組及最大劑量組的平均穩態濃度(Css)分別為156.12±100.10μg/ml、133.14±61.70μg/ml、577.91±563.50μg/ml。最大穩態濃度(Cssmax)為326.89±241.70μg/ml、427.03±266.50μg/ml、1.212.72±830.90μg/ml。最小穩態濃度(Cssmin)為82.64±75.20μg/ml、84.58±63.90μg/ml、162.88±74.70μg/ml。所得資料表明靈長類動物血清中的產物濃度與實驗中所用的BCD132-L-077劑量直接相關。
對於接受最小劑量為22.0mg/kg之產物的動物組而言,積聚指數(R)為1.95。對於接受平均劑量為44.0mg/kg之BCD-132的動物組而言,積聚指數R為1.68。對於接受最大劑量(88.0mg/kg)之產物的動物組而言,指數R為2.84。所得實驗資料表明積聚指數值不依賴於所用劑量。
在研究期間,為了確定產物結合抗體之形成對藥物動力學參數的可能影響,量測BCD132-L-077產物的免疫原性。實驗資料表明參與研究之所有動物中11.11%存在BAb。未發現與性別相關;在一隻雄性及一隻
雌性中觀測到BAb。發現平均劑量組及最大劑量組存在產物結合抗體,每組僅一隻動物中發現產物結合抗體。可評估所有動物組的藥物動力學參數,其限制條件為確定存在結合抗體之動物的實驗資料自處理程序中排除。
實例23. BCD132-L-077產物重複靜脈內投與食蟹獼猴(Macaca fascicularis)四週、隨後兩週恢復期之後,對毒性及局部刺激物影響的研究。
年齡4至7歲的總共30隻食蟹獼猴(Macaca fascicularis)(15隻雄性及15隻雌性)參與實驗。每組包括6隻猴。研究以22mg/kg、44mg/kg及88mg/kg劑量重複投藥下的產物毒性。根據待投與之產物劑量及安樂死時間將動物分成5組:
最小劑量為22mg/kg的BCD132-L-077產物(3隻雌性及3隻雄性);
平均劑量為44mg/kg的BCD132-L-077產物(3隻雌性及3隻雄性);
最大劑量為88mg/kg的BCD132-L-077產物,投藥結束之後安樂死(3隻雌性及3隻雄性);
最大劑量為88mg/kg的BCD132-L-077產物,恢復期結束之後安樂死(3隻雌性及3隻雄性);
假處理對照組(3隻雌性及3隻雄性)。
動物實驗組資料展示於表8中。
在研究界限內,每天進行臨床檢查;另外,吾人檢查以下:
.動物體重;
.體溫;
.尿分析;
.ECG;
.止血參數:活化部分凝血活酶時間、纖維蛋白原濃度、凝血酶原時間;
.基於以下參數的全面血液分析:紅血球數目、白血球數目、血紅素濃度、淋巴球、單核球、嗜中性球、嗜伊紅血球、嗜鹼性球;
.基於以下參數的血清生物化學分析:乳酸脫氫酶、總膽紅素、總蛋白質、葡萄糖、天冬胺酸轉胺酶、丙胺酸轉胺酶、膽固醇、三酸甘油酯、尿素、肌酸酐、鈉、鉀、鹼性磷酸酶;
.病理形態及組織學研究。
基於檢查資料及組織學檢查結果來評估局部刺激物影響。選擇投藥位點處的組織及引流淋巴結用於組織學檢查。
根據組織學檢查,測試產物不展示局部刺激物影響。
JSC«BIOKAD»所產生之BCD132-L-077治療性單株抗體產物之毒性研究中所獲得之資料表明,在歷時4週的重複每週靜脈內投與下,測試產物對實驗動物的主要器官及器官系統不展現毒性效應。此研究中所確定的觀測不到之副作用水準(NOAEL)對應於測試產物BCD132-L-077的最大劑量且等於88mg/kg。
實例24. BCD132-L-028產物在重複腹膜內投與免疫缺乏hIL15-NOG小鼠之後之抗腫瘤活性的研究,該等小鼠用人類NK細胞發生人類化且基於使用Raji人類淋巴瘤細胞株的皮下異種移植物模型。
在研究中,吾人計劃使用7組免疫缺乏轉殖基因hIL15-NOG小鼠,該等小鼠組成性表現人類IL-15且體重為15.0-25.0g。總共84隻雌性動物參與實驗。各組資料展示於表9中。
投與腫瘤細胞株之前,將動物稱重,且接著在整個實驗期間一週稱重2次。
投與腫瘤細胞之後,在整個實驗期間一週2次量測腫瘤節結。
根據下式計算腫瘤節結體積:
V=π/6×L×W×H,其中L、W、H為腫瘤線性尺寸。
藉由腫瘤生長抑制指數(TGI)相對於腫瘤生長指數(I)來評估測試產物的功效。根據下式計算指數:
其中Vk及Vo分別為對照組及處理組的中值腫瘤體積(MM3)。
