KR20110097772A - 생리적 조건하에 거대분자의 응집을 감소시키는 방법 및 제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 분자량 범위 2000 내지 54,000 달톤의 5％ 내지 20％ 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 첨가하여 생리적 조건하에서 단백질과 같은 거대분자의 응집을 감소시키고 이것의 엉김을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 거대분자의 피하 투여 동안 주사 부위에서의 염증을 최소화하는 방법을 추가로 제공한다. 추가의 측면에서, 본 발명은 거대분자의 피하 투여용 제약 제제, 및 본 발명의 제약 제제 중 인간화 항-CD20 항체를 투여하는 것을 포함하는, CD20 양성 암 또는 자가면역 질환의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 생리적 조건하에 항체 또는 기타 거대분자의 응집을 감소시키는 부형제의 능력을 평가하는 시험관내 투석 방법을 추가로 제공한다.

Description

생리적 조건하에 거대분자의 응집을 감소시키는 방법 및 제제 {METHOD AND FORMULATION FOR REDUCING AGGREGATION OF A MACROMOLECULE UNDER PHYSIOLOGICAL CONDITIONS}

본 발명은 거대분자의 피하 투여를 위한 주사 부위에서 생리적 조건하에서의 응집을 감소시킴으로써 염증을 최소로 하는 방법에 관한 것이다.

지난 20년 동안, 재조합 DNA 기술은 생체분자, 특히 단백질인 의약의 수를 유의하게 증가시켰다. 생체분자 약제의 증가는 약물 제제에 있어서의 새로운 도전으로 이어졌다. 고용량의 단백질 치료제, 예컨대 항체는 정맥내 주입에 의해 환자에게 전달될 수 있지만 이러한 약물 투여 경로는 불편하고, 일반적으로는 단백질 치료제를 가능하다면 피하 주사제로 제제화하는 것이 바람직하다. 그러나, 피하 주사용 약물 용액은 i.v. 주입시보다 훨씬 더 적은 부피여서 단백질이 반드시 더 높은 농도로 존재한다. 1 밀리리터 당 수십 밀리그램의 높은 치료용 단백질 농도에서는 치료용 단백질을 오랜 기간 동안 안정적으로 용해된 상태로 유지하는 것이 중요하다. 고농도의 단백질 용액은 응집이 일어나게 하는 단백질-단백질 상호작용의 가능성을 증가시킨다. 응집의 방지는 단백질 약물 제제에 있어서 주요 현안이 되었다. 응집은 활성 단백질의 생체이용률 감소, 약력학의 변경 및 원치않는 면역원성을 비롯한 수많은 문제점을 야기한다 ([Frokjaer, S. and Otzen, D.E., Nat. Rev. Drug. Discov. 4: 298-306 (2005)], [Jiskoot, W. and Crommelin, D.J.A., EJHP Practice 12:20-21 (2006))]).

응집 과정의 분자적인 세부사항이 일반적으로 알려져 있지 않기 때문에 응집의 방지는 여전히 주로 경험적이다. 전형적인 전략은 단백질 용액에 안정화제를 첨가하는 것이다. 통상적으로 사용되는 안정화제는 당, 염, 유리 아미노산, 예컨대 L-아르기닌 및 L-글루타민 ([Golovanov, A.P. et al., J. Am. Chem. Soc. 126:8933-8939 (2004)]), 폴리올 ([Singh, S. and Singh, J., AAPS Pharm. Sci. Tech 4: 1-9 (2003)], [Mishra, R. et al., J. Biol. Chem. 280:15553-15560 (2005)]), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 및 단백질-단백질 상호작용을 감소시킬 수 있는 기타 중합체, 예컨대 폴리소르베이트 또는 폴록사머 ([Frokjaer and Otzen, 상기 문헌], [Lee, R.C. et al., Ann. Biomed. Eng. 34: 1190-1200 (2006)], [Nema, S. et al., PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 51: 166-171 (1997)])를 포함한다.

PVP는 본질적으로 선형 중합된 1-비닐-2-피롤리디논 (비닐피롤리돈)으로 이루어진 합성 중합체이고, 이것의 중합 정도에 따라 다양한 분자량의 중합체가 생성된다. 폴리비닐피롤리돈에 대한 동의어는 PVP, 폴리(1-비닐-2-피롤리돈), 포비돈 및 콜리돈(Kollidon)을 포함한다. PVP는 경구 및 국소 경로에서 생물학적으로 불활성이고 비-독성이다. 분자량 25,000 달톤 미만의 PVP는 사구체 여과에 의해 전신 순환으로부터 제거되기 때문에 신체 내에 축적될 것이라 예상되지 않는다.

PVP는 제약 산업에서 정제 코팅 보조제로서, 및 안과용 및 국소 제제에서 점도 증진제로서 널리 사용되어 왔다. PVP는 또한 원래 비경구 투여시에 혈장 증량제로서 사용되었고, 이후에는 주사가능한 제제 (예를 들어, 항생제, 호르몬, 진통제)에서 점도 부여를 위해 사용되었다. 이들 제제는 소분자 화합물 또는 통상적으로 500 달톤 미만의 작은 단백질, 예컨대 호르몬으로 제한된다. 현재 이용가능한 PVP 함유 약물 제품은 비실린(Bicillin) C-R™ (와이어쓰(Wyeth)), 위실린(Wycillin)™ (와이어쓰) 및 화이자펜(Pfizerpen)™ (화이자(Pfizer))를 포함하며, 이것들 모두가 소분자 페니실린 G를 매우 낮은 농도 (≤ 0.6％)의 PVP와 함께 함유한다. Depo-SubQ 프로베라(Provera) 104™ (파마시아 앤드 업존(Pharmacia and Upjohn))는 5％ PVP를 소분자 메드록시프로게스테론 아세테이트와 함께 함유한다. 벡사르(Bexxar)™ (글락소 스미스 클라인(Glaxo Smith Kline))는 방사선표지된 항-CD20 항체를 4.4％ 내지 6.6％ PVP와 함께 함유한다. 특히, 벡사르의 경우에, PVP는 방사선표지된 항체가 그에 부착된 방사선동위원소에 의해 자가방사선분해되는 것을 감소시키기 위한 방사선보호제로서 사용된다 (미국 특허 번호 5,961,955 및 미국 특허 번호 6,338,835).

PVP 및 폴리에틸렌 글리콜은 또한 생화학자에 의해 용해된 단백질을 침전시키는데 사용된다 (미국 특허 번호 5,525,519).

CD20 항원 (인간 B-림프구-제한된 분화 항원, Bp35라고도 불림)은 프리(pre)-B 및 성숙 B 림프구에 위치하는 대략 35 kD 분자량의 소수성 막횡단 단백질이다 ([Valentine et al., J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989)] 및 [Einfeld et al., EMBO J. 7(3):711-717 (1988)]). 상기 항원은 또한 B 세포 비-호지킨 림프종 (NHL)의 90％ 초과에서 발현되지만 ([Anderson et al., Blood 63(6):1424-1433 (1984)]), 조혈 줄기 세포, 프로(pro)-B 세포, 정상적인 혈장 세포 또는 기타 정상 조직에서는 발견되지 않는다 ([Tedder et al., J. Immunol. 135(2):973-979 (1985)]). CD20은 세포 주기 개시 및 분화를 위한 활성화 과정의 초기 단계(들)을 조절한다고 여겨지고 ([Tedder et al., 상기 문헌]), 가능하게는 칼슘 이온 채널로서 기능한다 ([Tedder et al., J. Cell. Biochem. 14D:195 (1990)]).

B 세포 림프종에서 CD20이 발현되기 때문에, 이 항원은 이러한 림프종의 치료를 위한 유용한 치료 표적이었다. 예를 들어, 리툭시맙 (리툭산(RITUXAN)^®, 마브테라(MABTHERA)^®) 항체는 인간 CD20 항원에 대한 유전자 조작된 키메라 뮤린/인간 모노클로날 항체 (미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코 소재의 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 및 스위스 바젤 소재의 에프.호프만-라 로쉐 아게(F.Hoffmann-La Roche AG)가 시판함)로, 이것은 재발성 또는 불응성 저 악성도 또는 여포성의 CD20 양성 B 세포 비-호지킨 림프종을 갖는 환자의 치료에 사용된다. 리툭시맙은 1998년 4월 7일자로 허여된 미국 특허 번호 5,736,137 (Anderson et al.) 및 미국 특허 번호 5,776,456에서 "C2B8"이라고 지칭되는 항체이다. NHL의 치료용으로 지정된 다른 항-CD20 항체는 방사선동위원소 이트륨-90에 연결된 뮤린 항체 제발린(Zevalin)™ (미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 아이데크 파마슈티칼즈(IDEC Pharmaceuticals)) 및 I-131에 접합된 또 다른 완전 뮤린 항체인 벡사르™ (미국 워싱턴주 소재의 코릭사(Corixa))를 포함한다.

CD20은 또한 자가면역 질환의 치료에 유용한 표적 항원이다. 리툭시맙은 또한 B 세포 및 자가항체가 질환 병태생리에 소정의 역할을 한다고 여겨지는 다양한 비-악성 자가면역 장애에서도 연구되었다 (예를 들어, 문헌 [Edwards et al., Biochem Soc. Trans. 30:824-828 (2002)]). 리툭시맙은 예를 들어 류마티스 관절염 (RA) ([Leandro et al., Ann. Rheum. Dis. 61:883-888 (2002)], [Edwards et al., Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S46 (2002)], [Stahl et al., Ann. Rheum. Dis., 62 (Suppl. 1): OP004 (2003)], [Emery et al., Arthritis Rheum. 48(9): S439 (2003)]), 루푸스 ([Eisenberg, Arthritis. Res. Ther. 5:157-159 (2003)], [Leandro et al., Arthritis Rheum. 46: 2673-2677 (2002)], [Gorman et al., Lupus, 13: 312-316 (2004)]), 면역 혈소판감소성 자반병 ([D'Arena et al., Leuk. Lymphoma 44:561-562 (2003)], [Stasi et al., Blood, 98: 952-957 (2001)], [Saleh et al., Semin. Oncol., 27 (Supp 12):99-103 (2000)], [Zaia et al., Haematolgica, 87: 189-195 (2002)], [Ratanatharathorn et al., Ann. Int. Med., 133: 275-279 (2000)]), 진정 적혈구계 무형성 ([Auner et al., Br. J. Haematol., 116: 725-728 (2002)]), 자가면역 빈혈 ([Zaja et al., Haematologica 87:189-195 (2002)] (오자는 문헌 [Haematologica 87:336 (2002)]에 기재됨)), 한랭 응집소 질환 ([Layios et al., Leukemia, 15: 187-8 (2001)], [Berentsen et al., Blood, 103: 2925-2928 (2004)], [Berentsen et al., Br. J. Haematol., 115: 79-83 (2001)], [Bauduer, Br. J. Haematol., 112: 1083-1090 (2001)], [Damiani et al., Br. J. Haematol., 114: 229-234 (2001)]), 중증 인슐린 내성의 유형 B 증후군 ([Coll et al., N. Engl. J. Med., 350: 310-311 (2004)]), 혼합형 한랭글로불린혈증 ([DeVita et al., Arthritis Rheum. 46 Suppl. 9:S206/S469 (2002)]), 중증 근무력증 ([Zaja et al., Neurology, 55: 1062-63 (2000)], [Wylam et al., J. Pediatr., 143: 674-677 (2003)]), 베게너 육아종증 ([Specks et al., Arthritis ＆ Rheumatism 44: 2836-2840 (2001)]), 불응성 심상성 천포창 ([Dupuy et al., Arch Dermatol., 140:91-96 (2004)]), 피부근염 ([Levine, Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9):S1299 (2002)]), 쇼그렌 증후군 ([Somer et al., Arthritis ＆ Rheumatism, 49: 394-398 (2003)]), 활성 유형-II 혼합형 한랭글로불린혈증 ([Zaja et al., Blood, 101: 3827-3834 (2003)]), 심상성 천포창 ([Dupay et al., Arch. Dermatol., 140: 91-95 (2004)]), 자가면역 신경병증 ([Pestronk et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 74:485-489 (2003)]), 방종양성 안간대-간대성근경련 증후군 ([Pranzatelli et al., Neurology 60(Suppl. 1) PO5.128:A395 (2003)]) 및 재발 완화형 다발성 경화증 (RRMS) ([Cross et al. (abstract) "Preliminary results from a phase II trial of Rituximab in MS" Eighth Annual Meeting of the Americas Committees for Research and Treatment in Multiple Sclerosis, 20-21 (2003)])의 징후 및 증상을 잠재적으로 경감시킨다고 보고된 바 있다.

본 발명은 생리적 조건하에 항체와 같은 거대분자의 응집을 방지하는 방법 및 제제를 제공한다. 본 발명의 방법은 치료용 단백질, 예컨대 본 명세서에 기재된 항-CD20 항체의 제제 제조시에 이점을 제공한다. 이러한 이점은 치료용 항체의 생체이용률을 증가시키고 주사 부위에서 염증을 감소시키는 피하 주사용 제제의 제조 능력 및 또한 하기하는 발명의 상세한 설명에서 명백할 추가의 이점을 포함한다.

발명의 요약

PVP 및 폴리에틸렌 글리콜은 생화학자에 의해 용해된 단백질을 침전시키는데 사용된다 (미국 특허 번호 5,525,519). 분자량 범위 2000 내지 54,000 달톤의 PVP가 단백질의 응집 및 엉김(flocculation)을 실제로 억제하여 이것의 용해도를 개선시킨다는 본 발명자들의 발견은 예상치 못한 것이었고, 따라서 PVP의 신규 용도이다. 본 발명자들은 또한 한정된 분자량 (MW) 컷-오프(cut-off)를 갖는 투석 튜브(tubing) 및 주문제작된 방출 매질의 사용을 포함하는 신규 시험관내 스크리닝 방법을 개발하였고, 이것들 둘다 주사 부위에서의 생리적 조건을 모방한다.

본 발명은 분자량 범위 2000 내지 54,000 달톤의 5％ 내지 20％ 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 첨가하여 생리적 조건하에 단백질과 같은 거대분자의 응집을 감소시키고 이것의 엉김을 억제하는 방법을 제공한다. PVP 첨가에 의한 응집 및 엉김의 유의한 감소는 또한 래트에서 피하 주사 부위에서의 염증의 유의한 감소와도 상관관계가 있었다. 본 발명은 분자량 범위 2000 내지 54,000 달톤의 5％ 내지 20％ 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 단백질과 같은 거대분자의 피하 제제에 첨가하여 단백질과 같은 거대분자의 피하 투여 동안에 주사 부위에서의 염증을 최소화하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 거대분자는 항체이다. 본 발명의 추가의 실시양태에서, 항체는 치료용 항체 또는 진단용 항체이다.

본 발명의 다양한 실시양태에서, 거대분자는 항-CD20 항체이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 항-CD20 항체는 인간화 항체이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 항-CD20 항체는 표 1의 변이체 A, B, C, D, F, G, H 또는 I 중 하나를 포함한다. 본 발명은 항-CD20 항체가 서열 1 내지 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법 및 제제를 추가로 제공한다. 본 발명의 추가의 실시양태에서, 항체는 서열 1의 경쇄 가변 도메인 및 서열 2의 중쇄 가변 도메인, 또는 서열 3의 경쇄 가변 도메인 및 서열 4의 중쇄 가변 도메인, 또는 서열 3의 경쇄 가변 도메인 및 서열 5의 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 본 발명은 항체가 서열 6의 전장 경쇄 및 서열 7, 서열 8 또는 서열 15의 전장 중쇄를 포함하는 것인 방법 및 제제를 추가로 제공한다. 본 발명은 항체가 서열 9의 전장 경쇄 및 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13 또는 서열 14의 전장 중쇄를 포함하는 것인 방법 및 제제를 추가로 제공한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 분자량 범위 2000 내지 54,000 달톤의 5％ 내지 20％ 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 포함하는, 단백질과 같은 거대분자의 피하 투여용 제약 제제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 10 mg/mL 내지 200 mg/mL 농도 범위의 항체, 및 분자량 범위 2000 내지 54,000 달톤의 5％ 내지 20％ 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 포함하는, 항체의 피하 투여용 제약 제제를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체 농도 범위는 30 내지 150 mg/mL이다. 추가의 실시양태에서, 항체 농도 범위는 100 내지 150 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, PVP의 농도는 10％이다. 특정 실시양태에서, PVP의 분자량 범위는 7000 내지 11,000 달톤이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 100 mg/mL의 인간화 2H7 항체, 및 분자량 범위 7000 내지 11,000 달톤의 10％ PVP를 포함하는, 항체의 피하 투여용 제약 조성물을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 제약 조성물은 30 mM 아세트산나트륨, 5％ 트레할로스 이수화물, 및 pH 5.3의 0.03％ 폴리소르베이트 20(Polysorbate 20)을 추가로 포함한다.

본 발명은 표 1에 기재된 임의의 항체로 이루어진 인간화 항-CD20 항체를 포함하는 임의의 상기 제제를 추가로 제공한다. 본 발명은 항-CD20 항체가 서열 1 내지 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제제를 추가로 제공한다. 본 발명의 추가의 실시양태에서, 항체는 서열 1의 경쇄 가변 도메인 및 서열 2의 중쇄 가변 도메인, 또는 서열 3의 경쇄 가변 도메인 및 서열 4의 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 본 발명은 항체가 서열 6의 전장 경쇄 및 서열 7, 서열 8 또는 서열 15의 전장 중쇄를 포함하는 것인 방법 및 제제를 추가로 제공한다. 본 발명은 항체가 서열 9의 전장 경쇄 및 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13 또는 서열 14의 전장 중쇄를 포함하는 것인 방법 및 제제를 추가로 제공한다.