I i =V i /V o ,
其中I為腫瘤生長指數,i為實驗日,Vo為每天腫瘤體積。
實例25. BCD132-L-028單株抗體產物在單次靜脈內投與食蟹獼猴(Macaca fascicularis)之後的毒性及主要藥物動力學參數(毒物動力學)研究
在研究中,吾人計劃使用四組實驗性食蟹獼猴,每組包括三隻雄性。根據實驗,根據動物數目之指示,將猴保持於個別籠中。
使用體重作為準則,根據待投與之物質的劑量,將動物隨機分組。
計劃將產物以等張性無菌生理鹽水溶液靜脈內投與肘脈。使
用與實驗組所用相同的體積及方法,將等張性生理鹽水(安慰劑)投與對照組動物。
在研究界限內,每天進行臨床檢查;另外,吾人檢查以下:
1.動物體重;
2.體溫;
3.尿分析;
4.基於以下參數的全面血液分析:紅血球數目、白血球數目、血紅素濃度;
5.基於以下參數的血清生物化學分析:乳酸脫氫酶、總膽紅素、總蛋白質、葡萄糖、天冬胺酸轉胺酶、丙胺酸轉胺酶;
6.血清中之產物濃度研究、主要藥物動力學參數計算,及藥物動力學線性度評估。
實例26. BCD132-L-028單株抗體產物重複靜脈內投與食蟹獼猴(Macaca fascicularis)13週、隨後30天恢復期之後,對藥物動力學及免疫原性的研究。
在重複靜脈內投與13週、隨後30天恢復期之後的藥物動力學及免疫原性研究中,吾人計劃使用18隻食蟹獼猴(9隻雄性及9隻雌性)。
根據待投與之物質劑量將動物分成3組(表11),每組包括3隻雌性及3隻雄性:最小劑量組(6mg/kg)、中間劑量組(20mg/kg)、最大劑量組(60mg/kg)。
在研究中,吾人計劃:
1.評估實驗動物血清中的測試產物濃度;
2.在投與遞增劑量下,評估測試產物積聚;
3.在重複靜脈內投與測試產物下,評估結合抗體的水準。
實例27. BCD132-L-028單株抗體產物重複靜脈內投與食蟹獼猴(Macaca fascicularis)13週、隨後30天恢復期之後的毒性及局部刺激物影響研究。
在研究中,吾人計劃使用5組實驗性食蟹獼猴,每組包括3隻雄性及3隻雌性:最小劑量組(6mg/kg,不進行屍體解剖)、中間劑量組(20mg/kg,不進行屍體解剖)、最大劑量衛星組(60mg/kg,產物投與期結束之後進行屍體解剖)、主要最大劑量組(60mg/kg,恢復期結束之後進行屍體解剖)及假處理對照組(恢復期結束之後進行屍體解剖)。
每天對每隻動物進行臨床檢查;另外,吾人將評估以下:
.動物體重;
.體溫(投藥之前及接著每週進行直至實驗終止);
.使用Poly-Spectr心動描記法評估對心血管系統的影響;
.尿分析;
.基於以下參數的全面血液分析:紅血球數目、白血球數目、血紅素濃度、淋巴球數目、單核球數目、嗜中性球數目、嗜伊紅血球數目、嗜鹼性球數目;
.基於以下參數評估對血液凝固系統的影響:活化部分凝血酶原時間、纖維蛋白原濃度、凝血酶原時間;
.基於以下參數的血清生物化學分析:鈉、鉀、肌酐、尿素、鹼性磷酸酶、乳酸脫氫酶、總膽紅素、總蛋白質、葡萄糖、三酸甘油酯、天冬胺酸轉胺酶、丙胺酸轉胺酶、總膽固醇;
在產物投與期結束時(第14週),吾人計劃將每個動物組中的三隻雄性及三隻雌性安樂死。各組中的剩餘兩隻雄性及兩隻雌性在恢復期結束時(第18週)安樂死。基於屍體解剖資料及組織學檢查結果評估局部刺激物影響。為了進行組織學檢查,吾人將選擇肘脈、投藥位點處之組織及引流淋巴結的切片。
<110> JSC "BIOCAD"
<120> 特異性結合至CD20的單株抗體
<160> 8
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列BCD132-L-077_HC
<400> 1
<210> 2
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列BCD132-L-077_VH
<400> 2
<210> 3
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列BCD132-L-077_LC
<400> 3
<210> 4
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列BCD132-L-028_HC
<400> 4
<210> 5
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列BCD132-L-028_HC
<400> 5
<210> 6
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列BCD132-L-028_VH
<400> 6
<210> 7
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列BCD132-L-028_LC
<400> 7
<210> 8
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列BCD132-L-028_VL
<400> 8
Claims (36)
- 一種特異性結合至CD20的單株抗體或其抗原結合片段,其包含:1)包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列的重鏈可變域;2)包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8中所示之胺基酸序列的輕鏈可變域。
- 如請求項1之單株抗體或其抗原結合片段,其中1)該重鏈可變域包含SEQ ID NO:2中所示之胺基酸序列;2)該輕鏈可變域包含SEQ ID NO:4中所示之胺基酸序列。
- 如請求項1之單株抗體或其抗原結合片段,其中1)該重鏈可變域包含SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列;2)該輕鏈可變域包含SEQ ID NO:8中所示之胺基酸序列。
- 如請求項1之單株抗體,其包含:1)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5中所示之胺基酸序列的重鏈;2)包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7中所示之胺基酸序列的輕鏈。
- 如請求項4之單株抗體,其包含:1)包含SEQ ID NO:1中所示之胺基酸序列的重鏈;2)包含SEQ ID NO:3中所示之胺基酸序列的輕鏈。
- 如請求項4之單株抗體,其包含:1)包含SEQ ID NO:5中所示之胺基酸序列的重鏈;2)包含SEQ ID NO:7中所示之胺基酸序列的輕鏈。
- 如請求項1之單株抗體,其中特異性結合至CD20的該抗體為全長IgG抗體。
- 如請求項7之單株抗體,其中該全長IgG抗體係指人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4同型。
- 如請求項8之單株抗體,其中該完整IgG抗體係指人類IgG1同型。
- 一種核酸,其編碼如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項10之核酸,其中該核酸為DNA。
- 一種表現載體,其包含如請求項10至11中任一項之核酸。
- 一種用於產生宿主細胞以便產生如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段的方法,該方法包含用如請求項12之載體使細胞轉型。
- 一種宿主細胞,用於產生如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段,該宿主細胞包含如請求項10至11中任一項之核酸。
- 一種用於產生如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段的方法,其包含:在培養基中、在足以產生該抗體或其抗原結合片段的條件下培養如請求項14之宿主細胞,必要時隨後分離且純化所產生之該抗體或其抗原結合片段。
- 一種用於預防或治療CD20介導之疾病或病症的醫藥組合物,其包含如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑的組合。
- 如請求項16之用於預防或治療的醫藥組合物,其中該疾病或病症選自:a)腫瘤疾病或病症,或b)自體免疫疾病或病症。
- 如請求項17之醫藥組合物,其中該腫瘤疾病或病症選自包含以下之群:B細胞淋巴瘤或白血病。
- 如請求項18之醫藥組合物,其中該B細胞淋巴瘤選自:非霍奇金淋巴瘤(NHL)或霍奇金氏病(霍奇金氏淋巴瘤)。