본 발명은 분자량 범위 2000 내지 54,000 달톤의 5％ 내지 20％ 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 포함하는 제약 제제 중 표 1의 인간화 항-CD20 항체 중 임의의 하나를 투여하는 것을 포함하는, CD20 발현 B 세포의 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. CD20 양성 B 세포 암은 바람직하게는 B 세포 림프종 또는 백혈병이다. 구체적인 실시양태에서, 인간 CD20 (hCD20)에 결합하는 인간화 2H7 항체 및 그의 기능적 단편을 포함하는 제제를 비-호지킨 림프종 (NHL), 무통성 NHL, 예를 들어 재발성 무통성 NHL 및 리툭시맙-불응성 무통성 NHL, 림프구 우세형 호지킨병 (LPHD), 소형 림프구성 림프종 (SLL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL)의 치료에 사용한다. 구체적인 실시양태에서, 인간화 CD20 결합 항체, 특히, 표 1의 변이체 A, B, C, D 또는 H, 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 제제를 상기한 CD20 양성 B 세포 암의 치료에 사용한다.

본 발명은 또한 자가면역 질환으로 고통받는 환자에게 분자량 범위 2000 내지 54,000 달톤의 5％ 내지 20％ 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 포함하는 제약 제제 중 치료 유효량의 표 1의 인간화 2H7 항체를 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 자가면역 질환은 류마티스 관절염 (RA) 및 연소성 류마티스 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되고, RA 환자는 메토트렉세이트 (Mtx)-부적합 반응자 및 TNFα-길항제 부적합 반응자, 리툭시맙-불응성 또는 재발 환자이다. 한 실시양태에서, RA 환자는 또 다른 항-CD20 치료용 항체에 불응성 또는 재발성이다. 다른 실시양태에서, 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 예를 들어 루푸스 신염, 다발성 경화증 (MS), 예를 들어 재발 완화형 다발성 경화증 (RRMS), 베게너병, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신증, IgM 다발성신경병증, 중증 근무력증, ANCA 관련 혈관염, 진성 당뇨병, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군, 시신경 척수염 (NMO) 및 사구체신염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 구체적인 실시양태에서, 인간화 CD20 결합 항체, 특히, 표 1의 변이체 A, B, C, D 또는 H, 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 제제를 상기 기재된 자가면역 질환의 치료에 사용한다.

상기 언급된 질환을 치료하는 방법의 특정 실시양태에서, 상기 질환으로 고통받는 대상체 또는 환자는 영장류, 바람직하게는 인간이다.

본 발명은 분자량 범위 2000 내지 54,000 달톤의 5％ 내지 20％ 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 항체를 포함하는 수성 피하 제제에 첨가하여 주사시에 환자의 주사 부위에서 상기 수성 피하 제제 중 항체의 가용화를 개선 또는 유지하거나 항체의 침전을 최소화하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 분자량 범위 2000 내지 54,000 달톤의 5％ 내지 20％ 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 항체를 포함하는 수성 피하 제제에 첨가하여 피하 투여될 항체의 생체이용률을 증가시키는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 시험 부형제가 존재하는 거대분자의 제제 및 시험 부형제가 존재하지 않는 거대분자의 제제를 시험 매질에 대해 37℃에서 일정한 교반하에 투석하여 생리적 조건을 모방하는 단계, 변형된 매질 용액을 샘플링하는 단계, 및 외관, 예를 들어 샘플의 탁도 및 방출 매질 중에 존재하는 단백질의 양을 UV 측광 스캐닝과 같은 방법으로 측정하는 것을 포함하고, 여기서 부형제가 없는 대조군에 비해 시험 부형제를 함유하는 검정에서 방출 매질 중 단백질 농도가 증가하고 탁도가 감소한 것이 거대분자의 응집을 감소시키는 시험 부형제의 능력을 나타내는 것인, 생리적 조건하에 항체 또는 기타 거대분자의 응집을 감소시키는 부형제의 능력을 평가하는 시험관내 투석 방법을 추가로 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 매질은 예컨대 167 mM 나트륨, 140 mM 클로라이드, 17 mM 포스페이트, 4 mM 칼륨을 함유하는 변형된 PBS 용액과 관련이 있다. 상기 방법의 구체적인 실시양태에서, 투석 튜브은 100만 달톤 분자량 컷-오프를 갖는다. 상기 방법의 추가의 구체적인 실시양태에서, 시험 샘플 중의 단백질 농도 및 탁도를 UV 분광법으로 측정한다. 상기 방법의 추가의 실시양태에서, 상기 방법은 변형된 방출 매질 및 투석 튜브 내부의 용액을 침전에 대해 가시적으로 검사하는 것을 포함하고, 여기서 부형제가 없는 대조군에 비해 시험 부형제를 함유하는 투석 튜브에서 침전이 감소한 것은 거대분자의 응집을 감소시키는 시험 부형제의 능력을 나타낸다.

도 1은 생리적 조건하에서의 2H7의 응집을 보여준다. 150 mg/mL의 2H7를 2일 동안 37℃에서 PBS로 투석하였다.
도 2는 생리적 조건하에서의 2H7의 응집에 대한 부형제의 효과를 평가하는데 사용되는 시험관내 투석 모델을 보여준다. 250 mL 유리 단지에 37℃의 변형된 PBS 용액 (167 mM 나트륨, 140 mM 클로라이드, 17 mM 포스페이트, 4 mM 칼륨) 220 mL를 채웠다. 6 cm 길이의 12 mm 투석 튜브의 한쪽 끝을 클램프로 물려 놓고 대략 1 mL의 시험 샘플을 채우고 과량의 공기를 제거하였고, 튜브의 다른 쪽 끝은 클램프로 물려 밀폐부에 고정시켰다. 상기 단지를 일정한 교반하에 37℃에 두었다.
도 3은 시험관내 투석 모델에서 대조군의 거동을 보여준다. 2H7 및 rhuMab CD11a 둘다 도 2에 나타낸 모델에서 시험하였다. PBS 용액으로 방출된 단백질의 누적 백분율(％)을 제2.5시간, 제6시간, 제12시간, 제24시간, 제33시간 및 제48시간의 시점에 측정하였다.
도 4는 시험관내 모델에서 2H7의 방출에 저분자량 PVP (중량 평균 MW 9K 달톤) 및 고분자량 PVP (중량 평균 MW 120만 달톤)가 미치는 효과를 보여준다.
도 5는 시험관내 모델에서 2H7의 방출에 5％ 내지 20％의 저분자량 PVP (중량 평균 MW 9K 달톤)가 미치는 효과를 보여준다.
도 6은 시험관내 모델에서 2H7의 방출에 분자량 범위 2K 내지 1.5M의 PVP가 미치는 효과를 보여준다.

실시양태의 상세한 설명

다양한 형태의 동사 "응집되는 것"은, 개개의 단백질 분자 또는 복합체가 회합하여 응집물을 형성하는 과정을 지칭한다. "응집물"은 단백질의 분자 또는 복합체를 포함하는 중합성 조립물이다. 응집은 가시적인 침전물이 형성되는 정도로 진행될 수 있다. 이러한 가시적인 침전물의 형성은 본원에서 "엉김"이라 지칭되기도 한다.

거대분자 침전의 상대적인 양은 예를 들어 가시적 대조군에 대해 비교하여 결정될 수 있다. 침전을 검정하는 추가의 방법은 당업계에 공지되어 있고 하기 기재되어 있으며, 예를 들어 실시예 2에 상세하게 기재된 시험관내 투석 방법 또는 실시예 3에 기재된 생체내 모델을 참조한다.

용어 "생체이용률"은 약물 또는 기타 물질이 투여 후에 생리적 활성 부위에서 흡수되거나 이용가능해지는 정도 또는 그러한 속도를 지칭한다. 거대분자의 생체이용률은 당업계에 공지된 생체내 약력학 방법으로 검정할 수 있다.

용어 "거대분자"는 적어도 10,000 달톤 분자량의 분자를 지칭하고, 단백질, 예컨대 항체를 포함할 수 있다.

용어 "부형제" 또는 "제약 부형제"는 거대분자의 응집을 감소시킬 수 있는 화합물을 지칭한다. 부형제는 당, 염, 유리 아미노산, 예컨대 L-아르기닌 및 L-글루타민, 폴리올, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 및 기타 중합체, 예컨대 폴리소르베이트, 폴록사머 또는 PVP를 포함할 수 있다.

용어 "PVP"는 선형 중합된 1-비닐-2-피롤리디논 (비닐피롤리돈)으로 본질적으로 이루어진 중합체를 지칭하고, 중합의 정도에 따라 다양한 분자량의 중합체가 생성된다. 폴리비닐피롤리돈에 대한 동의어는 PVP, 폴리(1-비닐-2-피롤리돈), 포비돈 및 콜리돈을 포함한다.

용어 "치료용 항체"는 질환의 치료시에 사용되는 항체를 지칭한다. 치료용 항체는 다양한 작용 메카니즘을 가질 수 있다. 치료용 항체는 표적과 결합하고 이것의 정상적인 기능을 중화시킬 수 있다. 예를 들어, 암 세포의 생존에 필요한 단백질의 활성을 차단하는 모노클로날 항체는 암 세포의 사멸을 야기한다. 또 다른 치료용 모노클로날 항체는 표적과 결합하고 이것의 정상적인 기능을 활성화시킬 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 세포상의 단백질에 결합하여 세포자멸 신호를 촉발할 수 있다. 마지막으로, 모노클로날 항체가 질환에 걸린 조직에서만 발현되는 표적에 결합하는 경우에는 독성 페이로드(payload) (유효 작용제), 예컨대 화학요법제 또는 방사능 작용제를 모노클로날 항체에 접합시켜서, 질환에 걸린 조직에 독성 페이로드를 특이적으로 전달하여 건강한 조직에 대한 해를 감소시키는 작용제를 생성할 수 있다.

용어 "진단용 항체"는 질환에 대한 진단 시약으로서 사용되는 항체를 지칭한다. 진단용 항체는 특정 질환과 특이적으로 관련이 있거나 특정 질환에서 증가된 발현을 나타내는 표적에 결합할 수 있다. 진단용 항체는, 예를 들어 환자로부터의 생물학적 샘플 중의 표적 검출 또는 또는 환자 내 질환 부위, 예컨대 종양의 진단 영상화에 사용될 수 있다.

"CD20" 항원은 말초혈 또는 림프양 기원의 B 세포 90％ 초과의 표면에서 발견되는, 분자량 대략 35 kD의 글리코실화되지 않은 막횡단 인단백질이다. CD20은 초기 프리-B 세포 발생 동안 발현되어 혈장 세포 분화시까지 유지되고, 인간 줄기 세포, 림프양 선조 세포 또는 정상적인 혈장 세포에서는 발견되지 않는다. CD20은 정상적인 B 세포 및 또한 악성 B 세포 둘다에 존재한다. 문헌에서 CD20에 대해 사용되는 다른 명칭은 "B-림프구-제한된 분화 항원" 및 "Bp35"를 포함한다. CD20 항원은 예를 들어 문헌 [Clark and Ledbetter, Adv. Can. Res. 52:81-149 (1989)] 및 [Valentine et al., J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989)]에 기재되어 있다.

용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로는 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 모노클로날 항체), 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성 또는 기능을 나타내는 한은 항체 단편을 포함한다.

본 발명의 인간화 CD20 결합 항체의 생물학적 활성은 적어도 상기 항체의 인간 CD20과의 결합, 더욱 바람직하게는 인간 및 기타 영장류 (예를 들어, 시노몰구스 원숭이, 붉은털 원숭이, 침팬지) CD20과의 결합을 포함할 것이다. 항체는 1×10^-8 이하의 K_d 값, 바람직하게는 약 1×10^-9 이하의 K_d 값으로 CD20에 결합할 것이고, 이러한 항체를 처치하지 않은 적절한 음성 대조군과 비교할 때 생체내 B 세포를 바람직하게는 20％ 이상 사멸 또는 고갈시킬 수 있다. B 세포 고갈은 ADCC, CDC, 세포자멸 또는 기타 메카니즘 중 하나 이상으로 인한 것일 수 있다. 본원에서의 질환 치료법의 일부 실시양태에서, 특정 이펙터 기능 또는 메카니즘이 특별히 요망될 수 있고, 인간화 2H7의 특정 변이체가 이러한 생물학적 기능, 예컨대 ADCC의 달성에 바람직하다.

"항체 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로는 그의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편, 디아바디(diabody), 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자, 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

"Fv"는 완전한 항원 인식 부위 및 항원 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 1개의 중쇄 가변 영역 도메인 및 1개의 경쇄 가변 영역 도메인이 비-공유 결합으로 단단하게 연결된 이량체로 이루어진다. 이들 2개 도메인이 폴딩되어 6개의 초가변 루프 (H 쇄 및 L 쇄로부터 각각 3개의 루프)가 형성되는데, 상기 루프는 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 1개의 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 일반적으로 소량으로 존재하는, 모노클로날 항체의 생성 동안 발생될 수 있는 가능한 변이체를 제외하고는 동일하고/하거나 동일한 에피토프(들)에 결합한다. 전형적으로, 이러한 모노클로날 항체는 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 여기서의 표적-결합 폴리펩티드 서열은 복수 개의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선별을 포함하는 방법에 의해 수득된 것이다. 예를 들어, 선별 방법은 복수 개의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 독특한 클론을 선별하는 것일 수 있다. 선별된 표적 결합 서열을 추가로 변경시켜서 예를 들어 표적에 대한 친화도를 개선시키고 표적 결합 서열을 인간화하고 세포 배양물 중에서의 그의 생성을 개선시키며 생체내 그의 면역원성을 저하시키고 다중특이적 항체를 생성할 수 있으며, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체 또한 본 발명의 모노클로날 항체라는 것을 이해해야 한다. 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 모노클로날 항체 제제의 각 모노클로날 항체는 항원상의 단일 결정자에 대한 것이다. 모노클로날 항체 제제는 그의 특이성 이외에도 다른 이뮤노글로불린에 의해 전형적으로 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어구 "모노클로날"은 항체의 특징을 실질적으로 동종인 항체들의 집단으로부터 수득되었다는 것으로 표시하고, 임의의 특정한 방법을 통한 항체 생성이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 다양한 기술, 예를 들어 하이브리도마 방법 (예를 들어, 하기 문헌 참조:

재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지-디스플레이 기술 (예를 들어, 하기 문헌 참조:

및 인간 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자좌 또는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생성하는 기술 (예를 들어, 하기 문헌 참조:

로 제조될 수 있다.

본 발명의 CD20 결합 항체의 "기능적 단편"은, 이것들이 유도된 무손상 전장 분자와 실질적으로 동일한 친화도의 CD20 결합을 보유하며 본원에 기재된 바와 같은 시험관내 또는 생체내 검정으로 측정시에 B 세포 고갈을 비롯한 생물학적 활성을 나타내는 단편이다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 절편이 항체들 사이의 서열에서 광범위하게 상이하다는 사실을 지칭한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고, 특정 항체의 그의 특정 항원에 대한 특이성을 한정한다. 그러나, 가변성이 가변 도메인의 110개 아미노산 범위에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 대신, V 영역은 길이가 각각 9개 내지 12개 아미노산이며 가변성이 극도로 높아 "초가변 영역"이라 불리는 보다 짧은 영역에 의해 분리되어 있는, 15개 내지 30개 아미노산으로 이루어진 프레임워크 영역 (FR)이라 불리는 상대적으로 불변성인 스트레치로 이루어진다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 주로 β-시트 구조를 취하며 3개의 초가변 영역으로 연결되어 있는 4개의 FR을 포함하는데, 이것은 상기 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 상기 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 서로 근접하게 위치하고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접 관여하지는 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체-의존적 세포 세포독성 (ADCC)에 있어서의 항체의 참여를 나타낸다.

용어 "초가변 영역"이 본원에서 사용되는 경우, 이것은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 일반적으로, 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, V_L의 잔기 약 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 V_H의 약 31-35B (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) ([Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, V_L의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 V_H의 26-32 (H1), 52A-55 (H2) 및 96-101 (H3) ([Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)])을 포함한다.

본원에 지칭된 바와 같이, "컨센서스 서열" 또는 컨센서스 V 도메인 서열은 공지된 인간 이뮤노글로불린 가변 영역 서열의 아미노산 서열들을 비교하여 유래된 인공 서열이다. 이러한 비교를 기초로 하여, 인간 κ 및 인간 H 쇄 하위군 III V 도메인으로부터 유래된 서열의 컨센서스인 V 도메인 아미노산을 코딩하는 재조합 핵산 서열을 제조하였다. 컨센서스 V 서열은 임의의 공지의 항체 결합 특이성 또는 친화도를 갖지 않는다.

"키메라" 항체 (이뮤노글로불린)는 특정 종으로부터 유래되었거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이 있는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부를 가지며, 상기 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되었거나 또 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체, 및 또한 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 이러한 항체의 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이 있다 (미국 특허 번호 4,816,567, 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]). 본원에서 사용된 바와 같이, 인간화 항체는 키메라 항체의 하위세트이다.

"인간화" 형태의 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 보유하는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여 항체)의 초가변 영역의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 또는 수용 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체한다. 추가로, 인간화 항체는 수용 항체 또는 공여 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능, 예컨대 결합 친화도가 추가로 증진되도록 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고, FR 영역이 결합 친화도를 개선시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있지만 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. FR에서의 이러한 아미노산 치환의 수는 전형적으로 H 쇄에서는 6개 이하, L 쇄에서는 3개 이하이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)], [Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988)] 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.

"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 존재하의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 고전적 보체 경로의 활성화는 동족 항원에 결합된 항체 (적절한 하위클래스의 항체)에 대한 보체 시스템 제1 성분 (C1q)의 결합으로 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다.

달리 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐, 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인 잔기의 번호매김은 본원에 참고로 명백하게 포함되는 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에서와 같은 EU 지수의 번호매김이다. "카바트(Kabat)에서와 같은 EU 지수"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 번호매김을 지칭한다. 순차적 또는 기타 번호매김 시스템을 구체적으로 표시하지 않는다면, V 영역의 잔기는 카바트 번호매김에 따라 번호가 매겨진다.

CD20 항체는 다음을 포함한다: 현재 "리툭시맙" ("리툭산^®")이라 불리는 "C2B8" (미국 특허 번호 5,736,137); 아이데크 파마슈티칼즈, 인크.(IDEC Pharmaceuticals, Inc.)가 "Y2B8" 또는 "이브리투모맙 티욱세탄" (제발린^®)으로 시판하는 이트륨-[90]-표지된 2B8 뮤린 항체 (미국 특허 번호 5,736,137; 1993년 6월 22일자로 ATCC에 관리 번호 HB11388로 기탁된 2B8); ¹³¹I로 임의로 표지되어 "131I-B1" 또는 "요오드 I131 토시투모맙" 항체를 생성하는, "토시투모맙"이라고도 불리는 뮤린 IgG2a "B1" (벡사르™, 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline), 또한, 미국 특허 번호 5,595,721 참조); 뮤린 모노클로날 항체 "1F5" ([Press et al., Blood 69(2):584-591 (1987)]) 및 그의 변이체, 예를 들어 "프레임워크 패취형" 또는 인간화 1F5 (WO 2003/002607, Leung, S.; ATCC 기탁번호 HB-96450); 뮤린 2H7 및 키메라 2H7 항체 (미국 특허 번호 5,677,180); 인간화 2H7 (WO 2004/056312 (Lowman et al.) 및 하기 기재됨); HuMAX-CD20™ 완전 인간 항체 (덴마크 소재의 젠맵(Genmab); 예를 들어, 문헌 [Glennie and van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003)] 및 [Cragg et al., Blood 101: 1045-1052 (2003)] 참조); WO 2004/035607 (Teeling et al.)에 기재된 인간 모노클로날 항체; US 2004/0093621 (Shitara et al.)에 기재된, Fc 영역에 결합된 복합 N-글리코시드-연결 당 쇄를 갖는 항체; CD20 결합 분자, 예컨대 AME 시리즈 항체, 예를 들어 WO 2004/103404 (Watkins et al., 어플라이드 몰레큘라 에볼루션(Applied Molecular Evolution))에 기재된 AME-133™ 항체; A20 항체 또는 그의 변이체, 예컨대 키메라 또는 인간화 A20 항체 (각각, cA20, IMMU-106 a.k.a. hA20 (US 2003/0219433, US 2005/0025764; 이뮤노메딕스(Immunomedics)); 및 모노클로날 항체 L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 또는 NU-B2 (국제 백혈구 타이핑 워크샵(International Leukocyte Typing Workshop)에서 입수가능함) ([Valentine et al., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)]). 본원에서 바람직한 CD20 항체는 인간화, 키메라 또는 인간 CD20 항체, 더욱 바람직하게는 인간화 2H7 항체, 리툭시맙, 키메라 또는 인간화 A20 항체 (이뮤노메딕스), 및 HuMAX-CD20™ 인간 CD20 항체 (젠맵)이다.

"단리된" 항체는 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 항체이다. 항체의 천연 환경의 오염 성분은 상기 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법으로 측정시에 항체의 95 중량％를 초과하는 정도, 가장 바람직하게는 99 중량％를 초과하는 정도로, (2) 스피닝 컵 시쿼네이터를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비-환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 균일한 것으로 나타날 정도로 정제될 것이다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하는데, 이는 항체 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 1회 이상의 정제 단계를 통해 제조될 것이다.

본 발명의 조성물 및 방법

본 발명은 분자량 범위 2000 내지 54,000 달톤의 5％ 내지 20％ 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 포함하는, 단백질과 같은 거대분자의 피하 투여용 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 30 mg/mL 내지 200 mg/mL 농도 범위의 항체, 및 분자량 범위 2000 내지 54,000 달톤의 5％ 내지 20％ 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 포함하는, 항체의 피하 투여용 제약 제제를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체 농도 범위는 10 내지 150 mg/mL이다. 추가의 실시양태에서, 항체 농도 범위는 100 내지 150 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, PVP의 농도는 10％이다. 특정 실시양태에서, PVP의 분자량 범위는 7000 내지 11,000 달톤이다. 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 100 mg/mL의 인간화 2H7 항체, 및 분자량 범위 7000 내지 11,000 달톤의 10％ PVP를 포함하는, 항체의 피하 투여용 제약 조성물을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 제약 조성물은 30 mM 아세트산나트륨, 5％ 트레할로스 이수화물, 및 pH 5.3의 0.03％ 폴리소르베이트 20을 추가로 포함한다.

다양한 실시양태에서, 본 발명은 인간화 2H7 항체 (또한, 본원에서 hu2H7이라 지칭되기도 함)를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 인간화 2H7 항체는 표 1에 기재된 항체이다.

표 1의 항체 변이체 A, B 및 I 각각은 경쇄 가변 서열 (V_L):

중쇄 가변 서열 (V_H):

을 포함한다.

표 1의 각각의 항체 변이체 C, D, F 및 G는 경쇄 가변 서열 (V_L):

중쇄 가변 서열 (V_H):

을 포함한다.

표 1의 항체 변이체 H는 서열 3의 경쇄 가변 서열 (V_L) (상기함) 및 중쇄 가변 서열 (V_H):

을 포함한다.

표 1의 각각의 항체 변이체 A, B 및 I는 전장 경쇄 서열:

을 포함한다.

표 1의 변이체 A는 전장 중쇄 서열:

을 포함한다.

표 1의 변이체 B는 전장 중쇄 서열:

을 포함한다.

표 1의 변이체 I는 전장 중쇄 서열:

을 포함한다.

표 1의 각각의 항체 변이체 C, D, F, G 및 H는 전장 경쇄 서열:

을 포함한다.

표 1의 변이체 C는 전장 중쇄 서열:

을 포함한다.

표 1의 변이체 D는 전장 중쇄 서열:

을 포함한다.

표 1의 변이체 F는 전장 중쇄 서열:

을 포함한다.

표 1의 변이체 G는 전장 중쇄 서열:

을 포함한다.

표 1의 변이체 H는 전장 중쇄 서열:

을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 인간화 2H7 항체는 IgG Fc 내의 아미노산 변경을 추가로 포함하고, 야생형 IgG Fc를 갖는 항체에 비해 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 더욱 바람직하게는 적어도 100배, 바람직하게는 적어도 125배, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 150배 내지 약 170배 증가된 인간 FcRn에 대한 결합 친화도를 나타낸다.

IgG에서의 N-글리코실화 부위는 CH2 도메인의 Asn297이다. 본 발명의 인간화 2H7 항체 조성물은 Fc 영역을 갖는 상기 인간화 2H7 항체들 중 임의의 것의 조성물을 포함하고, 여기서 조성물 중 항체의 약 80％ 내지 100％ (바람직하게는 약 90％ 내지 99％)는 당단백질의 Fc 영역에 부착된, 푸코스가 없는 성숙 코어 탄수화물 구조를 포함한다. 이러한 조성물은 본원에서 인간 IgG와의 상호작용시에 FcγRIIIA (V158)만큼 효과적이지 않은 FcγRIIIA (F158)와의 결합에 있어서 놀라울 정도의 개선을 나타내는 것으로 입증되었다. FcγRIIIA (F158)는 정상적인 건강한 아프리카계 미국인 및 백인에서 FcγRIIIA (V158)보다 더 흔하다. 문헌 [Lehrnbecher et al., Blood 94:4220 (1999)]을 참조한다. 역사적으로, 가장 통상적으로 사용되는 산업용 숙주들 중 하나인 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO)에서 생성된 항체는 집단 내에 약 2％ 내지 6％의 비-푸코실화 항체를 함유한다. 그러나, YB2/0 및 Lec13은 78％ 내지 98％의 비-푸코실화 종이 있는 항체를 생성할 수 있다. 문헌 [Shinkawa et al., J Bio. Chem. 278 (5), 3466-347 (2003)]은, FUT8 활성이 더 적은 YB2/0 및 Lec13 세포에서 생성된 항체가 유의하게 증가된 시험관내 ADCC 활성을 나타낸다고 보고하였다. 푸코스 함량이 감소된 항체의 생성은 또한 예를 들어 문헌 [Li et al. (GlycoFi) "Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris" in Nature Biology online publication 22 Jan. 2006], [Niwa R. et al., Cancer Res. 64(6):2127-2133 (2004)], US 2003/0157108 (Presta), US 6,602,684 및 US 2003/0175884 (Glycart Biotechnology), US 2004/0093621, US 2004/0110704, US 2004/0132140 (모두가 교와 하꼬 고교(Kyowa Hakko Kogyo))에도 기재되어 있다.

본원의 제제는 또한 치료할 특정 적응증에 필요한 경우에는 1종 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포독성제, 화학요법제, 시토카인 또는 면역억제제 (예를 들어, T 세포에 작용하는 것, 예컨대 시클로스포린, 또는 T 세포와 결합하는 항체, 예를 들어 LFA-1에 결합하는 항체)를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제 중에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 장애 또는 치료법의 유형, 및 상기 논의된 기타 인자에 따라 달라진다. 이것들은 일반적으로 본원에 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로 또는 이전에 사용되던 투여량의 약 1％ 내지 99％로 사용된다.

생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이것은 멸균 필터를 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.

항체 생성

모노클로날 항체

모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조할 수도 있고, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 번호 4,816,567)으로 제조할 수도 있다.

하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터를 상기한 바와 같이 면역화시켜서, 면역화에 사용되는 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유발한다. 대안적으로, 림프구는 시험관내 면역화될 수 있다. 면역화 후, 림프구를 단리하고, 이후에 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포주와 융합시켜서 하이브리도마 세포를 형성시킨다 ([Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]).

이로써 제조된 하이브리도마 세포를 융합되지 않은 모 골수종 세포 (또한, 융합 파트너라 지칭되기도 함)의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 것이 바람직한 적합한 배양 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 없는 경우, 하이브리도마를 위한 선택적인 배양 배지는 전형적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장을 저해하는 물질인 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이다 (HAT 배지).

바람직한 융합 파트너 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선별된 항체-생성 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생성을 지지하는 세포이며, 융합되지 않은 모 세포에 대해 선별하는 선별 매질에 감수성이 있다. 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 살크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center) (미국 캘리포니아주 샌 디에고)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것, 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (미국 메릴랜드주 록크빌)으로부터 입수가능한 SP-2 및 유도체, 예를 들어 X63-Ag8-653 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주 역시 인간 모노클로날 항체 생성과 관련하여 기재된 바 있다 ([Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)] 및 [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]).

하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 항원에 대한 모노클로날 항체의 생성에 대해 검정한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전법 또는 시험관내 결합 검정, 예를 들어 방사선면역검정 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)으로 결정한다.

모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]에 기재된 스캐차드(Scatchard) 분석으로 결정할 수 있다.

원하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 일단 확인된 후에는, 상기 클론을 제한 희석 절차로 서브클로닝하고 표준 방법으로 성장시킬 수 있다 ([Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]). 이러한 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 예를 들어 하이브리도마 세포를 마우스에게 i.p. 주사함으로써 상기 하이브리도마 세포를 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다.

서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 항체 정제 절차, 예를 들어 친화도 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G-세파로스(Sepharose)의 사용) 또는 이온-교환 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.

모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 사용)를 이용하여 쉽게 단리 및 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 이후에 이것을 이용하여 다른 방식으로는 항체 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포를 형질감염시켜서 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 합성을 달성한다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 연구 논문은 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)] 및 [Plueckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)]을 포함한다.

추가의 실시양태에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]은 파지 라이브러리를 사용한 뮤린 및 인간 항체 각각의 단리를 기재한다. 이후의 간행물은 쇄 셔플링에 의한 고친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생성 ([Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)]), 및 또한 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서의 조합 감염 및 생체내 재조합 ([Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)])을 기재한다. 따라서, 이러한 기술은 모노클로날 항체 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술의 실행가능한 대안이다.

항체를 코딩하는 DNA는 예를 들어 상동성 뮤린 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 (C_H 및 C_L) 서열로 치환시키거나 (미국 특허 번호 4,816,567 및 문헌 [Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]), 또는 이뮤노글로불린 코딩 서열에 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드 (이종 폴리펩티드)에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 융합시켜서 변형시킴으로써 키메라 또는 융합 항체 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드 서열은 항체의 불변 도메인 대신 사용될 수도 있고, 또는 이것이 항체의 한 항원 결합 부위의 가변 도메인 대신 사용되어 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원 결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성시킨다.

인간화 항체

비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 기재되어 있다. 바람직하게는, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 도입된 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "도입" 잔기라 지칭되고, 전형적으로는 "도입" 가변 도메인의 것이다. 인간화는 본질적으로 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 치환시킴으로써 윈터(Winter) 및 동료들의 방법에 따라 수행될 수 있다 ([Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)], [Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)], [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]). 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 번호 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.

인간화 항체의 제조에 사용되는 인간 가변 도메인 경쇄 및 중쇄 둘다의 선택은 항체가 인간 치료용으로 의도된 경우에 항원성 및 HAMA 반응 (인간 항-마우스 항체)을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "최적-맞춤" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 V 도메인 서열을 확인하고, 이것 내부의 인간 프레임워크 영역 (FR)을 인간화 항체를 위해 수용한다 ([Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)], [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크 영역을 이용한다. 여러 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 사용할 수 있다 ([Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)], [Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)]).

추가로, 항체가 항원에 대해 높은 친화도를 보유하고 기타 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화하는 것이 중요하다. 이를 달성하기 위해서, 바람직한 방법에 따라, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 당업자에게 공지되어 있다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 디스플레이를 조사하면 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 이뮤노글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합되어 원하는 항체 특징, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, 항원 결합에 대한 영향에는 초가변 영역 잔기가 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.

인간화 항체는 항체 단편, 예컨대 Fab일 수 있고, 1종 이상의 세포독성제(들)과 임의로 접합되어 면역접합체를 생성할 수 있다. 대안적으로, 인간화 항체는 전장 항체, 예컨대 전장 IgG1 항체일 수 있다.

인간 항체 및 파지 디스플레이 방법

인간화에 대한 대안책으로서 인간 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 면역화시에 내인성 이뮤노글로불린의 생성 없이 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생성하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선(germ-line) 돌연변이체 마우스 내 항체 중쇄 연결 영역 (J_H) 유전자의 동형접합성 결실이 내인성 항체 생성을 완전히 억제시킨다고 기재된 바 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이러한 배선 돌연변이체 마우스에게 전달하면, 항원 접종시에 인간 항체가 생성될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)], [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)], [Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)], 미국 특허 번호 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (모두가 겐팜); 5,545,807; 및 WO 97/17852을 참조한다.

대안적으로, 파지 디스플레이 기술 ([McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)])이 면역화되지 않은 공여자로부터의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 인간 항체 및 항체 단편을 생성하는데 이용될 수 있다. 이러한 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자를 필라멘트형 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 소수의 외피 단백질 유전자로 프레임에 맞게(in-frame) 클로닝하고, 파지 입자의 표면상에 기능성 항체 단편으로서 디스플레이한다. 필라멘트형 입자는 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 기초한 선별에 의해 이러한 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자도 선별된다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있고, 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]에서 검토된다. V-유전자 절편의 여러 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 소형 무작위 조합형 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이가 단리되었다. 면역화되지 않은 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 구축될 수 있고, 다양한 어레이의 항원 (자가-항원을 포함함)에 대한 항체는 본질적으로 문헌 ([Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)] 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)])에 기재된 기술에 따라 단리될 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,565,332 및 5,573,905를 참조한다.

상기 논의된 바와 같이, 인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수도 있다 (미국 특허 5,567,610 및 5,229,275 참조).

항체 단편

특정 상황에서는, 온전한 항체가 아닌 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 단편의 크기가 작을수록 제거가 신속하고, 충실성 종양에 대한 접근을 개선시킬 수 있다.

항체 단편 생성을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해 소화를 통해 유도되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 이러한 단편은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생성될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두가 이. 콜라이에서 발현되어 분비될 수 있고, 이에 의해 다량의 이들 단편을 쉽게 생성할 수 있다. 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')₂ 단편을 형성할 수 있다 ([Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또 다른 접근법에 따라, F(ab')₂ 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는, 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')₂ 단편은 미국 특허 번호 5,869,046에 기재되어 있다. 항체 단편의 생성을 위한 다른 기술은 숙련된 전문인에게 명백할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택되는 항체는 단일-쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185, 미국 특허 번호 5,571,894 및 미국 특허 번호 5,587,458을 참조한다. Fv 및 sFv는 불변 영역이 결여된 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종이어서, 생체내 사용 동안 비-특이적 결합을 감소시키는데 적합하다. sFv의 아미노 또는 카르복시 말단에서 이펙터 단백질의 융합체가 생성되도록 sFv 융합 단백질을 구축할 수 있다. 문헌 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 문헌]을 참조한다. 예를 들어, 항체 단편은 또한 예를 들어 미국 특허 5,641,870에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수도 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.