- 如請求項18之醫藥組合物,其中該白血病選自:慢性淋巴球性白血病(CLL)或小淋巴球性淋巴瘤(SLL)。
- 如請求項17之醫藥組合物,其中該自體免疫疾病或病症選自包含以下之群:類風濕性關節炎、幼年型類風濕性關節炎(斯蒂爾氏病)、全身性紅斑性狼瘡症(SLE)、狼瘡性腎炎、潰瘍性結腸炎、韋格納氏疾病、發炎性腸病、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自體免疫血小板減少症、多發性硬化症、牛皮癬、IgA腎病變、IgM多發性神經病變、重症肌無力、脈管炎、ANCA脈管炎、實質性器官移植排斥反應、移植物抗宿主疾病(GvHD)、糖尿病、雷諾氏症候群、休格連氏症候群及腎絲球腎炎。
- 一種用於預防或治療CD20介導之疾病或病症的醫藥組合,該醫藥組 合包含如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段及至少一種不同治療活性化合物。
- 如請求項22之醫藥組合,其中該不同治療活性的抗腫瘤化合物選自化學治療劑、抗體或抗激素劑。
- 一種抑制需要此類抑制之個體體內之CD20生物活性的方法,包含投與有效量的如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段。
- 一種治療CD20介導之疾病或病症的方法,包含以治療有效量向需要此類治療之個體投與如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項16之醫藥組合物。
- 如請求項25之用於治療疾病或病症的方法,其中該疾病或病症選自:a)腫瘤疾病或病症,或b)自體免疫疾病或病症。
- 如請求項26之用於治療疾病或病症的方法,其中該腫瘤疾病或病症選自包含以下之群:B細胞淋巴瘤或白血病。
- 如請求項27之用於治療疾病或病症的方法,其中該B細胞淋巴瘤選自:非霍奇金淋巴瘤(NHL)或霍奇金氏病(霍奇金氏淋巴瘤)。
- 如請求項27之用於治療疾病或病症的方法,其中該白血病選自:慢性淋巴球性白血病(CLL)或小淋巴球性淋巴瘤(SLL)。
- 如請求項26之用於治療疾病或病症的方法,其中該自體免疫疾病或病症選自包含以下之群:類風濕性關節炎、幼年型類風濕性關節炎(斯蒂爾氏病)、全身性紅斑性狼瘡症(SLE)、狼瘡性腎炎、潰瘍性結腸炎、韋格納氏疾病、發炎性腸病、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自體免疫血小板減少症、多發性硬化症、牛皮癬、IgA腎病變、IgM多發性神經病變、重症肌無力、脈管炎、ANCA脈管炎、實質性器官移植排斥反應、移植物抗宿主疾病(GvHD)、糖尿病、雷諾氏症候群、休格連氏症候群及腎絲球腎炎。
- 一種如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項16之醫藥組合物的用途,用於治療需要此類治療之個體的由CD20介導之疾病或病症。
- 如請求項27之抗體或其抗原結合片段的用途,其中該疾病或病症選自:a)腫瘤疾病或病症,或b)自體免疫疾病或病症。
- 如請求項32之抗體或其抗原結合片段的用途,其中該腫瘤疾病或病症選自包含以下之群:B細胞淋巴瘤或白血病。
- 如請求項33之抗體或其抗原結合片段的用途,其中該B細胞淋巴瘤選自:非霍奇金淋巴瘤(NHL)或霍奇金氏病(霍奇金氏淋巴瘤)。
- 如請求項33之抗體或其抗原結合片段的用途,其中該白血病選自:慢性淋巴球性白血病(CLL)或小淋巴球性淋巴瘤(SLL)。
- 如請求項32之抗體或其抗原結合片段的用途,其中該自體免疫疾病或病症選自包含以下之群:類風濕性關節炎、幼年型類風濕性關節炎(斯蒂爾氏病)、全身性紅斑性狼瘡症(SLE)、狼瘡性腎炎、潰瘍性結腸炎、韋格納氏疾病、發炎性腸病、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自體免疫血小板減少症、多發性硬化症、牛皮癬、IgA腎病變、IgM多發性神經病變、重症肌無力、脈管炎、ANCA脈管炎、實質性器官移植排斥反應、移植物抗宿主疾病(GvHD)、糖尿病、雷諾氏症候群、休格連氏症候群及腎絲球腎炎。
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