기타 아미노산 서열 변형

본원에 기재된 CD20 결합 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항-CD20 항체의 아미노산 서열 변이체는, 항-CD20 항체 핵산에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형은 예를 들어 항-CD20 항체 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 원하는 특징을 갖는 최종 구축물이 생성되도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어진다. 아미노산 변화는 또한 항-CD20 항체의 번역후 프로세싱을 변경시킬 수 있고, 예를 들어 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시킬 수 있다.

문헌 [Cunningham and Wells in Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같이, 돌연변이유발의 바람직한 위치인 항-CD20 항체의 특정 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라 불린다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기들의 군이 확인되고 (예를 들어, 대전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu), 중성 또는 음으로 대전된 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 아미노산과 CD20 항원과의 상호작용에 영향을 미친다. 이후, 치환에 대한 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치를 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대하여 추가적인 또는 다른 변이체를 도입함으로써 정련시킨다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 자체의 성질은 미리 결정할 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서의 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, 표적 코돈 또는 영역에서 ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 수행하고, 발현된 항-CD20 항체 변이체를 원하는 활성에 대해 스크리닝한다.

아미노산 서열 삽입은 길이가 1개 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위인 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합 및 또한 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항-CD20 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체를 포함한다. 항-CD20 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항-CD20 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드가 상기 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.

또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이러한 변이체에서는 항-CD20 항체 분자 내의 1개 이상의 아미노산 잔기가 상이한 잔기로 대체된다. 치환적 돌연변이유발에서 가장 관심이 높은 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경 또한 고려된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"이라는 표제하에 하기 표에 나타냈다. 이러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 야기하면, 하기 표에 "예시적인 치환"으로 명명되거나 아미노산 클래스를 언급하며 아래에 추가로 기재된 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝할 수 있다.

항체의 생물학적 특성의 실질적인 변형은, (a) 치환 영역에서 폴리펩티드 주쇄의 구조가 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서 유지되거나, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성이 유지되거나, 또는 (c) 측쇄의 크기가 유지되는데 미치는 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 수행된다. 천연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같은 군으로 나뉜다:

(1) 소수성:

(2) 중성 친수성:

(3) 산성:

(4) 염기성:

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기:

, 및

(6) 방향족:

비-보존적 치환은 이들 클래스 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스로 교환하여 이루어진다.

또한, 항-CD20 항체의 적당한 형태 유지에 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기가 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 개선시키고 이상 가교를 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)이 항체에 부가되어 이것의 안정성을 개선시킬 수 있다 (특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).

특히 바람직한 유형의 치환 변이체는 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가의 개발을 위해 선택된 생성되는 변이체(들)은 이것들이 생성된 모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성하는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 사용한 친화도 성숙을 포함한다. 간략하게 설명하면, 여러 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6개 내지 7개 부위)를 각 부위에서 모든 가능한 아미노 치환이 생성되도록 돌연변이시킨다. 이로써 생성된 항체 변이체를 필라멘트형 파지 입자로부터 각 입자 내에 패키지된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합체로서 1가 방식으로 디스플레이시킨다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 본원에 개시된 바와 같이 이것들의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형시킬 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해서, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 인간 CD20 사이의 접촉 지점을 확인하기 위해서는 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기가 본원에서 상술된 기술에 따라 치환시킬 후보이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널을 본원에 기재한 바와 같이 스크리닝하고, 하나 이상의 관련 검정에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가 개발을 위해 선택할 수 있다.

항체의 또 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 원래 글리코실화 패턴을 변경시킨다. 이러한 변경은 항체에서 발견되는 1개 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및/또는 항체 내에 존재하지 않는 1개 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미한다.

항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결은 아스파라진 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 잔기의 부착을 지칭한다. 트리펩티드 서열, 아스파라진-X-세린 및 아스파라진-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)이 아스파라진 측쇄로 탄수화물 잔기를 효소적 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내 이들 트리펩티드 서열 중 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결된 글리코실화는 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌으로의 당, N-아세일갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나의 부착을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신이 사용될 수도 있다.

항체에 대한 글리코실화 부위의 부가는 1개 이상의 상기한 트리펩티드 서열이 함유되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 변경은 또한 본래의 항체의 서열에 1개 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가하거나 이러한 잔기로 치환시켜 달성될 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).

항-CD20 항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는, 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조된다. 이러한 방법은 천연 공급원으로부터의 단리 (천연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우), 또는 미리 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 항-CD20 항체의 올리고뉴클레오티드 매개 (또는 부위-지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 항체를 예를 들어 항체의 항원-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)이 증진되도록 이펙터 기능에 관하여 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 항체의 Fc 영역에 1개 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 시스테인 잔기(들)이 Fc 영역 내에 도입되어, 이 영역 내에서의 쇄간 디술피드 결합 형성을 허용할 수 있다. 이로써 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다. 문헌 [Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)]을 참조한다. 증진된 항-종양 활성을 갖는 동종이량체 항체도 또한 문헌 [Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같은 이종이관능성 가교제를 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체가 조작될 수 있고, 이에 의해 증진된 보체 매개 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있다. 문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)]을 참조한다.

치료 용도

본 발명의 인간화 2H7 CD20 결합 항체를 포함하는 개시된 방법 및 조성물은 수많은 악성 및 비-악성 질환, 예를 들어 CD20 양성 B 세포 암, 예컨대 B 세포 림프종 및 백혈병, 및 자가면역 질환의 치료에 유용하다. 골수의 줄기 세포 (B-세포 선조세포)에는 CD20 항원이 없어서, 처치 후 건강한 B-세포가 재생되어 수개월 이내에 정상 수준으로 돌아간다.

CD20 양성 B 세포 암은 세포 표면에 CD20을 발현하는 B 세포의 비정상적인 증식을 포함하는 암이다. CD20 양성 B 세포 신생물은 CD20-양성 호지킨병, 예를 들어 림프구 우세형 호지킨병 (LPHD); 비-호지킨 림프종 (NHL); 여포 중심 세포 (FCC) 림프종; 급성 림프구성 백혈병 (ALL); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 모발 세포 백혈병을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비-호지킨 림프종" 또는 "NHL"은 호지킨 림프종 이외의 림프계 암을 지칭한다. 호지킨 림프종은 일반적으로 호지킨 림프종에는 리드-스테른베르그(Reed-Sternberg) 세포가 존재하고 비-호지킨 림프종에는 상기 세포가 없는 것으로서 비-호지킨 림프종과 구별될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 상기 용어에 포함되는 비-호지킨 림프종의 예는 당업계에 공지된 분류 방식, 예를 들어 문헌 [Color Atlas of Clinical Hematology (3rd edition), A. Victor Hoffbrand and John E. Pettit (eds.) (Harcourt Publishers Ltd., 2000)]에 기재된 개정된 유럽-미국 림프종(Revised European-American Lymphoma) (REAL) 방식에 따라 당업자 (예를 들어, 종양학자 또는 병리학자)에 의해 확인되는 임의의 림프종을 포함한다. 특히, 도 11.57, 11.58 및 11.59의 목록을 참조한다. 보다 구체적인 예는 재발성 또는 불응성 NHL, 전선 저 악성도 NHL, III/IV기 NHL, 화학요법 내성 NHL, 전구체 B 림프모구성 백혈병 및/또는 림프종, 소형 림프구성 림프종, B 세포 만성 림프구성 백혈병 및/또는 전림프구성 백혈병 및/또는 소형 림프구성 림프종, B-세포 전림프구성 림프종, 면역종 및/또는 림프형질세포성 림프종, 림프형질세포성 림프종, 변연대 B 세포 림프종, 비장 변연대 림프종, 림프절외 변연대 - MALT 림프종, 림프절 변연대 림프종, 모발 세포 백혈병, 형질세포종 및/또는 혈장 세포 골수종, 저 악성도/소포 림프종, 중간 악성도/소포 NHL, 외투 세포 림프종, 여포 중심 림프종 (여포성), 중간 악성도 미만성 NHL, 미만성 거대 B-세포 림프종, 활동성 NHL (예를 들어, 활동성 전선 NHL 및 활동성 재발성 NHL), 자가 줄기세포 이식 후에 재발되거나 이식에 불응성인 NHL, 원발성 종격 거대 B-세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, 고 악성도 면역모구성 NHL, 고 악성도 림프모구성 NHL, 고 악성도 소 비-절단 세포 NHL, 거대 질환 NHL, 버키트 림프종, 전구체 (말초) 대과립 림프구성 백혈병, 균상식육종 및/또는 세자리 증후군, 피부 (피부성) 림프종, 미분화 대세포 림프종, 혈관중심성 림프종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

구체적인 실시양태에서, 인간화 CD20 결합 항체 및 그의 기능적 단편을 포함하는 제약 조성물은 비-호지킨 림프종 (NHL), 림프구 우세형 호지킨병 (LPHD), 소형 림프구성 림프종 (SLL), 및 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 예를 들어 이러한 상태의 재발의 치료에 사용된다.

무통성 림프종은 평균적인 환자가 수많은 차도 및 재발 기간 후 6년 내지 10년 동안 생존하는, 느리게 성장하는 불치 질환이다. 한 실시양태에서, 인간화 CD20 결합 항체 또는 그의 기능적 단편은 무통성 NHL, 예를 들어 재발성 무통성 NHL 및 리툭시맙-불응성 무통성 NHL의 치료에 사용된다. 재발성 무통성 NHL 환자는 이전에 1회 코스의 리툭시맙을 투여받았고 > 6개월 동안 반응했던 리툭시맙 반응자일 수 있다.

본 발명의 인간화 2H7 항체 또는 그의 기능적 단편은 예를 들어 재발성 또는 불응성 저 악성도 또는 여포성, CD20-양성, B-세포 NHL에서의 단일-작용제 치료법 (단일요법)으로 유용하거나, 또는 다중 약물 처방으로 다른 약물과 함께 환자에게 투여될 수 있다.

본 발명의 인간화 2H7 항체 또는 기능적 단편은 제1 요법으로 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 하기 약물 중 임의의 하나를 사용한 처치에 비-반응성이거나 부적합 반응을 갖거나, 또는 이들 약물 처치 후에 재발된 CD20 양성 B 세포 신생물 환자의 치료에 있어서의 이들 항체의 용도를 고려한다: 리툭시맙 (제넨테크); 이브리투모맙 티욱세탄 (제발린™, 바이오젠 아이데크(Biogen Idec)); 토시투모맙 (벡사르™, 글락소스미스클라인); HuMAX-CD20™ (젠맵); IMMU-106 (인간화 항-CD20 a.k.a. hA20 또는 90Y-hLL2임, 이뮤노메딕스); AME-133 (어플라이드 몰레큘라 에볼루션/일라이 릴리(Eli Lilly)); 겐투주맙 오조가미신 (밀로타르그(Mylotarg)™, 인간화 항-CD33 항체, 와이어쓰/PDL); 알렘투주맙 (캄패스(Campath)™, 항-CD52 항체, 쉐링 플로(Schering Plough)/젠자임(Genzyme)); 에프라투주맙 (IMMU-103™, 인간화 항-CD22 항체, 이뮤노메딕스).

본 발명은 플루다라빈 요법에 실패한 CLL 환자를 포함하는 CLL 환자를 본 발명의 인간화 2H7 항체로 치료하는 방법을 추가로 제공한다.

본원에서의 "자가면역 질환"은 개체 자신의 조직 또는 동시 분리계(co-segregate)로부터 그에 대해 발생하는 질환 또는 장애, 또는 그의 증상 또는 그로 인한 병태이다. 자가면역 질환 또는 장애의 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 관절염 (류마티스 관절염, 예컨대 급성 관절염, 만성 류마티스 관절염, 통풍성 관절염, 급성 통풍성 관절염, 만성 염증성 관절염, 퇴행성 관절염, 감염성 관절염, 라임 관절염, 증식성 관절염, 건선성 관절염, 척추 관절염, 및 유년 발병형 류마티스 관절염, 골관절염, 만성 진행성 관절염, 변형 관절염, 만성 원발성 다발성관절염, 반응성 관절염, 및 강직성 척추염), 염증성 과증식성 피부 질환, 건선, 예컨대 판상 건선, 적상 건선, 농포성 건선 및 손톱 건선, 아토피, 예를 들어 아토피성 질환, 예컨대 고초열 및 잡 증후군, 피부염, 예를 들어 접촉 피부염, 만성 접촉 피부염, 알레르기성 피부염, 알레르기성 접촉 피부염, 포진상 피부염 및 아토피성 피부염, x-연관 과다 IgM 증후군, 두드러기, 예컨대 만성 알레르기성 두드러기 및 만성 특발성 두드러기, 예를 들어 만성 자가면역 두드러기, 다발성근염/피부근염, 연소성 피부근염, 독성 표피 괴사용해, 경피증 (예를 들어, 전신성 경피증), 경화증, 예컨대 전신성 경화증, 다발성 경화증 (MS), 예컨대 척수-올리브로 MS, 원발성 진행성 MS (PPMS), 및 재발 완화형 MS (RRMS), 진행성 전신성 경화증, 아테롬성동맥경화증, 동맥경화증, 범발성 경화증 및 실조성 경화증, 염증성 장 질환 (IBD) (예를 들어, 크론병, 자가면역-매개 위장 질환, 대장염, 예컨대 궤양성 대장염, 궤양성 대장염, 현미경적 대장염, 교원성 대장염, 폴립성 대장염, 괴사성 소장대장염, 및 경벽성 대장염, 및 자가면역 염증성 장 질환), 괴저 농피증, 결절 홍반, 원발성 경화성 담관염, 상공막염), 호흡 곤란 증후군, 예를 들어 성인 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 수막염, 포도막의 전부 또는 일부의 염증, 홍채염, 맥락막염, 자가면역 혈액계 장애, 류마티스 척추염, 돌발성 난청, IgE-매개 질환, 예컨대 아나필락시 및 알레르기성 및 아토피성 비염, 뇌염, 예컨대 라스무센 뇌염 및 변연 및/또는 뇌간 뇌염, 포도막염, 예컨대 전포도막염, 급성 전포도막염, 육아종성 포도막염, 비-육아종성 포도막염, 수정체항원성 포도막염, 후포도막염, 또는 자가면역 포도막염, 신 증후군을 동반하거나 동반하지 않는 사구체신염 (GN), 예컨대 만성 또는 급성 사구체신염, 예컨대 원발성 GN,, 면역-매개 GN, 막 GN (막 신증), 특발성 막 GN 또는 특발성 막 신증, 막 또는 막 증식성 GN (MPGN), 예를 들어 제I형 및 제II형, 및 급속 진행성 GN, 알레르기성 상태 및 반응, 알레르기성 반응, 습진, 예를 들어 알레르기성 또는 아토피성 습진, 천식, 예컨대 기관지성 천식, 기관지 천식, 및 자가면역 천식, T 세포의 침윤 및 만성 염증 반응을 수반하는 상태, 외래 항원, 예컨대 임신 동안의 태아 A-B-O 혈액 군에 대한 면역 반응, 만성 폐 염증성 질환, 자가면역 심근염, 백혈구 부착 결핍, 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 또는 전신 루푸스 에리테마토데스, 예컨대 피부 SLE, 아급성 피부 홍반성 루푸스, 신생아 루푸스 증후군 (NLE), 파종상 홍반성 루푸스, 루푸스 (예를 들어, 신염, 뇌염, 소아, 비-신장, 신장외, 원판상, 탈모증), 유년 발병형 (제I형) 진성 당뇨병, 예를 들어 소아 인슐린-의존적 진성 당뇨병 (IDDM), 성인 발병형 진성 당뇨병 (제II형 당뇨병), 자가면역 당뇨병, 특발성 요붕증, 시토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민증과 관련이 있는 면역 반응, 결핵, 사르코이드증, 육아종증, 예를 들어 림프종양 육아종증, 베게너 육아종증, 무과립구증, 혈관병증, 예를 들어 혈관염 (예를 들어, 대혈관 혈관염 (예를 들어, 류마티스성 다발성근육통 및 거대 세포 (다까야수) 동맥염), 중형 혈관 혈관염 (예를 들어, 가와사키병 및 결절성 다발동맥염/결절성 동맥주위염), 현미경적 다발동맥염, CNS 혈관염, 괴사, 피부, 또는 과민성 혈관염, 전신 괴사성 혈관염, 및 ANCA-관련 혈관염, 예컨대 처크-스트라우스 혈관염 또는 증후군 (CSS)), 측두 동맥염, 재생불량성 빈혈, 자가면역 재생불량성 빈혈, 쿰즈 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙판 빈혈, 용혈성 빈혈 또는 면역 용혈성 빈혈, 예를 들어 자가면역 용혈성 빈혈 (AIHA), 악성 빈혈 (pernicious anemia 또는 anemia perniciosa), 애디슨병, 진정 적혈구계 빈혈 또는 무형성 (PRCA), 인자 VIII 결핍, 혈우병 A, 자가면역 호중구감소증, 범혈구감소증, 백혈구감소증, 백혈구 누출을 수반하는 질환, CNS 염증성 장애, 다발성 장기 손상 증후군, 예컨대 패혈증, 외상 또는 출혈에 부차적인 것, 항원-항체 복합체-매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알레르기성 신경염, 베체트병(Bechet's 또는 Behcet's disease), 캐슬맨 증후군, 굿파스튜어 증후군, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐슨-존슨 증후군, 유천포창, 예컨대 수포성 유천포창 및 피부 유천포창, 천포창 (예를 들어, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 천포창 점막 유천포창 및 홍반성 천포창), 자가면역 다내분비질환, 라이터병 또는 라이터 증후군, 면역 복합체 신염, 항체-매개 신염, 시신경척수염, 다발성신경병증, 만성 신경병증, 예컨대 IgM 다발성신경병증 또는 IgM-매개 신경병증, 혈소판감소증 (예를 들어, 심근 경색 환자에서 발생됨), 예를 들어 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), 수혈후 자반병 (PTP), 헤파린-유도된 혈소판감소증, 및 자가면역 또는 면역-매개 혈소판감소증, 예컨대 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 예를 들어 만성 또는 급성 ITP, 고환 및 난소의 자가면역 질환, 예를 들어 자가면역 고환염 및 난소염, 원발성 갑상선기능저하증, 부갑상선기능저하증, 자가면역 내분비 질환, 예를 들어 갑상선염, 예컨대 자가면역 갑상선염, 하시모토병, 만성 갑상선염 (하시모토 갑상선염), 또는 아급성 갑상선염, 자가면역 갑상선 질환, 특발성 갑상선기능저하증, 그레이브스병, 다분비선 증후군, 예컨대 자가면역 다분비선 증후군 (또는 다분비선 내분비병증 증후군), 방종양성 증후군, 예를 들어 신경학적 방종양성 증후군, 예컨대 램버트-이튼 근무력 증후군 또는 이튼-램버트 증후군, 근강직(stiff-man 또는 stiff-person) 증후군, 뇌척수염, 예컨대 알레르기성 뇌척수염 또는 알레르기 뇌척수염 및 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE), 중증 근무력증, 예컨대 흉선종-관련 중증 근무력증, 소뇌 변성, 신경근긴장증, 안간대 또는 안간대 간대성근경련 증후군 (OMS), 및 감각 신경병증, 다병소성 운동 신경병증, 쉬한 증후군, 자가면역 간염, 만성 간염, 루푸스양 간염, 거대 세포 간염, 만성 활성 간염 또는 자가면역 만성 활성 간염, 림프양 간질성 폐렴 (LIP), 폐쇄 세기관지염 (비-이식) 대 NSIP, 길랑-바레 증후군, 베르게르병 (IgA 신증), 특발성 IgA 신증, 선상 IgA 피부병, 원발성 담즙성 간경변, 폐경화, 자가면역 장질환 증후군, 셀리아크병, 복강 질환, 비열대 스프루 (글루텐 장질환), 불응성 스프루, 특발성 스프루, 한랭글로불린혈증, 근위축성 측삭 경화증 (ALS; 루게릭병), 관상 동맥 질환, 자가면역 귀 질환, 예컨대 자가면역 내이 질환 (AIED), 자가면역 난청, 안간대-간대성근경련 증후군 (OMS), 다발연골염, 예컨대 불응성 또는 재발성 다발연골염, 폐포 단백증, 아밀로이드증, 공막염, 비-암성 림프구증가증, 원발성 림프구증가증, 예를 들어 모노클로날 B 세포 림프구증가증 (예를 들어, 양성 모노클로날 감마글로불린병증 및 미결정 유의성의 모노클로날 감마글로불린병증, MGUS), 말초 신경병증, 방종양성 증후군, 채널병증, 예컨대 간질, 편두통, 부정맥, 근육 장애, 귀먹음, 실명, 주기적 마비, 및 CNS의 채널병증, 자폐증, 염증성 근장애, 국소 분절 사구체경화증 (FSGS), 내분비 눈병증, 포도망막염, 맥락망막염, 자가면역 간 장애, 섬유근육통, 다발성 내분비 부전, 슈미트 증후군, 부신염, 위 위축, 초로성 치매, 탈수초 질환, 예컨대 자가면역 탈수초 질환 및 만성 염증성 탈수초 다발신경병증, 당뇨성 신증, 드레슬러 증후군, 원형 탈모증, CREST 증후군 (석회증, 레이노 현상, 식도 운동장애, 수지경화증 및 모세혈관확장증), 남성 및 여성 자가면역 불임, 혼합 결합 조직병, 샤가스병, 류마티스성 열, 습관성 유산, 농부 폐, 다형 홍반, 심장절개후 증후군, 쿠싱 증후군, 조류 사육자병, 알레르기성 육아종성 맥관염, 양성 림프구성 맥관염, 알포트 증후군, 폐포염, 예컨대 알레르기성 폐포염 및 섬유성 폐포염, 간질성 폐 질환, 수혈 반응, 나병, 말라리아, 리슈만편모충증, 파동편모충증, 주혈흡충증, 회충증, 아스페르길루스증, 샘터 증후군, 카플란 증후군, 뎅기, 심내막염, 심내막심근 섬유증, 미만성 간질성 폐 섬유증, 간질성 폐 섬유증, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 낭성 섬유증, 안구내염, 장기 융기성 홍반, 태아 적모구증, 호산구성 근막염, 슐만 증후군, 펠티 증후군, 사상충증, 섬모체염, 예컨대 만성 섬모체염, 이시성 섬모체염, 홍채섬모체염 (급성 또는 만성), 또는 푸크 섬모체염, 헤노흐-쇤라인 자반병, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염, 에코바이러스 감염, 심근병증, 알츠하이머병, 파보바이러스 감염, 풍진 바이러스 감염, 백신처리후 증후군, 선천적 풍진 감염, 엡스타인-바 바이러스 감염, 볼거리, 에반 증후군, 자가면역 생식선 부전, 시덴함 무도병, 연쇄상구균 감염후 신염, 폐색성 혈전혈관염, 갑상선기능항진증, 척수 매독, 맥락막염, 거대 세포 다발성근육통, 내분비 눈병증, 만성 과민성 폐렴, 건성 각결막염, 유행성 각결막염, 특발성 신염 증후군, 미소 병변 신증, 양성 가족성 및 허혈-재관류 손상, 망막 자가면역, 관절 염증, 기관지염, 만성 폐쇄성 기도 질환, 규폐증, 아프타, 아프타 구내염, 동맥경화 장애, 아스퍼미오게네스(aspermiogenese), 자가면역 용혈, 뵈크 질환, 한랭글로불린혈증, 듀피트렌 구축, 수정체 과민 안내염, 알레르기성 장염, 나병 결절 홍반, 특발성 안면 마비, 만성 피로 증후군, 류마티스성 열, 함만-리치병, 감각신경성 난청, 발작성 혈색소뇨증, 성기능저하증, 국한성 회장염, 백혈구감소증, 전염성 단핵구증, 횡단 척수염, 원발성 특발성 점액부종, 신장증, 교감성 안염, 육아종성 고환염, 췌장염, 급성 다발신경근염, 괴저 농피증, 퀘르뱅 갑상선염, 후천성 비장 위축, 항-정자 항체에 의한 불임, 비-악성 흉선종, 백반증, SCID 및 엡스타인-바 바이러스-관련 질환, 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS), 기생충 질환, 예컨대 리슈만편모충, 독성-쇼크 증후군, 식중독, T 세포의 침윤, 백혈구-부착 결핍, 시토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민증과 관련이 있는 면역 반응을 수반하는 상태, 백혈구 누출을 수반하는 질환, 다발성 장기 손상 증후군, 항원-항체 복합체-매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 알레르기성 신경염, 자가면역 다내분비질환, 난소염, 원발성 점액부종, 자가면역 위축성 위염, 교감성 안염, 류마티스병, 혼합 결합 조직병, 신 증후군, 췌도염, 다내분비 부전, 말초 신경병증, 자가면역 다분비선 증후군 제I형, 성인 발병형 특발성 부갑상선기능저하증 (AOIH), 전두 탈모증, 확장성 심근병증, 후천적 수포성 표피박리증 (EBA), 혈색증, 심근염, 신 증후군, 원발성 경화성 담관염, 화농성 또는 비-화농성 부비동염, 급성 또는 만성 부비동염, 사골(ethmoid), 전두, 상악 또는 접형 부비동염, 호산구-관련 장애, 예컨대 호산구증가증, 폐 침윤 호산구증가증, 호산구증가증-근육통 증후군, 로플러 증후군, 만성 호산구성 폐렴, 열대성 폐 호산구증가증, 기관지폐렴성 아스페르길루스증, 아스페르길루스종, 또는 호산구를 함유하는 육아종, 아나필락시, 혈청검사 음성 척추관절염, 다내분비 자가면역 질환, 경화성 담관염, 공막, 상공막, 만성 점막피부 칸디다증, 브루톤 증후군, 유아의 일과성 저감마글로불린혈증, 비스코트-알드리히 증후군, 모세혈관확장성 운동실조, 교원병과 관련이 있는 자가면역 장애, 류마티스, 신경계 질환, 림프절염, 허혈성 재관류 장애, 혈압 반응의 감소, 혈관 기능이상, 혈관확장증, 조직 손상, 심혈관 허혈, 통각과민, 대뇌 허혈, 및 혈관증식(vascularization)을 수반하는 질환, 알레르기성 과민증 장애, 사구체신염, 재관류 손상, 심근 또는 다른 조직의 재관류 손상, 급성 염증성 성분을 갖는 피부병, 급성 화농성 수막염 또는 기타 중추신경계 염증성 장애, 안구 및 안와 염증성 장애, 과립구 수혈-관련 증후군, 시토카인-유도된 독성, 급성 중증 염증, 만성 난치성 염증, 신우염, 폐경화, 당뇨성 망막증, 당뇨성 대동맥 장애, 말단동맥 과형성, 소화 궤양, 판막염, 및 자궁내막증.

구체적인 실시양태에서, 인간화 2H7 항체 및 그의 기능적 단편을 포함하는 제약 조성물을 류마티스 관절염 및 연소성 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 예를 들어 루푸스 신염, 베게너병, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 예를 들어 재발 완화형 MS, 건선, IgA 신증, IgM 다발성신경병증, 중증 근무력증, ANCA 관련 혈관염, 진성 당뇨병, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군, 시신경 척수염 (NMO) 및 사구체신염의 치료에 사용한다.

"치료하는" 또는 "치료" 또는 "경감"은 표적화된 병리적 상태 또는 장애를 치유하지 않거나 상기 상태의 재발을 예방하지 않으면 대상체가 무기력해지는 (약해지는) 치료학적 처치를 지칭한다. 본 발명의 방법에 따라 치료량의 본 발명의 인간화 CD20 결합 항체가 투여된 후에 대상체가 특정 질환의 하나 이상의 징후 및 증상에서 관찰가능하고/하거나 측정가능한 감소를 나타내거나 이러한 징후 및 증상이 없는 경우, 상기 대상체는 자가면역 질환 또는 CD20 양성 B 세포 악성종양에 대해 성공적으로 "치료된" 것이다. 예를 들어, 암의 경우에, 암 세포 수의 유의한 감소 또는 암 세포의 부재; 종양 크기의 감소; 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도 저속화되고 바람직하게는 멈추는 것); 종양 성장의 어느 정도의 억제; 특정 암과 관련이 있는 하나 이상의 증상의 차도의 기간 증가, 질환의 진행 저속화, 및/또는 어느 정도의 경감; 이환률 및 사망률 감소, 및 삶의 질 개선이 그 대상이다. 질환의 징후 또는 증상의 감소는 환자도 느낄 수 있다. 치료는 암의 모든 징후의 소멸로서 정의되는 완전 반응 또는 종양의 크기가 바람직하게는 50％ 초과, 더욱 바람직하게는 75％ 초과로 감소되는 부분적 반응을 달성할 수 있다. 환자는 또한 환자가 안정적인 질환을 경험한다면 치료된 것으로 간주된다. 한 기준에서, 본 발명의 h2H7 항체는 > 95％ 말초혈 B 세포 고갈, 및 기준선의 25％까지로의 B 세포 회복을 달성한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 처치는 암 환자에서 처치후 4개월, 바람직하게는 처치후 6개월, 더욱 바람직하게는 처치후 1년, 훨씬 더욱 바람직하게는 2년 이상이 지난 후에 암이 진행되지 않게 하는데 효과적이다. 질환에 있어서의 성공적인 치료 및 개선을 평가하는 이러한 파라미터는 당업계의 숙련된 의사에게 일반적인 통상의 절차로 쉽게 측정가능하다.

"치료 유효량"은 대상체에서 질환 또는 장애의 "치료"에 효과적인 항체 또는 약물의 양을 지칭한다. 암의 경우, 치료 유효량의 약물은 암 세포의 수 감소, 종양 크기의 감소, 말초 장기로의 암 세포 침윤의 억제 (즉, 어느 정도 저속화되고 바람직하게는 멈추는 것), 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도 저속화되고 바람직하게는 멈추는 것), 종양 성장의 어느 정도의 억제, 및/또는 암과 관련이 있는 하나 이상의 증상의 어느 정도의 경감을 유도할 수 있다. "치료"에 관한 상기 정의를 참조한다. 자가면역 질환의 경우, 항체 또는 다른 약물의 치료 유효량은 상기 질환의 징후 및 증상을 감소시키는데 효과적이다.

신생물 치료의 효능 또는 성공을 평가하기 위한 파라미터는 적절한 질환에서의 숙련된 의사에게 공지되어 있을 것이다. 일반적으로, 숙련된 의사는 특정 질환의 징후 및 증상에서의 감소를 예기할 것이다. 파라미터는 질환 진행까지의 중앙 시간, 차도를 보이는 시간, 안정적인 질환을 포함할 수 있다.

하기 참고문헌은 림프종 및 CLL, 이것들의 진단, 치료, 및 치료 효능을 측정하기 위한 표준 의약 절차를 기재한다:

자가면역 또는 자가면역 관련 질환의 치료의 효능 또는 성공을 평가하기 위한 파라미터는 적절한 질환에서의 숙련된 의사에게 공지되어 있을 것이다. 일반적으로, 숙련된 의사는 특정 질환의 징후 및 증상에서의 감소를 예기할 것이다. 다음은 예로서 제공된다.

한 실시양태에서, 인간화 2H7 항체를 포함하는 제약 조성물은 류마티스 관절염의 치료에 사용된다.

RA는 200만명이 넘는 미국인에서 발생하고 이것으로 고통받는 사람들의 일상 활동을 방해하는 쇠약화 자가면역 질환이다. RA는 신체 고유의 면역계가 관절 조직을 부적절하게 공격하고 건강한 조직을 파괴하고 관절 내 손상을 야기하는 만성 염증을 일으킬 때 발생한다. 증상은 관절의 염증, 종창, 경직 및 통증을 포함한다. 추가로, RA는 전신 질환이기 때문에, 다른 조직, 예컨대 폐, 눈 및 골수에 영향을 미칠 수 있다. 공지된 치유법은 없다. 치료제는 다양한 스테로이드성 및 비-스테로이드성 항-염증성 약물, 면역억제제, 질환-변형 항-류마티스 약물 (DMARD), 및 생물학적 작용제를 포함한다. 그러나, 많은 환자가 처치에 부적합 반응을 지속적으로 나타낸다.

항체는 초기 RA 환자 (즉, 메토트렉세이트 (MTX)의 처치 경험이 없음)에서의 제1선 요법 및 단일요법으로 사용될 수도 있고, 또는 예를 들어 MTX 또는 시클로포스파미드와 조합하여 또는 이것의 사용 후에 사용될 수도 있다. 또는, 항체는 DMARD 및/또는 MTX 불응성 환자에 대한 제2선 요법 및 단일요법으로서 치료에 사용될 수도 있고, 또는 예를 들어 MTX와 조합되어 사용될 수도 있다. 인간화 CD20 결합 항체는 관절 손상을 예방하고 조절하며, 구조적 손상을 지연시키고, RA에서 염증과 관련된 통증을 감소시키고, 일반적으로 중간 정도 내지 중증 RA에서의 징후 및 증상을 감소시키는데 유용하다. RA 환자에게는 RA 치료에 사용되는 다른 약물의 처치 이전, 처치 이후 또는 처치와 함께 인간화 CD20 항체를 처치할 수 있다 (하기 조합 요법 참조). 한 실시양태에서, 이전에 질환-변형 항-류마티스 약물에 실패했고/했거나 메토트렉세이트 단독 처치에 부적합 반응을 갖는 환자를 본 발명의 인간화 CD20 결합 항체로 처치한다. 이러한 치료법의 한 실시양태에서, 환자에게 인간화 CD20 결합 항체 단독 투여 (제1일 및 제15일에 1 g의 i.v. 주입); CD20 결합 항체 및 시클로포스파미드 투여 (제3일 및 제17일에 750 mg의 i.v. 주입); 또는 CD20 결합 항체 및 메토트렉세이트 투여를 사용한 17일 처치법을 실시한다.

신체는 RA 동안에 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)를 생성하기 때문에, TNFα 억제제가 상기 질환의 요법에 사용되어 왔다. 그러나, TNFα 억제제, 예컨대 에타네르셉트 (엔브렐(ENBREL)^®), 인플릭시맙 (레미케이드(REMICADE)^®) 및 아달리무맙 (휴미라(HUMIRA)™)는 음성 부작용, 예컨대 감염, 심부전 및 탈수초를 야기할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 인간화 CD20 결합 항체 또는 그의 생물학적 기능적 단편은 예를 들어 TNFα 억제제 약물 사용시에 나타나는 이러한 음성 부작용의 위험이 감소되도록 RA 환자를 치료하거나 독성, 예를 들어 심장 독성이 나타나기 쉽다고 고려되는 환자를 치료하는데 있어서의 제1선 요법으로서 유용하다. 인간화 CD20 결합 항체 또는 그의 생물학적 기능적 단편은 또한 TNFα-억제제를 처치했으나 비-반응성이었던 RA로 고통받는 대상체, TNFα-억제제에 부적합 반응을 갖는 RA로 고통받는 대상체 (TNF-IR 환자), 또는 어느 정도의 반응 시간 후에 질환이 재발되었거나 TNFα-억제제 요법에 반응하지 않을 것으로 결정된 RA로 고통받는 대상체를 치료하는 방법에 유용하다. 한 실시양태에서, TNF-IR을 TNFα 억제제 처치 전에 저용량, 예컨대 100 mg 미만의 용량으로 처치한다.

RA에서의 치료 효능을 평가하는 방법 중 하나는 미국 류마티스 학회(American College of Rheumatology) (ACR) 기준을 기초로 하며, 이것은 특히 압통 및 종창 관절에서의 개선의 백분율(％)을 측정한다. RA 환자는 예를 들어 항체 처치가 없는 경우 (예를 들어, 처치 전의 기준선) 또는 위약 처치의 경우 대비 ACR 20 (20％ 개선)으로 스코어링될 수 있다. 항체 처치의 효능을 평가하는 다른 방법은 X선 스코어링, 예컨대 구조적 손상, 예컨대 골 미란 및 관절강 협소화의 스코어링에 사용되는 샤프(Sharp) X선 스코어를 포함한다. 환자는 또한 건강 평가 설문조사 (Health Assessment Questionnaire) (HAQ) 스코어, AIMS 스코어, 처치 동안 또는 처치 이후의 시점에서의 SF-36을 기초로 하여 활동제한의 예방 또는 활동제한에서의 개선에 대해 평가받을 수 있다. ACR 20 기준은 압통 (통증) 관절 수 및 종창 관절 수 둘다에서의 20％ 개선 및 하기하는 5가지 추가의 측정치 중 적어도 3가지에서의 20％ 개선을 포함할 수 있다:

1. 시각 상사 척도 (VAS)에 의한 환자의 통증 평가,

2. 환자의 전반적인 질환 활성 평가 (VAS),

3. 의사의 전반적인 질환 활성 평가 (VAS),

4. 건강 평가 설문조사로 측정된, 환자의 자가-평가된 활동제한, 및

5. 급성기 반응물, CRP 또는 ESR.

ACR 50 및 70은 유사하게 정의된다. 바람직하게는, 환자에게 적어도 ACR 20, 바람직하게는 적어도 ACR 30, 더욱 바람직하게는 적어도 ACR50, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 ACR70, 가장 바람직하게는 적어도 ACR 75 또는 그보다 높은 수치의 스코어를 달성하는데 효과적인 양의 본 발명의 CD20 결합 항체를 투여한다.

건선성 관절염은 독특하고 특이한 방사선학적 특징을 갖는다. 건선성 관절염의 경우, 관절 미란 및 관절강 협소화를 샤프 점수로도 평가할 수 있다. 본 발명의 인간화 CD20 결합 항체를 사용하여 관절 손상을 예방할 수 있을 뿐만이 아니라 상기 장애의 질환 징후 및 증상을 감소시킬 수도 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 SLE 또는 루푸스 신염으로 고통받는 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 인간화 CD20 결합 항체를 포함하는 제약 조성물을 투여하여 SLE 또는 루푸스 신염을 치료하는 방법이다. SLEDAI 스코어는 질환 활성의 수치 정량화를 제공한다. SLEDAI는 질환 활성과 상관관계가 있다고 공지된 24가지의 임상적 및 실험적 파라미터의 가중 지수이고, 수치 범위는 0 내지 103이다. 문헌 [Bryan Gescuk ＆ John Davis, "Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus" in Current Opinion in Rheumatology 2002, 14:515-521]을 참조한다. 다른 스코어링 방법은 BILAG 스코어링을 포함한다. 이중 가닥 DNA에 대한 항체는 신장 발적, 및 루푸스의 기타 조짐을 일으킨다고 여겨진다. 항체 처치를 받는 환자는 혈청 크레아티닌, 소변 단백질 또는 소변 중의 혈액에서의 유의하고 재현가능한 증가로서 정의되는 신장 발적에 대해 시간에 따라 모니터링될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 환자는 항-핵 항체 및 이중 가닥 DNA에 대한 항체의 수준에 대해 모니터링될 수 있다. SLE 처치는 고용량의 코르티코스테로이드 및/또는 시클로포스파미드 (HDCC)를 포함한다. 본원에서, 루푸스의 성공적인 치료는 발적을 감소시킬 것이고, 즉 중증도 및/또는 다음 발적까지의 시간을 감소시킬 것이다.

척추관절병증은 일군의 관절 장애, 예를 들어 강직성 척추염, 건선성 관절염 및 크론병이다. 치료의 성공은 인증된 환자 및 의사의 전반적 평가 측정 도구로 결정될 수 있다.

혈관염의 경우, 전신 혈관병증 환자의 대략 75％는 항-호중구 세포질 항체를 가지며 작은 크기/중간 크기의 혈관에 영향을 미치는 하기 3가지 상태 중 하나로 분류된다: 베게너 육아종증 (WG), 현미경적 다발성맥관염 (MPA) 및 처크-스트라우스 증후군 (CSS) (통칭하여 ANCA 관련 혈관염 (AAV)으로 공지됨).

건선의 치료 효능은 기준 상태와 비교하여 질환의 임상적 징후 및 증상에 있어서의 변화, 예를 들어 의사의 전반적 평가 (PGA) 변화 및 건선 부위 및 중증도 지수 (PASI) 스코어, 건선 증상 평가 (PSA)를 모니터링하여 평가한다. 본 발명의 인간화 CD20 결합 항체, 예컨대 hu2H7.v511를 처치한 건선 환자는 특정 시점에서 나타나는 가려움의 정도를 표시하는데 사용되는 시각 상사 척도를 기초로 하여 처치 전반에 걸쳐 주기적으로 측정될 수 있다.

환자에서는 치료용 항체의 첫번째 주입시에 주입 반응 또는 주입-관련 증상이 나타날 수 있다. 이러한 증상은 중증도가 다양하고, 일반적으로 의료 개입에 의해 가역적이다. 이러한 증상은 플루-유사 열, 오한/경직, 오심, 두드러기, 두통, 기관지경련, 혈관부종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 질환 치료 방법은 주입 반응을 최소화하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 부작용을 경감시키기거나 최소화시키기 위해서, 환자는 항체의 초기 조건화 또는 허용화 용량(들)을 투여받은 후에 치료 유효 용량을 투여받을 수 있다. 조건화 용량(들)은 더 높은 투여량을 허용하도록 환자를 조건화하기 위해서 치료 유효 용량보다 낮을 것이다.

투약

치료할 적응증 및 당업계의 의사에게 통상적인 투약 관련 인자에 따라, 본 발명의 항체는 독성 및 부작용을 최소화하면서 상기 적응증의 치료에 효능이 있는 투여량으로 투여될 것이다. 원하는 투여량은 질환 및 질환 중증도, 질환의 단계, 원하는 B 세포 조정 수준, 및 당업계의 숙련된 의사에게 통상적인 기타 인자에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 항체는 다양한 투여 빈도, 예를 들어 매주 1회, 2주 마다 1회, 매달 1회 등으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여 빈도는 6개월 마다의 1회 투여, 또는 6개월 마다 2주 간격을 둔 2회 투여이다. 주사될 항체 용액의 부피는 1회 주사 당 약 01. 내지 약 3 mL의 범위, 더욱 바람직하게는 1회 주사 당 약 0.5 mL 내지 약 1.5 mL의 범위일 수 있다. 1회 주사시에 투여되는 인간화 2H7 항체의 총량은 1회 주사 당 최대 약 150 mg일 수 있다. 여러회의 주사를 이용하여 원하는 용량을 달성할 수 있다.

자가면역 질환을 치료하는 경우, 인간화 2H7 항체의 투여량을 조정함으로써 개개의 환자에서 질환 및/또는 상태의 중증도에 따라 B 세포 고갈의 정도를 조정하는 것이 바람직할 수 있다. B 세포 고갈은 완전할 수 있지만 완전해서는 안된다. 또는, 초기 처치시에는 전체 B 세포 고갈을 원할 수 있지만 이후 처치시에는 단지 부분적인 고갈만이 달성되도록 투여량을 조정할 수 있다. 한 실시양태에서, B 세포 고갈은 처치 전의 기준선 수준과 비교하여 CD20 양성 B 세포의 적어도 20％이며, 즉, 80％ 이하가 남는다. 다른 실시양태에서, B 세포 고갈은 25％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％ 이상이다. 바람직하게는, B 세포 고갈은 질환의 진행의 정지, 더욱 바람직하게는 처치받는 특정 질환의 징후 및 증상의 경감, 훨씬 더욱 바람직하게는 질환의 치유에 충분하다.

1종 이상의 현행 요법이 비효과적이거나 불량하게 허용되거나 또는 금지되는 자가면역 질환 또는 B 세포 악성종양을 갖는 환자를 본 발명의 임의의 투약법을 이용하여 치료할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 종양 괴사 인자 (TNF) 억제제 요법 또는 질환-변형 항-류마티스 약물 (DMARD) 요법에 부적합 반응을 가졌던 RA 환자를 본 발명의 방법으로 치료할 것을 고려한다.

"만성" 투여는 급성 방식과는 반대로 연장된 기간의 시간 동안 초기 치료 효과 (활성)를 유지하기 위해 연속 방식으로 작용제(들)을 투여하는 것을 지칭한다. "간헐적" 투여는 중단없이 연속하여 수행되지는 않는 치료이지만, 성질상 주기적이다.

조합 요법

상기 기재된 B 세포 신생물의 치료에 있어서, 환자를 다중약물 요법으로 본 발명의 인간화 2H7 항체 및 1종 이상의 치료제, 예컨대 화학요법제로 처치할 수 있다. 인간화 2H7 항체는 화학요법제와 공동으로, 순차적으로 또는 교대로 투여될 수도 있고, 또는 다른 요법에 비-반응성이 된 후에 투여될 수도 있다. 림프종 치료를 위한 표준 화학요법제는 시클로포스파미드, 시타라빈, 멜팔란 및 미톡산트론과 멜팔란을 포함할 수 있다. CHOP은 비-호지킨 림프종 치료에 가장 통상적인 화학요법 중 하나이다. 하기하는 약물이 CHOP 요법에 사용된다: 시클로포스파미드 (상표명 시톡산, 네오사르); 아드리아마이신 (독소루비신/히드록시독소루비신); 빈크리스틴 (온코빈); 및 프레드니솔론 (때때로 델타손 또는 오라손이라 불림). 특별한 실시양태에서, CD20 결합 항체는 이것의 투여가 필요한 환자에게 화학요법제인 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니솔론 중 1종 이상과 조합하여 투여된다. 특정 실시양태에서, 림프종 (예를 들어, 비-호지킨 림프종)으로 고통받는 환자에게 본 발명의 인간화 2H7 항체를 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손) 요법과 조합하여 처치한다. 또 다른 실시양태에서, 암 환자에게 본 발명의 인간화 2H7 CD20 결합 항체를 CVP (시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손) 화학요법과 조합하여 처치할 수 있다. 특정 실시양태에서, CD20-양성 NHL로 고통받는 환자에게 인간화 2H7.v511 또는 v114를 CVP와 함께 예를 들어 3주마다 8회 주기 동안 투여한다. CLL 치료의 특정 실시양태에서, hu2H7.v511 항체를 플루다라빈 및 시톡산 중 하나 또는 이것들 2종 모두를 사용한 화학요법과 함께 투여한다.

"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 다음을 포함한다: 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시톡산^® 시클로스포스파미드; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에티일렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민; TLK 286 (텔시타(TELCYTA)™); 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)^®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄프토테신 (예를 들어, 합성 유사체 토포테칸 (하이캄틴(HYCAMTIN)^®), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)^®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (예를 들어, 그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토파이신 (특히, 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (예를 들어, 합성 유사체인 KW-2189 및 CB1-TM1); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 항생제, 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조)) 및 안트라사이클린, 예컨대 안나마이신, AD 32, 알카루비신, 다우노루비신, 덱스라족산, DX-52-1, 에피루비신, GPX-100, 이다루비신, KRN5500, 메노가릴, 다이네미신, 예를 들어 다이네미신 A, 에스페라미신, 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색단백질 에네디인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루이신, 아드리아마이신^® 독소루비신 (예를 들어, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 리포좀 독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에소루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴 및 조루비신; 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 프테로프테린 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈 및 플록스유리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄 및 테스톨락톤; 항-부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄 및 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예컨대 폴린산 (류코보린); 아세글라톤; 항-폴레이트 항-신생물 작용제, 예컨대 알림타(ALIMTA)^®, LY231514 페메트렉세드, 디히드로폴레이트 리덕타제 억제제, 예컨대 메토트렉세이트, 항-대사물질, 예컨대 5-플루오로우라실 (5-FU) 및 그의 전구약물, 예컨대 UFT, S-1 및 카페시타빈, 및 티미딜레이트 신타제 억제제 및 글리신아미드 리보뉴클레오티드 포르밀트랜스퍼라제 억제제, 예컨대 랄티트렉세드 (토무덱스(TOMUDEX)^RM, TDX); 디히드로피리미딘 데히드로게나제의 억제제, 예컨대 에닐우라실; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK^® 다당류 복합체 (미국 오레곤주 유진 소재의 제이에이치에스 내추럴 프로덕츠(JHS Natural Products)); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)^®, 필데신(FILDESIN)^®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드 및 탁산, 예를 들어 탁솔(TAXOL)^® 파클리탁셀 (미국 뉴저지주 프린스톤 소재의 브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology)), 크레모포르-무함유 아브락산(ABRAXANE)™, 파클리탁셀의 알부민-조작 나노입자 제제 (미국 일리노이주 샤움버그 소재의 아메리칸 파마슈티칼 파트너즈(American Pharmaceutical Partners)), 및 탁소테레(TAXOTERE)^® 독세탁셀 (프랑스 안토니 소재의 론-프랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer)); 클로란부실; 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)^®); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 백금; 백금 유사체 또는 백금-기재의 유사체, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)^®); 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (온코빈^®); 빈카 알칼로이드; 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)^®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 이것들 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 또한 이것들 중 2종 이상의 조합물, 예컨대 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보린과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN)™)을 사용한 치료법에 대한 약어인 FOLFOX.

또한, 상기 정의에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예컨대 항-에스트로겐 및 선택적인 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (예를 들어, 놀바덱스(NOLVADEX)^® 타목시펜), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 파레스톤(FARESTON)^® 토레미펜; 부신에서 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가스(MEGASE)^® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)^® 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, 리비소르(RIVISOR)^® 보로졸, 페마라(FEMARA)^® 레트로졸, 및 아리미덱스(ARIMIDEX)^® 아나스트로졸; 및 항-안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 및 또한 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 연루된 신호전달 경로 중의 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예컨대 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)^® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)^® 백신, 및 박시드(VAXID)^® 백신; 프로류킨(PROLEUKIN)^® rIL-2; 루르토테칸(LURTOTECAN)^® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX)^® rmRH; 및 이것들 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.

추가로, hu2H7 항체 및 그의 기능적 단편은 항-종양 혈관신생제, 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 길항제와 함께 CD20 발현 B 세포 신생물 (예를 들어, NHL)을 치료하는데 사용될 수 있다. "항-혈관신생제" 또는 "혈관신생 억제제"는 혈관신생, 혈관형성, 또는 바람직하지 않은 혈관 투과성을 직접적으로 또는 간접적으로 억제하는 저분자량 물질, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 단리된 단백질, 재조합 단백질, 항체, 또는 이것들의 접합체 또는 융합 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 항-혈관신생제는 상기 정의된 바와 같은 혈관신생제에 대한 항체 또는 기타 길항제, 예를 들어 VEGF에 대한 항체, VEGF 수용체에 대한 항체, VEGF 수용체 신호전달을 차단하는 소분자 (예를 들어, PTK787/ZK2284, SU6668)이다. "VEGF 길항제"는 1종 이상의 VEGF 수용체에 대한 VEGF 결합을 비롯한 VEGF 활성을 중화시키거나 차단하거나 억제하거나 없애거나 감소시키거나 방해할 수 있는 분자를 지칭한다. 한 실시양태에서, 이러한 B 세포 신생물로 고통받는 환자에게 2H7.v511 또는 2H7.v114를 아바스틴(Avastin)^® (베바시주맙; 제넨테크)과 함께 처치한다. 항-VEGF 항체 "베바시주맙 (BV)"은 또한 "rhuMAb VEGF" 또는 "아바스틴^®"이라고도 공지되어 있고, 이것은 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]에 따라 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체이다.

hu2H7 항체 및 그의 기능적 단편은 TRAIL이라고도 불리는 TNF 부류의 시토카인의 구성원, 예컨대 Apo-2 리간드 (Apo2L)와 함께 CD20 발현 B 세포 신생물을 치료하는 방법에서 유용하다. 전장 천연 서열 인간 Apo-2 리간드는 281개 아미노산 길이이고, 종양 괴사 인자 부류의 시토카인의 제II형 막횡단 단백질이다. 가용성 형태의 Apo-2 리간드, 예컨대 세포외 도메인 (ECD) 또는 그의 일부를 포함하는 것은 포유동물 암 세포에서 세포자멸 활성을 비롯한 다양한 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. Apo2L/TRAIL (WO 97/01633 및 WO 97/25428에 기재됨)은 전장 Apo-2L 단백질의 아미노산 114 내지 281을 포함하는 ECD 단편인 가용성 인간 단백질이다.

상기된 자가면역 질환 또는 자가면역 관련 상태의 치료시에, 환자에게 1종 이상의 hu2H7 항체를 제2 치료제, 예컨대 면역억제제와 함께 예컨대 다중 약물 요법으로 처치할 수 있다. hu2H7 항체는 면역억제제와 공동으로, 순차적으로 또는 교대로 투여될 수도 있고, 또는 다른 요법에 비-반응성이 된 후에 투여될 수도 있다. 면역억제제는 당업계에 기재된 것과 동일하거나 더 낮은 투여량으로 투여될 수 있다. 바람직한 보조 면역억제제는 치료할 장애의 유형 및 또한 환자의 병력을 포함하는 많은 인자에 따라 달라질 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 보조 요법을 위한 "면역억제제"는 환자의 면역계를 저해하거나 차폐시키는 작용을 하는 물질을 지칭한다. 이러한 작용제는 시토카인 생성을 억제하거나, 자가-항원 발현을 하향 조절 또는 저해하거나, 또는 MHC 항원을 차폐시키는 물질을 포함한다. 이러한 작용제의 예는 스테로이드, 예컨대 글루코코르티코스테로이드, 예를 들어 프레드니손, 메틸프레드니솔론, 및 덱사메타손; 2-아미노-6-아릴-5-치환된 피리미딘 (미국 특허 번호 4,665,077 참조), 아자티오프린 (또는 아자티오프린에 대해 유해 반응이 있는 경우에는 시클로포스파미드); 브로모크립틴; 글루타르알데히드 (미국 특허 번호 4,120,649에 기재된 바와 같이 MHC 항원을 차폐시킴); MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-이디오형 항체; 시클로스포린 A; 시토카인 또는 시토카인 수용체 길항제, 예를 들어 항-인터페론-알파, -베타 또는 -감마 항체; 항-종양 괴사 인자-알파 항체; 항-종양 괴사 인자-베타 항체; 항-인터루킨-2 항체 및 항-IL-2 수용체 항체; 항-L3T4 항체; 이종 항-림프구 글로불린; 범(pan)-T 항체, 바람직하게는 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합 도메인을 함유하는 가용성 펩티드 (1990년 7월 26일자로 공개된 WO 90/08187); 스트렙토키나제, TGF-베타, 스트렙토도르나제; 숙주로부터의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 데옥시스페르구알린, 라파마이신; T-세포 수용체 (미국 특허 번호 5,114,721); T-세포 수용체 단편 ([Offner et al., Science 251:430-432 (1991)], WO 90/11294 및 WO 91/01133); 및 T 세포 수용체 항체 (EP 340,109), 예컨대 T10B9를 포함한다.

류마티스 관절염을 치료하는 경우, 환자에게 본 발명의 CD20 결합 항체를 임의의 1종 이상의 하기 약물과 함께 처치할 수 있다: DMARDS (질환-변형 항-류마티스 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트), NSAI 또는 NSAID (비-스테로이드성 항-염증성 약물), 면역억제제 (예를 들어, 아자티오프린; 미코페놀레이트 모페틸 (셀셉트(CellCept)^®; 로쉐)), 진통제, 글루코코르티코스테로이드, 시클로포스파미드, 휴미라™ (아달리무맙; 애보트 래보러토리즈(Abbott Laboratories)), 아라바(ARAVA)^® (레플루노미드), 레미케이드^® (인플릭시맙; 미국 펜실바니아주 말번 소재의 센토코르 인크.(Centocor Inc.)), 엔브렐^® (에타네르셉트; 미국 워싱톤주 소재의 이뮤넥스(Immunex)), 악템라(ACTEMRA)^® (토실리주맙; 스위스 소재의 로쉐), COX-2 억제제. RA에 통상적으로 사용되는 DMARD는 히드록시클로로퀸, 술파살라진, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 에타네르셉트, 인플릭시맙, 아자티오프린, D-페니실라민, 골드(Gold) (경구), 골드 (근육내), 미노시클린, 시클로스포린, 스타필로코쿠스 단백질 A 면역흡착제이다.

아달리무맙은 TNF에 결합하는 인간 모노클로날 항체이다. 인플릭시맙은 TNF에 결합하는 키메라 마우스-인간 모노클로날 항체이다. 이것은 RA 및 크론병 치료를 위해 처방되는 면역-저해 약물이다. 인플릭시맙은 치명적인 반응, 예컨대 심부전 및 결핵을 비롯한 감염 및 또한 MS를 야기하는 탈수초와 관련이 있었다. 악템라 (토실리주맙)는 인간화 항-인간 인터루킨-6 (IL-6) 수용체이다.

에타네르셉트는 인간 IgG1의 Fc 부분에 연결된 인간 75 kD (p75) 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR)의 세포외 리간드 결합 부분으로 이루어진 "면역어드헤신" 융합 단백질이다. 에타네르셉트 (엔브렐^®)는 활성 RA 요법용으로 미국에서 승인을 받은 주사가능한 약물이다. 에타네르셉트는 TNFα에 결합하고, 대부분의 TNFα를 관절 및 혈액으로부터 제거하는 기능을 하여 TNFα가 염증 및 류마티스 관절염의 기타 증상을 촉진시키는 것을 예방한다. 상기 약물은 음성 부작용, 예를 들어 중증 감염 및 패혈증, 신경계 장애, 예컨대 다발성 경화증 (MS)과 관련이 있었다. 예를 들어,

을 참조한다.

RA의 통상적인 치료를 위해서는 예를 들어 문헌 ["Guidelines for the management of rheumatoid arthritis" Arthritis ＆ Rheumatism 46(2): 328-346 (February, 2002)]을 참조한다. 구체적인 실시양태에서, RA 환자에게 본 발명의 hu2H7 CD20 항체를 메토트렉세이트 (MTX)와 함께 처치한다. MTX의 예시적인 투여량은 약 7.5 내지 25 mg/kg/주이다. MTX는 경구 및 피하 투여될 수 있다.

한 예에서, 환자에게 또한 CD20 항체 주입 30분 전 메틸프레드니솔론 100 mg i.v. 투여 및 제2일 내지 제7일에 프레드니손 60 mg p.o. 투여, 제8일 내지 제14일에 30 mg p.o. 투여, 이후 제16일까지 기준선 용량으로 복귀하는 것으로 이루어진 코르티코스테로이드 요법과 동시에 MTX (경구 (p.o.) 또는 비경구 투여로 10 내지 25 mg/주)를 투여한다. 환자에게 또한 폴레이트 (5 mg/주)를 단일 용량으로 또는 분할된 1일 용량으로 투여할 수 있다. 임의로, 환자에게 처치 기간 동안 임의의 백그라운드 코르티코스테로이드 (10 mg/일 프레드니손 또는 등가물) 투여를 계속한다.

강직성 척추염, 건선성 관절염 및 크론병을 치료하는 경우, 환자에게 본 발명의 CD20 결합 항체를 예를 들어 레미케이드^® (인플릭시맙; 미국 펜실바니아주 말번 소재의 센토코르 인크.), 엔브렐 (에타네르셉트; 미국 워싱톤주 소재의 이뮤넥스)과 함께 처치할 수 있다.

SLE 치료는 CD20 항체 및 고용량 코르티코스테로이드 및/또는 시클로포스파미드 (HDCC)의 조합을 포함한다. SLE, AAV 및 NMO로 고통받는 환자에게 본 발명의 2H7 항체를 다음 중 임의의 것과 조합하여 처치할 수 있다: 코르티코스테로이드, NSAID, 진통제, COX-2 억제제, 글루코코르티코스테로이드, 통상적인 DMARDS (예를 들어, 메토트렉세이트, 술파살라진, 히드록시클로로퀸, 레플루노미드), 생물학적 DMARD, 예컨대 항-Blys (예를 들어, 벨리무맙), 항-IL6R, 예를 들어 토실리주맙; CTLA4-Ig (아바타셉트), (항-CD22, 예를 들어 에프라투주맙), 면역억제제 (예를 들어, 아자티오프린; 미코페놀레이트 모페틸 (셀셉트^®; 로쉐)), 및 세포독성제 (예를 들어, 시클로포스파미드).

건선을 치료하는 경우, 환자에게 인간화 2H7 항체를 국소 치료제, 예컨대 국소 스테로이드, 안트랄린, 칼시포트리엔, 클로베타솔 및 타자로텐, 또는 메토트렉세이트, 레티노이드, 시클로스포린, PUVA 및 UVB 요법과 함께 투여할 수 있다. 한 실시양태에서, 건선 환자에게 인간화 2H7 항체를 시클로스포린과 순차적으로 또는 공동으로 처치한다.

독성을 최소화하기 위해서, 종래의 전신 요법제를 본 발명에서의 투여량의 hu2H7 CD20 결합 항체 조성물과 함께 회전적, 순차적, 조합적 또는 간헐적 처치 방식으로 또는 더 낮은 투여량의 조합 요법으로 투여할 수 있다.

제조 용품 및 키트

본 발명의 또 다른 실시양태는 자가면역 질환 및 관련 상태 및 CD20 양성 암, 예컨대 비-호지킨 림프종의 치료에 유용한 본 발명의 제제를 포함하는 제조 용품이다. 제조 용품은 용기, 및 용기상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지 등을 포함한다. 용기는 다양한 재료, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 제제 또는 조성물 중 적어도 1종의 활성 작용제는 본 발명의 hu2H7 항체이고, 상기 항체는 투여시에 상기된 투여량을 전달하는 양으로 용기, 예컨대 시린지에 존재한다. hu2H7의 농도는 10 mg/mL 내지 200 mg/mL의 범위일 것이고, 30 내지 150 mg/mL 또는 100 내지 150 mg/mL일 수 있다. 라벨 또는 포장 삽입물은 해당 조성물이 특정 상태를 치료하는데 사용됨을 표시한다. 라벨 또는 포장 삽입물은 항체 조성물을 환자에게 투여하는 것에 관한 지침서를 추가로 포함할 것이다.

포장 삽입물은 치료 제품의 시판되는 포장물 내에 통상적으로 포함되어 있으며 이러한 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 사용법, 투여량, 투여, 금기사항 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는 지침서를 지칭한다. 한 실시양태에서, 포장 삽입물은 상기 조성물이 비-호지킨 림프종의 치료에 사용됨을 표시한다.

추가로, 제조 용품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 주사용수 (WFI), 주사용 정균수 (BWFI), 인산염 완충 염수, 링거액, 염화나트륨 (0.9％) 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질, 예를 들어 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.

실험 실시예

실시예 1

rhuMab 2 H7 을 위한 초기 피하 제제

rhuMAb 2H7을 위한 고농도 피하 제제 (150 mg/mL)를 개발하였다. 이 제제는 150 mg/mL 2H7, 30 mM 아세트산나트륨, 7％ 트레할로스 이수화물, pH 5.3의 0.03％ 폴리소르베이트 20을 포함한다. 이 제제는 권장 조건하의 최종 바이알 저장시에 장기간 안정적이다. 시노몰거스 원숭이에서 상기 물질을 피하 주사로 투여하면, 주사 부위에 증증의 염증이 생성되고 생체이용률이 낮다 (약 30％). 이들 동물에서는 피하 층에서 경미한 정도 내지 중간 정도의 대식세포 침윤이 관찰되었다. 자극의 원인은 이물질 (즉, 2H7 시험 물질) 때문이었다. 생성물이 주사 부위에 노출되는 것을 모방하는 조건하에 이 제제를 시험하여, 상기 단백질이 생리적 조건하에 유의하게 응집되는 것을 확인하여 (도 1) 시노몰로구스 원숭이에서 관찰되는 염증 결과를 입증하였다. 관찰된 침전은 pH 이동에 따른 염석 효과와 일치할 수 있다.

실시예 2

피하 주사의 생리적 조건하에 거대분자 응집을 시험하는 시험관내 투석 방법

피하 주사 동안의 생리적 조건하에 2H7 응집을 감소시키는 여러 부형제의 능력을 시험하는 시험관내 투석 방법을 개발하였다. 이 모델을 위해서 간질액을 모방하는 변형된 PBS 용액을 개발하였다. 이러한 시험관내 시스템을 이용하여 2H7 응집을 지연시키는데 있어서 당, 중합체, 계면활성제 및 아미노산의 효과를 평가하였다. 이어서, 시험관내 개선된 생성물 방출을 나타낸 후보 제제를 생체내 시험 (래트 피하 모델 - 실시예 3 참조)하여 이러한 개선이 생체내 염증 감소에 상응하는지의 여부를 결정하였다.

시험관내 투석 모델의 셋업을 도 2에 나타냈다. 250 mL 유리 단지에 37℃의 변형된 PBS 용액 (167 mM 나트륨, 140 mM 클로라이드, 17 mM 포스페이트, 4 mM 칼륨) 220 mL를 채웠다. 6 cm 길이의 투석 튜브 (스펙트라 포르(Spectra Por) 100만 분자량 컷오프(1 Million Molecular Weight Cut Off) (MWCO) PVDF 투석 튜브 12 mm 직경)를 정제수에 담갔다. 투석 튜브의 한쪽 끝을 클램프로 물려 놓고 상기 튜브에 대략 1 mL의 시험 샘플 (2H7 및 시험 부형제)을 채웠다. 과량의 공기를 제거하고, 튜브의 반대쪽 끝은 클램프로 물려 놓고 단지의 밀폐부에 고정시켰다. 이와 같이 채워진 백을 상기 변형된 PBS 용액을 함유하는 250 mL 유리 단지에 넣고, 상기 단지를 37℃에서 일정한 교반하에 두었다. 2.5시간, 6시간, 12시간, 24시간, 33시간 및 48시간 후에 변형된 PBS 방출 매질의 샘플 500 ㎕를 취하였다. 샘플의 탁도 및 상기 방출 매질 중에 존재하는 단백질의 양을 UV 측광 스캐닝으로 측정하였다. 또한, 방출 매질 및 투석 튜브 내부의 용액을 침전에 대해 가시적으로 검사하였다.

다음과 같은 경우, 시험 부형제는 시험관내 응집 연구에서 허용되는 것으로 간주되었다:

· 시험 부형제 사용시 2H7의 누적 방출량이 음성 대조군 (원래의 2H7 제제 - 150 mg/mL 2H7, 30 mM 아세트산나트륨, 7％ 트레할로스 이수화물, pH 5.3의 0.03％ 폴리소르베이트 20)의 경우보다 높아서 개선된 2H7 특징을 나타내는 경우.

· 양성 대조군 (랍티바(Raptiva)™; rhuMAb 항-CD11a, 피하 투여된 항체)이 침전을 나타내지 않고 음성 대조군보다 더 높은 방출을 나타내는 경우,

· 2H7의 침전이 감소되거나 없어진 경우.

· 방출 매질의 탁도가 감소된 경우.

이어서, 허용 기준을 충족시킨 후보를 생체내 래트 모델에서 시험하여 시험관내 응집 지연이 생체내 염증 감소와 상관관계가 있는지의 여부를 결정하였다.

시험관내 결과:

시험관내 투석 방법에서 연구 대조군의 전형적인 방출 프로파일을 도 3에 나타냈다. 이 모델의 대조군은 생리적 조건하에 쉽게 응집되지 않는 단백질 (rhuMAb CD11a)의 방출 및 전형적으로 응집되는 단백질 (원래의 2H7)의 방출을 브래킷(bracket)하는 것으로서 선택되었다. 2개의 방출 곡선 사이의 영역은 대조군에 비해 응집을 지연시키는 시험 부형제의 상대적인 능력을 측정한다.

원래의 2H7 제제의 누적 방출 비율은 낮았다 (< 30％). 2H7가 투석 백으로부터 변형된 PBS 용액으로 방출됨에 따라 방출 매질의 탁도 증가가 관찰되었고, 이것은 상기 물질이 이러한 환경하에 응집됨을 나타낸다. 24시간 이내에 투석 백 내부에서 광범위한 엉김이 관찰되었고, 연구 시작시에 150 mg/mL였던 2H7 농도가 48시간 연구 종료시에 4 내지 5 mg/mL로 급격하게 감소된 것에 상응하였다. 이러한 관찰결과 모두가, 2H7이 생리적 조건하에서 쉽게 응집됨을 나타낸다. 이러한 거동은 2H7 원래의 제제를 유리 바이알에 37℃에서 저장한 경우에는 관찰되지 않았다.

반대로, rhuMAb CD11a는 투석 백으로부터 변형된 PBS 용액으로 신속하게 방출되었다. 방출 매질은 연구 내내 투명한 상태로 유지되었고 투석 백 내부에서 엉김이 관찰되지 않았으며, 이는 rhuMAb CD11a가 생리적 조건하에 응집되지 않으며 이 모델을 위한 대조군으로 적합하다는 것을 나타낸다. 표 3은 방출된 단백질의 백분율(％), 방출 매질 탁도 및 엉김의 존재를 요약한다.

실시예 3

거대분자 응집을 시험하기 위한 생체내 래트 피하 모델

래트 피하 모델은 피하 염증의 특징에 있어서의 유사성을 기초로 하는 적절한 모델이다. 원래의 2H7 제제를 투여한 래트의 염증 반응은 시노몰로구스 원숭이에서 관찰된 염증 반응과 일치하였다 (실시예 1 참조). 인간 이뮤노글로불린에 대한 면역-조직화학 염색은 2H7을 주사한 래트 피부 절편에서 양성이었고, 이것은 염증 부위에서의 항체의 존재 또는 지속을 나타내고, 시험 물질의 침전이 주사 부위에서 염증을 일으킨다는 이론을 지지한다.

생체내 래트 스크리닝 검정을 다음과 같이 수행하였다:

각각의 시험 또는 대조군 제제 (0.25 mL)를 피하 투여하였다. 동물을 투여후 제72시간에 부검하였다. 주사 부위에서의 피부 절편을 가로로 절개하여 포르말린 중에 고정시키고, 염증을 감소시키는 것에 대한 시험 부형제의 효과를 조직학으로 결정하였다. 다음과 같이 조직학 절편에 염증 스코어를 배정하였다:

+/-: 최소/약한 염증

1: 경미한 염증

2: 중간 정도

3: 중증

육아종의 존재를 병리학으로 결정하였다. 주사 부위로부터의 조직을 절편화하여 염색하고 광학 현미경하에 육아종의 존재 또는 부재에 대해 관찰하였다.

생체내 래트 모델에 대한 허용 기준은 다음과 같았다: (1) rhuMAb CD11a (음성 대조군)과 유사한 염증, 및 (2) 주사 부위에서의 육아종의 부재.

실시예 4

2 H7 의 응집을 감소시키는 계면활성제의 능력

계면활성제는 일반적으로 거대분자의 응집을 지연시키는데 사용된다. 계면활성제가 2H7의 응집 및 엉김을 감소시키는 능력을 실시예 2에 기재된 시험관내 모델로 평가하였다. 시험한 계면활성제는 친수성-친유성 평형 (HLB) 범위를 포함하였다. 폴리소르베이트 20, 폴록사머 및 스팬(Span) 20 및 80 계면활성제의 첨가는 원래의 2H7 제제에 비해 2H7 방출을 유의하게 개선시키지 않았다. 폴리소르베이트 80 사용시에는 시험관내 2H7 방출에 있어서 중간 정도의 개선이 관찰되었지만, 시험한 임의의 다른 계면활성제에서는 2H7 방출에 있어서의 유의한 개선이 관찰되지 않았다 (표 4 참조). 그러나, 투석 백 내부의 엉김은 모든 경우에서 관찰되었다 (표 4). 따라서, 계면활성제가 단백질 응집을 감소시키는데 통상적으로 사용되기는 하지만, 시험관내 모델에서 2H7의 응집을 지연시키는데에는 효과적이지 않은 것으로 나타났다.

실시예 5

2 H7 의 응집에 대한 PVP 의 효과

2H7의 응집에 대한 PVP의 효과를 시험관내 모델에서 시험하였다. 사용된 물질은 다음과 같았다:

· 바스프(BASF) 콜리돈 30 (중량 평균 분자량 44K 내지 54K 달톤)

· 바스프 콜리돈 17 PF (중량 평균 분자량 7K 내지 11K 달톤)

· 바스프 콜리돈 12 PF (중량 평균 분자량 2K 내지 3K 달톤)

· 바스프 콜리돈 90F (중량 평균 분자량 1M 내지 1.5M 달톤)

· 스펙트럼 폴리비닐피롤리돈 K-15 (바스프 콜리돈 17 PF와 유사함)

저분자량 PVP (중량 평균 MW 9K 달톤)의 첨가는 시험관내 모델에서 2H7의 방출을 유의하게 개선시켰다 (도 4). 투석 백 내의 대다수의 2H7이 방출되었고, 그 양은 rhuMAb CD11a 대조군과 유사하였다. 투석 백 내부에서는 엉김이 관찰되지 않았고, 방출 매질은 연구 내내 투명한 상태로 유지되었다. 이것들 모두가 저분자량 PVP가 생리적 조건하에 2H7의 응집을 억제한다는 것에 대한 지시자이다. 사용된 PVP의 분자량은 중요하다. 고분자량 PVP (중량 평균 MW 120만 달톤)의 첨가는 변형된 PBS 용액으로의 2H7 방출 감소 및 투석 백 내부에서의 상당한 엉김을 야기하였다 (도 4).

이러한 유망한 결과를 기초로, 농도 범위 1％ 내지 20％의 저분자량 PVP (중량 평균 MW 9K 달톤)를 시험관내 투석 모델에서 평가하였다. 5％ 내지 20％의 저분자량 PVP (중량 평균 MW 9K 달톤)의 첨가가 2H7의 응집 억제에 효과적이었다. 5％ 내지 20％의 PVP 사용시에 방출된 2H7의 백분율(％)은 rhuMAb CD11a 대조군의 경우와 유사하였다 (도 5). 방출 매질은 연구 내내 투명한 상태로 유지되었고, 단백질의 엉김 역시 없었다. 저분자량 PVP 농도가 3％ 미만이면 2H7 방출률은 유사했지만 변형된 PBS 방출 용액이 점점 혼탁해져서, PVP의 이러한 농도는 2H7의 응집을 억제하기에는 지나치게 낮다는 것을 나타낸다. 방출된 단백질의 백분율(％), 방출 매질의 탁도 및 엉김의 존재에 대한 요약을 표 5에 나타냈다.

PVP의 추가의 분자량 범위를 또한 시험관내 시스템에서 평가하였다 (도 6). 2K 내지 최고 54K 분자량의 10％ PVP의 첨가는 매질로 방출된 2H7의 백분율(％)이 대조군에 비해 증가된 것으로 입증되는 바와 같이 2H7 응집을 감소시키는데 효과적이었다. 고분자량 PVP (100만 내지 150만 달톤)는 원래의 2H7 제제 대조군과 유사하게 2H7의 응집을 증가시켰다.

실시예 6

생체내 래트 피하 모델에서 염증에 대한 PVP 의 효과

이후, 시험관내 연구에서 유의한 개선을 나타냈던 저분자량 PVP (평균 MW 9K 달톤) 함유 항체 제제를 생체내 래트 피하 모델로 시험하였다. 본 실험의 목적은 시험관내 생리적 조건하에 2H7의 응집을 없애는 것이 주사 부위에서의 염증 감소로 해석되는지의 여부를 결정하는 것이었다. 동물 모델에 대한 성공 기준은 다음과 같았다: (1) 시험 제제 사용시의 염증이 rhuMAb CD11a 연구 대조군과 비슷하게 낮을 것, 및 (2) 주사 부위에 육아종이 없을 것.

각 시험 제제에 대한 조직병리학적 결과의 요약을 표 6에 제공한다. 음성 대조군인 rhuMAb CD11a, 및 단백질을 함유하지 않는 20％ PVP 비히클은 최소의 피하 염증을 유도하였다. 원래의 150 mg/mL 2H7 제제 주사를 양성 대조군으로 사용하였고, 이것은 주사 부위에서 중간 정도 내지 증증의 (2-3+) 염증을 유도하였다. 2H7에 5％ 초과의 PVP (중량 평균 MW 9K 달톤)를 첨가하였을 때 염증이 감소되었다. 100 mg/mL 2H7을 함유하는 10％ PVP의 최적 농도는 주사 부위에서의 염증을 음성 대조군 수준 (+/-)으로 감소시켰고, 이것은 성공 기준에 해당하였다. 염증 증가는 2H7 단백질 농도의 증가와 상관관계가 있었다. 더 높은 농도의 2H7 (150 mg/mL)에 20％ PVP를 첨가하였을 때 염증이 경미한 수준 (1+)으로 유의하게 감소되었다. 어떠한 시험 동물에서도 육아종은 관찰되지 않았다.

염증 등급화 스코어:

+/- = 최소/약간의 수준

1+ = 경미한 수준

2+ = 중간 정도의 수준

3+ = 중증

결론:

요약하면, 5％ 내지 20％ 폴리비닐피롤리돈 (중량 평균 분자량: 2K 내지 54K 달톤)의 첨가는 생리적 조건하에 2H7의 응집을 유의하게 감소시키고 2H7의 엉김을 없애는데 효과적이었다. PVP 및 2H7을 사용한 결과는 PVP의 종래 사용을 기초로는 예상되지 못하는 것이었고, 따라서 본 접근법의 신규성 및 획기성을 예시한다. 단백질 응집을 감소시키는데 통상적으로 사용되는 계면활성제도 본 발명자들의 시험관내 모델에서 평가하였으나, 이것들 중 어느 것도 2H7의 응집 지연에 효과적이지 않았다.

궁극적으로, 이러한 환경에서 2H7의 응집을 감소시키는 것은 2H7을 주사한 동물의 주사 부위에서 염증을 유의하게 감소시키는 결과를 가져왔다. 염증은 중증 수준 (원래의 2H7)에서 10％ 저분자량 PVP를 포함하는 2H7 제제의 경우에는 최소 내지 약간의 수준으로 감소되었다. 이러한 조건하에 응집되는 상기 단백질의 능력을 감소시키는 것은 생체이용률의 증가로 해석될 수 있다. 마지막으로, 본 발명자들은 단백질 응집을 감소시키는 부형제의 능력을 측정하기 위한 시험관내 투석 모델을 성공적으로 개발하였고 이것의 유용성을 입증하였다.

참고문헌

특허, 출원 공개 및 기타 간행물을 포함하여 본 출원에서 언급된 참고문헌은 본원에 참고로 포함된다.

달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 실시는 당업계의 기술 내에 속하는 분자 생물학 등의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 완전하게 설명되어 있다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다:

SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc., et al. <120> METHOD AND FORMULATION FOR REDUCING AGGREGATION OF A MACROMOLECULE UNDER PHYSIOLOGICAL CONDITIONS <130> P2390R1 WO <141> 2009-11-16 <150> US 61/115,439 <151> 2008-11-17 <160> 15 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30 Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro 35 40 45 Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 80 85 90 Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 95 100 105 Lys Arg <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser 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Claims (42)

1. 거대분자를 함유하는 제제에 분자량 범위 2000 내지 54,000 달톤의 5％ 내지 20％ 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 첨가하는 것을 포함하는, 거대분자의 피하 투여 동안 주사 부위에서의 염증을 최소화하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 거대분자가 단백질인 방법.
3. 제2항에 있어서, 단백질이 항체인 방법.
4. 제3항에 있어서, 항체가 치료용 항체인 방법.
5. 제3항에 있어서, 항체가 진단용 항체인 방법.
6. 제3항에 있어서, 항체가 항-CD20 항체인 방법.
7. 제6항에 있어서, 항체가 표 1에 나타낸 항체 변이체 A, B, C, D, F, G, H 또는 I를 포함하는 것인 방법.
8. 제6항에 있어서, 항체가 서열 1 내지 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
9. 제6항에 있어서, 항체가 서열 1의 경쇄 가변 도메인 및 서열 2의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 방법.
10. 제6항에 있어서, 항체가 서열 3의 경쇄 가변 도메인 및 서열 4의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 방법.
11. 제6항에 있어서, 항체가 서열 3의 경쇄 가변 도메인 및 서열 5의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 방법.
12. 제6항에 있어서, 항체가 서열 6의 전장 경쇄 및 서열 7의 전장 중쇄를 포함하는 것인 방법.
13. 제6항에 있어서, 항체가 서열 6의 전장 경쇄 및 서열 15의 전장 중쇄를 포함하는 것인 방법.
14. 제6항에 있어서, 항체가 서열 9의 전장 경쇄 및 서열 10의 전장 중쇄를 포함하는 것인 방법.
15. 제6항에 있어서, 항체가 서열 9의 전장 경쇄 및 서열 11의 전장 중쇄를 포함하는 것인 방법.
16. 제6항에 있어서, 항체가 서열 9의 전장 경쇄 및 서열 12의 전장 중쇄를 포함하는 것인 방법.
17. 제6항에 있어서, 항체가 서열 9의 전장 경쇄 및 서열 13의 전장 중쇄를 포함하는 것인 방법.
18. 제6항에 있어서, 항체가 서열 9의 전장 경쇄 및 서열 14의 전장 중쇄를 포함하는 것인 방법.
19. 10 mg/mL 내지 200 mg/mL 농도 범위의 항체, 및 분자량 범위 2000 내지 54,000 달톤의 5％ 내지 20％ 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 포함하는, 항체의 피하 투여용 제약 제제.
20. 제19항에 있어서, 항체가 30 mg/mL 내지 150 mg/mL의 농도 범위로 존재하는 제제.
21. 제19항에 있어서, 항체가 100 mg/mL 내지 150 mg/mL의 농도 범위로 존재하는 제제.
22. 제19항에 있어서, PVP의 농도가 10％인 제제.
23. 제19항에 있어서, PVP의 분자량 범위가 7000 내지 11,000 달톤인 제제.
24. 제19항에 있어서, 100 mg/mL의 인간화 2H7 항체, 및 분자량 범위 7000 내지 11,000 달톤의 10％ PVP를 포함하는 제제.
25. 제24항에 있어서, 인간화 2H7 항체가 표 1에 나타낸 항체 변이체 A, B, C, D, F, G, H 또는 I를 포함하는 것인 제제.
26. 제24항에 있어서, 30 mM 아세트산나트륨, 5％ 트레할로스 이수화물, 및 pH 5.3의 0.03％ 폴리소르베이트 20(Polysorbate 20)을 추가로 포함하는 제제.
27. 제26항에 있어서, 인간화 2H7 항체가 표 1에 나타낸 항체 변이체 A, B, C, D, F, G, H 또는 I를 포함하는 것인 제제.
28. CD20 양성 B 세포 암을 갖는 환자에게 분자량 범위 2000 내지 54,000 달톤의 5％ 내지 20％ 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 포함하는 제약 제제 중 치료 유효량의 표 1의 인간화 2H7 항체를 투여하는 것을 포함하는, CD20 양성 B 세포 암을 치료하는 방법.
29. 제28항에 있어서, CD20 양성 B 세포 암이 B 세포 림프종 또는 백혈병인 방법.
30. 제29항에 있어서, CD20 양성 B 세포 암이 비-호지킨 림프종 (NHL), 재발성 무통성 NHL 및 리툭시맙-불응성 무통성 NHL, 림프구 우세형 호지킨병 (LPHD), 소형 림프구성 림프종 (SLL) 및 만성 림프구성 백혈병 (CLL)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
31. 제29항에 있어서, 인간화 2H7 항체가 표 1의 변이체 A, B, C, D 또는 H인 방법.
32. 자가면역 질환을 갖는 환자에게 분자량 범위 2000 내지 54,000 달톤의 5％ 내지 20％ 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 포함하는 제약 제제 중 치료 유효량의 표 1의 인간화 2H7 항체를 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환을 치료하는 방법.
33. 제32항에 있어서, 자가면역 질환이 류마티스 관절염 (RA) 및 연소성 류마티스 관절염, 예를 들어 메토트렉세이트 (Mtx)-부적합 반응자 및 TNFα-길항제 부적합 반응자, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 예를 들어 루푸스 신염, 다발성 경화증 (MS), 예를 들어 재발 완화형 다발성 경화증 (RRMS), 베게너병, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신증, IgM 다발성신경병증, 중증 근무력증, ANCA 관련 혈관염, 진성 당뇨병, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군, 시신경 척수염 (NMO) 및 사구체신염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
34. 제33항에 있어서, 인간화 2H7 항체가 표 1의 변이체 A, B, C, D 또는 H인 방법.
35. 분자량 범위 2000 내지 54,000 달톤의 5％ 내지 20％ 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 항체를 포함하는 수성 피하 제제에 첨가하는 것을 포함하는, 주사시에 환자의 주사 부위에서 상기 수성 피하 제제 중 항체의 가용화를 개선 또는 유지하거나 항체의 침전을 최소화하는 방법.
36. 제35항에 있어서, 항체가 표 1에 나타낸 인간화 항-CD20 항체 변이체 A, B, C, D, F, G, H 또는 I인 방법.
37. 분자량 범위 2000 내지 54,000 달톤의 5％ 내지 20％ 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 항체를 포함하는 수성 피하 제제에 첨가하는 것을 포함하는, 피하 투여될 항체의 생체이용률을 증가시키는 방법.
38. 제37항에 있어서, 항체가 표 1에 나타낸 인간화 항-CD20 항체 변이체 A, B, C, D, F, G, H 또는 I인 방법.
39. (a) 시험 부형제가 존재하는 거대분자의 제제 및 시험 부형제가 존재하지 않는 거대분자의 제제를 변형된 PBS 용액 (167 mM 나트륨, 140 mM 클로라이드, 17 mM 포스페이트, 4 mM 칼륨)에 대해 37℃에서 일정한 교반하에 투석하는 단계,
    (b) 변형된 PBS 용액에서 시험 샘플을 취하는 단계, 및
    (c) 상기 시험 샘플의 탁도 및 시험 샘플 중에 존재하는 단백질의 양을 측정하는 단계
    를 포함하고, 여기서 시험 부형제가 없는 대조군에 비해 시험 부형제를 함유하는 검정에서 상기 샘플 중 단백질 농도가 증가하고 탁도가 감소한 것이 거대분자의 응집을 감소시키는 시험 부형제의 능력을 나타내는 것인, 생리적 조건하에 항체 또는 다른 거대분자의 응집을 감소시키는 부형제의 능력을 평가하는 시험관내 투석 방법.
40. 제39항에 있어서, 제제가 100만 달톤 분자량 컷-오프(cut-off)의 투석 튜브에서 투석되는 것인 방법.
41. 제39항에 있어서, 시험 샘플 중의 단백질 농도 및 탁도가 UV 분광법을 이용하여 측정되는 것인 방법.
42. 제39항에 있어서, 변형된 PBS 용액 및 투석 튜브 내부의 용액을 침전에 대해 가시적으로 검사하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 시험 부형제가 없는 대조군에 비해 시험 부형제를 함유하는 투석 튜브에서 침전이 감소한 것이 거대분자의 응집을 감소시키는 시험 부형제의 능력을 나타내는 것인 방법.

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